PRÁCTICA 4 Métodos de Preservación y Concentración

GESTIÓN DE LABORATORIOS
Facultad de Medicina Código:

DOCENTES
Carrera de Bioquímica Manual de prácticas de laboratorio
Versión: 1.0
Clinica de Parasitología Clínica
Plan: B011 Cód. asignatura: 15665 Página 1 de 15
PRÁCTICA 4:
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN Y PROCEDIMIENTOS DE CONCENTRACIÓN
1. Objetivo
- Indicar los procedimientos de concentración y los métodos de preservación para la muestra fecal.
2. Resultados de aprendizaje esperados
- Realizar las técnicas de concentración y los métodos de preservación siguiendo los referentes
teóricos.
- Revisar y anotar las diferencias de cada uno de los procedimientos realizados.
3. Fundamento teórico
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN:
Los especímenes fecales que no pueden procesarse y examinarse en el tiempo recomendado deben
colocarse en un preservante o una combinación de preservantes apropiados para su examen posterior. Los
preservantes evitarán el deterioro de los parásitos presentes. Existen varios fijadores para preservar
protozoos y helmintos (Cuadro 1). Cada uno tiene limitaciones específicas, y ninguna solución única permite
que todas las técnicas se realicen con resultados óptimos. La elección del preservante debe dar al
laboratorio la capacidad para realizar una técnica de concentración y preparar un frotis.
- Se recomienda el uso de más de una solución preservante, para conservar todas las formas
diagnósticas, tomando en cuenta el uso que se le quiera dar a cada preservado. Por ejemplo, fijadores
como MIF y PAF sirven para preservar los cuatro estadios diagnósticos pero no sirve para realizar
tinciones permanentes, únicamente se pueden emplear en tinciones temporales y montajes húmedos.
- Los preservantes usados con más frecuencia son la formalina al 10% y el PVA. En vista de que tienen
ventajas complementarias, es recomendable que la muestra sea dividida y preservada en ambos.
- Asegurarse de que la muestra se mezcle bien con el preservante (las heces formadas necesitan ser
bien desarmadas)
- Revisar que el recipiente esté bien sellado, reforzar con parafilm u otro material y guardar el recipiente
en una funda plástica.
- Las muestras preservadas pueden ser almacenadas por varios meses.
Cuadro 1. Preservantes para heces fecales

PRESERVANTE USO PROCEDIMIENTO
Formalina al 5 o 10% Preserva huevos, larvas y 3 volúmenes formalina
(bufferada) quistes 1 volumen heces
PVA 2 volúmenes PVA
Preserva trofozoitos y quistes
(Alcohol polivinílico) 1 volumen heces
MIF Preserva trofozoitos, quistes, 3 volúmenes MIF
(mertiolate-yodo-formaldehído) huevos y larvas 1 volumen heces
PAF Preserva trofozoitos, quistes, 3 volúmenes PAF
(fenol-alcohol-formaldehído) huevos y larvas 1 volumen heces
SAF
Preserva trofozoitos, quistes, 3 volúmenes SAF
(acetato de sodio-ácido acético-
huevos y larvas 1 volumen heces
formaldehído)
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PROCEDIMIENTOS DE CONCENTRACIÓN
La concentración fecal se ha convertido en un procedimiento rutinario que permite la detección de un
pequeño número de parásitos que se pueden perder usando sólo un examen directo. Existen dos tipos de
procedimientos de concentración: flotación y sedimentación, ambos diseñados para separar los
protozoarios, huevos de helmintos y larvas de los desechos fecales por centrifugación y diferencias en
gravedad específica. (Cuadro 2)
Cuadro 2. Métodos de concentración de parásitos en heces fecales
Métodos de
concentracón
Fotación -
Flotación Sedimentación
Centrifugación
NaCl Saturado Formalina-

Simple Centrifugación
(Willis) Sulfato de Zinc
Sulfato de Zinc
Solución Solución
al 33% (p.e.
Salina Salina
1.180)
Agua A-E
F-E
MIF
PAF
4. Actividades prácticas
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN:
1. FORMALINA:
- Es un preservante satisfactorio para recolectar muestras que van a ser examinadas en busca de
huevos, larvas y quistes. Simple de preparar, no requiere mucho tiempo y es estable.
- Se recomienda al 5% para protozoarios y al 10% para helmintos. Para uso de rutina es preferible
la formalina al 5% (huevos de Ascaris y tricocéfalo pueden continuar desarrollándose en solución
al 5% pero no interfiere en la identificación de la especie).
- La formalina neutra es más satisfactoria para preservar quistes que la formalina simple, sobre
todo para preservaciones a largo tiempo.
- Las muestras preservadas en formalina pueden ser observadas directamente, ser sometidas a
procedimientos de concentración, a tinción cromotropa o pruebas de inmunoensayo
1.1. Preparación:
Formalina (para un litro) Al 10% Al 5%

Formaldehido comercial (37-40%) 100 mL 50 mL
Agua destilada 900 mL 950 mL
Mezclar bien y guardar en frasco oscuro
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Formalina bufferada (pH neutro)

Sales de fosfato (para 8 litros)
Na2HPO4 6,10 g
NaH2PO4 0,15 g
Pesar las dos sales y almacenar en un frasco bien cerrado,
protegido de la humedad. Preparar un litro de formalina al 10% o
al 5% y añadir 0,8 gramos de las sales de fosfatos. Mezclar y
almacenar en frasco oscuro.
1.2. Procedimiento:
A. Para diagnóstico de rutina:
 Una porción de heces fecales
 Tres volúmenes de formalina
 Mezclar bien y guardar en un frasco tapado
 Seleccionar la porción más formada de la muestra ya que se preservan mejor quites, huevos
y larvas.
B. Para referencia:
 Mezclar una porción de heces con solución salina
 Filtrar a través de una gasa
 Recoger en un tubo cónico para centrífuga
 Dejar el filtrado en reposo por una hora a temperatura ambiente
 Desechar el sobrenadante cuidadosamente
 Preservar el sedimento en 2 a 3 volúmenes de formalina neutra al 10% o al 5%
1.3. Observaciones:
- Para quistes de protozoarios, larvas de helmintos y ciertos huevos como Himenolepis diminuta e
H. nana es mejor emplear formalina neutra al 5%. Para los otros organismos usar la formalina
neutra al 10%.
- Si el material es almacenado para estudio futuro, se debe observar frecuentemente el nivel de
formalina en el frasco, ya que se evapora. Es mejor cambiar el preservante cada 6 meses, la
adición de formalina fresca retarda la degeneración de los organismos.
2. SOLUCION MERTIOLATE–YODO–FORMALDEHIDO (MIF):

- Puede utilizarse para preservar quistes y trofozoitos de protozoarios y para huevos y larvas de
helmintos.
2.1. Preparación de la solución:
Solución MF stock (estable)

Agua destilada 50 mL
Formaldehído comercial 5 mL
Tintura de mertiolate 40 mL
Glicerina 1mL
Mezclar la solución y almacenar en botella ámbar.
Solución yodo lugol (preparar cada tres semanas)

Cristales yodo 5g
Yoduro de potasio 10 g
Disolver el yoduro de potasio en el agua destilada. Añadir los cristales de yodo lentamente y agitar
hasta su disolución. Almacenar en frasco ámbar.
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Solución de trabajo (MIF)

Solución MF stock 2,35 mL
Solución yodo-lugol 0,15 mL
Preparar inmediatamente antes de su uso, la preparación con mucho tiempo de antelación causa
un denso precipitado de la solución de lugol y el colorante falla en su reacción tintorial con los
protozoarios.
2.2. Procedimiento:
- Mezclar una parte de heces fecales (del tamaño de un fréjol) en los 2,5 mL de solución de trabajo
y almacenar en un frasco bien tapado.
- Usar volúmenes mayores de solución de trabajo si va a utilizar mayor cantidad de muestra.
- Para examinar, tomar una gota de la capa superior del sedimento y colocar en un portaobjetos.
- La preparación debe tener la misma densidad que cuando se realiza un montaje directo.
2.3. Reacciones de tinción:

Tanto para montaje húmedo como para el preservado:
- Fase yodada: los quistes y trofozoítos se tiñen de amarillo verdoso o café amarillento, el núcleo se
tiñe de café oscuro.
- Fase de eosina: reemplaza la fase de yodo y es permanente. El núcleo se tiñe de rojo oscuro o
negro; el citoplasma toma color rosa o rojo.
- Los elementos nucleares de todas las especies de protozoarios, excepto Dientamoeba fragilis son
bastante bien definidos.
- El glucógeno aparece como un área café oscuro en la fase de yodo y no toma color en la fase de
eosina. Los cuerpos cromatoides tienen su apariencia característica.
- Los flagelos pueden ser observados en los trofozoitos flagelados.
- Los huevos de helmintos se tiñen y retienen sus características normales.
- Restos fecales, sangre o células epiteliales se tiñen de café oscuro.
- No hay distorsión de los parásitos, pero para un buen contraste se recomienda usar un filtro azul
en el sistema de iluminación.
3. SOLUCION FENOL–ALCOHOL–FORMALDEHIDO (PAF):

Puede sustituir a la formalina en la preservación de muestras. Sirve para protozoarios incluyendo
trofozoítos, también para huevos y larvas de helmintos. El núcleo es más claro que con formalina. El
material fijado con PAF puede ser examinado como montaje no teñido o teñido con tionina o azure A.
Fijador PAF:
Cristales de fenol 20 g
Solución salina 0,85% 825 mL
Disuelver los cristales en Solución salina y añadir:
Alcohol etílico al 95% 125 mL
Formaldehído 50 mL
Mezclar bien. Si se dispone de fenol líquido, utilizar 23 mL de éste en lugar de 20 g de cristales.
Colorante tionina:
Polvo tionina 10 mg
Disolver el polvo en el agua.
Colorante Azure A o Azure metileno A

Azure A polvo 10 mg
Disolver el polvo en el agua.
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3.2. Procedimiento:
A. Preservación:
Mezclar una porción de heces fecales con tres partes de solución fijadora PAF. Las heces
deben ser emulsionadas en la solución tanto como sea posible.
B. Examen microscópico:
- Dejar en reposo el frasco que contiene el preservado PAF hasta que aparezca sedimento,
luego descartar la mitad del sobrenadante.
- Mezclar el sedimento.
- Colocar con una pipeta, una gota de la suspensión sobre un portaobjetos.
- Añadir una gota de colorante, preferiblemente tionina y mezclar.
- Colocar un cubreobjetos y sellar los bordes con una mezcla de parafina-vaselina 1:1.
C. Reacciones de tinción
- En este fijador, los trofozoítos de amebas tienden a fijarse con los pseudópodos extendidos.
- El citoplasma de quistes y trofozoítos se tiñe de azul claro con núcleos y cuerpos cromatoides
ligeramente azul oscuros.
- Los gránulos individuales de la cromatina periférica de los núcleos son a menudo visibles.
- Los huevos se tiñen con una coloración lo suficientemente ligera para no oscurecer las
características morfológicas.
4. SOLUCION DE ACETATO DE SODIO, ACIDO ACETICO, FORMALINA (SAF)

La solución de SAF sirve para la fijación de parásitos intestinales y permite la realización de
procedimientos de tinción así como los de concentración.
Tiene las siguientes ventajas:

- Se pueden obtener tinciones permanentes excelentes desde muestras preservadas con SAF.
- Los trofozoitos son preservados por algunos meses, dando la oportunidad de preparar,
posteriormente, placas para enseñanza.
- Muestras preservadas en SAF pueden ser concentradas por el método de formalina-éter.
- El fijador no es costoso y tiene un tiempo de vida prácticamente ilimitado.
Solución SAF
Formalina al 10% 48 mL
Ácido acético glacial 6 mL
Acetato de sodio 9g
Mezclar y almacenar bien tapado
4.2. Procedimiento:
- Mezclar 3 porciones de fijador SAF con una de heces fecales frescas.
- Almacenar en frascos bien tapados.
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PROCEDIMIENTOS DE CONCENTRACIÓN
5. TÉCNICAS DE FLOTACIÓN:
Utilizan soluciones que tienen mayor peso específico que los organismos a ser flotados para que los
organismos lleguen a la parte superior. La principal ventaja de esta técnica es producir un material más
limpio que la técnica de sedimentación. Las desventajas de la mayoría de las técnicas de flotación son que
las paredes de los huevos y quistes a menudo colapsar, lo que dificulta la identificación. Además, algunos
huevos de parásitos no flotan.
Gráfico 1. Flotación
Las características de los métodos de flotación son las siguientes:

- Se basan en la diferencia de peso específico de los parásitos y el medio de suspensión empleado.
- Las más usadas son las de Sulfato de Zinc, la de Willis y la de azúcar de Sheather.
- Usan soluciones con gravedad específica elevada de tal forma que los organismos flotan en la capa
superior y los restos precipitan hacia el fondo. Por ejemplo: huevos de helmintos y quistes de
protozoarios con peso específico entre 1.005 y 1.015, flotarán.
- Su principal ventaja es que proporcionan un material más limpio para la observación que las técnicas
de sedimentación.
- Las desventajas de la mayoría de técnicas de flotación radican en que las paredes de los huevos y
quistes a menudo colapsan, complicando su identificación y que algunos huevos no flotan.
5.1. Flotación con solución saturada de cloruro de sodio (Willis)

A. Materiales:
- Frasco de 20 mL (5 cm de alto)
- aplicadores
- portaobjetos y cubreobjetos
- solución saturada de sal común o de mesa.
B. Preparación de la solución:
- Añadir sal de mesa a 500 mL de agua corriente hirviendo.
- Mezclar hasta saturar la solución
- Dejar enfriar y chequear con un hidrómetro que el peso específico sea al menos 1.20.
- Filtrar la solución antes del uso.
C. Procedimiento:
- Llenar ¼ del frasco con solución saturada de sal, añadir de 4 a 5 g de heces fecales y mezclar
bien.
- Agregar solución salina saturada hasta el borde del frasco.
- Colocar un portaobjetos o cubreobjetos sobre la boca del frasco. Evitar la formación de burbujas
- Dejar en reposo de 10 minutos a 1 hora, lo óptimo son 15 minutos.
- Para preparar el montaje, levantar el portaobjetos (la gota suspendida contiene el material a
examinar), invertir y colocar un cubreobjetos o examinar directamente. Si trabaja con
cubreobjetos colocar este sobre un portaobjetos.
- Examine inmediatamente al microscopio.
D. Utilidad:
- Concentración de huevos de Nematodos y Taenias.
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E. Desventaja:
- No sirve para huevos operculados, esquistosomas ni larvas.
5.2. Flotación con Sulfato de Zinc:
A. Materiales:
- tubos de ensayo 100 x 13 mm
- aplicadores
- centrífuga
- tubos cónicos de 15 mL
- asa bacteriológica
- portaobjetos, cubreobjetos
- sulfato de zinc 33% (p.e. 1.18 para muestras frescas, 1.20 para preservadas)
- solución salina (0.85%)
- yodo-lugol
B. Preparación de la solución:
- Añadir 331 g de Sulfato de Zinc a un litro de agua destilada tibia.
- Mezclar y filtrar.
- Chequear el peso específico: 1.180 o 1.200 y corregir en caso necesario.
C. Procedimiento:
- Preparar la suspensión mezclando de 4-5 g, aproximadamente, de heces fecales con 10 mL
de agua corriente o solución salina, en un tubo cónico.
- Mezclar hasta conseguir una suspensión homogénea.
- Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto.
- Descartar el sobrenadante y obtener 1 ó 1,5 mL de sedimento.
- Añadir solución de Sulfato de Zinc al sedimento, aproximadamente hasta la mitad del tubo y
mezclar bien.
- Luego agregar más solución de Sulfato de Zinc, hasta un medio cm del borde del tubo.
- Centrifugar a 2500 rpm por 3 minutos.
- Retirar el tubo de la centrífuga sin sacudir y dejar en reposo por 1 minuto.
- Recoger el material de la película superficial con una asa bacteriológica.
- Colocar una gota a cada lado de un portaobjetos y a una de ellas añadir una gota de solución
de yodo-lugol.
- Colocar el cubreobjetos y examinar al microscopio
D. Utilidad:
Concentración de huevos de helmintos comunes (Himenolepis nana, Taenia), larvas de
Strongyloides, quistes de protozoarios (Giardia lamblia).
E. Desventaja:
No sirve para huevos operculados y esquistosomas.
6. TÉCNICAS DE SEDIMENTACIÓN:
Utilizan las soluciones de gravedad específica más baja que los organismos parásitos, concentrando así
este último en el sedimento. Se recomiendan técnicas de sedimentación para los laboratorios de
diagnóstico generales porque son más fáciles de realizar y menos propenso a errores técnicos. La técnica
de sedimentación utilizada es la de formalina-acetato de etilo, una técnica de sedimentación bifásica, y
que puede ser utilizado con muestras conservadas en formol, MIF o SAF.
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Gráfico 2. Sedimentación
6.1. Sedimentación simple (por gravedad):

- Básicamente es un proceso de lavado en el cual la concentración no es muy marcada y la preparación
contiene muchos restos fecales.
- No es una técnica de rutina pues la concentración es mínima, algunas veces es menos efectiva que
otros métodos.
- Es una técnica simple para descubrir todos los huevos, larvas y quistes, pero que lleva mucho tiempo.
- Utiliza gran cantidad de heces fecales (el uso de gran cantidad de muestra fecal es de ayuda cuando
están presentes pocos huevos).
- Se puede utilizar agua corriente o solución salina al 0.85% para hacer la suspensión de heces.
A. Materiales:
- matraz de 250 mL
- probeta de 250 mL
- aplicadores
- embudo
- gasa
- Pipeta Pasteur
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Agua corriente
- Solución salina al 0.85%
- Yodo-lugol
B. Procedimiento:
- Colocar aproximadamente 5 g de heces fecales (el tamaño de una canica) en un matraz de
250 mL.
- Llenar una cuarta parte con agua corriente y mezclar vigorosamente con 2 aplicadores.
- Añadir agua hasta llenar las 3/4 partes del matraz.
- Filtrar esta suspensión a través de un embudo con 2 capas de gasa húmeda a un probeta
graduada de 250 mL.
- Dejar reposar la suspensión por 1 hora.
- Retirar cuidadosamente las 2/3 partes del sobrenadante teniendo cuidado de no dejar escapar
el sedimento.
- Añadir nuevamente agua corriente hasta el borde de la probeta de tal forma que el sedimento
quede resuspendido uniformemente y dejar reposar otra hora.
- Retirar con cuidado el sobrenadante sin topar el sedimento.
- Introducir una pipeta Pasteur en la capa superior del sedimento, tomar una gota y colocarla en
un portaobjetos con el respectivo cubreobjetos.
- Si la preparación es muy gruesa, diluirla con una gota de solución salina.
- Si se sospecha de la presencia de quistes realizar una preparación con Yodo-lugol.
- Tomar muestras adicionales de la capa media y del fondo del sedimento y realizar montajes
en fresco.
C. Utilidad:
Concentración de huevos de esquistosomas y operculados; incluyendo huevos inmaduros y
degenerados de esquistosomas.
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6.2. Sedimentación por centrifugación:
- Con estos procedimientos se acorta el tiempo y los resultados son mejores que con el método anterior.
- Son técnicas rápidas que no requieren reactivos costos.
- Utilizan una cantidad representativa de heces.
- La presencia de restos fecales puede causar confusión.
6.2.1. Técnica de solución salina:
- Moderadamente efectiva para huevos, larvas, quistes.

- No es muy marcada la concentración.
A. Materiales:
- tubo de ensayo de 15 mL
- aplicadores
- embudo
- gasa
- tubo de centrífuga de15 mL
- solución salina al 0.85%
- pipeta Pasteur
- portaobjetos
- cubreobjetos
- solución salina al 0.85%
B. Procedimiento:
- Colocar aproximadamente 5 g de heces en un tubo de ensayo de 15 mL.
- Llenar hasta la mitad del tubo con solución salina al 0.85% y mezclar vigorosamente con 2
aplicadores hasta obtener una suspensión fecal homogénea.
- Filtrar la suspensión a través de un embudo con 2 capas de gasa húmedas a un tubo cónico
de 15 mL.
- Retire el sobrenadante con cuidado sin remover el sedimento.
- Tomar una gota de la capa superior del sedimento con una pipeta Pasteur, colocarla en un
portaobjetos y poner el cubreobjetos.
- Si la preparación es muy gruesa, diluirla con una gota de solución salina.
- Si se sospecha de la presencia de quistes realizar una preparación con Yodo-lugol.
C. Utilidad:
- Recomendada para huevos de Schistosoma japonicum y mansoni.
6.2.2. Técnica de ácido–éter:
- El ácido clorhídrico utilizado disuelve el material albuminoide, caseína, mucina, jabón, fosfatos y sales
cálcicas.
- El éter disuelve las grasas neutras y ácidos grasos libres; esto más la agitación mecánica favorece la
liberación de los huevos de los restos en los cuales se hallan atrapados.
- El grado técnico es satisfactorio.
A. Materiales:
- Tubos de ensayo
- aplicadores
- embudo y gasa
- tubos cónicos graduados, tapones
- centrífuga
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- pipeta Pasteur
- HCl al 15%
- éter
B. Procedimiento:
- Preparar la suspensión mezclando 5 g de heces fecales con 5 a 10 mL de HCl al 15%.
- Filtrar a través de dos capas de gasa previamente humedecida para obtener unos 5 mL de
filtrado.
- Añadir igual cantidad de éter. Tapar y agitar vigorosamente por 1 minuto.
- Centrifugar a 2000 rpm por 1 min.
- En el tubo centrifugado se observa, desde la parte superior:
a. capa de éter
b. tapón de restos
c. capa de HCl
d. sedimento (parásitos)
- Remover el tapón de restos con un aplicador de madera y descartar las tres primeras capas.
- Mezclar el sedimento y con una pipeta capilar trasladar una gota a un portaobjetos.
- Colocar un cubreobjetos y examinar al microscopio.
C. Utilidad:
Huevos de helmintos comunes, particularmente útil para huevos de esquistosomas.
D. Desventaja:
No es satisfactorio para quistes de protozoario; mata a los embriones cuando se hallan en los
huevos.
6.2.3. Técnica formalina-eter (acetato de etilo)
- Es la técnica más utilizada en la rutina.

- Permite utilizar muestras fecales frescas o preservadas.
- Se puede guardar el sedimento para examinación posterior sin afectar los resultados.
- Se recomienda reemplazar éter (tóxico) por acetato de etilo.
- El éter o acetato de etilo disuelve ácidos grasos libres y grasas neutras.
A. Materiales:
- aplicadores, palillos, hisopos
- vaso de precipitación
- tubos cónicos graduados de 15 mL
- tapones
- embudo
- gasa
- centrífuga
- solución salina(0.85%)
- formalina al 10%
- éter o acetato de etilo
B. Procedimiento para muestras frescas:
- Preparar 10 mL de suspensión fecal mezclando de 4-5 g de heces fecales con solución
salina al 0.85% hasta conseguir una suspensión homogénea.
- “En la preparación de la suspensión se puede utilizar agua en lugar de solución salina, sin
embargo Blastocystis hominis puede deformase o destruirse”.
- Filtrar la suspensión fecal a través de dos capas de gasa previamente humedecida y añadir
solución salina a través de los restos sobre la gasa hasta obtener un volumen de 12 mL
en el tubo cónico graduado.
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- Decantar el sobrenadante, se debe obtener de 1 a 1.5 mL de sedimento.
- Si la cantidad de sedimento es excesiva resuspender el sedimento con solución salina y
desechar parte de esta suspensión; añadir salina hasta la marca 10 y centrifugar.
- Si la cantidad de sedimento es escasa, desechar el sobrenadante y añadir otra cantidad
de suspensión a partir de la muestra original y centrifugar.
- Añadir al sedimento 9 mL de formalina al 10%, mezclar vigorosamente con un aplicador
de madera y dejar en reposo por 5 minutos.
- Añadir 3 mL de éter o 4 mL de acetato de etilo.
- Tapar el tubo y agitar vigorosamente por inversión durante 30 segundos.
- Retirar el tapón con cuidado para evitar que explote y se derrame la muestra.
- Luego de centrifugación se obtiene 4 capas, desde la parte superior:
a) capa de acetato de etilo
b) tapón de restos
c) capa de formalina
d) sedimento (parásitos)
Foto 1 Centrifugado con formalina-acetato de etilo
- Desprender la capa de restos de la parte superior del tubo, circulando con un aplicador
alrededor del tapón de restos.
- Decantar las capas superiores del sobrenadante.
- Limpiar los restos fecales de la pared del tubo con un hisopo.
- Añadir algunas gotas de formalina al 10% para resuspender la muestra.
- “En este paso la preparación puede guardarse por largo tiempo”.
- Depositar con una pipeta dos gotas de sedimento sobre un portaobjetos (una de ellas para
tinción con yodo-lugol).
- Mezclar cada preparación con un palillo y colocar cubreobjetos.
- Examinar al microscopio.
C. Procedimiento para muestras preservadas en formalina:
- Mezclar la muestra preservada en formalina.
- Filtrar a un tubo cónico aproximadamente 5 mL a través de una gasa húmeda.
- Añadir solución salina hasta obtener 10 mL de suspensión, mezclar y centrifugar a 2000
rpm por 2 minutos
- Decantar el sobrenadante y ajustar a 1 mL de sedimento.
- Proseguir con los mismos pasos que en el procedimiento anterior para muestras frescas.
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D. Utilidad:
- La formalina al 10% preserva mejor los quistes de protozoarios (núcleos y cuerpos
cromatoides fácilmente identificables) y causa menor distorsión de quistes pequeños como
Endolimax nana.
- Concentra huevos y larvas de helmintos comunes, quistes de protozoarios, huevos
operculados y esquistosomas.
- Causa menor distorsión de los detalles estructurales.
E. Desventaja:
- No es muy efectivo para quistes de Giardia lamblia y Iodameba butschlii tampoco para
huevos de Himenolepis nana.
F. Detalles importantes:
- Es preferible usar acetato de etilo en lugar de éter (inflamable y tóxico) porque es un
solvente más seguro para el laboratorio.
- El uso de acetato de etilo aumenta la obtención de huevos de Himenolepis nana y quiste
de Giardia lamblia.
6.2.4. Técnica MIF-éter:
- Se procede de la misma manera que para Formalina-Eter.

- La ventaja es que el alcohol y la acetona en la tintura de mertiolate reducen el peso específico
de la solución y aumenta la concentración de huevos de helmintos.
- Se pueden utilizar muestras frescas o preservadas en MIF.
A. Procedimiento para heces fecales preservadas en MIF:
- Mezclar la suspensión fecal MIF y trasvasar a un tubo de centrifuga de 15 mL.
- Si la cantidad de espécimen es insuficiente, añadir preservante MIF fresco hasta la marca
10 mL.
- Añadir 3 mL de éter, tapar el tubo y sacudir vigorosamente por 1 minuto.
- Retirar el tapón con cuidado.
- Centrifugar a 2000 rpm por 1 minuto. Deben formarse cuatro capas:
a) Acetato de etilo
b) restos
c) solución MIF
d) sedimento
Foto 2 Centrifugado con MIF-Acetato de etilo

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Versión: 1.0
- Con el tubo en posición horizontal, remover el tapón con la ayuda de un aplicador y

desechar las tres primeras capas.
- Limpiar las paredes con un hisopo de algodón.
- Con una pipeta Pasteur, remover la porción superior del sedimento.
- Colocar en un portaobjetos, poner cubreobjetos y examinar.
B. Utilidad:
- Además de quistes, huevos y larvas, con ésta técnica se pueden observar ocasionalmente
formas vegetativas de amebas y flagelados intestinales.
6.2.5. Concentración de materia fecal fijado con PAF (fenol alcohol formaldehído):
- Está técnica es adecuada para observar todas las fases de los parásitos, inclusive trofozoitos.
A. Procedimiento:
- En un tubo de ensayo colocar con la ayuda de un aplicador una parte de heces fecales,
con tres partes de solución fijador PAF. Mezclar bien.
- Filtrar de 10 a 12 mL de la suspensión a través de una gasa húmeda y recoger el filtrado
en un tubo cónico de centrífuga
- Añadir solución salina 0.85% para ajustar el volumen de líquido a 12 mL.
- Decantar el sobrenadante, debe quedar 0,5 mL de sedimento.
- Añadir al sedimento solución salina hasta el nivel 12 mL y resuspender el sedimento
- Decantar el sobrenadante y repetir el lavado por 2 o 3 veces más hasta que el
sobrenadante quede claro.
- Añadir 2 mL de solución salina al sedimento y mezclar.
- Colocar una gota de colorante azure A o tionina sobre un portaobjetos.
- Transferir con una pipeta una porción de sedimento sobre la gota de colorante y mezclar.
Colocar un cubreobjetos y examinar.
B. Resultados:
- Con este procedimiento los trofozoitos de amebas aparecen con los pseudópodos
extendidos.
- El citoplasma de quistes y trofozoitos teñidos de azul claro, y el núcleo y cuerpos
cromatoides de azul oscuro.
- Los gránulos de la cromatina periférica a menudo son visibles y se los observa de forma
individual.
- Los huevos de helmintos se tiñen, pero ligeramente de manera que no pierden sus
características.
6.2.6. Técnica flotación-centrifugación: formalina-sulfato de zinc:

- Está técnica permite la concentración por sedimentación y luego la flotación de quistes, huevos
y larvas.
A. Procedimiento:
- Para esta técnica se debe partir del material preservado en formalina al 10%.
- Filtrar 10 mL de una suspensión fecal en formalina a través de una capa de gasa
humedecida.
- Centrifugar a 2500 rpm por 1-2 minutos.
- Decantar el sobrenadante, lo máximo posible.
- ¡De aquí en adelante, los pasos deben realizarse sin interrupción!
DOCENTES
Versión: 1.0
- Añadir sulfato de zinc (p.e. 1.20) hasta unos 2 cm del borde del tubo.
- Mezclar completamente con la ayuda de dos aplicadores.
- Colocar el tubo en la gradilla con sumo cuidado. Evite sacudir.
- Dejar en reposo por 1 minuto.
- Transferir con la ayuda de un asa bacteriológica dos gotas de la película superficial a un
portaobjetos.
- Colocar un cubreobjetos sobre estas gotas, evitando la formación de burbujas.
- Dejar este portaobjetos en una caja petri en la que previamente se ha colocado un papel
humedecido. Tapar y dejar en reposo por 1 hora.
- Examinar la preparación.
6.3. ERRORES TÉCNICOS EN LOS MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN:

- Cantidad incorrecta de heces fecales para preparar la suspensión: escasa o excesiva.
- Suspensión mal homogeneizada.
- Sobrenadante decantado con parte del sedimento.
- Peso específico de las soluciones para métodos de flotación: si son muy bajos los organismos no
flotan; si son muy altos los organismos se distorsionan.
- Velocidad y tiempo de centrifugación.
- Manejo brusco de los tubos con material en flotación.
- Pureza de las soluciones y calidad del agua utilizada.
6.4. EFECTIVIDAD DE LOS MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN
- Comparando los diferentes métodos de concentración podemos observar que dependiendo del
propósito, algunos métodos son más efectivos que otros y esto deberá tenerse en cuenta cuando
se quiere concentrar un parásito en particular (Cuadro 3).
Cuadro 3. Efectividad de los métodos de concentración
Método
1 2 3 4 5 6 7 8
Parásito
PROTOZOARIOS
Trofozoitos - - - - - + + -
Quistes - ++** + - +++= +++ +++ +++
HELMINTOS. (Huevos)
Ascaris lumbricoides ++ ++ + ++ ++ ++ + +++
Trichuris trichiura ++ ++ + ++ ++ ++ + +++
Uncinarias +++ ++ + ++ ++ ++ + +++
Taenias ++ ++* + ++ ++ ++ + +++
Schistosoma - - +++ +++ ++ ++ ++ ++
Operculados - - - - ++ ++ ++ ++
Larvas Strongyoides. - + + + ++ ++ +++ ++
1. Flotación con solución saturada de cloruro de sodio o sal común
2. Flotación con Sulfato de Zinc al 33% con p.e. 1.018
3. Sedimentación simple con solución salina o agua corriente o centrifugación
4. Centrifugación con ácido-éter
5. Centrifugación con formalina-éter
6. Centrifugación con MIF-c
7. Centrifugación con PAF
8. Flotación- centrifugación con formalina y sulfato de zinc.
 - no efectivo
 + poco efectivo
 ++efectivo
 +++ muy efectivo
 *muy efectivo para huevos de Himenolepis nana
 ** muy efectivo para quistes de Giardia lamblia
 = poco efectivo para quistes de Giardia lamblia y Iodameba butschlii

 poco efectivo para huevos de Himenolepis nana.
DOCENTES
Versión: 1.0
5. Presentación de resultados (Informe o reporte)

5.1 Realice el informe de laboratorio e indique los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio.
6. Guía para discusión de resultados-cuestionario

6.1 Discuta la importancia de los métodos de preservación y de los procedimientos de concentración,
mencionando su aplicación tanto en el área clínica como en la investigación biomédica.
7. Conclusiones y recomendaciones
7.1 Indique las conclusiones y recomendaciones de la práctica en función de los resultados obtenidos el
análisis y la discusión, los objetivos de la práctica y a la bibliografía consultada.
8. Bibliografía
8.1 Ash L and Orihel T. Parasites: a guide laboratory procedures and identification. ASCP
8.2 Girard, R. (2014). Manual de Parasitología. Técnicas para Laboratorios de Atención Primaria de Salud
y para el Diagnóstico de las Enfermedades Infecciosas Desatendidas.3er. Edición. Honduras.
8.3 Shimizu, R. (2007). Parasitology.

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GESTIÓN DE LABORATORIOS

Facultad de Medicina Código:

MÉTODOS DE PRESERVACIÓN Y PROCEDIMIENTOS DE CONCENTRACIÓN

2. Resultados de aprendizaje esperados

Cuadro 1. Preservantes para heces fecales

Cuadro 2. Métodos de concentración de parásitos en heces fecales

NaCl Saturado Formalina-

Formalina (para un litro) Al 10% Al 5%

Formalina bufferada (pH neutro)

2. SOLUCION MERTIOLATE–YODO–FORMALDEHIDO (MIF):

2.1. Preparación de la solución:

Solución MF stock (estable)

Solución yodo lugol (preparar cada tres semanas)

Solución de trabajo (MIF)

2.3. Reacciones de tinción:

3. SOLUCION FENOL–ALCOHOL–FORMALDEHIDO (PAF):

3.1. Preparación de la solución:

Colorante Azure A o Azure metileno A

4. SOLUCION DE ACETATO DE SODIO, ACIDO ACETICO, FORMALINA (SAF)

Tiene las siguientes ventajas:

4.1. Preparación de la solución:

Las características de los métodos de flotación son las siguientes:

5.1. Flotación con solución saturada de cloruro de sodio (Willis)

6.1. Sedimentación simple (por gravedad):

6.2. Sedimentación por centrifugación:

6.2.1. Técnica de solución salina:

- Moderadamente efectiva para huevos, larvas, quistes.

6.2.2. Técnica de ácido–éter:

6.2.3. Técnica formalina-eter (acetato de etilo)

- Es la técnica más utilizada en la rutina.

- Centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos.

Foto 1 Centrifugado con formalina-acetato de etilo

6.2.4. Técnica MIF-éter:

- Se procede de la misma manera que para Formalina-Eter.

Foto 2 Centrifugado con MIF-Acetato de etilo

- Con el tubo en posición horizontal, remover el tapón con la ayuda de un aplicador y

6.2.6. Técnica flotación-centrifugación: formalina-sulfato de zinc:

6.3. ERRORES TÉCNICOS EN LOS MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN:

6.4. EFECTIVIDAD DE LOS MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

Cuadro 3. Efectividad de los métodos de concentración

5. Presentación de resultados (Informe o reporte)

6. Guía para discusión de resultados-cuestionario

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