Agar
Agar
Agar
El hongo patógeno debe ser aislado de otros microorganismos. Para las levaduras, se debe agregar
dos gotas de una mezcla de penicilina estreptomicina (5 000 U/ml y 5 mg/ml) o emplear medios que
contengan cloranfenicol (500 mg/L). En los hongos filamentosos, deben eliminarse las bacterias
saprófitas al colocar la muestra antes de sembrarla en líquido de Raulin, pues tiene pH ácido e inhibe
bacterias; también es posible ubicar la muestra en una solución con antibióticos antibacterianos
(penicilina-estreptomicina-cloranfenicol) o situar dos tubos de la mezcla de antibióticos en el medio de
cultivo, pues éstos se difunden bien; para muchos es más sencillo utilizar medios con antibióticos
termoestables (cloranfenicol). Es más difícil eliminar hongos saprófitos de los cultivos; para lograrlo, es
factible incubar a 30 a 37°C (los hongos saprófitos banales se desarrollan con mayor lentitud a estas
temperaturas); utilizar medios especiales para agentes patógenos, con sangre o vitaminas, o
simplemente emplear medios con cicloheximida (Actidione).
Identificación de los hongos.
Al obtener el cultivo de un hongo se deben estudiar sus características macroscópicas, microscópicas
y fisiológicas para definir el género y la especie. Las características varían con el medio de cultivo, la
naturaleza de los azúcares, la pureza de la peptona, el pH, el grado de humedad y la temperatura. Por
eso es preferible utilizar siempre medio glucosado de Sabouraud para estudiar y comparar
características estándar en las mismas condiciones de humedad y temperatura, evitando
contaminaciones.
Pueden utilizarse los métodos que siguen:
1. Análisis a través del tubo. Se utiliza la lupa del microscopio, se observa el borde de
crecimiento. Es un método poco preciso pero rápido.
2. Análisis de un fragmento del cultivo. Consiste en tomar un fragmento de la colonia, dilacerarlo y
observarlo con azul de lactofenol. Es el método habitual, pero puede destruir los aparatos
esporíferos y dificultar la identificación.
3. Método de la cinta adhesiva transparente (Rush-Munro). Es una variante de la técnica anterior
y permite observar las estructuras fúngicas casi sin alteración. Se recorta un pequeño cuadrado
de cinta y se adhiere a la parte terminal del asa de platino, se aplica después la parte adhesiva
sobre la colonia y luego se coloca sobre un portaobjetos con una gota de colorante, se retira el
asa, se añade otra gota de colorante, se pone un cubreobjetos y se observa al microscopio.
4. Cultivo en lámina o microcultivo. Es el más preciso y permite observar las estructuras fúngicas
in situ. Consiste en obtener un cultivo sobre un portaobjetos y observar el hongo sin deterioro
de su morfología.
TÉCNICAS DE SIEMBRA
Método de siembra por estría en placa
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de
siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la
superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina
simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van
depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se
toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma
técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra
separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo
que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles.
Métodos de vertido en placa y extensión en placa
En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa.
Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se
puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro
debe ser diluida 10 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por
tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de
cien en cien.
Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (de medio
estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso
se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes.
En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en
placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias
superficiales se extenderán y serán más grandes.
En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la
superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La
suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas
técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por
estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión
o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta
que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que
permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por
tanto, se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de
microorganismos. Para obtener un cultivo axénico mediante este método:
a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con sólo
unos pocos cientos de bacterias-
b) Verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa
Petri.
c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie
(más grandes).
d) Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico:
(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.
(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra.
(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y
volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo
grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una
cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células
aisladas.
(d) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el
cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar
por estrías una segunda placa.
MEDIOS DE CULTIVO
Pueden ser de tres tipos: naturales, semisintéticos y sintéticos. Los naturales están elaborados con
leche, huevo, granos de cereales, levadura de cerveza y otros compuestos. Los semisintéticos, como
el Sabouraud, aportan una fuente de carbono y nitrógeno. Los sintéticos tienen una composición
química bien definida y se usan en investigación; no son de uso sistemático.
CLASIFICACION
Se pueden realizar distintas clasificaciones atendiendo a su estado físico, composición, el uso al que
se destinan:
SEGÚN SU ESTADO FISICO Se dividen en sólidos, semisólidos y líquidos:
Sólidos, presentan en su composición una agente solidificante (AGAR) en proporción de 12 a
15 gramos por litro.
Semisólidos, presentan AGAR en su composición, pero a una concentración mucho menor,
entre 2.5 a 4 gramos del agente solidificante
Líquidos, no presenta ningún agente solidificante
SEGÚN SU COMPOSICION Se dividen en empíricos, sintéticos y semisintéticos.
Empíricos, en su composición aparecen sustancias orgánicas.
Sintéticos, en su composición aparecen sustancias químicas definidas
Semisintéticos, en su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas
SEGÚN AL USO AL QUE SE DESTINEN Se dividen en: enriquecidos, diferenciales o aislamiento,
selectivos e inhibidores, transporte y mantenimiento, uso general, para filtros de membrana.
Enriquecidos, suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores, tales
como sangre de caballo, etc.
Diferenciales o de aislamiento, contienen colorantes, azucares e indicadores para provocar la
respuesta bioquímica conocida
Selectivos e inhibidores, además de los componentes de los medios diferenciales, contienen en
su composición una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la
muestra a estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismo que se busca.
Transporte y mantenimiento, se utilizan en la recogida, transporte y conservación de muestras
biológicas. Son medios muy reductores que inhiben las reacciones enzimáticas
autodestructivas dentro de las células evitando los efectos destructivos de la oxidación.
Uso general, son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de
microorganismos fastidiosos.
Filtros de membrana, son medios que permiten el examen de grandes volúmenes con una baja
concentración de microorganismos, la separación de los microorganismos del medio de cultivo
e incluso su cambio de un medio de cultivo a otro, permite el crecimiento sin interrupción del
microorganismo.
MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS.
Medio de transporte para hongos (medio de Stuarts)
Fórmula: Tioglicolato de sodio
1 g Glicerofosfato de sodio
10 g CaCl2
100 mg Azul de metileno
0.002 mg
Agua destilada
1 000 ml
El pH debe ser de 7.3.
Medio de Bennett
Se utiliza para actinomicetos.
Fórmula: Extracto de levadura 19 g
Extracto de carne 18 g
NZ Amida A 2 g
Caseína para digestión 1 g
Glucosa 10 g
Gelosa 15 g
Agua destilada 1000 ml
Medio de Löwenstein-Jensen
Se emplea para actinomicetos, micobacterias y Actinomadura.
Fórmula: Fosfato monopotásico 2.4 g
Sulfato de magnesio 0.24 g
Citrato de magnesio 0.6 g
Asparagina 3.6 g
Glicerina 12 ml
Agua destilada 600 ml
Fécula de papa (patata) 30 g
Huevos frescos 1000 ml
Solución de verde de malaquita al 2% 20 ml
Medio para hidrólisis de la caseína
Es útil para tipificar Nocardia.
Fórmula 1: Leche entera en polvo
4 cucharadas
Agua destilada 50 ml
Sig.: A Agar 20 g Agua destilada 1000 ml Sig.: B Se esterilizan ambas preparaciones. En una caja de
Petri, se mezclan dos tubos de agar con uno de leche, se deja solidificar y se siembra la colonia
problema.
Fórmula 2: Dextrosa 1 g
Agar bacteriológico 1.5 g
Agua destilada 50 ml
Sig.: A Leche descremada (“Skim milk”) 1.5 g
Agua destilada 50 ml
Sig.: B Se esterilizan por separado A y B a 10 lb de presión durante 10 min; se dejan enfriar a 45°C, se
vacían en cajas de Petri y se mezclan.
Medio para hidrólisis de tirosina, xantina o hipoxantina
Sirve para tipificar Nocardia.
Fórmula: Peptona 5 g
Extracto de carne 3 g
Agar 15 g
l-tirosina 5 g (o xantina o hipoxantina) 4 g
Agua destilada 1000 ml
pH 7
La tirosina, xantina o hipoxantina debe distribuirse uniformemente en todo el medio y luego se
esteriliza 15 min a 110°C.
Medio para hidrólisis de la gelatina diluida
Sirve para estudiar actinomicetos.
Fórmula: Gelatina 4 g
Agua destilada 1000 ml
Medio de Garrod
Para aislar y conservar actinomicetos.
Fórmula: Extracto de carne 3 g
Cloruro de sodio 5 g
Peptona 10 g
Almidón soluble 1 g
Agar 20 g
Agua destilada 1000 ml
Se disuelven los ingredientes en el agua. Se esteriliza a 120°C durante 15 min y se envasa.
Caldo de tioglicolato con soya tripticasa
Se usa para actinomicetos anaerobios.
Fórmula: Caldo de tioglicolato 29.50 g
Caldo de soya tripticasa 1.50 g
Caldo de triptosa 1.25 g
Agua destilada 1000 ml
Medio para especies de Corynebacterium
Para aislamiento de especies del género Corynebacterium.
Fórmula: Suero fetal bovino 20 ml
Agar bacteriológico 2 g
Medio 199 (preparado) 78 ml
Se mezclan los componentes y se envasan. Se esterilizan a 15 lb de presión por 20 minutos.
Medio de Kurung
Es útil para conservar hongos patógenos en su forma parasitaria.
Fórmula: Fécula de papa (patata) 1 g
Agua destilada 100 ml
Mezcla de huevo 150 ml
El agua con la fécula de papa (patata) se calienta en el mechero de Bunsen hasta que la mezcla se
gelifique, entonces se esteriliza a 115°C durante 15 min. Se agita la mezcla de huevos (que contiene
100 ml de yemas y 40 ml de huevos enteros) en presencia de perlas de vidrio y se agrega con técnica
estéril a la fécula de papa (patata). El medio se reparte en tubos y se deja coagular inclinado a 90°C
durante una hora.
Medio de urea de Christensen
Permite comprobar la presencia de ureasa y cuando es positiva el color del medio pasa de rosado a
rojo (p. ej., Cryptococcus).
Fórmula: Peptona 0.1 g
Glucosa 0.5 g
NaCl 0.5 g
KH2PO4 0.2 g
Agar 1.5 g
Agua destilada 100 ml
Rojo fenol 0.012 g
Se disuelven los componentes y se ajusta el pH a 6.8, luego se esteriliza el medio, se enfría y se
añade urea al 20%, 0.5 ml por cada 4.5 ml de medio. La urea se esteriliza previamente para filtración.
Agar Papa Dextrosa
El Agar Papa Dextrosa está compuesto por Infusión de Papa deshidratada y Dextrosa que fomentan el
crecimiento exuberante de los hongos.
Agar mycosel
El agar mycosel es un medio selectivo para el aislamiento de hongos patógenos a partir de materiales
con flora mixta de otros hongos y bacterias.
Bibliografía.
Arenas, R. (2008). MICOLOGÍA MÉDICA ILUSTRADA. 3rd ed. México: McGRAW-HILL
INTERAMERICANA EDITORES, S.A. de C.V., pp.36-47; 347-359.