ANTOCIANINAS POR pH DIFERENCIAL Y CONTENIDO TOTAL DE FLAVONOIDES

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Arauz, Keila; 2 Cruz, Jaqueline; 3 Juárez, Gissell
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4-784-260; 2 4-808-1395; 3 4-789-2287
Curso de laboratorio de Productos Naturales (QM 460)
Resumen:
Las antocianinas son compuestos fenólicos, de la familia de los flavonoides, colorantes naturales
ampliamente distribuidos en frutas, bayas y flores.  La experiencia realizada tuvo como objetivo:
determinar el contenido total de flavonoides y las antocianinas presentes en uvas y fresas
mediante UV-Vis. Para esta finalidad se realizó primeramente la extracción con etanol de la
cascara de uvas y fresas. Seguidamente, la determinación de flavonoides totales, donde se
realizó una curva de patrón de quercetina y se leyó la absorbancia en el UV-Vis. Posteriormente,
la determinación de antocianinas por pH diferencia, donde se añadió buffer de pH=4,5 y pH=1,0 al
extracto y se leyó la absorbancia de cada pH en el UV-Vis, se obtuvo la concentración de
antocianinas total en el extracto de fresa que fue de 45,42097. En el extracto de uva fue de
223,6314. Luego, el tamizaje fitoquímico, donde se realizó la reacción de Shinoda; obteniendo un
resultado positivo, color rosa para el extracto de uva, la reacción de FeCl 3; obteniendo un
resultado color marrón para el extracto de uvas. Finalmente; se puede concluir que uno de los
principales factores que afecta la estabilidad del color de las antocianinas es el pH y que las
fresas contienen mayor cantidad de flavonoides totales que las uvas y otras frutas.
PALABRAS CLAVES: flavonoides, antocianinas, UV-Vis, actividad antioxidante, quercetina.
OBJETIVOS:
 Determinar el contenido total de flavonoides presentes en uvas y fresas por UV-Vis.
 Determinar antocianinas presentes en uvas y fresas por UV-vis/ pH diferencial.
 Realizar pruebas de tamizaje fitoquímico al extracto de uvas y fresas.
MARCO TEÓRICO:
El fruto de uva (Vitis vinífera L.) ha sido ampliamente estudiado por sus propiedades
antioxidantes. La cáscara y semillas de la uva son consideradas fuentes importantes de
compuestos fenólicos, a los que se les atribuyen la propiedad astringente y antioxidante de las
uvas y sus productos. (Gámez, et-al, 1999)
La fresa pertenece a la familia Rosaceae, es una fuente de compuestos polifenólicos con
actividad antioxidante, especialmente antocianinas, ácidos fenólicos y vitamina C; los cuales son
protectores de la oxidación de muchos organelos. Las fresas poseen mayor actividad antioxidante
que muchas frutas como: toronja, naranja, uva roja, kiwi. (de Pabón, et-al, 2013)
Los flavonoides constituyen el grupo más importante de clasificación con más de 5000
compuestos, son un grupo de compuestos polifenólicos de bajo peso molecular que comparten un
esqueleto común de difenilpirano, formado por dos anillos de fenilo (A y B) ligados a través de un
anillo C de pirano (heterocíclico). (Martínez, 2000) Los flavonoides se clasifican de acuerdo a su
estructura química, los más comunes en alimentos son los flavonoles, flavonas, antocianidinas,
flavanoles, isoflavonas, catequinas, charconas y flavandioles. Dentro de todos estos grupos las
flavonas (apigenina, luteolina y diosmetina), los flavonoles (quercetina, miricetina y kampferol) y
sus glicósidos son los compuestos más abundantes en vegetales. (Hertog, et-al, 1992)
Las antocianinas son compuestos fenólicos del grupo de los flavonoides. Se encuentran en la
naturaleza, en algunos frutos que van del color rojo al azul como los arándanos, las cerezas, las
ciruelas o las uvas. (Santacruz, 2011) Su fórmula básica está conformada por dos anillos
aromáticos unidos por una estructura de tres carbonos. En su forma natural, esta estructura se
encuentra esterificada a uno o varios azúcares, en cuyo caso se denominan antocianinas simples.
Si además del azúcar en la molécula existe un radical acilo, entonces son antocianinas aciladas .
(Moreno, et-al, 2003)
La estabilidad de las antocianinas se ve afectada por el pH, temperaturas de almacenamiento,
presencia de enzimas, luz, oxigeno, estructura y concentración de las antocianinas, y la presencia
de otros compuestos tales como otros flavonoides, proteínas y minerales. (Daniel, 2009)
Dependiendo del pH las antocianinas pueden existir en cuatro especies diferentes: base
quinoidal, catión flavilo, pseudobase carbinol y chalcona. Con soluciones muy acidas el catión
flavino rojo es la única estructura. Con incrementos de pH la concentración del catión decrece al
mismo tiempo que la hidratación da lugar a la base de carbinol incolora. La forma chalcona es la
más susceptible a la degradación y la forma iónica flavilio es la más estable. (Mejía, 2017)
Los fenoles absorben en la región ultravioleta (UV). En el caso de los fenoles de tipo flavonoides
se presentan 2 bandas de absorción características:18 la banda del anillo aromático A con un
máximo de absorción en el rango 240-285 nm (banda benzoil) y otra banda del anillo B con
máximo de absorción en el rango 300-550 nm (banda cinamoil). (Martínez, 2006) Las
antocianinas tienen una absorción característica con bandas alrededor de 250, 370 y 500- 545
nm. Está última banda de absorción varía con el pH del medio. (Ortega, et-al, 2006)
MATERIALES Y REACTIVOS:
Los reactivos utilizados fueron: Etanol al 80% y 95%, Nitrato de Aluminio (10%), Acetato de Sodio
(1M), Ácido Clorhídrico (1M y 0,2M), Cloruro de Potasio (0,2M), Quercetina
Como equipo se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis
Utilizamos vasos químicos, probetas (50 mL) ,volumétricos (10 y 100mL), micropipetas.

MÉTODO EXPERIMENTAL:
Para determinar el contenido de flavonoides totales se realizó una curva de calibración con
concentraciones de 1 a 100 ppm de Quercetina, preparadas a partir de una solución madre de
200ppm en etanol al 80%. Posteriormente se mezclaron 100 µL de solución patrón, 300 µL de
etanol al 95%, 20 µL de nitrato de aluminio al 10%, 20 µL de acetato de sodio 1 M y 560 µL de
agua. Se homogenizo y se dejó incubar por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se leyó la
absorbancia a una longitud de onda de 415nm en un espectrofotómetro UV-Vis.
Se realizaron pruebas de tamizaje fitoquímico como Shinoda y Cloruro férrico.
En la identificación de antocianinas totales se pesaron fresas y las uvas (por separado) y se
colocó en un vaso químico con etanol al 80% para obtener el extracto etanólico. La cuantificación
de antocianinas totales se realizó por el método de pH diferencial. Donde se preparó una solución
buffer pH 4,5 con 40 mL de acetato de sodio 1M, 24 mL de HCl 1 N y 36 mL de agua. Además se
preparó una solución buffer pH 1,0 con 12,5 mL de KCl 0,2 N y 38,5 mL de HCl 0,2. Ambos se
ajustaron para obtener un pH final de 1,0 y 4,5. La determinación de antocianinas está basada en
la Ley de Lambert-Beer.
RESULTADOS:
Tabla 1. Tamizaje Fitoquímico para extracto etanólico de uvas
Prueba Observación
Shinoda Coloración rosa (positiva)
Cloruro Férrico Coloración marrón (positiva)
Flavonoides totales
Grafico 1. Concentración Vs Absorbancia

Absorbancia vs Concentración
1
0.9
f(x) = 0.01 x + 0
0.8 R² = 1
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 20 40 60 80 100 120

Cuadro 1. Patrones de Quercetina

Concentración (ppm) absorbancia
0 0
11.3 0.075
22.6 0.186
45.2 0.414
67.8 0.552
113 0.918

Cuadro 2. Concentración de Flavonoides en la muestra de fresas y cascara de uvas

Absorbancia de Absorbancia de Fresas (ppm) Cascara Uva
extracto de extracto de uva (ppm)
fresa
0,073 0,322 8,5854 38,9513

Cuadro 3. pH diferencial de Antocianinas

A´ de uva A´ de fresa ppm (uva) ppm (fresa)
3,348 0,68 223, 6315 45,4210

Ilustración 1. pH diferencial en fresas. A la derecha tenemos el extracto de fresa a un pH de 4.5 y el de la izquierda

tiene un pH de 1
Ilustración 2. pH diferencial en uvas. A la derecha tenemos el extracto de uva a un pH de 4.5 y el de la izquierda tiene
un pH de 1

DISCUSIÓN:
En esta práctica se llevó a cabo la determinación del contenido total de flavonoides por UV-Vis,
realizando una curva de calibración para determinar las concentraciones en las fresas y uvas. Los
Flavonoides engloba a numerosos componentes naturales repartidos en varias familias, siendo
los más importantes las flavonas y Ias isoflavonas. Se trata de pigmentos naturales que le dan
color a las plantas. Los encontrarnos en plantas muy coloridas corno Ias verduras de color verde
oscuro o Ias frutas rojas. [ CITATION Cau17 \l 6154 ]
La estructura química de estos compuestos consta de dos anillos aromáticos (bencénicos),
unidos a través de una cadena de tres carbonos que puede encontrase como un anillo central
heterocíclico (ɤ-pironas) que es el más común, o también con la cadena de tres carbonos abierta
(Chalcona), C6C3C6 (Martínez, 2005). Además, gracias a los anillos bencénicos que poseen en su
estructura, son capaces de absorber radiación ultravioleta. Esto sumado con la ruta biosintética
de la cuál provienen, le confieren a la molécula sus características espectrales.
Las fresas han atraído la atención de consumidores e investigadores debido a que poseen mayor
actividad antioxidante total comparada con otras como la toronja, naranja, uva roja, kiwi, banano,
manzana, tomate, pera y melón, evaluadas como frutas frescas. La actividad antioxidante de
extractos de fresa se ha asociado con el contenido de fenoles totales, adicionalmente, las
antocianinas, que son colorantes naturales con potente propiedad antioxidante, son las
responsables del color brillante y atractivo de las fresas. [ CITATION Car12 \l 6154 ]. Aunque las fresas
tengan mayor concentración de antocianinas registró una absorbancia menor a la de la uva. Esto
se debe a que se utilizó la cascara de la uva y no la “carne”, como bien es visto la cascara de la
uva tiene un color morado. Y al aumentar de pH dichas muestras su absorbancia registraba una
disminución.
Las antocianinas a ciertos pH presentan diferente actividad debido a que esto repercute en su
estabilidad molecular. Los espectros UV-VIS a diferentes pH también cambian y nos ayudan a
determinar si está o no polimerizada [ CITATION Tho98 \l 6154 ]
El color llamativo de las antocianinas se debe principalmente a Ia carga positiva del catión flavilio.
A pH 1 dará un color intenso tal como se encuentran de forma típica en verduras y frutas. Las
cargas van cambiando a lo largo de Ia variación del pH dando las estructuras y colores que se
ilustraron en Ia ilustración 1 y 2. El catión flavilio a pH 1 es la forma más estable mientras que las
chalconas a pH 4.5 son Ias más susceptibles a degradación [ CITATION Str03 \l 6154 ]. La forma del
espectro UV-Vis de Ias antocianinas puede brindar información sobre su concentración y el tipo
que se utilizó.
Existen algunos métodos de identificación que son netamente cualitativos, entre los cuales se
encuentran los ensayos de color, que permiten el reconocimiento de flavonoides por un cambio
en la coloración (Martínez, 2005). Entre estos se encuentran: el ensayo de Shinoda que este se
utiliza para flavonoides con tengan es su estructura un núcleo benzopirona como las flavonas,
flavonoles, flavanonas, etc. producen coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o
alcohólicas. Y resulto positivo.
CONCLUSIÓN:
 Es posible determinar la presencia de metabolitos secundarios, en este caso flavonoides,
mediante pruebas cualitativas como la de Shinoda y Cloruro férrico, para posteriormente
hacer un análisis cuantitativo.
 La cascara de la uva presento mayor cantidad de flavonoides, dando un resultado de
38,9513ppm; mientras que las fresas presentaron una concentración de flavonoides de
8,5854 ppm.
 Al cambiar el pH de la antocianina se cambia el color de la muestra por tanto la
absorbancia resultante es afectada.

REFERENCIAS:
 Gámez-Meza, N., Noriega-Rodríguez, J. A., Medina-Juárez, L. A., Ortega-García, J.,
Cazarez-Casanova, R., & Angulo-Guerrero, O. (1999). Antioxidant activity in soybean oil of
extracts from Thompson grape bagasse. Journal of the American Oil Chemists' Society.
 de Pabón, L. M. C., Cartagena, R., Peláez, C., Gaviria, C. A., & Rojano, B. A. (2012).
Capacidad antioxidante de dos variedades de Fragaria x ananassa (Weston) Duchesne
(fresa) sometidas a variaciones en la nutrición vegetal. Revista Cubana de Plantas
Medicinales.
 Hertog, M. G., Hollman, P. C., & Katan, M. B. (1992). Content of potentially
anticarcinogenic flavonoids of 28 vegetables and 9 fruits commonly consumed in the
Netherlands. Journal of agricultural and food chemistry.
 Martínez, N. D. S. (2006). Identificación de compuestos fenólicos con posible actividad
biológica obtenidos de ciruela (Prunus cerasifera Ehrh) (Doctoral dissertation, Universidad
Veracruzana. Instituto de Ciencias Básicas. Región Xalapa.).
 Ortega, G. M., & Guerra, M. (2006). Separación, caracterización estructural y cuantificación
de antocianinas mediante métodos químico-físicos. Parte II. ICIDCA. Sobre los Derivados
de la Caña de Azúcar.
 Santacruz Cifuentes, L. A. (2011). Análisis químico de antocianinas en frutos silvestres
colombianos (Doctoral dissertation, Universidad Nacional de Colombia).
 Moreno, Y. S., Bustos, F. M., Hernández, M. S., Paczka, R. O., & Vázquez, J. L. A. (2003).
Efecto de la nixtamalización sobre las antocianinas del grano de maíces
pigmentados. Agrociencia.
 Martínez-Valverde, I., Periago, M. J., & Ros, G. (2000). Significado nutricional de los
compuestos fenólicos de la dieta. Archivos latinoamericanos de nutrición.
 Daniel, D. (2009). Determinación de antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante
en licores y fruto de mora. Huajuapan de León, Oaxaca, México: Universidad Tecnológica
de la Mixteca.
 Mejía Abanto, D. M. (2017). Extracción y cuantificación de antocianinas en frambuesa
(Rubus idaeus L.) a diferentes temperaturas y tiempos de extracción.
 Thornton Morrison, R., & Neilson, R. (1998). Química Orgánica (Quinta ed.). (Addison
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 Carvajal, L. (marzo de 2012). Revista Cubana de Plantas Medicinales. Obtenido de
scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1028-47962012000100005
 Causse, C. (2017). Los secretos de salud de los antioxidantes. Madrid: Hispano Europea.
 Martínez, A. (2005). Flavonoides. Medellín.
 Stryer, L., Berg, J. M., & Tymoczko, J. L. (2003). Bioquímica (Quinta ed.). Barcelona,
España: Reverté.