Tincion Gram

PRACTICA N°3: TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM
I. OBJETIVOS:
 Caracterizar e identificar a las bacterias Gram positivas y Gram negativas de

acuerda a su forma y disposición.
 Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e
identificación de las bacterias.
II. MARCO TEORICO:
La pared celular es responsable de la tinción Gram, el procedimiento de la tinción se

inicia con una tinción de las células bacterianas fijadas mediante el colorante básico
cristal violeta, posteriormente se trata con una disolución de yodo en forma de Lugol,
el yodo forma un complejo con el cristal violeta que es insoluble en agua y sólo
medianamente soluble en alcohol o acetona.
Las células se tratan después con alcohol para difereciarlas, las células Gram
positivas retienen el complejo colorante-yodo por lo que las obsrvamos de color
morado-azules y las células Gram negativas negativas son decoloradas por el alcohol
por lo que se hacen visibles mediante la coloración de contraste que en este caso es
la fucsia.
Para explicar el mecanismo de la tinción de gram se han propuesto varias

hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los
microorganismos.
Aquí puedes ver las
diferencias
estructurales y
químicas de los dos
Reacción y coloración de las bacterias
tipos de pared
bacteriana:
Productos que se
utilizan
GRAM + GRAM -
1) Cristal violeta Células color violeta Células color violeta
Se forma el complejo CV-I. Se forma el complejo CV-I. Las
2) Lugol solución
Las células continúan células continúan teñidas de color
iodada
teñidas de color violeta. violeta.
Se deshidratan las paredes
celulares. Se contraen los Eliminación por extracción de
poros. Disminuye la grasas de las paredes celulares.
3) Alcohol permeabilidad. El complejo Aumenta la porosidad. El
CV-I no sale de las células complejo CV-I se separa de la
que continúan teñidas de célula.
color violeta.
Células no decoloradas;
Células decoloradas; se tiñen de
4) Safranina quedan teñidas de color
color rosado.
violeta.
III. MATERIALES:
 Microscopios
 Mecheros
 Asas de platino
 Set colorantes Gram
 Lamina portaobjetos
 Aceite de inmersión
 Alcohol isopropílico
 Gradilla porta láminas
 Pizeta con agua destilada
 Papel seda
 Hisopos
 Alcohol desinfectante
 Plumón indeleble
IV. PROCEDIMIENTOS:
a) Rotulamos convenientemente cada uno de los portaobjetos

b) Preparamos extendidos de los microorganismos indicados por nuestro
profesor, tomamos material de la colonia elegida, con un hisopo y luego
extendemos el material sobre toda la superficie del portaobjeto.
c) Fijamos con calor pasando el preparado sobre la llama suave del mechero,
teniendo mucho cuidado con no quemarlo.
d) Cubrimos el extendido con una solución de colorante de cristal violeta, y
esperamos en contacto de 60 segundos.
e) Seguidamente decantamos el colorante y cubrimos en solución de Lugol,
dejamos en contacto durante 2 minutos.
f) Decoloramos con alcohol-acetona, lavamos con agua.
g) Cubrimos con safranina, dejamos en contacto durante 20 segundos, lavamos
con agua.
h) Secamos y observamos al microscopio óptico con objetivo de inmersión.
V. RESULTADOS:
Se tomó dos muestras iniciales, siendo ambas nasales y se procedió a realizar la

tinción Gram. (Utilizamos el hisopo esterilizado).
a) Al agregarle el cristal violeta, que es un colorante

básico que en contacto con las células Gram
positivas y negativas reacciona con ellas
coloreándolas (color azul).
b) Seguidamente al agregarle el yodo en solución de

Lugol, y al reaccionar con el cristal violeta forma
un complejo el cristal violeta (CV-I).(conocida
como solución de mordiente)
c) Utilizamos el alcohol acetona, las Gram positivas al decolorar con alcohol
acetona las paredes celulares se deshidratan, se produce una retracción de los
poros, la permeabilidad disminuye y el complejo CV.I no puede salir de la
bacteria y permanece coloreada, mientras que las Gram negativas al tener
contacto con el alcohol acetona se da la extracción de lípidos de la pared
celular, aumenta la porosidad, el complejo CV-I sale de la bacteria y esta
queda coloreada.(Siendo este el agente decolorante y el punto crítico de la
tinción).
d) Al agregarle la safranina, Las bacterias Gram negativas decoloreadas, tomaran

el color del colorante de contraste safranina, siendo este el color rojo.
e) En el caso que no salga el color rojo indica que la safranina no colorea a la

bacteria, ya que la safranina colorea al Gram negativo, indicando que la
bacteria sería una Gram negativa.
CUESTIONARIO:
1.- ¿Qué función cumple el yodo durante la tinción?
El yodo en solución de Lugol al reaccionar con el cristal violeta forma el complejo

cristal violeta, siendo este complejo insoluble en agua y forma así una capa insoluble
en agua pero soluble en alcohol, dejando así el camino listo para el punto crítico en
donde el alcohol decolora a las Gram negativas y mantiene el color en las Gram
positivas.
2.- ¿Cuál es el punto crítico de la coloración Gram y por qué se llama así?
3.- Haz un dibujo de las paredes celulares de una bacteria Gram positiva y una
negativa señalando las principales estructuras en ellas.
GLOSARIO:
a) Colorante
b) Mordente
c) Tinción diferencial
d) Tinción simple
e) Peptidoglucano
f) Ácido teicoico
g) Espacio periplásmico
h) Porinas
i) Membrana celular
j) Lipopolisacárido

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