Tinción de Gram 1

Tinción de Gram
La tinción de Gram o coloración Gram es un tipo de
tinción diferencial empleado en microbiología para la
visualización de bacterias, sobre todo en muestras
clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés
Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se
utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular
bacteriana como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana,
considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias
que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa.

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio

Metodologia tras ser teñidas con la tinción de Gram.

• Recoger muestras.
• Hacer el extendido en espiral.
• Dejar secar a temperatura ambiente.
• Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al
calor (flameado 3 veces aprox.)
• Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de
genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram
positivas y gram negativas se tiñen de color
azul-purpura.
• Enjuagar con agua.
• Agregar lugol y esperar entre 30 segundos y 3
minutos.
Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).
• Enjuagar con agua.
• Agregar acetona y/o alcohol y esperar entre 15 y 20s.
• Enjuagar con agua.
• Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color
rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
• Enjuagar con agua.
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.

Explicación
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram
negativas). El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para
solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el
complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo
hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un
colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram
negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
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La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de
manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las
Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción,
la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar
durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de
yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste
no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada
diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se
modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se
califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gramnegativos.
Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los
colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados
de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre
atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por
consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más
ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se
refieren al número de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta
de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de
Gram.
La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita
casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la
primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el
colorante. La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio,
y quizá por otras causas.

Teorías
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño
de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o
el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:
El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la
acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con
mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gramnegativas, los lípidos de la pared
(más abundantes que en las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del
complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general
de la pared celular.
Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. Stearn (1923) basó la suya en una
combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, Las proteínas y aminoácidos son cuerpos
anfóteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en
soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera,
comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos
microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y
con los básicos en medio alcalino. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto
isoeléctrico”. Como los microorganismos contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y
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definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según Stern y
Stearn, los microorganismos grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos
gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:
• . Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
• . Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.
• . Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la
alcalinidad.
• . Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar
la acidez.
• . En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.
• . Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino más bien una débil
combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.
• . La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos
gramnegativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren
gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram
son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la
afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.
• . El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos
débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya
reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.
Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban
negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia
grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reacción. Otra explicación de la reacción de Gram puede ser
la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo. Libenson y Mcllroy, han
comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los
componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular, sería de esperar que las bacterias
desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico
de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de
retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.
La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. Sin
embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. Los
resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad del
complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva
consiste esencialmente en la formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y
colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos grampositivos, a diferencia
de la de los gramnegativos, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán
teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared
celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.
Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de
Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa
solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo
constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.
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Técnica de la coloración gram

Fijar un frotis
• Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco.
• Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra.
• Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina
portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.
• Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en
el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al
terminar la extensión, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lámina.
• Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta
que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la
morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas
demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

Tinción
Con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra,
como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada
para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C. k

Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el
lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer
sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado,
aproximadamente de medio a un centímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina en
posición inclinada hacia abajo...

Mordiente
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto más. El mordiente es
cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias.

Decoloración
Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o
alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se
van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir,
hasta que ya no escurra más líquido azul.
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Lavado y secado
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la
llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

Tinción de contraste
Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de
contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.

Nuevo enjuague
Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en
la forma anteriormente descrita.
De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica.

Bacterias resistentes a la tinción Gram

La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tiñen como gramnegativas:
• Mycobacterias (están encapsuladas).
• Mycoplasmas (no tienen pared).
• Formas L (pérdida ocasional de la pared).
• Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared, respectivamente).

Utilidades
En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
• Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.
• Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción
de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor
número de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la
atmósfera de incubación.
A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica.
Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar
cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en
empalizada.
También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son
blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibriones.

Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas
y Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de
ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el
ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también
conocido como mureína)
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Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda
membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa
delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de
proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared.
La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram
positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram
negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de
peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el
contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos,
no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que
impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

Causas que alteran la tinción de Gram

• I: Edad de la bacteria.
• II: Errores del operador.
• III: Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción
puede variar según la edad de las células y la técnica empleada, por ella junto a la muestra deben teñirse controles
con grampositivas y gramnegativas.

Fuentes

Bibliografía
• Aulton Michael E., Ciencia y diseño de formas farmacéuticas, 2° edición, Ed. Elsevier España, 2004.
• Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-683-00603-7.
• Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams &
Wilkins. ISBN 0-13-066271-2.
• Søgaard M, Nørgaard M, Schønheyder H (2007). "First notification of positive blood cultures: high accuracy of
the Gram stain report (Epub ahead of publication)". J Clin Microbiol 45: 1113.
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Fuentes y contribuyentes del artículo

Tinción de Gram  Fuente: http://es.wikipedia.org/w/index.php?oldid=40366669  Contribuyentes: Aleator, Alhen, Angel GN, Ascánder, BlueMonday, CaStarCo, Camilo, Dami, Deft.mon, Diego
5397, Diegusjaimes, EKhan, Eduardozazueta, Eloy, Eric, Erodrigufer, Fernando Estel, Fran4004, Gurgut, HUB, Huhsunqu, Humberto, Javicaci, Javierito92, Karina Téllez, Kojie, Maldoror,
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