Biologia Molecular

BIO12412L
BIO2690L

Ana Alexandre
[email protected]

Catarina Mateus
[email protected]
Clonagem
Clonagem de genes - produção de muitas cópias idênticas de uma molécula de DNA por replicação.
• A descoberta do DNA circular dos plasmídeos no início da década de 1950 marca o início da clonagem de genes.
• A versatilidade dos plasmídeos circulares de DNA permitiu a inserção de material genético externo e a sua multiplicação
(por replicação do DNA) em células bacterianas.

• A descoberta das enzimas de restrição (Prémio Nobel em

1978 atribuído a Werner Arber, Dan Nathans e Hamilton
Smith) permitiu avançar na engenharia genética e inserir
genes externos codificadores de proteínas humanas.

As enzimas de restrição representam

um mecanismo de defesa usado pelas
bactérias para se defenderem da infeção
dos vírus. DNA

As enzimas de restrição clivam o DNA

em locais específicos (e portanto de
forma previsível).
Clonagem
Alguns objetivos da clonagem:

- isolar um fragmento de DNA de interesse

- isolar diferentes fragmentos de uma mesma amostra – construção de bibliotecas de genes
- sequenciação
- produção de uma proteína (por exemplo, o gene da insulina humana é expresso em bactérias E. coli para produzir a
insulina usada pelos diabéticos).

DNA
Clonagem
Vetores de clonagem
Plasmídeos – DNA circular com replicação independente do cromossoma, muito presentes em bactérias.

Bacteriófagos– vírus que infetam bactérias. Permite a clonagem de fragmentos maiores que os plasmídeos.

DNA cromossómico

Plasmídeo
Clonagem
Vetores de clonagem – para grandes fragmentos de DNA

Os fosmídeos são vectores que podem

transportar inserções de 35 a 45-kb.
São híbridos modificados de DNA de
fago λ e DNA de plasmídeo F bacteriano
(funcionam como fagos).

Cromossoma artificial bacteriano (BAC).

Derivado do plasmídeo F que pode
transportar inserções que variam de 100 a
200 kb, embora o vetor em si tenha apenas
~7 kb.
Clonagem - plasmídeos
• Duas ou mais moléculas de DNA provenientes de diferentes organismos podem ser ligadas e originar uma só molécula
de DNA, designada por DNA recombinante (rDNA).
Clonagem - plasmídeos
Digestão
com enzimas
de restrição
Quando o plasmídeo e o DNA de interesse
são digeridos com a mesma enzima de
restrição, então os extremos de ambas as
moléculas são compatíveis para ligação.

Há hibridação por complementaridade das

bases azotadas. Ligação
A ligação entre o backbone das diferentes
moléculas de DNA é feita pela enzima DNA
ligase.
Clonagem - plasmídeos
Principais passos:

-Isolamento de material genético do DNA recombinante

organismo de interesse.
-Restrição do DNA plasmídico (vetor de
clonagem) e do fragmento de interesse
Colocação na célula
(por exemplo, o gene que se pretende
hospedeira
clonar) usando a mesma enzima de
restrição.
Multiplicação
-Ligação do fragmento de DNA a ser
clonado com o vetor usando a enzima DNA Multiplicação da
ligase. célula hospedeira
-Tornar a célula hospedeira competente e
introduzir o vetor recombinante no
hospedeiro através de um processo Divisões celulares originam
denominado “transformação”. múltiplos clones
-Seleção de clones
Clonagem - plasmídeos
• Nem todas as bactérias incorporam plasmídeos;
os plasmídeos podem não possuir os
fragmentos desejados.
• Seleção das bactérias portadoras de plasmídeo
com fragmento desejado:

- Um plasmídeo inclui um gene que confere

resistência a um dado antibiótico (a verde), que
permite que as bactérias sobrevivam.
- As bactérias portadoras de plasmídeo são
selecionadas em placas com nutrientes contendo o
antibiótico.
- deve ser ainda verificado se o plasmídeo contém
o fragmento desejado.
Clonagem - bacteriófagos
Infeção lítica de uma célula bacteriana por um fago

As infeções mais comuns podem acontecer de forma muito

rápida e são de tipo lítico, uma vez que implicam a lise
(destruição) celular.

No ciclo lítico, o fago infeta a célula hospedeira, através da

ligação da cauda a recetores específicos localizados na
superfície da célula e em seguida injecta o seu DNA para o
interior da célula. Dá-se uma fase de replicação de DNA e
síntese proteica, em que os componentes que compõem um
fago são sintetizados. Os fagos recém sintetizados são
libertados da célula hospedeira após a sua lise.

A rutura celular, ou lise, provoca a libertação de centenas de

novos fagos, os quais podem infetar outras células hospedeiras
próximas. Desta forma, alguns ciclos de infeção lítica podem
permitir que fagos se espalhem rapidamente por uma
população bacteriana.
Clonagem - bacteriófagos
Infeção lisogénica de uma célula bacteriana por um fago
Caracterizam-se pela inserção da molécula de DNA do fago no
genoma da bactéria hospedeira, lá permanecendo (como
profago) até se desencadear um ciclo lítico.

- As duas primeiras etapas (ligação e injeção do DNA) são

semelhantes ao ciclo lítico.
- Assim que o DNA do fago está dentro da célula, não é
imediatamente copiado ou expresso para sintetizar proteínas,
integra-se no cromossoma bacteriano. O DNA fágico
integrado, denominado profago, não é ativo: os seus genes não
são expressos e não levam à produção de novos fagos.
- Cada vez que a célula hospedeira se divide, o profago é
copiado com o DNA do hospedeiro.
- Em determinadas condições, o profago pode tornar-se ativo e
sair do cromossoma bacteriano, desencadeando as etapas
seguintes do ciclo lítico: replicação do DNA e síntese proteica,
montagem do fago e lise.
 Artigo científico – clonagem de genes

Título

Autores
Enquadramento

• A difteria é uma doença infecciosa das vias aéreas causada pela bactéria
Corynebacterium diphtheriae.

• A toxina da difteria (DT) é o agente que dá a C. diphtheriae a sua

patogenicidade.

• A DT é uma das toxinas bacterianas mais bem estudadas: polipéptido

constituído por dois fragmentos distribuídos entre um domínio catalítico
(Fragmento A) e outro sem atividade catalítica com funções na translocação do
fragmento A para o interior das células (Fragmento B).

• Foram isoladas muitas variantes naturais (resultantes de mutação) da DT com

toxicidade reduzida, mas ainda assim capazes de estimular a imunogenicidade
(capacidade de uma substância desencadear uma resposta imunitária do
organismo) -> genericamente chamadas cross-reacting materials (CRMs).
CRM197

• A CRM197 tem sido usada no desenvolvimento de vacinas (uma vez que a toxicidade foi muito reduzida).

• A CRM197 foi isolada em simultâneo com outros CRMs (CRM30, CRM45, CRM176, e CRM228) mas apresentava a
vantagem de não possuir atividade catalítica, sendo menos tóxica que a DT (por mutação no fragmento A), mas
mantendo a capacidade de ligação à membrana celular (ausência de mutação no fragmento B) → selecionada
para o desenvolvimento de vacinas.

• CRM197 - A mutação no fragmento A (o domínio catalítico) corresponde a uma substituição na posição 52 de

glicina por ácido glutâmico. O seu elevado grau de pureza, estrutura homogénea e capacidade de conjugação
(por ausência de mutação no fragmento B), permitiram a produção de múltiplas vacinas conjugadas bem definidas
e caracterizadas.

• No entanto, O CRM197 apresenta ainda toxicidade em leveduras e células de mamíferos.

Objetivo
• Produzir um mutante não-tóxico da DT, a CRM197EK, contendo 3 substituições de aminoácidos:

Mutação do gene CRM197 (G52E) → na proteína expressa, a glicina (G) da posição 52 foi substituída por
Ácido glutâmico (E).

CRM 197EK (K51E/G52E/E148K)

Glicina, p52 →ácido glutâmico
Lisina, p51 →ácido glutâmico
Ácido glutâmico, p148 →Lisina → Mutações adicionais
 Estratégia experimental
• E. coli é, desde a introdução da tecnologia de DNA
recombinante, o principal hospedeiro na produção de
proteínas recombinantes.

• Por forma a garantir a sua produção, as proteínas

recombinantes requerem uma conjugação bem sucedida da
expressão genética, solubilidade da proteína e facilidade de
purificação.

• Para esse efeito, são adicionados aos plasmídeos

recombinates tags (sendo o resultado da sua tradução as
chamadas proteínas de fusão) e utiliza-se a co-expressão
com outros plasmídeos chaperone.
Estratégia experimental

• Construção de um plasmídeo (pET48b-crm197ektrxhis) com uma tripla mutação (K51E/G52E/E148K)

Fig. 1 pET48b-crm197ektrxhis (7176 bp). The gene encoding

CRM197EK harbors mutations for three amino acid residues
(K51E/G52E/E148 K). Arrows indicate direction of transcription
Estratégia experimental
Construção de um plasmídeo (pET48b-crm197ektrxhis). Inclusão de:
• Tioredoxina (Trx-tag) - responsável pela solubilidade e
termoestabilidade da proteína CRM197EK

• Polihistidina (His-tag) - facilita a purificação e a deteção da CRM197EK.

Resultando em CRM197EKTrxHis - uma proteína de fusão (fusion protein).

• Faz-se também a expressão em simultâneo de vários plasmídeos

chaperones (pKJE7, pGro7, pG-KJE8, pG-Tf2 e pTf16), cujas chaperone
proteins garantem a correta aquisição da estrutura terciária (“folding”)
da proteína.
Estratégia experimental
• Otimização da expressão de CRM197EKTrxHis em E. coli:

-Comparação da expressão em Origami B e Origami 2 – diferem em termos de background

genético;
-Efeito da co-expressão com chaperones moleculares;
-Purificação;
-Testes de lise de ácidos nucleicos (nucleases) e ELISA;
-Modelação in silico.
Resultados

SDS-PAGE da expressão de CRM197EKTrxHis (seta)

em E. coli Origami B e E. coli Origami 2.
Un – não induzida; In – Induzida;
S-fração solúvel; I-fração insolúvel
Resultados - Effect of Co-expression of CRM197EKTrxHis and Molecular Chaperones

As proteínas nascentes irão atingir a sua conformação correta

com a ajuda das chaperones - uma classe de proteínas
encontrada em todos os organismos, desde as bactérias,
plantas e humanos.

Os três principais sistemas de chaperones:

-Trigger Factor (TF) – associada ao ribossoma

-DnaK/DnaJ (e GrpE)

-GroEL/GroES
Resultados - Effect of Co-expression of CRM197EKTrxHis and Molecular Chaperones

SDS-PAGE de CRM197EKTrxHis demonstrando o efeito da

presença de cada um dos plasmídeos chaperone.
w/o representa ausência de chaperone.
Conclusões
Hibridação
Técnica molecular baseada no grau de semelhança genética entre combinações de sequências:

- Southern blotting: análise de DNA

- Northern blotting: análise de RNA
- Western blotting: análise de proteínas

Utiliza a técnica de eletroforese para separar as moléculas:

movimento ao longo de um gel (e.g., DNA, RNA, Proteínas) no
interior de um fluido sob a influência de um campo elétrico. A
eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida é a forma
mais usual de separar estas moléculas de acordo com o seu
tamanho.
Hibridação: Southern-blot e Northern-blot
Permite a deteção de fragmentos de DNA (Southern-blot) ou RNA (Northern-blot).

• O DNA é digerido com enzimas de restrição e os

fragmentos resultantes são separados por
eletroforese em gel de agarose. O RNA também é
separado por eletroforese, embora se usem
condições diferentes do DNA.
• Desnaturação e transferência do DNA/RNA para
uma membrana.
• Hibridação com uma sonda marcada por
fluorescência ou radioatividade, com os
fragmentos complementares. A sonda hibrida
apenas com os fragmentos complementares.
• Após exposição da sonda marcada é possível
visualizar as bandas de referência, bem como o
número e tamanho dos fragmentos
complementares.

Exemplo de aplicação prática: detetar a presença de determinado fragmento em várias espécies, e aferir sobre a sua maior ou
menor semelhança filogenética.
 Hibridação: Western-blot
Permite a deteção de proteínas

• Extração de proteínas – pode ser feita por

homogeneização, lise química, alteração de
temperatura.
• Eletroforese SDS-PAGE - As proteínas são separadas
num gel de poliacrilamida acordo com o seu tamanho.
• Transferência das proteínas - As proteínas
incorporadas no gel de poliacrilamida são transferidas
para uma membrana.
• Hibridação - A membrana é incubada numa solução
que contém anticorpos primários específicos para a(s)
proteína(s) de interesse, seguida de incubação com
anticorpos secundários.
• Visualização das bandas de proteínas de interesse,
através da observação da intensidades das bandas
(que emitem fluorescência), permitindo a análise
qualitativa e semi-quantitativa.

Exemplo de aplicação prática: Utilização de anticorpos para detetar uma dada proteína (imunodeteção)
 Artigo científico – hibridação

Título
Autores
Enquadramento
• Os genes que codificam chaperones, como dnaKJ e groESL, são componentes
importantes da resposta ao choque térmico, sendo também induzidos por
outras condições de stress.

• O gene groEL é tipicamente encontrado em múltiplas cópias em bactérias

fixadoras de azoto. Bradyrhizobium japonicum apresenta um total de cinco
operões groESL, possuindo diferentes sistemas de regulação e sendo induzidos
de forma diferente.

Uma chaperone consiste numa proteína que

interage com, estabiliza ou ajuda outra proteína
a adquirir a sua conformação funcionalmente
ativa, sem estar presente na sua estrutura final.
Objetivos

• Investigar as bases moleculares da tolerância térmica por comparação da expressão

genética de genes chaperones em isolados termo-tolerantes e termo-sensíveis.
Estratégia experimental

• Transcriptional analysis of the dnaKJ and groEL genes:

- Extração de RNA;
- Eletroforese em gel de agarose;
- RNA transferido para uma membrana;
- Síntese da sonda (que irá hibridar com o mRNA);
- Hibridação Northern-blot.
 Resultados

• Transcritos em isolados termo-tolerantes e

termo-sensíveis sujeitos a choque (a) e stress (b)
térmico, para os dois genes (dnaK and groESL)

• Aumento nos níveis de transcrição após

aumento de temperatura.

• Após o choque/stress térmico, o aumento dos

níveis de transcrição de dnaK e groESL foi mais
elevado nos isolados tolerantes do que nos
sensíveis dentro do mesmo grupo de espécies.

• Os resultados sugerem a existência de uma

relação entre níveis mais elevados de
transcrição dos genes dos chaperones dnaK e
groESL e uma maior capacidade dos isolados de
rizóbios de grão-de-bico para suportar o stress
térmico.