Aula 6 2024

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
Faculdade de Ciências e Letras
NITROGÊNIO E PROTEÍNAS
Disciplina: Análise de Alimentos EBT 0414
Prof. Cassia Roberta Malacrida Mayer

[email protected]
Análise de Alimentos
PROTEÍNAS
“Compostos nitrogenados orgânicos complexos, presentes em

todas as células vivas, formados fundamentalmente por C, H, O
e N. Contém ainda S, P, Cu, etc. Os compostos nitrogenados que
entram na formação das proteínas são conhecidos como
aminoácidos (aas), compostos orgânicos que contêm grupo
ácido (carboxílico) e amínico”.
PROTEÍNAS NOS ALIMENTOS
 Função nutricional;
 Propriedades organolépticas: textura, cor, sabor e aroma;

 Podem estar combinadas com lipídios e carboidratos;
 Propriedades emulsificante, espumante e reológicas.
PROTEÍNA ANIMAL vs VEGETAL

ANÁLISE DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS
A determinação de proteína pode ser feita pela determinação de um

elemento (geralmente carbono e nitrogênio) ou grupo (aminoácidos e
ligações peptídicas).
• Métodos químicos
• Métodos físicos (índice de refração,

densidade específica, tensão superficial,
condutividade, entre outros) => pouco
utilizados
MÉTODOS QUÍMICOS
MÉTODO DE KJELDAHL
Desenvolveu em 1883 o processo básico para

determinação de nitrogênio orgânico total. Os passos
incluem:
- Digestão: H2SO4 a 350 - 400ºC + catalisador
Johann - Neutralização e destilação
Kjeldahl
(1849 -1900) - Titulação
- Conversão do teor de nitrogênio para teor de proteína
Esse método determina N orgânico total: N proteico e N

não-proteico.
MÉTODO DE KJELDAHL
• O método de Kjeldahl baseia-se na transformação do nitrogênio da

amostra em sulfato de amônio através da digestão com ácido
sulfúrico e posterior destilação com liberação da amônia, que é
fixada em solução ácida e titulada.
ETAPA DE DIGESTÃO
K2SO4: aumenta o ponto de ebulição do H2SO4 (de 337ºC para mais de

400ºC), torna a digestão mais eficiente;
CuSO4: Catalisador - Acelera o processo de oxidação da matéria orgânica.

MICRODIGESTOR DE KJELDAHL
ETAPA DE DIGESTÃO
ETAPA DE NEUTRALIZAÇÃO E DESTILAÇÃO
Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a

liberação da amônia dentro de um volume
conhecido de uma solução de ácido bórico e
indicador (alaranjado de metila + verde de
bromocresol) formando borato de amônia.
DESTILADOR DE NITROGÊNIO KJELDAHL

ETAPA DE NEUTRALIZAÇÃO E DESTILAÇÃO

ETAPA DE TITULAÇÃO
O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCl

ou H2SO4) padronizada.
Titulometria de neutralização:
mols de N = mols de HCl

mN / 14 = VHCl x MHCl
mN = VHCl x MHCl x 14
% proteína = % N x fator de conversão

CONVERSÃO DO TEOR DE N PARA PROTEÍNA BRUTA
A maioria das proteínas possui em média 16% de nitrogênio,

portanto:
16g N ___ 100g proteínas

1g N ____ Xg
Xg = 100/16 = 6,25
é obtido pela
O teor de proteína bruta multiplicação do teor de N
de um alimento total pelo fator de
conversão (6,25)
Conteúdo de proteína para alimentos específicos

MÉTODO DE KJELDAHL
VANTAGENS
– Aplicável a todos os tipos de alimentos
– Relativamente simples
– Não é caro
– É um método oficial para a determinação de proteínas
– Pode ser utilizado para análise de ug de proteína (micro Kjeldhal)
DESVANTAGENS
– Mede nitrogênio orgânico total (não apenas N de proteínas)
– Demorado
- Utiliza reagentes corrosivos
MÉTODO DE KJELDAHL
Método micro Kjeldahl

Digestão :
1) Pesar em balança analítica a quantidade de amostra e transferir

para tubo de Kjeldahl;
2) Adicionar cerca de 2,5 g de mistura catalítica e 7 mL de ácido
sulfúrico p.a.;
3) Aquecer o tubo em bloco digestor da seguinte forma: no caso de
amostras líquidas, aquecer, a princípio lentamente (iniciar com
temperatura em torno de 120ºC por cerca de 30 minutos); logo após,
aumentar para 250ºC (em torno de 30 minutos) elevando
gradativamente para 450ºC até que o líquido se torne límpido e
transparente, de tonalidade azul-esverdeada. Para amostras com
baixa umidade (ex. leite em pó), o aquecimento é iniciado a 250ºC
(em torno de 30 minutos) e elevado a 450ºC da mesma forma
descrita para amostras líquidas.
MÉTODO DE KJELDAHL
Destilação:
1) Acoplar ao destilador um erlenmeyer contendo cerca de 20 mL de

solução de ácido bórico a 4 % com 4 ou 5 gotas de solução de
indicador misto (erlenmeyer receptor do destilado);
2) Adaptar o tubo de Kjeldahl ao destilador e adicionar a solução de
hidróxido de sódio a 50 % até que a mesma se torne negra (cerca de
20 mL);
3) Proceder à destilação. Recolher o volume necessário para a
completa destilação da amônia (aproximadamente 75 mL).
MÉTODO DE KJELDAHL
Titulação:
Titular com solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido

clorídrico 0,1 N até a viragem do indicador (coloração verde à leve
tom róseo - avermelhado).
MÉTODOS QUÍMICOS POR GRUPOS
MÉTODO DO BIURETO
 Ligações peptídicas
(duas ou mais) formam
um complexo de cor
roxa com sais de cobre
em soluções alcalinas
 A intensidade da cor é proporcional a quantidade de proteínas
-> intensidade da cor é medida

MÉTODO DO BIURETO
VANTAGENS
– É simples, rápido e barato
– Por envolver uma reação com a ligação peptídica, o método determina
proteína, ao contrário do método de Kjeldahl que determina N total
DESVANTAGENS
– A necessidade de uma curva de calibração com um padrão conhecido
de proteína (com o mesmo tipo de proteína que está sendo submetida
a análise)
– A cor formada no complexo não é idêntica para todas as proteínas,
porém os desvios causados são menores do que em outros métodos
colorimétricos
MÉTODO DO BIURETO
Exemplo
– Uma alíquota de amostra foi dissolvida no reativo de biureto (cobre e

hidróxido de sódio) e o volume completado para 100 mL em balão
volumétrico
– Filtrou-se e a absorbância foi medida a 540 nm (resultado = 0,12)
– Utilizando uma curva padrão (abs x mg de proteína) calculou-se a

quantidade de proteína na amostra
Abs = 0,0795*Prot + 0,0055
0,12 = 0,0795*Prot + 0,0055
Prot = 1,44 mg/L

MÉTODO POR FENOL (Folin-Ciocalteau – Lowry)
• Baseia-se na interação das proteínas com o reagente fenol e

cobre em condições alcalinas;
• Uma mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico,
(reagente Folin-Ciocalteau) sofre uma redução quando reage com
proteínas, na presença do catalisador cobre (II), e produz um
composto com absorção máxima em 750 nm, desenvolvendo uma
cor azul cuja intensidade será medida e comparada com uma
curva padrão.
MÉTODO POR FENOL
VANTAGENS:
• Sensibilidade: 100 vezes maior que o biureto;
• Específico: menos interferentes.
DESVANTAGENS:
• Lento;
• Necessita de um período de incubação;
• A intensidade da cor pode variar de acordo com a composição da
proteína;
• Necessita de curva padrão com proteína conhecida.
ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA

Este método é baseado no fato de que as proteínas apresentam
absorção na região de 280 nm (fenilalanina, cisteína, cistina, metionina,
triptofano, histidina e tirosina) e na região abaixo de 220 nm (ligação
peptídica);

No entanto, em pH neutro e comprimento de onda de 280 nm, somente
os aminoácidos triptofano, tirosina e cistina possuem uma absortividade
molar significativamente grande.
ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA
VANTAGENS:

Simples e rápido;

Não destrutivo.
DESVANTAGENS:

Os resultados não são muito precisos porque eles vão depender da
concentração dos três aminoácidos na composição da proteína;

Está sujeito a muitos interferentes;
MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS
Baseada na turbidez causada pela proteína por algum agente

precipitante, como: ácido tricloroacético, ferricianeto de potássio e
ácido sulfossalicílico.
Vantagens: rápido e simples para amostras líquidas, onde a proteína

está em solução.
Desvantagens:
Para amostras sólidas a proteína deve ser extraída para uma
solução;
Os resultados variam com o tipo de proteína;
Pode haver precipitação de outras substâncias com as proteínas,
causando interferência no método.
MÉTODO DE DYE-BINDING
• Amostra é tratada com corante (excesso) que reage

quantitativamente com proteína para formar um complexo
insolúvel que pode ser separado. O excesso de corante em solução
é medido colorimetricamente (quantidade de proteínas = corante
adicionado – corante livre);
• Utilizado em amostras de grãos de cereais, sementes oleaginosas,

produtos vegetais e animais e laticínios;
• Corantes utilizados: laranja G, laranja 12, vermelho A, preto

búfalo e preto amino 10B.
VANTAGENS:
• Boa correlação com o método oficial de Kjeldahl;
• Exatidão;
• Economia.
• Em 2008 foi desenvolvido equipamento específico

- Método prático e rápido (2 a 3 min de análise)
- Muito utilizado na análise de leite
O exemplo acima mostra que, na prática, a adição de melamina (0,3%) permite ao

fraudador um ganho em volume de 36%. Isso devido à adição de água para diluição,
que é feita para que o resultado de proteína medido por Kjeldalh mantenha-se
próximo de 3,25% (valor esperado para amostras de leite).

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Prof. Cassia Roberta Malacrida Mayer

“Compostos nitrogenados orgânicos complexos, presentes em

PROTEÍNAS NOS ALIMENTOS

 Propriedades organolépticas: textura, cor, sabor e aroma;

PROTEÍNA ANIMAL vs VEGETAL

ANÁLISE DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS

A determinação de proteína pode ser feita pela determinação de um

• Métodos físicos (índice de refração,

Desenvolveu em 1883 o processo básico para

Esse método determina N orgânico total: N proteico e N

• O método de Kjeldahl baseia-se na transformação do nitrogênio da

K2SO4: aumenta o ponto de ebulição do H2SO4 (de 337ºC para mais de

CuSO4: Catalisador - Acelera o processo de oxidação da matéria orgânica.

ETAPA DE NEUTRALIZAÇÃO E DESTILAÇÃO

Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a

DESTILADOR DE NITROGÊNIO KJELDAHL

ETAPA DE NEUTRALIZAÇÃO E DESTILAÇÃO

O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCl

mols de N = mols de HCl

% proteína = % N x fator de conversão

CONVERSÃO DO TEOR DE N PARA PROTEÍNA BRUTA

A maioria das proteínas possui em média 16% de nitrogênio,

16g N ___ 100g proteínas

Conteúdo de proteína para alimentos específicos

Método micro Kjeldahl

1) Pesar em balança analítica a quantidade de amostra e transferir

Método micro Kjeldahl

1) Acoplar ao destilador um erlenmeyer contendo cerca de 20 mL de

Método micro Kjeldahl

Titular com solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido

MÉTODOS QUÍMICOS POR GRUPOS

 A intensidade da cor é proporcional a quantidade de proteínas

-> intensidade da cor é medida

– Uma alíquota de amostra foi dissolvida no reativo de biureto (cobre e

– Utilizando uma curva padrão (abs x mg de proteína) calculou-se a

Abs = 0,0795*Prot + 0,0055

0,12 = 0,0795*Prot + 0,0055

Prot = 1,44 mg/L

MÉTODOS QUÍMICOS POR GRUPOS

MÉTODO POR FENOL (Folin-Ciocalteau – Lowry)

• Baseia-se na interação das proteínas com o reagente fenol e

MÉTODO POR FENOL

MÉTODOS QUÍMICOS POR GRUPOS

MÉTODOS QUÍMICOS POR GRUPOS

MÉTODOS QUÍMICOS POR GRUPOS

Baseada na turbidez causada pela proteína por algum agente

Vantagens: rápido e simples para amostras líquidas, onde a proteína

MÉTODOS QUÍMICOS POR GRUPOS

• Amostra é tratada com corante (excesso) que reage

• Utilizado em amostras de grãos de cereais, sementes oleaginosas,

• Corantes utilizados: laranja G, laranja 12, vermelho A, preto

• Em 2008 foi desenvolvido equipamento específico

O exemplo acima mostra que, na prática, a adição de melamina (0,3%) permite ao

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