Emisión:

07-05-2014
DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES Versión: 0
POR HPLC-RID
Actualización:
07-05-2014
Sección Química de Página 1 de 7
ME-711.02-220
Alimentos y Nutrición

1. OBJETIVO
Determinar el contenido de azucares totales en bebidas analcoholicas y en jugos de frutas y/o
hortalizas a partir de la sumatoria de fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa, lactosa y galactosa.

2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

El método es aplicable a bebidas analcoholicas, jugos de frutas y hortalizas, refrescos, bebidas
de fantasía líquida o en polvo.

3. FUNDAMENTO
Se precipitan las impurezas de las muestras y el sobrenadante se somete a una purificación a
través de cartuchos C18 obteniendo la solución de azúcares para ser identificados y
cuantificados por Cromatografía Liquida con detector RID. Los azúcares totales corresponden a
la suma de los mono y disacáridos presentes en la muestra tales como: fructosa, glucosa,
sacarosa, lactosa, maltosa.

4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS

4.1 Chávez-Servín, J. L., Castellote, A. I., & López-Sabater, M. C. (2004). Analysis of

mono- and disaccharides in milk-based formulae byhigh-performance liquid
chromatography with refractive index detection. Journal of Chromatography A,
1043(2), 211-215.
4.2 AOAC Official method 982.14. Glucose, Fructose, Sucrose and Maltose in
Presweetened Cereals. Liquid Chromatography Method, Capitulo 32 página 62,
2012.
4.3 AOAC Official Method 977.20. Separation of Sugars in Honey. Liquid
Chromatographic Method, capitulo 44 página 31,2012.

5. TERMINOLOGÍA
5.1 RID: Detector con índice de refracción.

DUEÑO DE PROCESO: ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA APROBADO:

INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE
Encargado de Laboratorio de “DOCUMENTO CONTROLADO” SE
Nutrientes, Aditivos y CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA Jefe Subdepartamento
Contaminantes. Alimentos y Nutrición
 Emisión:
07-05-2014
DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES Versión: 0
POR HPLC-RID
Actualización:
07-05-2014
Sección Química de Página 2 de 7
ME-711.02-220
Alimentos y Nutrición

6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 REACTIVOS
6.1.1 Agua desionizada.
6.1.2 Metanol p.a.
6.1.3 Solución de hexacianoferrato de potasio trihidratado 0,25 M (Carrez I).
6.1.4 Solución de acetato de zinc dihidratado 1M (Carrez II).
6.1.5 Fosfato de sodio p.a.
6.1.6 Acetonitrilo HPLC
6.1.7 Estándares de monosacáridos y disacáridos (fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa y
lactosa).

6.2 INSUMOS

6.2.1 Matraces Erlenmeyer de 150 mL.

6.2.2 Matraces aforados de 50 y 100 mL
6.2.3 Embudos
6.2.4 Micropipetas de 1000 y 5000 µL
6.2.5 Pipetas Pasteur
6.2.6 Papel filtro Whatmann 1.
6.2.7 Filtros de disco de PVDF (0,22 µm)
6.2.8 Cartuchos para extracción en fase sólida con fase estacionaria C18, 500 mg, 6 cc
6.2.9 Termómetro
6.2.10 Papel de aluminio.
6.2.11 Guantes, espátulas, gradillas y material general de laboratorio.
6.2.12 Columna Lichrospher 100-NH2 250 x 4,6 mm, 5 µm con pre columna o equivalente.

6.3 EQUIPOS
6.3.1 Balanza analítica (precisión 1 mg).
6.3.2 Placa calefactora.
 Emisión:
07-05-2014
DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES Versión: 0
POR HPLC-RID
Actualización:
07-05-2014
Sección Química de Página 3 de 7
ME-711.02-220
Alimentos y Nutrición

6.3.3 Baño ultrasonido.

6.3.4 Sistema de extracción en fase solida con bomba de vacío.
6.3.5 Cromatógrafo líquido (HPLC) con detector RID.

7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES

7.1 Muestreo/Muestra

7.1.1 La cantidad mínima de muestra es de 200 mL para muestras liquidas y 20 g para

muestra sólida. De preferencia en su envase original, almacenada a temperatura
ambiente.

7.2 Preparación de Reactivos

7.2.1 Solución de acetato de zinc dihidrato 1M (Carrez II): para 100 mL pesar 24 gramos
de la sal y adicionar 3mL de ácido acético glacial. Finalmente aforar con agua
desionizada.

7.2.2 Fase móvil Acetonitrilo/Agua (80/20): para 1 litro tomar 800 mL de acetonitrilo y
agregar agua desionizada hasta 1000 mL. Sonicar 20 minutos en caso que su equipo no
cuente con desgasificador.

7.2.3 Solución de Hexacianoferrato de potasio trihidrato 0,25M (Carrez I): para 100 mL
pesar 10,6 gramos de la sal. Finalmente aforar con agua desionizada.

7.2.4 Solución individual de mono y disacáridos 100 mg/mL: Pesar aproximadamente 1

gramo de estándar y llevarlo a 10 mL con agua desionizada. Considerar el porcentaje
de pureza para determinar la concentración final.

7.2.5 Solución multiestándares de azucares 10 mg/mL: Tomar una alícuota de 1 mL de

cada solución individual de los estándares juntándolos en un matráz de 10 mL y aforar
con agua desionizada).

7.2.6 Solución multiestándares de azucares 1 mg/mL: Tomar una alícuota de 1 mL de la

solución multiestándares de azucares 10 mg/mL y aforar a 10 mL con agua desionizada.

7.3 Preparación de curva de calibración.

Realizar curva de calibración que contenga los 5 monosacaridos a 6 niveles; 25, 50,
100, 500, 1000, 2500 µg/mL. Preparar la curva según la tabla y llevar a volumen con
ACN/agua (50:50).
 Emisión:
07-05-2014
DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES Versión: 0
POR HPLC-RID
Actualización:
07-05-2014
Sección Química de Página 4 de 7
ME-711.02-220
Alimentos y Nutrición

Concentración Alícuota Volumen final Concentración inicial

ug/mL mL mL mg/mL
50 0,5 10 1
100 0.5 5 1
500 0,5 10 10
1000 0.5 5 10
2500 0.5 2 10

7.4 Preparación de controles

(No aplica).

7.5 Preparación de la Muestra o etapas previas a realizar la medición.

7.5.1 Pesar de 2 a 7 g de muestra sólida en un matraz Erlenmeyer de 150 mL o tomar 5 a 10

mL si es muestra líquida en un matraz aforado de 100 mL.
7.5.2 Si la muestra es sólida agregar aproximadamente 50 mL de agua desionizada
previamente calentada no más allá de los 80°C (nota: para muestras con un pH
considerablemente bajo, vale decir con altos contenidos de ácidos orgánicos, no agregue
agua previamente calentada para evitar una hidrólisis exacerbada de la sacarosa). Tapar
el matraz con un trozo de papel aluminio por seguridad. Mezclar suavemente a pulso sin
invertir hasta notar que la masa solida se disperse. Si la muestra es líquida agregar 50
mL de agua fría, mezclar bien con movimiento orbital (no invertir).
7.5.3 Si la muestra es sólida llevar a un baño de agua con sonicación por un periodo de 20
minutos o hasta disolución completa de la muestra. Retirar el matraz del baño y dejar
enfriar hasta temperatura ambiente.
7.5.4 Agregar 5 mL de la solución Carrez I y agitar por unos 20 segundos con movimiento
orbital. Luego agregar 5 mL de la solución de Carrez II y agitar al igual que con Carrez I.
Deben formarse precipitados color amarillo anaranjado.
7.5.5 Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL. Aforar con agua
desionizada.
7.5.6 Agitar 1 minuto.
7.5.7 Dejar el matraz en reposo por al menos 2 horas. Se formaran complejos de alto peso
molecular que se desplazaran al fondo por gravedad, clarificando la solución.
7.5.8 Filtrar aproximadamente la mitad de la solución del matraz por medio de un filtro de papel.
 Emisión:
07-05-2014
DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES Versión: 0
POR HPLC-RID
Actualización:
07-05-2014
Sección Química de Página 5 de 7
ME-711.02-220
Alimentos y Nutrición

7.5.9 Acondicionar un cartucho de extracción en fase sólida Sep-Pak C18 (500 mg y 6 cc)
cargando primero aproximadamente 6 mL de metanol p.a. y luego aproximadamente 6
mL de agua desionizada, descartar
7.5.10 Tomar 5 mL del filtrado de la muestra y cargarlos en el cartucho C18 previamente
acondicionado.
7.5.11 Dejar eluir el volumen con un flujo lento (en lo posible solo por presión atmosférica),
procurando que haya pasado todo el volumen. Este primer filtrado debe descartarse.
7.5.12 Agregar 5 mL más del filtrado y eluir. Colectar este segundo eluato.
7.5.13 Filtrar una alícuota de la fracción colectada por medio de un filtro de disco de PVDF
(0,22 µm de tamaño de poro) o bien ultracentrifugar por 5 minutos a 12.000 rpm.
7.5.14 Analizar el filtrado.

Nota: De ser necesario diluir la muestra.

7.6 Análisis de la muestra o realización de la medición. Condiciones instrumentales

7.6.1 Fase móvil en modo isocratico, flujo de 1 a 1,5 mL/min (dependiendo de la resolución de
la columna).
7.6.2 Detección: temperatura de la celda 40 °C.
7.6.3 Temperatura del horno: 40 °C.
7.6.4 Volumen de inyección: 50 µL.
7.6.5 Tiempo corrida: 35 min.

El orden de elusión de los analitos a determinar son: fructosa, glucosa, galactosa, sacarosa,
maltosa y lactosa.

7.7 Cálculo de Resultados:

Los resultados pueden expresarse como el contenido individual de cada monosacárido o bien
como la suma total de azucares.

[sumatoria concentración HPLC de azucares (µg/mL)]·10

Azucares totales (g/100g) = ---------------------------------------------------------------------------------------------
[masa de muestra(g)/1000]
 Emisión:
07-05-2014
DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES Versión: 0
POR HPLC-RID
Actualización:
07-05-2014
Sección Química de Página 6 de 7
ME-711.02-220
Alimentos y Nutrición

7.8 Aseguramiento de la calidad del ensayo.

Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos

realizados con el método de ensayo recogido en este procedimiento. Los controles de calidad
quedan de la siguiente manera:

Set de muestras Nº de duplicados Nº Fortificados ó Quality

Control
1-10 1 1
11-20 2 1
21-30 3 1
31 o mas 4 2

Criterios de aceptación:
- Criterio aceptación para fortificado y QC: Porcentaje de recuperación de acuerdo a la
concentración según lo establecido por la AOAC.
- Criterio aceptación duplicados: deben tener a lo menos un 85% de similitud en el
resultado.
- Además se participará en ensayos de intercomparación, en forma periódica, según lo
establecido en el manual de calidad.

7.9 Expresión de los Resultados.

Los resultados se expresan en concentración de azucares totales como g/100g.

8. CONTROL DE REGISTROS

ALMACENAMIENTO
LUGAR
MEDIO
IDENTIFICACION RESPONSABLE TIEMPO RESPONSABLE/ DISPOSICION
SOPORTE
RECUPERACION
Registro análisis Encargado del
proximal en Laboratorio de 5 años con
Laboratorio de
alimentos Nutrientes, destrucción
5 Años. papel Nutrientes, Aditivos
RG-711.00-078 aditivos y posterior del
y Contaminantes.
contaminantes documento.
.
 Emisión:
07-05-2014
DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES Versión: 0
POR HPLC-RID
Actualización:
07-05-2014
Sección Química de Página 7 de 7
ME-711.02-220
Alimentos y Nutrición

9. CONTROL DE CAMBIOS

PRINCIPALES
PUNTOS
VERSION FECHA MODIFICADOS RESUMEN DE MODIFICACIONES

10. CUADRO DE RESPONSABILIDADES

Ejecuta el método Elabora el informe de Aprueba el informe de

(Cargo) resultados resultados
(Cargo) (Cargo)
Técnico de Laboratorio Profesional encargado del Jefatura de Sub
Encargado de Laboratorio Laboratorio departamento Alimentos y
Nutrientes Aditivos y Nutrición
Contaminantes

11. ANEXOS
No Aplica.