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Universidade Estadual de Ponta Grossa Departamento de Biologia Estrutural, Molecular e Gentica Disciplina de Microbiologia Prof. Denis Leandro de Freitas

Antibiograma

Objetivos: Compreender a realizao e a finalidade das tcnicas utilizadas nos testes de sensibilidade aos antimicrobianos; Realizar e interpretar o teste de difuso em disco no laboratrio;

Introduo:

Como sabemos, as diferentes espcies e cepas bacterianas exibem diferentes padres de sensibilidade aos agentes antimicrobianos para uso in vivo. Isso acontece devido aos mecanismos de resistncia exibidos, sejam eles mecanismos naturais ou adquiridos nos processos de transferncia de informaes genticas entre bactrias. Dessa forma, muitas vezes necessrio determinar no laboratrio a sensibilidade ou resistncia de bactrias a um ou vrios antimicrobianos diferentes. Esse teste de avaliao da sensibilidade bacteriana aos antimicrobianos conhecido como Antibiograma. O antibiograma pode ser realizado por duas metodologias principais:

1) Mtodo da diluio em tubo: Concentrao Inibitria Mnima (CIM)

Nesse teste, uma soluo padro do antimicrobiano a ser testado diluda seriadamente em tubos contendo meio de cultura lquido (Caldo Meller-Hinton). Aps o preparo das diluies, a cada tubo adicionado o mesmo volume de uma suspenso da bactria a ser testada. Esta suspenso preparada de forma que a turvao inicial do inculo seja aproximadamente igual a uma DO625nm = 0,08 a 0,10 (conforme descrito mais detalhadamente abaixo); antes da adio aos tubos, esta suspenso ainda diluda 1:100 em Caldo Meller-Hinton. Aps o preparo das diluies do antimicrobiano e a adio do inculo, os tubos so incubados normalmente a 37C por um perodo de 18-24 horas. Nesse teste, quanto maior for a concentrao do antimicrobiano no tubo, menos a bactria crescer gerando um padro caracterstico de turvao. Aps a incubao dos tubos, a CIM considerada o tubo que

contm a menor concentrao do antimicrobiano (em g/mL) que inibe completamente o crescimento da bactria, ou seja, a turvao observada no tubo (Figura 1). O mtodo da CIM pode ser realizado em tubos de cultura convencionais ou ento em microplacas de 96 poos. Este mtodo considerado quantitativo e os valores determinados podem auxiliar no ajuste da dose teraputica de um antimicrobiano utilizado no tratamento de uma infeco em particular.

Figura 1

2) Mtodo da difuso em disco: Kirby-Bauer

Este mtodo emprega antimicrobianos impregnados em discos de papel de filtro em quantidades conhecidas. Este teste baseia-se na capacidade do antimicrobiano em se difundir em meio de cultura slido e inibir o crescimento bacteriano ao redor do disco. Neste teste, uma suspenso da bactria a ser testada preparada pelo cultivo da mesma em meio lquido (Caldo Meller-Hinton ou Caldo Trptico de Soja) ou pela ressuspenso de colnias em meio lquido ou soluo salina estril. Em ambos os casos, este inculo deve ter sua concentrao padronizada e isto realizado pelo ajuste da turvao do mesmo. No mtodo de Kirby-Bauer, o inculo deve apresentar uma turvao equivalente a uma DO625nm = 0,08 a 0,10. Isto equivale a uma densidade populacional prxima de 108 UFC/mL. A leitura da turvao pode ser feita em espectrofotmetro ou pela comparao com a turvao dada pelo tubo 0,5 da Escala de McFarland. Essa escala corresponde a um conjunto de tubos contendo concentraes conhecidas de uma suspenso de BaSO4. Aps o preparo do inculo, a suspenso bacteriana padronizada semeada de maneira homognea na superfcie de placas contendo gar Meller-Hinton ou gar Trptico de Soja, com auxlio de um "swab" (zaragatoa) estril. O meio Meller-Hinton o mais adequado para

esta metodologia, pois o meio que menos interfere na difuso e na atividade dos antimicrobianos. Aps a semeadura das placas, os discos contendo os antimicrobianos so depositados na superfcie do gar, em condies estreis, com auxlio de uma pina. As placas so incubadas e, medida que o antimicrobiano difunde de forma radial no meio, podem se formar halos de inibio de crescimento ao redor do disco, de tamanho varivel de acordo com o antimicrobiano e de acordo com a sensibilidade da bactria a este (Figura 2).

Figura 2

A inexistncia de halo de inibio representa resistncia total da bactria ao antimicrobiano no disco. No entanto, quando ocorre o halo, a sensibilidade somente pode ser afirmada aps a medio do dimetro da zona de inibio do crescimento e comparao do valor com aquele existente em tabelas padronizadas. Estes critrios so estabelecidos pelo CLSI ("Clinical and Laboratory Standards Institute"). O mtodo de Kirby-Bauer o mais utilizado. No entanto um mtodo muito sujeito a interferentes. Por isso, alguns cuidados devem ser tomados: pH do meio: deve estar entre 7,2 e 7,4; Espessura do meio: deve ser de aproximadamente 4mm; Concentrao do inculo: deve apresentar aproximadamente 108 UFC/mL Temperatura de incubao: deve estar entre 35 e 37C; Crescimento bacteriano: um mtodo utilizado para bactrias de crescimento rpido (24 a 48 horas), pois tempos de incubao muito elevados podem inativar o antimicrobiano testado.

Atualmente, mtodos mais sofisticados foram desenvolvidos para realizao dos testes de sensibilidade aos antimicrobianos. Um exemplo o E-test, um mtodo que associa o princpio da concentrao inibitria mnima e o princpio da difuso em meio slido. Nesse teste, placas de gar Meller-Hinton so semeadas da mesma forma como no mtodo de Kirby-Bauer. No entanto, sobre o gar so colocadas tiras plsticas especiais contendo o antimicrobiano a ser testado. Essas tiras contm, na face voltada para o meio, um gradiente de concentrao do antimicrobiano e apresentam, na face voltada para cima, uma escala da respectiva concentrao inibitria mnima (em g/mL). Aps a incubao, quanto maior for a concentrao do antimicrobiano, maior ser a zona de inibio do crescimento. No entanto, como se trata de uma tira, a rea total de inibio de crescimento apresenta uma forma elptica. O ponto da tira que demarca a concentrao a partir do qual o crescimento bacteriano inibido representa a concentrao inibitria mnima (CIM) (Figura 3).

Figura 3

Materiais Necessrios:

Culturas de Escherichia coli em placas de gar Nutriente; Agulhas bacteriolgicas Tubos com soluo salina estril Estante para tubos Tubos referentes ao padro 0,5 da Escala de McFarland Carto escuro para ajuste da turvao do inculo "swab" Placas de gar Meller-Hinton

Pinas metlicas Discos 30g com (TET30), os antimicrobianos: 5g Penicilina G 10g (PEN10), Tetraciclina Ciprofloxacina (CIP5) e Sulfonamidas 300g (SUL300)

Bico de Bunsen Canetas para identificar placas Recipiente com desinfetante

Procedimento:

1) Preparo do Inculo:

Com a agulha bacteriolgica devidamente flambada, ressuspender colnias isoladas de E. coli em soluo salina estril; A cada colnia transferida, comparar a turvao da suspenso com o tubo padro 0,5 da Escala de McFarland, utilizando um carto de fundo escuro; No se esquecer de homogeneizar muito bem o tubo de McFarland!

Se a turvao ultrapassar a escala, ajustar com soluo salina estril; Utilizar o inculo em at 15 minutos.

2) Semeadura das placas:

Sob condies estreis, introduzir um "swab" estril na suspenso bacteriana (obtida na etapa anterior) e remover o excesso de inculo comprimindo o "swab" contra a parede interna do tubo;

Semear na superfcie da placa de gar Meller-Hinton, de forma homognea, em trs direes diferentes; Deixar a placa em temperatura ambiente por no mnimo 5 minutos e no mximo 15 minutos, para que o inculo seja completamente absorvido pelo gar antes da aplicao dos discos.

3) Aplicao dos discos: Flambar rapidamente uma pina metlica e coletar um disco de Penicilina G 10g (sob condies estreis) depositando-o na superfcie do gar, mantendo a placa na posio horizontal; Pressionar suavemente o disco com auxlio da pina, para garantir a aderncia do mesmo no meio de cultura; Uma vez colocado o disco, no remover do lugar, pois o incio da difuso do antimicrobiano imediata! Repetir o procedimento para os discos de Tetraciclina 30g, Ciprofloxacina 5g e Sulfonamidas 300g, totalizando 4 discos bem distribudos na placa;

Colocar no mximo 5 discos em placas de 90mm de dimetro e no mximo 12 discos em placas de 150mm de dimetro. Vedar as placas e incub-las na posio invertida em estufa a 37C por 16 a 18 horas.

4) Leitura das placas:

Posicionar a placa contra uma superfcie escura e medir o dimetro do halo de inibio do crescimento, com auxlio de uma rgua no fundo da placa; Considerar o halo de inibio a partir do ponto onde no observado crescimento bacteriano; Interpretar cada antimicrobiano referindo-se bactria testada como Sensvel (S), Intermediria (I) ou Resistente (R), de acordo com a comparao das leituras dos halos com os critrios estabelecidos nas tabelas padronizadas.