PROTOCOLO MIEL

1 2 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL 3 ESTADO DE HIDALGO 4 5 INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS 6 7 8 EFECTO DEL SELENIO Y COMPUESTOS BIOACTIVOS EN LA 9 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTITUMORAL DE DIVERSAS 10 MIELES 11 12 13 TESIS QUE, PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN 14 CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS, PRESENTA 15 DAVID CHÁVEZ BORGES 16 17 DIRECTOR: DR. RAFAEL GERMAN CAMPOS MONTIEL 18 19 20 21 ABRIL DEL 2018 22 ÍNDICE 23 24 1. RESUMEN ................................................................................................................. 5 25 2. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 6 26 3. MARCO TEÓRICO ................................................................................................... 7 27 3.1 LA MIEL .................................................................................................................. 7 28 3.2 PRODUCCIÓN DE MIEL EN MÉXICO................................................................ 8 29 3.3 TIPOS DE MIEL...................................................................................................... 8 30 3.4 COMPOSICIÓN ...................................................................................................... 9 31 3.5 COMPUESTOS VOLÁTILES .............................................................................. 12 32 3.6 COLOR .................................................................................................................. 13 33 3.7 CONTENIDO DE 5-HIDROXIMETILFURFURAL (5-HMF) ............................ 13 34 3.7 COMPUESTOS BIOACTIVOS ............................................................................ 14 35 3.7.2 COMPUESTOS FENÓLICOS ........................................................................ 15 36 3.8 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ..................................................................... 17 37 3.9 ACTIVIDAD ANTITUMORAL ........................................................................... 19 38 3.10 SELENIO ............................................................................................................. 22 39 3.11 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS .............................................................. 26 40 4. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 29 41 5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................. 30 42 6. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................... 31 43 7. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 31 44 8. HIPÓTESIS .............................................................................................................. 31 45 9. METODOLOGÍA..................................................................................................... 32 46 9.1 DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES ................................................... 32 47 9.2 DETERMINACIÓN DE FLAVONOIDES ........................................................... 33 48 49 9.3DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MÉTODO DE ABTS............................................................................................................................ 33 50 51 9.4 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MÉTODO DE DPPH ..................................................................................................................... 34 1 52 53 9.5 DETERMINACIÓN DE CANTIDAD DE SELENIO POR ESPECTRSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA ..................................................................................... 34 54 55 9.6 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTITUMORAL INDUCIDA POR Agrobacterium tumefaciens ......................................................................................... 35 56 9.7 57 10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .............................................................................. 36 REFERENCIAS.................................................................................................... 37 58 59 2 60 ÍNDICE DE TABLAS 61 62 Tabla 1 - Composición fisicoquímica de la miel ............................................................. 40 63 Tabla 2 - Contenido de vitaminas y minerales en la miel (mg/100g) .............................. 40 64 3 65 ÍNDICE DE FIGURAS 66 67 Ilustración 1 - Distribución de la producción de miel en el estado de Hidalgo (millones 68 de litros/año) .................................................................................................................... 41 69 Ilustración 2 - Producción de miel del estado de Hidalgo en los últimos años (millones 70 de litros) ........................................................................................................................... 41 71 4 72 73 1. RESUMEN 74 La presencia de selenio en la miel es uno de los factores que le otorgan propiedades 75 bioactivas que benefician al cuerno humano con su consumo. La presencia de 76 selenoproteínas en la miel formadas por los aminoácidos selenometionina y selenocisteína 77 son precursores de compuestos antioxidantes que son medidos por medio de técnicas 78 comúnmente usadas, para la determinación del contenido de fenoles totales se utiliza la 79 técnica de Folin-Ciocalteu, dentro de los fenoles se encuentran los flavonoides que son 80 medidos por el método de Dowd y las técnicas de inhibición de radicales ABTS y DPPH 81 para determinar la actividad antioxidante total. El contenido de selenio que forma los 82 compuestos mencionados se determina por espectroscopia de absorción atómica acoplada 83 a generador de hidruros usando una lámpara de cátodo hueco especial para este mineral. 84 La actividad antitumoral se mide a través del bioensayo de discos de papa induciendo una 85 tumoración con Agrobacterium tumefaciens para su posterior redimición con extracto de 86 miel. Se evalúa la correlación de la presencia de selenio con la actividad antioxidante y 87 antitumoral por medio del modelo estadístico de la correlación de Pearson. 88 89 PALABRAS CLAVE: Miel, antioxidante, antitumoral, selenio, Agrobacterium 90 tumefaciens 5 91 92 1. INTRODUCCIÓN 93 La miel es uno de los alimentos más antiguamente conocidos y consumidos por la riqueza 94 de compuestos que le aporta al cuerpo humano, una carga de carbohidratos, proteínas y 95 vitaminas. Es una solución de azúcar viscosa e hipersaturada que viene del néctar que ha 96 sido recolectado y modificado por las abejas (Apis mellifera). Las abejas recolectan el 97 néctar de las plantas, transforman y combinan con sus propias sustancias, la miel se 98 almacena en el panal para madurar (Vandamme, Heyneman et al. 2013). Una parte 99 fundamental en el estudio de la miel son sus componentes fundamentales, contiene 100 principalmente azúcar (75-79%) y agua (20%). Otros componentes de la miel son 101 proteínas, vitaminas del complejo B, minerales, antioxidantes como flavonoides, ácido 102 ascórbico, catalasa y selenio. Ha sido usada también por sus propiedades medicinales y 103 funcionales, siendo un alimento antioxidante ya que contiene una variedad de fenoles y 104 flavonoides, antitumoral, antimicrobiano y antifúngico. 105 Dentro del presente trabajo se analizan los diferentes compuestos bioactivos en diversas 106 muestras de miel obtenidas en el estado de Hidalgo, así como, sus propiedades 107 antioxidantes y antitumorales, buscando encontrar una relación directa con su contenido 108 de Selenio el cual se medirá a través de una espectroscopia de absorción atómica. La 109 determinación de los compuestos bioactivos se realizará con la medición de fenoles 110 totales, flavonoides y la presencia de antioxidantes por los métodos de ABTS y DPPH. La 111 actividad antitumoral se determinará usando el bioensayo de Discos de papa con ayuda de 112 la bacteria fitopatógena Agrobacterium tumefaciens causante de la enfermedad de 113 tumoración de agallas en organismos vegetales. 6 114 115 2. MARCO TEÓRICO 116 117 3.1 LA MIEL 118 De acuerdo con la FAO en su norma CODEX STAN 12-1981 para miel, ésta se define 119 como la sustancia dulce natural producida por abejas Apis mellifera a partir del néctar de 120 las plantas o de secreciones de partes vivas de éstas o de excreciones de insectos 121 succionadores de plantas que quedan sobre partes vivas de las mismas y que las abejas 122 recogen, transforman y combinan con sustancias específicas propias, y depositan, 123 deshidratan, almacenan y dejan en el panal para que madure y añeje. 124 125 Desde el punto de vista bioquímico Pita-Calvo and Vázquez (2017) describen a la miel 126 como un producto elaborado por abejas a partir de carbohidratos contenidos en exudados 127 producidos por ciertas plantas las cuales le otorgan componentes de la miel, otros 128 compuestos son provistos por las abejas y algunos otros se deben a las reacciones 129 bioquímicas durante la maduración. 130 131 Contiene principalmente azúcares simples o monosacáridos, de los cuales la fructosa y la 132 glucosa son los componentes principales (65%) y contiene un 18% de agua 133 aproximadamente. Proteínas, flavonoides, compuestos fenólicos, sabores, aromas, 134 aminoácidos libres, ácidos orgánicos y vitaminas constituyen componentes menores de 135 las mieles, pero contienen todos los minerales que son esenciales para la salud (González- 136 Miret, Terrab et al. 2005). 7 137 138 3.2 PRODUCCIÓN DE MIEL EN MÉXICO 139 México se encuentra enlistado entre los diez principales productores de miel a nivel 140 mundial y es considerado también uno de los principales exportadores. La Secretaría de 141 Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), informó 142 que la miel mexicana es símbolo de calidad y sabor a nivel internacional, lo que permite 143 comercializar este alimento a diversos destinos del extranjero por aproximadamente 150 144 millones de dólares al año. El funcionario del organismo de la SAGARPA, resaltó que el 145 valor de la producción de miel en México actualmente supera los dos mil 500 millones de 146 pesos con una producción de más de 70 mil toneladas anuales. 147 En México se dedican a la apicultura alrededor de 43 mil productores y se tiene el registro 148 de 1.9 millones de colmenas, el principal destino de la miel mexicana es la Unión Europea 149 (UE) y se ha fortalecido su presencia en Arabia Saudita, este año también se incursionó 150 en otros países, como Angola y algunas Naciones de Centro América (Soto, Elizarraras et 151 al. 2017). En la sección de firguras se muestra la distribución de la producción de miel en 152 el estado de Hidalgo y posteriormente se establece una gráfica con las principales 153 producciones por años en el estado. 154 155 156 157 3.3 TIPOS DE MIEL 158 Hay aproximadamente 320 variedades diferentes de miel originadas de varias fuentes 159 florales. El sabor, el color y el olor de un tipo específico de miel depende de las diversas 160 fuentes líquidas de las flores y plantas visitadas por la abeja melífera. Los diversos tipos 8 161 de miel también dependen de temperatura, lluvias de la estación y cambios climáticos. El 162 color de miel varía de marrón claro a marrón oscuro dependiendo del lugar donde 163 polinizan las abejas melíferas (Meo, Al-Asiri et al. 2017). 164 165 MIELES MONOFLORALES: se designa a una miel como monofloral cuando el tipo de 166 polen que la caracteriza está presente en su sedimento en cantidades superiores al 45% del 167 total, salvo en algunas excepciones (azahar, biércol, romero). 168 169 MIELES MUTIFLORALES: mieles en las que, aunque proceden del néctar de flores, no 170 predomina ninguna forma polínica sobre las demás. Existe una gran variedad de este tipo 171 de mieles, de las cuales un gran número presentan denominación de origen (Gil 2010). 172 173 3.4 COMPOSICIÓN 174 CARBOHIDRATOS: Los principales hidratos de carbono que componen la miel son 175 monosacáridos: glucosa (31%) y fructosa (38%). Por medio de cromatografía de gases se 176 ha determinado 16 oligosacaridos, incluidos 11 disacáridos (/maltosa, turanosa, kojibiosa, 177 sacarosa, palatinosa, laminaribiosa, gentibiosa, neotrealosa, nigerosa), 5 trisacáridos 178 (erlosa, isopanosa, panosa, teanderosa, maltotriosa), también se incluyen algunos 179 tetrasacáridos (isomaltotreosa, maltotreosa, estaquinosa, nistosa) (Khan, Anjum et al. 180 2018). 181 182 PROTEÍNAS: diversos estudios han permitido encontrar de 8-11 proteínas en varias 183 fuentes de miel. Estas se originan a partir de la abeja melífera y el lugar donde obtiene la 9 184 sustancia de alimentación. Las proteínas de la miel se encuentran principalmente en forma 185 de enzimas (Khan, Anjum et al. 2018). 186 187 ENZIMAS: Las abejas proporcionan diferentes enzimas durante el proceso de 188 maduración de la miel. Las enzimas añadidas incluyen diastasa (amilasa), que 189 digiere el almidón a maltosa y es relativamente estable calor y almacenamiento; e 190 invertasa (sacarasa o a-glucosidasa), que cataliza la conversión de sacarosa a 191 glucosa y fructosa. La invertasa también cataliza muchas otras conversiones de 192 azúcar y es principalmente responsable de los niveles de azúcar de la miel. Glucosa 193 oxidasa y catalasa son otras dos enzimas añadidas por las abejas melíferas, que 194 regulan la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2). El H2O2 producido sirve 195 como uno de los factores antibacterianos de la miel (Amir, Yesli et al. 2010). 196 AMINOÁCIDOS: el contenido medio de aminoácidos libres es de 0,1%, aunque 197 los valores son muy variables y pueden oscilar entre 0,05 y 0,4%. Se han 198 determinado una veintena de aminoácidos y es la prolina, aminoácido segregado 199 por las abejas, el mayoritario (más del 30% de esta fracción, aunque puede llegar 200 hasta el 80%); en menor proporción se encuentran asparragina, fenilalanina, 201 aminobutírico, ácido aspártico, glicina y serina (Gil 2010). 202 203 204 HUMEDAD: según la U.S. Food and Drug Act la miel no debe tener un contenido superior 205 a 25 % de agua. El contenido de humedad es una de las características más importantes 206 de la miel y está en función de ciertos factores tales como los ambientales y del contenido 207 de humedad del néctar. La miel madura tiene normalmente un contenido de humedad por 10 208 debajo del 18.5% y cuando se excede de este nivel, es susceptible a fermentar, 209 particularmente cuando la cantidad de levaduras osmofílicas es suficientemente alta. El 210 contenido de agua en la miel influye en su viscosidad, peso específico y color, 211 condicionando así la conservación y cualidades organolépticas de este producto. (Ulloa, 212 Mondragón et al. 2010). La Tabla 1 muestra la composición bioquímica promedio por 213 cada 100 gramos de miel. 214 215 216 MINERALES: Solayman, Islam et al. (2016) han indicado que dentro de los compuestos 217 presentes en la miel también se encuentran minerales y otros elementos, de los cuales su 218 contenido difiere en tipos y cantidades dependiendo del origen botánico y geográfico de 219 donde procedan. 220 Se han reportado aproximadamente 54 minerales presentes en miel, que incluyen 221 elementos de alta presencia en el cuerpo humano (Na, K, Ca, Mg, P, S, Cl) y elementos 222 traza (Al, Cu, Pb, Zn, Mn, Cd, Tl, Co, Ni, Rb, Ba, Be, Bi, U, V, Fe, Pt, Pd, Te, Hf, Mo, 223 Sn, Sb, La, I, Sm, Tb, Dy, Sd, Th, Pr, Nd, Tm, Yb, Lu, Gd, Ho, Er, Ce, Cr, As, B, Br, 224 Cd,Hg, Se, Sr). Diversos estudios han demostrado que el contenido mineral total en la 225 miel es relativamente bajo y generalmente representa del 0.1% al 0.2% de la composición, 226 pero puede exceder el 1% en algunos casos. 227 228 VITAMINAS: La miel tiene varios compuestos bioactivos esenciales incluyendo 229 vitaminas: A (Retinol), Vitamina E (Tocoferol), Vitamina K (Vitamina Anti- 230 Hemorrágica), Vitamina B1 (Tiamina), Vitamina B2 (riboflavina), vitamina B6, niacina, 231 vitamina C (ácido ascórbico), pantoténico ácidos y fenólicos, flavonoides y ácidos grasos 11 232 (Meo, Al-Asiri et al. 2017). En la Tabla 2 se pueden observar el contenido de mineral y 233 de vitaminas por cada 100 gramos de miel. 234 235 236 3.5 COMPUESTOS VOLÁTILES 237 El sabor de la miel es producido por mezclas complejas de compuestos volátiles, que 238 pueden diferir según el néctar, condiciones de procesamiento, origen y almacenamiento. 239 Las mieles uniflorales tienen un distintivo sabor de la planta, debido a la presencia de 240 ciertos compuestos orgánicos volátiles que componen los néctares. Los compuestos 241 volátiles en la miel tienen su origen en diferentes fuentes, por ejemplo, la transferencia de 242 compuestos volátiles de la planta. Por otro lado, las abejas también pueden producir 243 o convertir constituyentes de plantas en otros componentes que otorgan propiedades a los 244 compuestos volátiles. Además, estos compuestos pueden verse afectados por el 245 procesamiento poscosecha, a partir de la presencia de microorganismos (da Silva, Gauche 246 et al. 2016). 247 Se han identificado más de 400 compuestos diferentes en la fracción volátil de la miel y 248 algunos se utilizan como marcadores de mieles comerciales, como 3,9-epoxy-1-þ- 249 mentadieno, t-8-þmenthan-óxido-1,2-diol y cis-rosa, que han propuesto como marcador 250 de miel de limón; dicetonas, compuestos de azufre y alcanos son características de la miel 251 de eucalipto, mientras que hexanal y heptanal son los compuestos principales en el aroma 252 de las mieles de lavanda. Los alcoholes son una clase grande e importante de compuestos 253 presentes en la miel, son una combinación de grupos metilo con alcoholes, como 3-metil- 254 3- buteno-1-ol y 2-metil-2-buten-1-ol que proporciona frescura a la miel (Castro-Vázquez, 255 Díaz-Maroto et al. 2007). 12 256 257 3.6 COLOR 258 El color es el primer atributo atractivo de la miel, y como tal es muy importante para la 259 comercialización. Es un parámetro importante en la calidad, aceptación y preferencia de 260 los consumidores. 261 Los expertos en miel saben que su color puede variar de tonos claros a tonos ámbar casi 262 negros, siendo el más común el amarillo brillante rojizo o verdoso. En muchos países, el 263 precio de la miel está relacionado con su color, las mieles ligeramente coloreadas 264 generalmente tienen un mayor valor, aunque las mieles oscuras se aprecian en ciertas 265 regiones, lo que demuestra que la aceptación general del color de las mieles por parte de 266 los consumidores puede variar ampliamente (Tuberoso, Jerković et al. 2014). 267 268 269 3.7 CONTENIDO DE 5-HIDROXIMETILFURFURAL (5-HMF) 270 La presencia de 5-HMF es considerado un indicativo del deterioro de la miel. La norma 271 establecida por el Comité del Codex Alimentarius sobre Azúcares (2001) establece un 272 valor máximo de 40.00 mg kg-1 para la mezcla de mieles o miel procesada y un valor 273 máximo de 80.00 mg kg-1 si la miel y las mezclas de estas mieles contienen origen 274 declarado de regiones con clima tropical. 275 Normalmente 5-HMF está formado por la descomposición de monosacáridos o la reacción 276 de Maillard, cuando la miel se calienta o almacena por mucho tiempo. Cuando la 277 temperatura de tratamiento térmico y el almacenamiento es más prolongado, la 278 concentración de 5-HMF aumenta significativamente. El alto contenido de 5-HMF en 279 mieles también puede ser una indicación de falsificación por añadimiento de jarabe 13 280 invertido, porque se puede producir 5-HMF calentando azúcares en presencia de un ácido 281 para la inversión de sacarosa (Capuano and Fogliano 2011). 282 283 284 285 3.7 COMPUESTOS BIOACTIVOS 286 3.7.1 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 287 Los antioxidantes que se producen naturalmente en la miel son flavonoides, ácidos 288 fenólicos, enzimas (glucosa oxidasa, catalasa), ácido ascórbico, sustancias similares a los 289 carotenoides, ácidos orgánicos, productos de reacción de Maillard, aminoácidos y 290 proteínas. Diversas investigaciones indican que la actividad antioxidante total de la miel 291 es proporcionada principalmente por su composición fenólica, más que la vitamina C y 292 otros componentes (Hossen, Ali et al. 2017). 293 Los mecanismos básicos para la actividad antioxidante de la miel incluyen la capacidad 294 de eliminación de radicales libres, quelación de iones metálicos (pro-oxidantes) y aquellos 295 relacionados a la capacidad oxidoreductiva de los compuestos fenólicos debido a la 296 presencia de grupos hidroxilo delimitando los anillos aromáticos. Ácidos orgánicos 297 (glucónico, málico y cítrico), carotenoides, las enzimas (glucosa oxidasa y catalasa) y la 298 vitamina C son compuestos originalmente presentes en la miel que actúan como 299 antioxidantes. Otros compuestos, como los compuestos furfurales, que originalmente no 300 se encuentran presentes en la miel, pero se forman durante su procesamiento o 301 almacenamiento, también puede contribuir a la actividad antioxidante (Bastos and 302 Sampaio 2013). 14 303 Solayman, Islam et al. (2016) mencionan que los efectos nocivos de los radicales libres se 304 reducen por las defensas antioxidantes del cuerpo. Estos mecanismos de defensa contra el 305 daño por radicales libres generalmente involucran vitamina C, vitamina E y betacaroteno 306 (y otros carotenoides) como los principales antioxidantes. Además, varias enzimas que 307 contienen metales, que incluyen glutatión peroxidasa (Se), catalasa (Fe) y superóxido 308 dismutasa (Zn, Cu y Mn), también son críticos en la defensa de los componentes celulares 309 internos del daño oxidativo. 310 Varios estudios in vitro evaluaron la capacidad de la miel para reaccionar con el DPPH 311 (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical libre, lo que indica que los compuestos 312 antioxidantes de la miel (principalmente flavonoides) puede donar un hidrógeno a la 313 estructura de radicales libres. La capacidad de interacción de la miel con el reactivo DPPH 314 generalmente se expresa como IC50, lo que significa la cantidad de antioxidante necesario 315 para disminuir la concentración inicial de DPPH en un 50% (Bastos and Sampaio 2013). 316 317 318 3.7.2 COMPUESTOS FENÓLICOS 319 Tal como expresa Gil (2010) los compuestos bioactivos fenólicos son los responsables del 320 color, junto con los componentes que se forman en las reacciones de pardeamiento no 321 enzimático. Poseen además actividad antiséptica, antiinflamatoria y antioxidante. Estos 322 componentes se dividen en tres familias: derivados del ácido benzoico (4- 323 hidroxibenzoico), derivados del ácido cinámico (4-hidroxicinámico) y flavonoides 324 (flavonas, flavonoles y flavanonas). Su contenido es muy variable, entre 20 y 2.000 μg/100 325 g de miel. Entre ellos se encuentran miricetina, quercetina, luteolina, canferol, 15 326 pinocebrina, pinobanksina y chirisina. Su origen es triple: néctar, polen y propóleos. Los 327 que proceden solamente del néctar se utilizan para confirmar el origen floral; así, la 328 hesperetina en la miel de naranjo y el canferol en la miel de romero. 329 330 Los compuestos fenólicos intervienen como antioxidantes naturales en los alimentos, por 331 lo que la obtención y preparación de productos con un alto contenido de estos compuestos 332 supone una reducción en la utilización de aditivos antioxidantes, pudiendo incluso 333 englobarlos dentro de los llamados alimentos funcionales. Desde el punto de vista 334 nutricional, esta actividad antioxidante se asocia con su papel protector en las 335 enfermedades cardiovasculares y el cáncer (Porras and López 2009). 336 337 FLAVONOIDES: Los flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales y 338 que protegen al organismo del daño producido por agentes oxidantes, como los rayos 339 ultravioletas, la polución ambiental, sustancias químicas presentes en los alimentos. 340 Contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo fenólicos y 341 excelentes propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, lo que les 342 confiere una gran capacidad antioxidante. Por ello, desempeñan un papel esencial en la 343 protección frente a los fenómenos de daño oxidativo, y tienen efectos terapéuticos en un 344 elevado número de patologías, incluyendo la cardiopatía isquémica, la aterosclerosis o el 345 cáncer. 346 Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia los radicales 347 hidroxilo y superóxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena 348 de peroxidación lipídica y se ha descrito su capacidad de modificar la síntesis de 349 eicosanoides (con respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la 16 350 agregación plaquetaria (efectos antitrombóticos) y de proteger a las lipoproteínas de baja 351 densidad de la oxidación (prevención de la placa de ateroma) (Martínez, González et al. 352 2002). 353 354 Estevinho, Pereira et al. (2008) por medio de ciertas investigaciones indicaron que los 355 flavonoides presentes en la miel se dividen en tres clases con similar estructura: 356 flavonoles, flavonas y flavanonas. Estos son importantes debido a su contribución al color, 357 olor y sabor de la miel y también debido a sus efectos beneficiosos para la salud. Por otra 358 parte, la composición de compuestos fenólicos de la miel y, en consecuencia, la capacidad 359 antioxidante depende de las fuentes florales utilizadas para recolectar miel cuyo 360 predominio depende del clima y factores estacionales y ambientales. Las diferentes 361 propiedades de la miel son apreciables ya que la composición de los compuestos 362 bioactivos en la miel de diferentes lugares deben ser diferentes. 363 364 365 3.8 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA 366 En la medicina moderna el uso terapéutico de la miel requiere que debe exhibir actividad 367 antimicrobiana consistente y estandarizada. Los científicos farmacéuticos y biológicos 368 deben identificar las especies florales que dan características antimicrobianas. Las mieles 369 contienen bajo pH y alta osmolaridad combinados a través de un ensamblaje enzimático 370 de peróxido de hidrógeno que ejerce el resultado antimicrobiano (Meo, Al-Asiri et al. 371 2017). 372 El uso de la miel como un remedio tradicional para infecciones microbianas se remontan 373 a la antigüedad. Diversas investigaciones que se han llevado a cabo sobre diferentes tipos 17 374 de miel han demostrado que es efectiva contra varios patógenos humanos, incluyendo 375 Escherichia coli (E. coli), Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium, S. aureus. 376 Estudios de laboratorio han revelado que la miel es efectiva contra S. aureus resistente a 377 la meticilina, estreptococos hemolíticos y enterococcos resistentes a la vancomicina 378 (Mandal and Mandal 2011). 379 Khan, Anjum et al. (2018) mencionan que muchas variedades de miel de diferentes 380 orígenes vegetales han demostrado tener actividad antimicrobiana: miel de Erica (Erica 381 arborea); Canola (Brassica napus); Castaña (Castanea sativa); Abeto (Pinaceaseabies); 382 Acacia (Fabaceae acacia) y miel de múltiples flores. Diferentes tipos de miel con orígenes 383 geográficos diversos como Brasil, Etiopía, Nueva Zelanda, Irán, India y Pakistán también 384 se ha demostrado que tienen actividad antibacteriana potente. 385 El mecanismo antibacteriano de la miel no se entiende completamente hasta ahora. Sin 386 embargo, se propone por muchos investigadores que la miel inhibe el crecimiento 387 bacteriano debido a un número de diferentes factores: alta concentración de azúcar, pH 388 bajo, generación de peróxido de hidrógeno, compuestos proteicos, compuestos fenólicos 389 u otros componentes no identificados. Las mayores concentraciones de azúcares 390 proporcionan alta osmolaridad a la miel, que es un conocido factor antimicrobiano. El 391 bajo contenido de humedad de la miel, conduce a valores de aw (actividad del agua) entre 392 0.56 y 0.62, esto dificulta el crecimiento de casi cualquier microorganismo excepto ciertas 393 levaduras y bacterias osmofílicas. Varios estudios han concluido que la concentración de 394 azúcar de la miel es el único factor responsable de su efecto antibacteriano. Muchos 395 investigadores han demostrado que los compuestos proteicos son la fuente principal para 396 proporcionar actividad antimicrobiana (Khan, Anjum et al. 2018). 18 397 ACTIVIDAD ANFIFÚNJICA: Muchas especies de hongos son más patogénicas 398 que las bacterias. Dentro del filo de los hongos Candida es la especie más patógena 399 y oportunista que existe. Los productos naturales se han usado tradicionalmente en 400 el tratamiento de enfermedades, ya que estos consisten en muchos compuestos 401 activos. Se ha probado que algunas variedades de miel tienen actividades 402 antifúngicas contra algunas especies de levadura incluyendo Candadia. También 403 se investigó que tiene un potencial antimicótico y es capaz de detener el desarrollo 404 de C. albicans cuando se implementa en biofilms impidiendo su proliferación en 405 la superficie de la película. La actividad antifúngica de la miel se debe a muchas 406 características, pero un estudio reveló que el extracto etanólico de la miel tiene 407 fuerte actividad antifúngica en comparación con miel pura o cualquier otro 408 extracto solvente (Khan, Anjum et al. 2018). 409 410 411 412 3.9 ACTIVIDAD ANTITUMORAL 413 La miel juega un papel clave en el desarrollo de la medicina moderna. La calidad 414 nutricional de la miel es altamente efectiva y muestra propiedades potenciales contra 415 especies reactivas de oxígeno, inflamación, agentes infecciosos como bacterias y hongos, 416 así como para reducir la tos y curación de heridas. La miel también juega un papel 417 importante para mejorar el sistema reproductivo, concentración testosterona, conteo de 418 espermatozoides y fertilidad. La miel es uno de los pocos alimentos naturales que cuenta 419 con todas estas propiedades medicinales (Denisow and Denisow-Pietrzyk 2016). 19 420 El cáncer es un grupo de enfermedades multifactoriales asociadas con la proliferación 421 incontrolada de células. Factores ambientales (90-95%) y genéticos (5-10%) contribuyen 422 a la formación de cáncer en los animales. Entre los factores ambientales se encuentran: 423 humo, exposición química cancerígena, radiación, un estilo de vida sedentario, infección 424 y estrés son los más comunes. Además de los factores ambientales y genéticos, el estado 425 hormonal, la condición inmune y las mutaciones también contribuyen a desarrollo del 426 cáncer. Sin embargo, los estudios experimentales sugieren que el consumo regular de 427 frutas, verduras, hierbas, miel y otros alimentos ricos en polifenoles se asocian con una 428 menor incidencia de cáncer. Los polifenoles previenen el cáncer a través de varios 429 mecanismos, por ejemplo, mediante la inhibición de la proliferación celular, modulación 430 de las vías de señalización de las células cancerosas, inducción de la apoptosis de las 431 células tumorales, modificación de la actividad enzimática, prevención del estrés 432 oxidativo a través de efectos antioxidantes e inhibición de daño al ADN. En el cáncer, hay 433 una proliferación celular descontrolada. Por lo tanto, la inhibición de la proliferación 434 celular incontrolada es el principal objetivo para apuntar a la prevención del cáncer. Los 435 polifenoles son antioxidantes naturales, que pueden prevenir la proliferación celular en 436 varias maneras. La quercetina es un agente antioxidante y anticancerígeno que se 437 encuentra en la miel que puede inhibir la proliferación de células cancerosa en la próstata 438 (Hossen, Ali et al. 2017). 439 440 Diferentes estudios indicaron que la miel se puede usar como medicina natural para tratar 441 el cáncer. Un estudio concluyó que la miel mostró un efecto antiproliferativo in vitro en 442 el cáncer de vejiga. Un estudio similar mostró que la miel tiene fenil éster del ácido cafeíco 443 (CAPE) que detienen el crecimiento celular en la fase sub G1 de ciclo celular canceroso 20 444 e induce la apoptosis de las células mediante la activación de caspasa-3 por la proteína 445 CAPE (Khan, Anjum et al. 2018). 446 447 Por otra parte Shati and Alamri (2010) sugirieron que el efecto antitumoral de la miel en 448 su mayoría depende del momento de la aplicación. Es probable que los componentes 449 polifenólicos presentes en la miel, estimulen la defensa antitumoral del sistema huésped. 450 Incluso en presencia de un tumor, los componentes nutritivos de miel prevalecen. Es 451 posible que la miel promueva la reducción del crecimiento tumoral ya que contiene una 452 mezcla de vitaminas, minerales y aminoácidos, así como una gran cantidad de glucosa. 453 Esto mejora la nutrición y la oxigenación, y su acidez favorece la liberación de oxígeno 454 de la hemoglobina en los capilares de los tejidos adyacentes. 455 456 457 TUMOR: se producen a partir de diversas enfermedades (entre ellas algunos tipos 458 de cáncer) en las cuales el organismo produce un exceso de células con rasgos 459 típicos de comportamiento y crecimiento descontrolado. La célula cancerosa 460 “olvida” la capacidad para morir y se divide casi sin límite, estas células llegan a 461 formar unas masas, que en su expansión destruyen y sustituyen a los tejidos 462 normales, dando lugar a tumores sólidos o enfermedades hematológicas o 463 linfáticas en función de los tejidos afectados (De la Torre, Cobo et al. 2008). 464 APOPTOSIS: o muerte celular programada es una parte fundamental en el proceso 465 de desarrollo de los organismos pluricelulares. La progresión ordenada del 466 crecimiento del tejido y la diferenciación necesitan a la muerte sistemática y la 467 eliminación de poblaciones selectas de células, de tal manera que nuevas células 21 468 diferenciadas puedan repoblar el sustrato y mantener o iniciar funciones 469 alternativas del tejido (Soto, Cáceres et al. 1999). 470 471 La miel transduce la señal apoptótica a través del agotamiento inicial de proteínas 472 intracelulares (tioles), consecuentemente reduciendo la membrana mitocondrial 473 potencial (MMP) y aumentando la generación de especies reactivas del oxígeno 474 (ROS). Diversos resultados han demostrado que la miel tiene la capacidad de 475 inducir la apóptosis por medio de las ROS y mecanismos mitocondriales- 476 dependientes en células cancerígenas. Esto promueve a la miel como un agente 477 potencialmente quimioterapéutico contra cáncer (Jaganathan and Mandal 2010). 478 479 La miel contiene muchos compuestos biológicamente activos incluyendo ácido 480 cafeíco, éster fenetílico del ácido cafeíco y glicón flavonoide. Se ha demostrado 481 que estos compuestos tienen un efecto inhibidor sobre la proliferación y 482 transformación de células tumorales por la baja regulación de muchas rutas 483 celulares enzimáticas, incluida la proteína tirosina quinasa, vías de ciclooxigenasa 484 y ornitina descarboxilasa (Swellam, Miyanaga et al. 2003). 485 486 487 488 3.10 SELENIO 489 El selenio es esencial para la vida y no existe duda que la de que la cantidad adecuada de 490 este elemento es requerida para una salud humana óptima. Muchos de sus roles 491 fisiológicos se atribuyen directamente a su presencia dentro de las selenoproteínas. Por 22 492 ejemplo, uno de los procesos celulares fundamentales, la síntesis de ADN, depende de la 493 presencia de selenio dentro del sitio catalítico de TrxR (tioredoxina reductasa, interviene 494 en el crecimiento celular). La deficiencia moderada de selenio se ha relacionado con 495 muchas afecciones, como el aumento en riesgo de cáncer e infecciones, infertilidad 496 masculina, disminución de la función inmune y tiroidea, y varias condiciones 497 neurológicas, incluyendo Alzheimer y Enfermedad de Parkinson (Papp, Lu et al. 2007). 498 499 Costa-Silva, Maia et al. (2011) mencionan que las selenoproteínas son un grupo de 500 proteínas que contienen selenocisteína (SeCys) como parte de su cadena polipeptídica. En 501 humanos, existen al menos 25 selenoproteínas conocidas, algunas expresadas en múltiples 502 genes y con funciones similares. Los procesos celulares que requieren selenoproteínas 503 identificadas incluyen la biosíntesis de desoxirribonucleótido trifosfato, eliminación de 504 peróxidos, reducción de proteínas y membranas oxidadas, regulación de redox, 505 metabolismo de las hormonas tiroideas, transporte y almacenamiento de selenio e 506 intervención en el plegamiento de proteínas. 507 508 SELENIO COMO ANTIOXIDANTE: La generación de radicales libres, ocurre 509 continuamente como parte de la función celular normal. Desafortunadamente, el exceso 510 de producción de radicales libres se asocia con una variedad de trastornos clínicos 511 incluyendo aterosclerosis, cáncer, diabetes y otros. Debido a que los radicales libres 512 reaccionan con una variedad de moléculas, sus efectos nocivos la mayoría de las veces 513 incluyen daño al ADN (rupturas de cadena y oxidación de bases purina), oxidación de 514 lípidos (principalmente ácidos grasos poliinsaturados), oxidación de aminoácidos en 515 proteínas, e inactivación oxidativa de enzimas específicas por oxidación de cofactores. 23 516 Las células de mamíferos están protegidas contra ROS por dos líneas de defensa: un 517 mecanismo endógeno que involucra principalmente enzimas y un exógeno mecanismo 518 que utiliza compuestos eliminadores de radicales libres de bajo peso molecular. Hay 519 cuatro enzimas antioxidantes predominantes. Estas incluyen superóxido dismutasas 520 (SOD), catalasas (CAT), glutatión peroxidasas (GSH-Px), y selenoproteína P (SePP). 521 Aunque el selenio (Se) es comúnmente conocido como un nutriente antioxidante, no tiene 522 actividad antioxidante en sí mismo y en su lugar se requiere para la síntesis y la actividad 523 de algunas enzimas antioxidantes (Zachara 2015). 524 525 Los compuestos de selenio (Se) generalmente se consideran antioxidantes. Estos efectos 526 están mediados por selenoproteínas, que contienen selenocisteína (SeCys), que puede ser 527 reemplazado por cisteína (Cys) en las condiciones de bajo estado de Se. Cys es un 528 aminoácido que contiene azufre (S), con un grupo tiol (SH) y es el precursor del glutatión 529 (GSH). El análogo selenoso de Cys es SeCys, con un reemplazo del átomo S por uno Se. 530 Las proteínas basadas en Se tienen una reactividad mayor que la correspondiente de 531 derivados de azufre. La selenoproteína, sintetizada en el hígado, tiene una gran cantidad 532 de residuos de SeCys que permiten la retención de Se y su transporte desde la sangre a los 533 tejidos. Las peroxidasas de glutatión (GPX), el glutatión la reductasa (GR), las reductasas 534 de tioredoxina (TXNRD o TrxR), son selenoproteínas con funciones oxidorreductoras que 535 catalizan la reducción de enlaces disulfuro (S-S) en proteínas y péptidos, proporcionando 536 propiedades reductivas. Selenoproteínas antioxidantes mantienen el estado redox en 537 células sanas. Ellas las protegen y se ha demostrado que dosis muy bajas (1-10 nM) de 538 selenito de sodio (Na2SeO3) o de selenometionina (SeMet) (10-50 nM) podría prevenir 24 539 la muerte celular inducida por especies reactivas de oxígeno (ROS) en células humanas 540 cultivadas (Collery 2018). 541 542 GLUTATIÓN PEROXIDASA (GPx): fue la primera proteína que se ha demostrado que 543 incorpora selenio en su sitio catalítico y se sabe que estaba asociada con selectividad 544 antioxidante del selenio. Las GPx son bien conocidos como catalizadores la reducción de 545 peróxido de hidrógeno e hidroperóxidos orgánicos, protegiendo así las células del daño 546 oxidativo. En humanos, se conocen siete GPx, cinco de los cuales son selenoenzimas y 547 dos que contienen cisteína (Papp, Lu et al. 2007). 548 La glutatión peroxidasa (GPx) es una enzima intracelular importante que descompone los 549 peróxidos de hidrógeno (H2O2) en agua; y peróxidos lipídicos a sus correspondientes 550 alcoholes principalmente en las mitocondrias y algunas veces en el citosol. La mayoría de 551 las veces, su actividad depende de un cofactor de micronutrientes conocido como selenio. 552 Por esta razón, GPX a menudo se conoce como selenocisteína peroxidasa. La enzima 553 juega un papel más crucial en el proceso de inhibición de la peroxidación de lípidos, y por 554 lo tanto protege las células del estrés oxidativo (Ighodaro and Akinloye 2017). 555 556 SELENIO COMO ANTITUMORAL: Muchos estudios experimentales demostraron la 557 actividad antitumoral de los compuestos de Se como agente único, o en combinación con 558 fármacos citotóxicos. La citotoxicidad selectiva en células malignas resistentes a los 559 medicamentos frente a las células normales y benignas es una característica muy 560 importante del Se con una alta afinidad a las proteínas conectadas a la resistencia de 561 múltiples fármacos. Un hecho importante es que hay una captación selectiva de Se por las 25 562 células tumorales. Esto puede ser debido al estado redox del Se, la presencia de tioles 563 reducidos en el medio extracelular, la formación de Se-S, la cooperación entre la 564 cistina/sistema glutamato (xCT o Xc-) y tioredoxina reductasa, la disponibilidad de 565 Cisteína. 566 El segundo parámetro involucrado en la selectividad del Se es la identificación de la 567 Glutatión S-transferasa (GST) y de su isoforma P (GSTP) como objetivos selectivos de 568 compuestos orgánicos de Se contra el cáncer. GST es una de las principales proteínas con 569 grupo tiol de varias células cancerosas y una sobreexpresión de GSTP se ha observado en 570 muchos tipos de cáncer. Esta transferasa tiene un papel principal en la glutatiónilación de 571 la proteína ER (del retículo endoplásmico, encargada de identificar proteínas mal 572 plegadas) (Collery 2018). 573 574 575 576 3.11 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 577 Ha sido conocida como una bacteria fitopatógena capaz de ocasionar la aparición de 578 agallas y tumores, e inclusive la muerte de las plantas infectadas, principalmente en 579 dicotiledóneas y algunas gimnospermas. Estas bacterias, además de su cromosoma 580 circular, poseen material genético extracromosomal de forma circular con un tamaño de 581 aproximadamente 200 kilobases, el cual, por ser responsable de los efectos oncogénicos, 582 ha sido llamado plásmido Ti (Tumor Inducing, inductor de tumores) (Chi, Echeverría et 583 al. 2004). 584 26 585 Como lo describen Escobar and Dandekar (2003) Agrobacterium tumefaciens es capaz de 586 realizar transferencia genética entre dos reinos diferentes. Desde este descubrimiento A. 587 tumefaciens ha servido como modelo de sistema para el estudio de bacterias de sistemas 588 secretores, transferencia horizontal de genes e intercambio de señales entre bacterias- 589 plantas. También ha sido modificado para la transformación genética controlada de las 590 plantas. 591 La patogénesis de Agrobacterium es un proceso único y altamente especializado que 592 involucra la transferencia de genes entre reinos bacteria-planta. Los genes de 593 Agrobacterium en una célula vegetal causan la proliferación celular descontrolada y la 594 síntesis de compuestos nutritivos que pueden ser metabolizados específicamente por las 595 bacterias infectantes. Por lo tanto, la infección efectivamente crea un nuevo nicho 596 específicamente adecuado para supervivencia de Agrobacterium (Escobar and Dandekar 597 2003). 598 La bacteria fitopatógena Agrobacterium tumefaciens es el agente causal de la enfermedad 599 de la hiel de la corona (tumor en tallo) en una amplia gama de especies de plantas. Se ha 600 creído que si se revela el misterio de la enfermedad del tumor de tallo en las plantas 601 podrían ayudar a comprender los mecanismos de la oncogénesis en general, y 602 eventualmente usar este conocimiento para curar el cáncer en animales y humanos. El 603 desarrollo de la enfermedad de agallas Agrobacterium (patogénesis) requiere dos 604 elementos: transformación y tumorogénesis. La formación de tumores en los sitios de 605 infección después unos pocos días requiere la entrega e integración del T-ADN 606 tumorigénico en el genoma de la planta (transformación). El T-ADN lleva dos juegos de 607 genes, el primario (iaaM, iaaH e ipt) y el secundario (6b y 5), estos genes oncogénicos 608 codifican enzimas involucradas en la síntesis de las hormonas auxina y citoquinina en la 27 609 planta y en la modificación de los efectos de fitohormonas en la célula, respectivamente. 610 Su actividad conduce a la formación de tumores (tumorogénesis) (Păcurar, Thordal- 611 Christensen et al. 2011). 28 612 613 3. JUSTIFICACIÓN 614 La miel presenta un conjunto de propiedades benéficas para la salud que han sido 615 estudiadas ampliamente, la gran diversidad de compuestos que la conforman crea 616 complejidad las características que le confiere cada una. Las tendencias actuales enfocan 617 al selenio como uno de los elementos probióticos más importantes, su presencia como 618 compuesto que conforma la miel genera incertidumbre sobre su afectación en la alta 619 actividad antioxidante de dicho alimento, por lo que es importante determinar su 620 comportamiento en relación a la cantidad contenida del elemento. Por otra parte, la 621 relación de la presencia de selenio en miel puede ser importante para determinar sus 622 propiedades antitumorales que han sido estudiadas en algunas otras matrices alimentarias 623 con resultados favorables. 29 624 625 4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 626 El selenio es uno de los elementos con propiedades bioactivas más funcionales para el 627 cuerpo humano, está presente en una gran variedad de alimentos y se conoce su relación 628 con las propiedades antioxidantes principalmente. Recientes estudios han demostrado que 629 entre algunas de las propiedades de este metal está la de ser el precursor más importante 630 en la formación de selenoproteínas y enzimas endógenas las cuales traen beneficios a la 631 salud. La producción de miel en México es una de las más importantes a nivel mundial, 632 por su parte el estado de Hidalgo en diferentes regiones, principalmente en el norte tiene 633 una alta generación de este producto, pero su bajo desarrollo tecnológico y poca 634 investigación científica relacionada con las propiedades funcionales de la miel, 635 específicamente en cuanto a su contenido de selenio, del que se sabe tiene presencia, ha 636 generado incertidumbre en cuanto a su relación con la actividad antioxidante y 637 antitumoral, de la cual no se ha sacado el mayor provecho del potencial que tiene este 638 producto. 30 639 640 5. OBJETIVO GENERAL 641 Determinar la correlación que existe entre la presencia de selenio y compuestos bioactivos 642 sobre la actividad antioxidante y antitumoral de diversas mieles. 643 644 645 6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 646 Cuantificar el selenio en las diversas muestras de miel por medio de espectroscopia de 647 absorción atómica acoplada a generador de hidruros. 648 Obtener resultados de actividad antioxidante correlacionados con el selenio a través de los 649 métodos ABTS y DPPH. 650 Determinar la capacidad antitumoral de la miel por medio de inhibición de Agrobacterium 651 tumefaciens en el bioensayo de discos de papa. 652 653 654 7. HIPÓTESIS 655 El selenio contenido en la miel y sus compuestos bioactivos presentan una correlación 656 positiva en cuanto a su actividad antioxidante y antitumoral. 657 31 658 659 8. METODOLOGÍA 660 La parte experimental de la investigación se llevará a cabo en el Laboratorio de 661 Aprovechamiento Agroalimentario del Instituto de Ciencias Agropecuarias. 662 Las muestras de miel (Apis mellifera) serán obtenidas de diferentes regiones del estado de 663 Hidalgo, evaluando inicialmente 5 muestras de San Felipe Orizatlán, Huejutla, Tasquillo, 664 Villa de Tezontepec y Atotonilco el Grande. La obtención de las muestras será durante los 665 meses de marzo y abril del presente año y se almacenarán protegidas de la incidencia de 666 luz y a temperatura ambiente hasta su posterior tratamiento. 667 668 669 9.1 DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES 670 El contenido de fenoles totales se determinará utilizando el método Folin-Ciocalteu 671 (Singleton et al., 1999). Se realizará una dilución de miel 1:10 en agua destilada, la mezcla 672 se homogenizará y se centrifugará a 15,000 rpm en una centrifuga Z 36 HK durante 15 673 min a 4 °C. Un volumen de 0.5 ml del sobrenadante se mezclará con 2.5 ml del reactivo 674 Folin-Ciocalteu (Sigma Aldrich, USA) diluido (1ml de reactivo y 9 ml de agua destilada). 675 Después de 5 minutos de reposo, a la mezcla se le agregarán 2 ml de una solución de 676 carbonato de sodio al 7.5 % y se dejará reposar por 2 horas. La lectura se realizará a 760 677 nm en un espectrofotómetro Jenway 6715 UV. La concentración de fenoles totales se 678 calculará utilizando una curva de calibración de ácido gálico (Fermont, Productos 679 químicos Monterey) en concentraciones de 0-140 ppm (R=0.9979) y expresará en 680 miligramos Equivalentes de Acido Gálico (mg EAG/100 g de miel). 32 681 682 9.2 DETERMINACIÓN DE FLAVONOIDES 683 La determinación del contenido de flavonoides totales de realizará mediante el método 684 Dowd, adaptado por Arvouet-Grand et al, (1994). Donde se pesará 1g de miel y se aforará 685 a 10 ml con metanol puro, se agitará y se centrifugará a 15,000 rpm durante 15 min a 4°C, 686 posteriormente en un tubo de ensayo se colocarán 2 ml del sobrenadante y se agregarán 2 687 ml de una solución de tricloruro de aluminio (AlCl3) (Fermont, Monterey, Mex.) al 2% 688 en metanol y se dejará reposar durante 20 min en la oscuridad, para posteriormente leer 689 las absorbancias a 415 nm. El contenido total de flavonoides será determinado usando una 690 curva de calibración con quercetina con una R=0.9958 con concentraciones de 0-35ppm, 691 (Sigma Aldrich, USA), los resultados fueron expresado en miligramos equivalentes de 692 quercetina mg EQ/100g miel. 693 694 695 696 9.3DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MÉTODO DE ABTS 697 Mediante la decoloración del radical ABTS (Sigma-Aldrich, Canadá) se determinará la 698 actividad antioxidante según lo descrito por (Re et al., 1999), donde el radical ABTS 7 699 μM, se hará reaccionar con persulfato de potasio (K2S2O8) (Mallinckrodt Chemicals, 700 USA) 2.45 μM, en proporción 1:1, dejando la mezcla en agitación durante 16 horas en la 701 oscuridad, cuando el radical se haya formado, se diluirá con etanol al 20% hasta alcanzar 702 una absorbancia de 0.7 ± 0.01 a 734 nm. Una vez estabilizado el radical se colocarán 3 ml 703 de este en un tubo de ensayo y se agregarán 100 μL del extracto de miel, se agitará 704 rápidamente y medirá la absorbancia a los 10 minutos de reacción, se utilizará etanol al 33 705 20% como blanco. Los resultados serán expresados en mg EAA/100 g de miel obtenidos 706 de la curva de calibración con ácido ascórbico (REASOL). 707 708 709 710 9.4 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MÉTODO DE DPPH 711 Para la preparación de la solución de DPPH 0.2 Mm, se pesarán 7.8 mg de DPPH (Sigma 712 Aldrich, USA) y se disolverán en 100 mL de metanol al 80%, la mezcla se dejará en 713 agitación en oscuridad durante dos horas para su completa disolución. En un tubo de 714 ensayo se colocarán 2.5 mL de solución metanólica de DPPH y se harán reaccionar con 715 0.5 mL de solución de miel, la mezcla se dejará reposar en la obscuridad durante 30 716 minutos y se leerán a una absorbancia de 515 nm. La actividad antioxidante será 717 determinada usando una curva estándar con ácido ascórbico. Los resultados se expresarán 718 en miligramos equivalentes de ácido ascórbico (mg EAA)/100g de miel. (Brand-Williams, 719 Cuvelier, & Berset, 1995). 720 721 722 723 9.5 DETERMINACIÓN DE CANTIDAD DE SELENIO POR ESPECTRSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA 724 DIGESTIÓN: Para la determinación de la cantidad de Selenio, se deberá llevar a 725 cabo una digestión previa de las muestras. Muestras de 0.5 g serán pesadas y 726 colocadas en viales de digestión, posteriormente serán descompuestas en un horno 727 de microondas con cavitación usando 4.0 ml de una solución de HNO3 (v/v) con 728 una concentración 7M y también se añadirán 4.0 ml de H2S2 al 30% (v/v). La 34 729 radiación con microondas consistirá en 3 fases: 10 minutos se aplicarán 800 W, 20 730 minutos 800W y 50 minutos bajo ventilación. Las muestras digeridas serán 731 transferidas a frascos volumétricos y de diluirán con 20 ml de agua destilada. Está 732 etapa de la técnica se realizará de acuerdo con lo descrito por Lemos, Venturieri 733 et al. (2018). 734 735 736 737 9.6 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTITUMORAL INDUCIDA POR Agrobacterium tumefaciens 738 OBTENCIÓN DE DISCOS DE ZAHANAORIA: para la evaluación de la 739 actividad antitumoral se seleccionarán ejemplares de zanahoria sanos y frescos que 740 serán esterilizados en hipoclorito de sodio durante 30 segundos. Se obtendrán 741 anillos de 0.5 cm con ayuda de un sacabocados que serán colocados sobre agar- 742 agar al 1% donde se evaluará el crecimiento tumoral. 743 PREPARACIÓN DEL INOCULO DE A. tumefaciens: se utilizará una 744 concentración bacteriana de 3x106 bacterias/ml la cual se comprobará por medio 745 de un conteo sobre Cámara Neubabuer. 746 Los discos de zanahoria sobre agar-agar serán sometidos a pequeñas incisiones 747 donde se procederá a depositar 200 uL de los diferentes extractos e inóculos 748 bacterianos. 749 35 750 751 9.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 752 Los resultados obtenidos se analizarán por un análisis de varianza (ANOVA) utilizando 753 un diseño completamente al azar, por medio de la técnica de comparación de medias de 754 Tukey en donde se buscará encontrar diferencias significativas (p<0.05) entre los 755 tratamientos. 36 756 757 9. REFERENCIAS 758 759 Amir, Y., et al. (2010). "Physico-chemical and microbiological assessment of honey from Algeria." 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Ascórbico Hierro 0.03-4 Manganeso 0.02-2 Cromo 0.01-0.3 Selenio 0.002-0.1 (Solayman, Islam et al. 2016) ≈0.025 <0.01 0.01-0.02 0.01-0.032 0.10-0.20 0.020.11 2.2-2.5 40 876 877 11.ILUSTRACIONES 878 879 880 Ilustración 1 - Distribución de la producción de miel en el estado de Hidalgo (millones de litros/año) SAGARPA (2010). 881 882 883 884 885 Ilustración 2 - Producción de miel del estado de Hidalgo en los últimos años (millones de litros) SAGARPA 2010. 886 41