INTRODUCCIN

Sabemos que para purificar una sustancia de inters se hace siguiendo los criterios de separacin basados en alguna propiedad fsica o qumica que diferencia al compuesto en cuestin de otros que en principio estaran ligados a l. Entre los diversos criterios de separacin cabe citar: -Aquellos que fraccionan las molculas basndose en sus tamaos, como la cromatografa de filtracin en gel y la ultracentrifugacin. -Los que separan las molculas atendiendo a las diferencias en la carga elctrica neta del compuesto, como la cromatografa de intercambio inico y la electroforesis. -Los que se basan en la retencin especfica de slo uno o varios tipos de molculas, entre los que cabe destacar la cromatografa de afinidad. -Procedimientos de separacin basados en diferencias de solubilidad. -Mtodos basados en la adsorcin diferencial a determinadas matrices. La cromatografa de filtracin en gel, ms corrientemente llamada de exclusin molecular, es una tcnica de purificacin muy extendida y apreciada debido a su sencillez y eficacia en la resolucin de mezclas complejas de macromolculas. Esta tcnica puede utilizarse con buenos resultados con fines analticos (por ejemplo, para la determinacin de pesos moleculares).

CROMATOGRAFA DE FILTRACIN EN GEL

La cromatografa de filtracin en gel es una tcnica que permite separar molculas en funcin de su tamao molecular. La capacidad separadora reside fundamentalmente en el gel cuya matriz consta de un gran nmero de esferas porosas microscpicas. Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tamao de sus poros El objetivo es separar una mezcla de sustancias de distinto peso molecular por medio de una cromatografa en una columna y determinar los correspondientes parmetros que caracterizan el comportamiento cromatogrfico de cada sustancia.

La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran nmero de esferas porosas microscpicas. Estas esferas estn constituidas por largas cadenas de polmeros unidas entre si por enlaces qumicos para formar una red tridimensional. El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio quedando listo para su uso.

Ent rada

de

m uest ra

Lqui do que baa el gel Super ficie del gel

Gel depositado Filtro poroso que retiene el gel Espacio muert o ocupado por relleno inert e Salida de muestra f raccionada

Esquema de una columna de cromatografa de filtracin en gel

En el interior de una columna de cromatografa pueden distinguirse varios volmenes : a) El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado. b) El volumen de vaco (Vo), o el volumen existente entre las esferas del gel.

c) El volumen ocupado por las esferas del gel, que se expresa como la diferencia entre los dos volmenes anteriores: Vt-Vo.

Vt

Vo

V t -V o

Volmenes de una columna cromatogrfica

Cuando una mezcla de molculas de diferentes tamaos se hace pasar a travs de la columna de gel, se produce la separacin en virtud del siguiente principio: - Las molculas de muy pequeo tamao penetran en el interior de las esferas que componen el gel y, por consiguiente, no son extradas de la columna hasta que no ha pasado a travs de ella un volumen de lquido igual a su volumen total (Vt). Sin embargo, aquellas molculas cuyo tamao es mayor que el de los poros de las esferas del gel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo nicamente el volumen vaco (Vo), siendo las primeras en salir de la columna. El resto de las molculas, de tamao intermedio, presentan una mayor o menor

facilidad para difundir al interior de las esferas en funcin de su tamao, siendo extradas fraccionadamente con volmenes que estn comprendidos entre el Vt y el Vo.

Cuanto mayor es una molcula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de lquido que se requiere para extraerla de la columna. Teniendo en cuenta que para las protenas globulares el tamao est, en general, relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografa separa las sustancias en funcin de dichos pesos moleculares, obtenindose primero las ms pesadas.

ECUACIN DE ELUCIN: En cromatografa de exclusin molecular, el volumen de la fase mvil (V m), normalmente, se llama el volumen vaco, Vo. La cantidad Kav, ( o Kmedia) se define como

donde Vr es el volumen de retencin de un soluto, y V t el volumen total de la columna . En el caso de molculas grandes que no penetran en el gel, Vr = Vo, y = 0. En el caso de una molcula pequea que penetra libremente en el gel, Vr = Vt y Ka,, = 1. Las molculas de tamao intermedio penetran en algunos poros del gel, pero no en otros, de forma que Kav, vale entre 0 y 1. Idealmente, la penetracin en gel es el

nico mecanismo por que son retenidas las molculas en este tipo de cromatografa. En realidad, siempre existe algo de adsorcin, de modo que Kav puede ser > 1.

El volumen vaco se mide haciendo pasar una molcula inerte grande a travs de la columna. Su volumen de elucin se define como Vo. Para este fin la molcula ms utilizada es el azul de dextrano 2000, un colorante azul.

TIPOS DE GELES: Entre los geles utilizados en columnas abiertas, a escala preparativa, de exclusin molecular se encuentran el Sephadex y el Bio-Gel P que es una poliacrilamida entrecruzada con N- N'-metilenbisacrilamida. Los tamaos de poro ms pequeos en los geles muy entrecruzados excluyen molculas de peso molecular mayor o igual que 700, mientras que los tamaos de poro ms grandes excluyen molculas de peso molecular igual o mayor

que 108. Cuanto menor es el tamao de partcula del gel, mayor es la resolucin, y ms lento el flujo a travs de la columna.

En HPLC, se pueden utilizar esferas de poliestireno con tamaos de poro desde 5 nm hasta centenares de nm. Las partculas de un dimetro de 5 m dan 80 000 platos por metro de longitud de columna. La slice microporosa de tamao de poro controlado permite 10 000-16 000 platos/metro. La slice se recubre de una fase hidrfila que minimiza la adsorcin de solutos. Se puede usar una resina polister hidroxilada de tamao de poro bien definido en intervalo de pH de 2 a 12, mientras que las fases de slice, generalmente, no pueden usarse por encima de pH 8. Las partculas con diferentes tamaos de poro se pueden mezclar para dar un intervalo ms amplio de separacin de tamaos moleculares.

GRADOS DE LOS GELES Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tamao de sus poros. ste viene expresado por dos nmeros que representan pesos moleculares, correspondiendo el menor de ellos al peso molecular mximo de una sustancia que difunda perfectamente a travs de todos los poros del gel, y el mayor, al peso molecular mnimo que ha de tener una sustancia para que pueda ser excluida

de las esferas del gel.

Las sustancias de peso molecular fuera de dicho rango no son fraccionadas sino que se extraen conjuntamente con el volumen vaco (Vo), las de peso molecular mayor que el rango, o con el volumen total (Vt), las ms pequeas que dicho rango.

En el mercado se encuentran geles con rangos de fraccionamiento muy diversos (desde 1.000-5.000, hasta 10.000-4.000.000), lo que posibilita la separacin a diferentes escalas de pesos moleculares.

MEDIOS DE FILTRACIN POR GEL:

FUENTE: Los datos de esta tabla se han tomado de boletines de los fabricantes, que facilitan una gran cantidad de informacin til sobre estos productos.

DETERMINACIN DE PESOS MOLECULARES: La filtracin por gel se usa principalmente para separar molculas de pesos moleculares significativamente distintos. Para cada fase estacionaria, existe un intervalo dentro del cual se da una relacin logartmica entre el peso molecular y el volumen de elucin. Se puede estimar el peso molecular de una sustancia comparando su volumen de elucin con el de estndares. Sin embargo, se debe tener cuidado al interpretar los resultados, porque molculas con el mismo peso molecular, pero de diferentes formas, presentan caractersticas distintas de elucin. En el caso de protenas, es importante usar una fuerza inica bastante alta (mayor que 0,05 M), para eliminar la adsorcin electrosttica del soluto por puntos ocasionalmente cargados que existan en el gel. Slice TSK SW para cromatografa de exclusin molecular HPLC

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA SEPARACIN: Adems de la diferencia intrnseca de tamao existente entre las molculas que van a ser cromatografiadas, hay diferentes factores que influyen en una correcta separacin de las mismas: - Longitud de la columna. La capacidad de separacin de sustancias de diferente tamao aumenta con la longitud de la columna.

- Flujo. La resolucin de la separacin disminuye al aumentar el flujo del lquido con que son arrastradas las molculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo -1 oscila entre 2 y 10 cm h .

- El volumen de la muestra a cromatografiar. Debe ser pequeo comparado

con el volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total. - Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no est empaquetado homogneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.

CARACTERIZACIN DEL COMPORTAMIENTO CROMATOGRFICO DE UN SOLUTO Los resultados de la cromatografa de filtracin en gel se expresan

habitualmente en forma de grficas (cromatogramas) donde se representa la cantidad de solutos en funcin del volumen de lquido extrado de la columna. 0 ,3

0 ,2

0 ,1 0 10 20 30 40 50 60 70 Cromatograma de filtracin en gel

Se pueden utilizar varios parmetros para caracterizar el comportamiento cromatogrfico de una sustancia: - Volumen de elucin (Ve). Se define como el volumen de lquido necesario para extraer una determinada sustancia. Presenta el inconveniente de depender fuertemente del volumen total de la columna. El volumen de elucin (Ve) de una sustancia vara entre Vt y Vo. - Coeficiente de distribucin (Kav). Es el parmetro ms correcto y tambin el ms ampliamente utilizado. El Kav de una sustancia se define como: Kav = VeVo/Vt-Vo El valor de Kav oscila entre 0 (cuando Ve=Vo) y 1 (cuando Ve=Vt), y representa la fraccin de volumen del interior de las esferas a la que accede cada sustancia en virtud de su tamao. Adems, el coeficiente de distribucin est relacionado con el logaritmo del peso molecular de un soluto, a partir de su Kav, cromatografiando por filtracin varios patrones de peso molecular conocido.

AQU LE AGREGAS LA PARTE EXPERIMENTAL

EN CONCLUSIN:
CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN Nombre: Exclusin Propiedad: Tamao (y forma)/ Para masas moleculares elevadas Relleno: partculas polimricas con una red de poros uniforme (10 m) en los que pueden difundir molculas del soluto y del disolvente. Tiempo de residencia: depende del tamao efectivo de las molculas. Molculas ms grandes no se retenidas y eluyen primero. Separacin: por tamao, no implica interacciones qumica o fsica con el relleno. Rellenos de slice: retienen por adsorcin y catalizan descomposiciones. Se modifican por sustituyentes orgnicos (sililacin). Rellenos de copolmeros: estireno-divinilbenceno: hidrofbicos. Soporte Resina de micropartculas esfricas formadas por polmeros hidroflicos (dextrano, agarosa poliacrilamida o mezcla de ellos). Tamaos de poro intrvalo o rango de fraccionamiento. P.e. Sephadex G25: Sephadex G200: 1000 5000 Da 5000 250000 Da

F. ESTACIONARIA (LQUIDA) solvente acuoso (el mismo que el de la fase mvil) que se encuentra dentro de micropartculas.

F. MVIL (LQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la columna por los espacios intersticiales (entre las micropartculas).

Molec. GRANDES RPIDAS * Avanzan con mayor velocidad a travs de los espacios intersticiales (con F. mvil)

Molec. PEQUEAS LENTAS * Son retenidas por las fibras de las micropartculas y avanzan con menos velocidad (con F. estacionaria).

TEORA: Vt = Vg + Vi + Vo Vt: volumen total de la columna Vg: volumen ocupado por matriz slida del gel Vi: volumen del disolvente retenido Vo: volumen libre exterior Volumen de elucin = Vo: analitos no retenidos Volumen de elucin = Vo + K Vi analitos de tamao intermedio (K entre 0 y 1). Lmite de exclusin: peso molecular por encima del que no existe retencin. Lmite de penetracin: peso molecular por debajo del cual las molculas pueden penetrar completamente en los poros.

APLICACIONES:

Filtracin sobre gel Disolventes acuosos y relleno hidroflicos Penetrabilidad sobre gel: disolventes orgnicos no polares y rellenos hidrofbicos. Separacin de productos naturales de alto peso molecular. Separacin de homlogos y oligmeros. Determinacin de la distribucin de pesos moleculares en polmeros o productos naturales (comparacin con patrones).

VENTAJAS

Tiempo de separacin cortos y bien definidos (entre Vo y Vo+Vi) Bandas estrechas No hay prdida de muestra No hay desactivacin de la columna

DESVENTAJAS

Nmero limitado de bandas No diferencia compuestos de tamao semejante (ismeros)

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, DECANA DE AMRICA)

FACULTAD DE QUIMICA E INGENIERIA QUIMICA E.A.P DE INGENIERIA QUIMICA

CURSO: ANLISIS INSTRUMENTAL

PROFESOR: HOLGER MALDONADO

TEMA: CROMATOGRAFA DE GEL DE FILTRACIN

INTEGRANTES: AMES ARCOS ARACELLI CAMARENA SULLCA JENNIFER MAGALLY PAYE DE LA CRUZ SAUL ORELLANA LIZARBE JIMMY ZAVALA LIZARASO WILLIAMS 0307 02070075 03070167 03070111 04070042

Ciudad Universitaria, Enero del 2008