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CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR (SEC)

Todos los métodos cromatográficos que tienen aplicación industrial pueden encuadrarse
en 4 categorías:

1. Cromatografía de exclusión molecular (SEC)

2. Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
3. Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
4. Cromatografía de afinidad (AC)

Si se toma en cuenta la interacción entre la muestra y la matriz cromatográfica, se los

puede clasificar en adsortivos y no adsortivos.
En los métodos adsortivos (IEC, HIC y AC) la muestra se une a la matriz y luego se
eluyen los distintos componentes por un cambio en la composición de la fase móvil. En
algunos casos no es necesario cambiar la composición de la fase móvil para eluir la
sustancia deseada, porque su interacción con la matriz cromatográfica es débil y la
sustancia sólo sufre un retardo al pasar por la columna.
La cromatografía de exclusión molecular es el único representante de los métodos no
adsortivos. En este tipo de cromatografía no hay una interacción real entre las moléculas
de la muestra y la matriz cromatográfica, y la separación se va efectuando a medida que la
muestra atraviesa la columna.

DIFERENCIAS ENTRE MÉTODOS ADSORTIVOS Y NO ADSORTIVOS

Volumen de separación: en los métodos no adsortivos toda la separación de los

componentes de la muestra se efectúa en un volumen menor al volumen total de la
columna, mientras que en los métodos adsortivos este volumen puede ser mucho mayor,
típicamente 3 a 10 volúmenes de columna.
Dilución/concentración de la muestra: otra diferencia importante entre los métodos
adsortivos y no adsortivos es que mientras que los no adsortivos diluyen la muestra, los
adsortivos generalmente la concentran.
Volumen de siembra: la cantidad de muestra en los no adsortivos siempre es menor que
el volumen de la columna. En los adsortivos puede ser mayor.
Elución: en los no adsortivos la elución no es modificable por la composición del buffer
de corrida, en los adsortivos sí.

CARACTERÍSTICAS DE LA SEC

Los factores (ventajas) que la hacen importante para la purificación de proteínas en gran
escala son:

1) Es el único método cromatográfico para el fraccionamiento de proteínas basado

únicamente en el tamaño molecular.
2) Las únicas limitaciones en cuanto a la concentración de soluto son su solubilidad y la
viscosidad de la solución.
3) Es muy suave y las recuperaciones son altas, justamente por no haber interacción con la
matriz cromatográfica.
4) La operación es isocrática, de manera que no hay problemas de reequilibración de la
matriz cromatográfica.

Desventajas de la SEC:
1) Bajas productividades por la escasa capacidad de las columnas.
2) Bajas eficiencias de columna: es el método cromatográfico con menor resolución.
3) Provoca dilución de la proteína.

MECANISMO (Ver animación en campus virtual)

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La forma de casi todas las partículas de una matriz cromatográfica tiende a la esfericidad,
y al empaquetarse en una columna las partículas dejan un espacio libre que va a ser
ocupado por solvente. Es el V0 o volumen muerto.
A su vez, dentro de las esferas de gel hay poros llenos de fase móvil. Cuando un soluto
llega a una partícula, si su tamaño es menor que el del poro, penetrará en él por difusión. Si
es mayor, eluirá sin penetrar en el poro. En general, cualquier soluto puede penetrar hasta
cierto punto en los poros de la matriz cromatográfica, de manera que hay una gradación
entre los distintos solutos en cuanto a su capacidad para entrar en los poros del gel, que
depende de su tamaño molecular.
Entonces al pasar a través de la columna los solutos de menor tamaño molecular van a ser
retardados porque pueden difundir totalmente dentro de los poros, mientras que los de
mayor tamaño fluyen sin penetrar en los poros y salen más rápido.

ESTRUCTURA QUÍMICA DE LAS MATRICES CROMATOGRÁFICAS

Hay muchos tipos de matrices que varían en su estructura química pero que comparten
ciertas propiedades: casi todas son preparadas por cross-linking (entrecruzamiento) entre un
polimero hidrofilico y un reactivo bifuncional que provoca el entrecruzamiento de las
moléculas del polímero.
Por este procedimiento se logra insolubilizarlo en agua y buffers acuosos, pero merced a
su carácter hidrofílico absorbe fácilmente agua y se hincha dando un gel que puede em-
pacarse en una columna cromatográfica.

CLASIFICACIÓN DE LAS MATRICES CROMATOGRÁFICAS

Las matrices cromatográficas pueden dividirse según:

- Polímero base
- Grado de entrecruzamiento
- Tamaño de las partículas

Las matrices cromatográficas pueden dividirse según cuál sea su polímero base en
derivadas del dextrano, de la agarosa, de la celulosa, mixtas, y de polímeros sintéticos.

POLÍMERO BASE
Ver diapo 3 los diferentes polímeros ofrecidos por algunas compañias.

GRADO DE ENTRECRUZAMIENTO

El grado de entrecruzamiento va a influir sobre:

-diámetro de poros
-resistencia mecánica
-absorción de agua

A mayor grado de entrecruzamiento, menor van a ser el diámetro de los poros y la

absorción de agua, y mayor va a ser la resistencia mecánica.

Este último factor, que a escala de laboratorio tiene poca o ninguna importancia, a escala
industrial es vital: si un gel se comprime por falta de resistencia mecánica, el flujo de
solvente disminuirá y la productividad también. Será necesario aplicar una determinada
presión a la columna para restablecer el flujo, pero puede llegarse al colapso del gel, con lo
que el flujo se interrumpe.
En términos generales, cuanto mayor sea la resistencia mecánica de un gel, mayor será
el flujo que se obtiene para una misma presión de trabajo.
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Existen Sephadex desde G10 hasta G200, pasando por G15, G25, G50, G100 y G150. Cuanto
menor es el número, mayor es el grado de entrecruzamiento.
Además, el número que sigue a la letra G da idea de la cantidad de agua que absorben los
distintos tipos de Sephadex: ese número dividido 10 da los ml de agua que absorbe 1 g de
ese tipo de Sephadex. Este valor se denomina agua de imbibición o en inglés water regain.

TAMAÑO DE PARTÍCULAS

De acuerdo al tamaño de partículas, las matrices cromatográficas se dividen en :

- Gruesas (coarse)
- Medias (medium)
- Finas (fine)
- Superfinas (superfine)
Cuanto más pequeñas sean las partículas, menor va a ser el flujo que se obtenga porque el
V0 es menor. Dicho de otra manera, a menor tamaño de partículas mayor será la presión
que hay que ejercer sobre la columna para obtener un determinado flujo.
Esto se puede ver en la Figura de la diapo 5 del Power Point.

Diferenciar correctamente el tamaño de una partícula cromatográfica del tamaño del

poro de esa partícula.

CARACTERIZACIÓN DE LAS MATRICES CROMATOGRÁFICAS: CURVAS DE

SELECTIVIDAD

La curva de selectividad de una matriz cromatográfica es el gráfico del volumen de

elución de distintos solutos en una columna empaquetada con ese tipo de gel, en función
del peso molecular de dichos solutos (logaritmo).

Todas las curvas de selectividad poseen una parte en que el Ve es función lineal del PM
(Rango de fraccionamiento). Fuera de esta zona, aunque varíe el PM de los solutos que se
cromatografían, el Ve será el mismo. O sea que por debajo de cierto PM (límite inferior del
rango de fraccionamiento) o por encima de otro valor de PM (límite superior del rango de
fraccionamiento), la matriz cromatográfica no los separa ya que todos salen con el mismo
Ve.
Precisamente el rango de fraccionamiento es el ámbito de PM dentro del cual se establece
una relación lineal entre Ve y log PM.
Todas las sustancias que tengan un PM superior al límite superior del rango de
fraccionamiento van a salir juntas, ya que no pueden entrar a ninguno de los poros del gel y
eluyen con un Ve igual al Vo.
Todas las sustancias que tengan un PM inferior al límite inferior del rango de
fraccionamiento van a salir juntas, porque penetran totalmente en todos los poros del gel y
eluyen con un Ve aproximadamente igual al volumen total de la columna.
En todos estos casos, se ha hablado de PM como una magnitud estrechamente ligada al
tamaño molecular.
Pero 2 moléculas del mismo tamaño molecular (o PM) pueden tener propiedades
cromatográficas muy distintas, dependiendo de su forma. Evidentemente, no va a ser igual
la accesibilidad a los poros de las moléculas esféricas que la de las moléculas alargadas.
Observando las tablas de rangos de fraccionamiento, se puede ver que para un determinado
tipo de matriz cromatográfica, el rango es distinto según se trate de moléculas
aproximadamente esféricas o de moléculas alargadas. Para las moléculas alargadas el rango
de fraccionamiento es más restringido, lo que significa que para el mismo PM las
moléculas esféricas tienen mayor facilidad para penetrar en los poros del gel que las
moléculas alargadas.
Cuando se trabaja en presencia de agentes desnaturalizantes (urea, guanidina, etc.), el
rango de fraccionamiento se restringe porque las moléculas pierden su forma esférica por
efecto del desnaturalizante.
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Esto significa que el Ve de una misma proteína en su estado nativo o desnaturalizada

es diferente en una SEC?

FORMAS DE EXPRESAR EL COMPORTAMIENTO CROMATOGRÁFICO DE UN

SOLUTO

El comportamiento de una proteína en SEC puede medirse por el Ve o por Kd que puede
variar entre 0 y 1. Es cero cuando Ve es igual a V0 y es 1 cuando Ve es igual a V0 +Vi
V0 (volumen muerto): es el volumen de líquido exterior a las partículas de la matriz
cromatográfica.
Vi (volumen de imbibición): es el volumen de solvente que está dentro de los poros de las
partículas de la matriz cromatográfica
Vm (volumen de matriz): es el volumen ocupado por la matriz cromatográfica en sí.
Vt (volumen total de una columna, volumen de lecho o "bed volume") es la suma de 3
componentes: V0, Vi y Vm.

Kd representa la fracción de la fase estacionaria a la que puede acceder por difusión una
determinada sustancia.

RESOLUCION DE LA SEC

La resolución es la capacidad de discriminar entre 2 sustancias.

La cromatografía de exclusión molecular es la menos resolutiva de las cromatografías.
En SEC la resolución aumenta con el largo de la columna, y disminuye con el tamaño de
partículas de la matriz, la viscosidad de la fase móvil, el flujo de la misma y el volumen de
muestra sembrado.
Por ser isocrática, la SEC puede realizarse automáticamente de manera que cuando
termina un ciclo de purificación inmediatamente comienza otro.

Qué significa que es isocrática?

APLICACIONES DE LA SEC

Hay 2 aplicaciones potenciales de la SEC a nivel industrial:

- Separación de grupos
- Fraccionamiento

SEPARACION DE GRUPOS
Hay 2 aplicaciones clásicas de este tipo de SEC:

- Desalificación
- Cambio de buffer

Las sales en general tienen peso molecular pequeño, muy distinto al de las proteínas,
polisacáridos o macromoléculas en general, por lo que la separación es muy fácil.
Se trabaja con una sustancia con Kd = 1 (sal) que sale con Ve = V0 + Vi, que debe ser
separada de otra con Kd = 0 (macromolécula) que sale con el V0.
Para este propósito se usan matrices cromatográficas con alto grado de
entrecruzamiento, que hace que tengan poros pequeños y alta resistencia mecánica.
Como van a separarse cosas de tamaño muy distinto, se usan 2 condiciones que atentan
contra la resolución en cuanto a largo de columna, flujo y volumen de muestra: flujos altos
(2-3 volúmenes de columna/hora), volúmenes de muestra grandes (hasta 30% del volumen
total de la columna) y columnas cortas.
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Se pueden usar flujos altos sin que la matriz se compacte porque se usan matrices de alta
resistencia mecánica.
El largo de columna normal para este tipo de cromatografía es de 60-90 cm.

SCALE-UP (escalado cromatográfico)

Para el scale-up debe optimizarse la separación a escala de laboratorio y luego se aumenta

el tamaño de la columna en función del volumen de muestra variando su diámetro y
manteniendo constantes la altura y el flujo lineal.

A escala de laboratorio se acostumbra a expresar el flujo de una columna como flujo

volumétrico (ml/min ó ml/h). Un flujo volumétrico de 15 ml/min, por ejemplo, puede ser
alto o bajo, dependiendo del diámetro de la columna.
A los fines comparativos y para poder proceder al scale-up, es necesario expresar el flujo
como flujo lineal, que en realidad es una velocidad (e/t) y que indica qué espacio recorrió
el frente del solvente en la unidad de tiempo (cm/min ó cm/h) y es independiente del
diámetro de la columna.

Ejemplo industrial: separación del etanol de la albúmina en el procedimiento de Cohn

(después de precipitar la albúmina del plasma con etanol en frío, es necesario eliminar el
etanol para seguir con la purificación de la albúmina).

Se usa Sephadex G25 coarse en una columna de acero inoxidable (Ver diapo 9)

Se optimizan las condiciones en laboratorio y se establece que para procesar un vol de

muestra de 0,3 litros se necesita una columna de 60 cm de largo x 5 cm de diámetro.
Luego se decide escalar el proceso para procesar 18,75 litros de muestra. Por lo tanto el vol
de columna debe ser proporcional.
Si para 0,3 L de muestra necesito una columna de 1,2 litros (escala lab) para 18,75 L de
muestra .....x: 75 litros (escala industrial)
Entonces se aumentó 4 veces el vol de muestra y lo mismo el vol de columna.
Para mantener la resolución se debe mantener constante la longitud de la columna (60 cm)
y dado que el vol de columna industrial es mayor debemos calcular el diámetro. Para
calcularlo usamos la fórmula del vol del cilindro (V : π . r 2. h). Conocemos la altura
(constante) y conocemos el volumen de la columna (75 L) por lo tanto calculamos el radio
y el diámetro.

Escala Laboratorio Escala Industrial

Diam 5 cm Diam 40 cm

Longitud de columna (cm) 60 60

Volumen total columna (l) 1,2 75
Volumen de muestra (l) 0,3 18,75
Flujo lineal (cm/h) 192 192
Flujo volumétrico (l/h) 3,8 240
Flujo volumétrico (Vt/h) 3,2 3,2

Luego tenemos otros 2 valores establecidos a escala lab y relacionados con el flujo. El
Flujo lineal tiene que mantenerse constante y es independiente de las dimensiones de la
columna por eso se mantiene en 192 cm/h. Sin embargo, el flujo volumétrico sí varía y es
mayor en el caso de la columna industrial (calculado como Litros por hora). Si ese mismo
flujo volumétrico se calcula como Volumen total de la columna por hora es el mismo en
los dos casos. Cálculo: 3,8/1,2: 3,2 y para la escala industrial lo mismo: 240/75: 3,2
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FRACCIONAMIENTO
Acá el problema es distinto que en la desalificación ya que hay que separar sustancias de
tamaños no tan distintos, dentro del rango de fraccionamiento de la matriz cromatográfica.
Las macromoléculas deben entrar parcialmente en los poros, por lo que deben usarse
matrices cromatográficas de poros más grandes que para la separación de grupos (poco
entrecruzadas, baja resistencia mecánica).
Este tipo de matrices en las columnas de pequeño diámetro que se usan a escala de
laboratorio se mantienen sin compactarse por efecto de adhesión a la pared, pero en la
escala industrial al aumentar el diámetro de la columna se pierde este efecto de pared y el
material que está en el centro puede comprimirse por presión hidrostática, haciéndose el
flujo menor en el centro e irregular, con la consiguiente pérdida de resolución.
Como debe discriminarse entre 2 ó más sustancias no tan distintas, los flujos a
utilizar son menores y el volumen de muestra sembrada también menor que en la
separación de grupos (no más del 10% del volumen total de la columna).
Para evitar el problema de la compresibilidad del gel, se usan columnas modulares en pilas
(stack). Los módulos son de 15 cm de alto y se unen por cañerías delgadas, con lo que se
llega a la altura deseada por suma de módulos sin que haya problemas con el gel. Si en un
stack la primera columna se tapa, se la puede reemplazar fácilmente (Ver Figura de la
diapo 12 del Power Point) .
La SEC en modo fraccionamiento es poco poderosa. En la industria sólo se usa al final de
un proceso de purificación como "polishing" para eliminar los agregados de una
preparación de una macromolécula.

Ejemplo industrial: Problema para resolver. Completar la tabla siguiendo el

procedimiento explicado anteriormente si se quiere utilizar con un volumen de muestra de
5 Litros.

Escala Laboratorio Escala Industrial

Diam 5 cm
Longitud de la columna (cm) 60
Volumen total de columna (l) 1,2
Volumen de muestra (l) 0,09
Flujo lineal (cm/h) 16,2
Flujo volumétrico (l/h) 0,32
Flujo volumétrico (Vt/h) 0,27