Clase de Problemas Tamiz Molecular 2021

Cromatografía de filtración molecular
• Método cromatográfico que separa moléculas de acuerdo a

diferencias en sus dimensiones moleculares (radio de Stokes):
“tamizaje molecular”.
• También se llama de exclusión molecular, cromatografía de

exclusión por tamaño, de filtración en gel, o de tamiz molecular.
• El lecho cromatográfico para obtener la separación son partículas

porosas no cargadas (gel), que están empaquetadas dentro de un
tubo o columna. Ésta es la fase estacionaria.
• Las sustancias a ser separadas son transportadas a través del

lecho por un flujo de líquido: fase móvil.
• Compuestos con diferentes tamaños, son retenidos en diferentes
formas y migran a lo largo del lecho con diferentes velocidades.
• Cuanto menor es el tamaño de la sustancia más se retarda su
salida de la columna.
Visitar el enlace:
https://www.youtube.com/watch?v=aWtThd13I4I
• Las moléculas grandes están, por

razones estéricas, impedidas de penetrar
dentro de los granos del gel, y se
desplazarán o viajarán a la misma
velocidad que el líquido.
• Las moléculas más pequeñas podrán

penetrar dentro de los granos del gel y
saldrán con un retardo. Es decir las
moléculas serán eluidas del gel según sus
pesos moleculares decrecientes.
• Para la separación de proteínas y polisacáridos se usa como fase esta-
cionaria (F.E.) polímeros lineales entrecruzados (es decir, que forman enlaces
transversales).
• La F.E. está formada por pequeñas esferas que se expanden o “hinchan” al
sumergirlas en disoluciones acuosas, generando un retículo o matriz tridi-
mensional, con poros de tamaño definido. El tamaño de los poros depende
del grado de entrecruzamiento de los materiales.
• La propiedad característica de esta cromatografía que los granos que

forman la fase estacionaria constituye un gel no cargado.
• Ejemplos: Dextranos (marca comercial: Sephadex), Agarosa (Sepharosa y
Biogel A), Poliacrilamida (Biogel P).
Aplicaciones:
- Purificación de una proteína : como técnica cromatográficas.
- Determinación de masas moleculares:
Para proteínas globulares se puede establecer una correlación entre el
tamaño molecular y la movilidad en la columna de exclusión.
- Eliminar sustancias de pequeño tamaño molecular de una muestra

proteica: por ejemplo, las sales inorgánicas en un “desalado” de la
muestra, eliminación de inhibidores enzimáticos, etc.
Definiciones
•Lecho cromatográfíco: material empaquetado en la columna más el líquido intersticial.
•Eluyente: líquido que percola a través del lecho entre las partículas del gel.
Parámetros utilizados para la caracterización del lecho

Vt = Volumen total, es el volumen del lecho contenido en la columna. Vt = Vi + Vo + Vg
Vo = Volumen muerto; es el volumen del líquido en el espacio intersticial entre los granos del lecho.
Se determina empíricamente midiendo el volumen de elución de un soluto pequeño que se
excluye completamente de los poros de la matriz del gel.
Vi = Volumen interno; es el volumen ocupado por el solvente contenido dentro de las partículas de
gel. Se calcula conociendo el peso del gel (a) y el agua absorbida por hidratación (Vr). Vi = a x Vr
Vg = Volumen de la matriz, es el volumen del dextrano (en el caso de Sephadex) sin incluir al solvente
contenido dentro de las partículas.
Vx = Volumen de la fase gel, incluye el volumen de la matriz y del líquido que contiene. se obtiene
por diferencia entre Vt y Vo. Vx = Vi + Vg = Vt - Vo
Parámetros usados para caracterizar el comportamiento del soluto
• Volumen de elución (Ve): Es el volumen de eluyente que se requiere para
transportar las moléculas de la sustancia a través de la columna.
¿Cómo se determina el Ve?

(A) Para pequeños volúmenes de muestra aplicados (como para
ser despreciados en comparación con el volumen de elución), se
toma como Ve el volumen de líquido que ha pasado por la columna
entre la aplicación de la muestra y la posición del pico máximo en el
diagrama de elución, si la curva es simétrica.
(B) Para muestras de tamaño intermedio que no forman plateau
en sus curvas de elución, el Ve se medirá a partir del punto donde
se aplicó la mitad del volumen de muestra hasta el máximo de la
curva de elución.
(C) Si el volumen de muestra es tan grande que la curva de
elución alcanza un "plateau", el Ve es el volumen eluído desde
el comienzo de la aplicación de la muestra hasta el punto de
inflexión de la parte ascendente del pico de elución.
• Constante de retención R = (Ve/Vo), donde

Vo es el volumen de elución para una sustancia
que es completamente excluida del gel.
• Ve/Vt: donde Vt es el volumen total del lecho

cromatográfico.
La cromatografía en gel también puede considerarse como un caso especial de

cromatografía de partición. La teoría de la cromatografía provee una correlación
entre el comportamiento de una sustancia y su coeficiente de partición (K) entre
la fase móvil y la fase estacionaria. Así, es posible relacionar:
• Ve = Vo + K Vs
donde K es el coeficiente de partición entre las fases y Vs es el volumen de la fase
estacionaria.
Existen dos coeficientes de partición diferentes. La diferencia entre ambos

depende de la definición de la fase estacionaria.
• Si se considera fase estacionaria toda la fase gel (Vx), se obtiene el coeficiente

de partición:
Kav = Ve – Vo = Ve – Vo
Vx Vt – Vo
• Si se considera fase estacionaria sólo el líquido que embebe el gel (Vi),

resulta el siguiente coeficiente de partición:
Kd = Ve – Vo = Ve – Vo .
Vi Vt – Vo – Vg
Parámetros usados para la caracterización de los geles
• Vr = "agua embebida" es la medida más común de la capacidad de hincharse

del gel. Representa la cantidad de agua (en mL), embebida por 1 g de gel seco.
No incluye el líquido intersticial entre los granos.
• Finalmente el tamaño de la partícula de los granos es una variable
importante. Influye en el ancho de las bandas separadas, la resolución, la
dilución y la velocidad de flujo que pueden conseguirse
Curvas de elución de un azúcar:

a) en columnas de Sephadex G-25, igual flujo (45 mL/h) pero distinto tamaño de grano;
b) columnas de Sephadex G-25 de iguales poros, pero distintas velocidades de flujo.
Links de interés
Videos
Representación microscópica de fundamentos de la separación por exclusión molecular
https://www.youtube.com/watch?v=aWtThd13I4I
Preparación Sephadex y calibración de columna
https://www.youtube.com/watch?v=S89mAyh6yHU&t=6s
Manual de GE: tamices moleculares: principios y métodos
https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/AssetStream.aspx?mediaformatid=10061&destinationid=10016&assetid
=11639

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Cromatografía de filtración molecular

• Método cromatográfico que separa moléculas de acuerdo a

• También se llama de exclusión molecular, cromatografía de

• El lecho cromatográfico para obtener la separación son partículas

• Las sustancias a ser separadas son transportadas a través del

• Las moléculas grandes están, por

• Las moléculas más pequeñas podrán

• La propiedad característica de esta cromatografía que los granos que

- Eliminar sustancias de pequeño tamaño molecular de una muestra

Parámetros utilizados para la caracterización del lecho

¿Cómo se determina el Ve?

• Constante de retención R = (Ve/Vo), donde

• Ve/Vt: donde Vt es el volumen total del lecho

La cromatografía en gel también puede considerarse como un caso especial de

Existen dos coeficientes de partición diferentes. La diferencia entre ambos

• Si se considera fase estacionaria toda la fase gel (Vx), se obtiene el coeficiente

• Si se considera fase estacionaria sólo el líquido que embebe el gel (Vi),

• Vr = "agua embebida" es la medida más común de la capacidad de hincharse

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