Separação e Recuperação de Bioprodutos

Recuperação, Separação e
Purificação de Bioprodutos
(Downstream Processing)
EQ Unioeste – Prof.Dr. Sérgio L. de Lucena
Cap.21 : Biotecnologia Industrial Vol.2

Cap.11: Bioprocess Engineering – Shuler
“Purificação de Enzimas” - Biotecnologia Industrial V.3
Introdução
Estratégias para separação e purificação de bioprodutos

•Separação de produtos insolúveis
•Desintegração de células
•Separação de produtos solúveis
•Etapas finais da purificação
Introdução
 A recuperação e purificação de bioprodutos oriundos de processos
fermentativos é uma necessidade para quaisquer processos comerciais.
 As dificuldades presentes nos processos de separação e purificação dependem
fortemente da natureza do produto.
 Os produtos de interesse podem ser a própria biomassa, uma substância
extracelular (produzida no interior da célula e liberado para o meio de cultivo)
ou uma substância intracelular (produzida e armazenada no interior da célula).
 Como o caldo de fermentação é bastante complexo na sua natureza química,
constituindo-se de centenas de substâncias além do produto de interesse,
tornam-se necessárias várias etapas de separação e purificação pois muitas
vezes o produto final deve ter um alto grau de pureza, como por exemplo os
fármacos.
 As etapas de tratamentos finais (downstream processing) representam,
normalmente, os maiores custos envolvidos na produção de um bioproduto.
 São necessárias técnicas e metodologias de engenharia química bastante
especializadas, pois muitas vezes os bioprodutos são compostos bastantes
frágeis (por exemplo, sensíveis ao calor) e normalmente se encontram bastante
diluídos entre outras substâncias no caldo fermentado.
Operações Unitárias
Principais operações unitárias utilizadas para recuperar e purificar bioprodutos
de acordo com o fator principal que afeta a separação (Fig.11.1 - Shuler)
O produto é extracelular ou
intracelular ?
 Se o produto for a biomassa (ou produtos
intracelulares)
 Toda a ênfase é dada na separação da parte sólida
contendo o produto;
 Se o produto for extracelular (P está
dissolvido no caldo fermentado)
 Toda a ênfase é dada na separação da parte líquida e
logo após remove a maior parte da água
(concentração).
Recuperação do Produto
.
Produto é Desintegração Fração Sólida
intracelular celular (subprodutos)
Fração
sólida
Fração Líquida
Caldo (onde está o produto)
Fermentado
Fração Produto está Remoção de Tratamentos

líquida dissolvido no parte da água posteriores
meio (extracelular) (concentração)
Separação de
produtos intracelulares
 A separação de sólidos tais como a biomassa, partículas
insolúveis e macromoléculas é normalmente a primeira
etapa na recuperação do produto desejado;
 O caldo fermentado poderá sofrer tratamentos

(químicos ou físicos) para facilitar a separação dos
sólidos: Ex.: ajustes de pH, de força iônica, adição de
coagulantes e floculantes, tratamentos térmicos, etc;
Separação da Biomassa
Operações Unitárias mais comuns:
 Filtração;
 Centrifugação;
 Coagulação e floculação;
 Filtração
É uma operação eficiente e barata para se separar material
particulado e células presentes no caldo de fermentação.
Ex.: Filtros à vácuo com
tambor rotativo contínuos
 Filtração tangencial: quando a alimentação escoa

tangencialmente à superfície do meio filtrante.
 Centrifugação
Utiliza forças centrífugas
para separar material
particulado na faixa de
100 a 0,1μm.
•Centrífugas a disco;
•Centrífugas tubulares;
 Coagulação e Floculação
Utilizada para formar agregados de células.
Coagulação: formação de pequenos flocos utilizando agentes

coagulantes (eletrólitos);
Floculação: é a aglomeração de pequenos flocos formando partículas
maiores e sedimentáveis. Utiliza-se agentes floculantes como
polieletrólitos (poliacrilamida, sulfato de poliestireno, etc) ou sais
como Cloreto de Cálcio.
Coagulação e Floculação: geralmente é aplicada antes da

centrifugação, filtração ou sedimentação pois torna esses processos
de separação mais eficientes.
Desintegração das Células
 Operação necessária quando o produto (a molécula
alvo) é intracelular;
 Desintegração pode ser por métodos mecânicos ou por
métodos não-mecânicos;
 O produto não pode perder sua atividade biológica;
 Promove a liberação do produto para o meio externo
para posterior separação;
 Difícil implementação em larga escala para micro-
organismos muito pequenos;
 Métodos Mecânicos:
 Vibradores Ultrassônicos (sonicadores): eficientes para
bactérias gram-negativas e bacilos. Pouco eficiente para
bolores. Pode desnaturar biomoléculas mais sensíveis.
 Extrusores homogeneizadores: pasta de células é
forçada a passar através de pequenos orifícios a partir de
uma zona de alta pressão. A diminuição brusca da
pressão promove o rompimento da parede e membrana
celular;
 Moinho de bolas: biomassa e submetida a ação de forças
cisalhantes e de impacto de pequenas bolas.
 Métodos Não-Mecânicos:
 Choque osmótico;
 Ciclos de congelamento e descongelamento;
 Tratamento enzimático com Lisozima;
Separação de
Produtos Solúveis
 Após a desintegração das células, o conteúdo celular
(resíduos celulares e o produto) será liberado para o
meio externo.
 Separa-se a parte sólida por Ultra-filtração ou Ultra-
centrifugação;
 O produto encontra-se dissolvido na parte líquida de
onde deve ser recuperado utilizando métodos
adequados;
Separação de
produtos solúveis
 O produto dissolvido na parte líquida
pode ser recuperado utilizando os
seguintes métodos:
 Extração Líquido-Líquido
 Extração em sistema duas fases aquosas (SDFA)
 Precipitação
 Adsorção
 Separação por membranas: diálise e ultrafiltração
 Cromatografia
Separação de
produtos solúveis
 Extração Líquido-Líquido
 O líquido extraente deve ser imiscível com o
caldo e deve possuir um alto coeficiente de
distribuição (KD) para o produto.
 Coeficiente de Distribuição: YL
YL= concentração na fase leve (solvente orgânico)
KD 
XH= concentração na fase pesada (caldo aquoso)
XH
 Solvente deve ser não-tóxico, seletivo e

barato: ex.: acetato de amila ou isoamila;
Separação de
produtos solúveis
 Extração em Sistema Duas Fases Aquosas (SDFA)
Duas fases aquosas podem ser formadas com a adição de
polímeros incompatíveis como por ex.: polietileno glicol (PEG) e
Dextrana. As fases contendo PEG e dextrana têm mais de 75%
água e são imiscíveis. Ideal para manter a atividade biológica de
produtos sensíveis como enzimas e outras proteínas. Haverá uma
solubilidade preferencial por uma das fases.
 Exemplos de Sistemas Aquosos imiscíveis:
 PEG-Dextrana: PEG-Dx
 PEG-sal (PEG-Fosfato de K, PEG-Sulfato de Mg, PEG-Citrato de
Na, etc)
 Polipropilenoglicol-Dextrana: PPG-Dx
Separação de
produtos solúveis
 Precipitação
 Utilizada para separar moléculas protéicas de
outros componentes presentes num meio líquido.
 A precipitação de proteínas ocorre por:
 Efeito Salting-out: adição de sais como sulfato de
amônio em altas concentrações (>1,5M)
 Redução da solubilidade em baixas temperaturas
(<5ºC) com a adição de solventes como etanol ou
acetona.
Separação de
produtos solúveis
 Adsorção
 Moléculas do produto são transferidas da fase líquida
(onde estão dissolvidas) para uma fase sólida porosa
(matriz) que contém grupos adsorventes (iônicos,
hidrofóbicos, afinidade,etc);
 Há uma relação de equilíbrio entre a concentração na fase
líquida e a concentração na fase sólida adsorvente
(isotermas de adsorção);
 Produto é recuperado posteriormente promovendo-se sua
dessorção da matriz adsorvente (ex. mudando-se o pH,
força iônica, etc).
Separação de
produtos solúveis
Separação por membranas: Diálise e Ultrafiltração
 Diálise:
 É um método de separação por membranas seletivas para
determinados tamanhos de moléculas. As moléculas menores
difundem-se através dos poros da membrana enquanto que as maiores
ficam retidas até que um equilíbrio seja alcançado. Ideal para
dessalinizar soluções protéicas (o sal tem baixa MM).
 Ultrafiltração
 Consiste no transporte de soluções através de membranas com poros
de 0,001 a 0,1μm e fluxo de filtrado entre 10 a 200 L/h/m2 e pressão
transmembrana de 100 a 500 kPa.
 A água e outras moléculas pequenas (de acordo com o diâmetro de
corte) passam através da membrana.
 Separa e concentra. Não purifica.
Separação de
produtos solúveis
 Cromatografia
 Separação de vários componentes presentes num meio
líquido (fase móvel) que passa através de um leito fixo em
colunas contendo partículas sólidas porosas (fase
estacionária);
 A fase estacionária contém grupos específicos que
interagem com os solutos;
 Os diferentes níveis de interações provocam a separação
dos componentes;
 Componentes com interações mais fortes são mais lentos
enquanto os que possuem interação mais fraca são mais
rápidos e saem primeiro.
Separação de
produtos solúveis
 Tipos de cromatografia mais comuns:
 Adsorção (ADC);
 Partição Líquido-Líquido (LLC);
 Troca Iônica (IEC);
 Afinidade (AFC);
 Hidrofóbica (HC);
 Filtração em Gel (GFC);
Etapas Finais para
Purificação
 Cristalização;
 Secagem;
FIM

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Estratégias para separação e purificação de bioprodutos

Fração Produto está Remoção de Tratamentos

 O caldo fermentado poderá sofrer tratamentos

 Filtração tangencial: quando a alimentação escoa

Coagulação: formação de pequenos flocos utilizando agentes

Coagulação e Floculação: geralmente é aplicada antes da

 Solvente deve ser não-tóxico, seletivo e

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