PRÁCTICA 13 - PCR - Determinación RH

PRÁTICA 13: PCR: AMPLIFICACIÓN DEL GEN QUE CODIFICA PARA EL Rh
FUNDAMENTO
La presencia o ausencia del gen D en el genoma de un individuo, determina la presencia o no en la

membrana de los hematíes de una lipoproteína que constituye antígeno D. Los individuos son clasificados como Rh+
si contienen el antígeno D en la membrana de sus hematíes (esto es una visión bastante simple, en el módulo TAH
se verá con más profundidad).
El sistema Rh está implicado en

reacciones postransfusionales, enfermedad
hemolítica del recién nacido, anemias
hemolíticas autoinmunes y otras reacciones
hemolíticas.
El locus Rh consiste en 2 genes

estructurales: D y CcEe, los cuales codifican
para la cadena del polipéptido D y las proteínas
C/c y E/e respectivamente.
La base de esta práctica es la

amplificación de un fragmento del gen D (no el
gen completo). La amplificación de este
fragmento indicará que la persona es Rh+.
Debido a que los genes D y CcEe son altamente
homólogos, es posible diseñar cebadores que se
emparejan en una región del gen D y también a
una región del gen CcEe. Los individuos Rh+
producirán 2 fragmentos de diferentes tamaños
(1200 pb y 600 pb) y los individuos Rh- una
única banda correspondiente al fragmento del
gen CcEe (1200 pb).
En la PCR, el ADN o gen a amplificar es la secuencia de interés o secuencia diana y los oligonucleótidos
sintéticos utilizados son los “primers” o cebadores. Se utilizan 2 cebadores de entre 20-45 que se corresponden con
los extremos del gen o fragmento a amplificar. Cada cebador se une a uno de los extremos de cada cadena de ADN y
es el punto de inicio de la amplificación.
Una reacción típica de PCR contiene ADN molde, Taq polimerasa (con MgCl 2), una pareja de cebadores y los
4 dNTPS en un tampón de reacción apropiado. El volumen total de reacción es de 25-50 μl (nosotros usaremos 25
μl).
En el primer paso de la reacción de PCR, la

desnaturalización, las cadenas complementarias de
ADN se separan (desnaturalizan) la una de la otra a
95ºC. En estas condiciones la Taq polimerasa
permanece estable.
En el segundo paso, la muestra se enfría a una
temperatura entre 40-65ºC que permita la hibridación
o anillamiento de los 2 cebadores, cada uno a una
hebra del ADN molde.
En el tercer paso, la elongación o extensión,
la temperatura se eleva a 72ºC y la Taq polimerasa
añade nucleótidos a los cebadores para completar la
síntesis de una nueva cadena complementaria.
Estos tres pasos constituyen un ciclo de PCR, que se
repite durante 20-40 ciclos, amplificando la secuencia
diana exponencialmente.
MATERIALES
 Bata y guantes  Termociclador
 Microtubos para el termociclador  Agua estéril libre de RNAasas.
 Micropipetas de tamaño adecuado  Vaso de precipitado para residuos
 Puntas de pipeta, a ser posible con filtro
Reactivos:
- Mezcla máster (master mix)
- Control positivo (Rh+)
- Agua ultrapura (realmente debería ser agua libre de nucleasas)
Muestras: ADN extraído y purificado de prácticas anteriores
PROCEDIMIENTO
A tener en cuenta:
 Si es posible utilizar puntas con filtro.
 Cambiar siempre de punta cada vez que se realiza una acción para evitar contaminaciones que puede dar lugar
a falsos resultados.
 Vamos a utilizar 2,5 µl (100-250 ng) del ADN de cada alumno para cada reacción de PCR.
REACTIVOS VOLUMEN
MIX PCR 22,50 µl
ADN (100-250 ng) 2,5 µl
Volumen Total 25 µl
 En la siguiente práctica vamos a realizar dos geles para realizar la electroforesis, por lo que vamos a preparar
para cada gel un control negativo y un control positivo.
1. Preparación de los tubos control:

a) Preparar un control negativo de amplificación (uno para cada tres grupos), para ello colocar 2,5 µl de
agua ultrapura en lugar del ADN, en un microtubo de termociclador. Rotular ese microtubo como C-.
b) Preparar un control positivo de amplificación (uno para cada tres grupos), para ello colocar 2,5 µl del
control positivo Rh+ en lugar del ADN en un microtubo de termociclador. Rotular ese tubo como C+.
2. Preparación de los tubos con muestra:
a) Rotular los tubos para las muestras con la misma numeración que en la práctica anterior.
b) Preparar las muestras, colocando para ello 2,5 µl de ADN extraído y purificado en un microtubo para el
termociclador rotulado.
3. Añadir a cada microtubo (controles y muestras) 22,5 µl de mezcla máster*.
*El MIX Hot Star ya contiene: Primers o cebadores, Taq polimerasa, dNTPs, tampón y MgCl2.
4. Mezclar bien, el colorante rojo incluido en la polimerasa facilita el proceso.
5. Programar el termociclador incluyendo un paso de desnaturalización inicial de 10 minutos a 95 ºC, este paso
permite la activación de la Polimerasa “HOT STAR”.
PROGRAMA Rh
PASO TEMPERATURA TIEMPO

Desnaturalización HOT STAR 95 ºC 10 minutos
95 ºC 30 segundos
Ciclos PCR 64 ºC 30 segundos
Realizar 35 ciclos 72 ºC 45 segundos
Extensión final 72 ºC 10 minutos
Final (Tª de mantenimiento) 4 ó 12 ºC (para no Indefinido hasta que se apaga
sobrecargar el aparato)
PREGUNTAS PARA RESPONDER TRAS LA PRÁCTICA
1. ¿Para qué sirve el Mix Hot Star? ¿Qué contiene?
2. ¿Qué ocurre en los tres pasos de la PCR?
3. ¿Para qué sirve el control positivo y negativo?
4. ¿Para qué sirve el cloruro magnésico?
5. ¿Cuál es el siguiente paso tras la amplificación?
6. ¿Qué diferencia hay entre una Taq polimerasa y una polimerasa?

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PRÁTICA 13: PCR: AMPLIFICACIÓN DEL GEN QUE CODIFICA PARA EL Rh

La presencia o ausencia del gen D en el genoma de un individuo, determina la presencia o no en la

El sistema Rh está implicado en

El locus Rh consiste en 2 genes

La base de esta práctica es la

En el primer paso de la reacción de PCR, la

1. Preparación de los tubos control:

4. Mezclar bien, el colorante rojo incluido en la polimerasa facilita el proceso.

PASO TEMPERATURA TIEMPO

1. ¿Para qué sirve el Mix Hot Star? ¿Qué contiene?

2. ¿Qué ocurre en los tres pasos de la PCR?

3. ¿Para qué sirve el control positivo y negativo?

4. ¿Para qué sirve el cloruro magnésico?

5. ¿Cuál es el siguiente paso tras la amplificación?

6. ¿Qué diferencia hay entre una Taq polimerasa y una polimerasa?

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