1.

Vetores

Um vetor, como descrito anteriormente, é uma molécula de DNA capaz de transportar a

sequência gênica a ser clonada para o interior da célula.

De maneira geral, um vetor deve ter os seguintes elementos genéticos básicos:

● Uma origem de replicação, a fim de poder se replicar autonomamente dentro da célula

hospedeira e, dessa forma, amplificar o DNA de interesse.

● Uma marca de seleção que permita selecionar as células recombinan- tes, ou seja, as
células hospedeiras que incorporarem o vetor.

● Uma região de múltiplos sítios de reconhecimento de enzimas de res- trição, onde será
inserida a sequência a ser clonada, denominada sítio blommúltiplo de clonagem (multiple
cloning site, MCS).

De acordo com a característica, os vetores são divididos segundo sua função em vetores de
clonagem, vetores de expressão e vetores integrativos.

1.1. Vetores de expressão

São vetores utilizados em clonagem molecular de genes, seja na construção de bibliotecas

de genes ou de cDNAs seja na subclonagem de fragmentos específicos como produtos de
amplificação por PCR, ou mesmo um gene, ou fragmento de DNA produzido por síntese química.

Os primeiros vetores empregados na clonagem molecular foram derivados dos plasmídeos

naturais de bactérias, principalmente E. coli, e são moléculas de DNA circular de dupla fita,
geralmente de baixa massa molecular.

O vetor pBR32213 (Figura 1.9a) foi dos primeiros vetores construídos, o mais utilizado para
clonagem molecular até a década de 1980 e deu origem a grande parte dos vetores plasmidiais
utilizados atualmente. Esse plasmídeo possui a origem de replicação do plasmídeo ColE1 de E. coli e
genes de resistência à ampicilina (ampR) e à tetraciclina (tetR) como marcas de seleção. Apresenta
uma interessante forma de seleção por inativação de um dos genes de resistência a antibióticos, pois
contém sítios únicos de restrição dentro de cada gene.

Assim, de acordo com a enzima de restrição utilizada para a clonagem, o inserto irá inativar
um dos dois genes e, ao transformar uma célula hospedeira sensível aos dois antibióticos, a que
receber o plasmídeo recombinante passará a ser resistente apenas àquele cujo gene de resistência
permaneceu intacto. Além de esse vetor oferecer uma forma fácil que de seleção, apresenta o
processo de replicação denominado "relaxado", permite que ele se duplique inúmeras vezes na
célula hospedeira. O número de cópias do PBR322 pode ainda ser amplificado com a adição de
cloranfenicol no meio de cultura.

A série de vetores desenvolvida posteriormente é a série de vetores pUC14 (Figura 1.9b),

que são os chamados vetores de seleção direta, ou seja, além de permitirem a seleção de
transformantes por resistência à ampicilina, o sítio múltiplo de clonagem está localizado dentro do
gene da enzima ẞ-galac-tosidase (lacZ). A seleção é feita com base na clivagem do substrato
cromogênico X-gal por essa enzima, que produz colônias de coloração azul índigo.

Uma vez inserido o fragmento de DNA no vetor, o gene (lacZ) é inativado, tornando a célula
incapaz de produzir a enzima ativa. Dessa forma, ao adicionar o indutor IPTG e o substrato
cromogênico da enzima (X-gal) ao meio de cultura sólido, a célula que recebeu o plasmídeo
recombinante, por não produzir a enzima, não converterá o X-gal em azul índigo, ficando a colônia da
cor bege-claro, típica da E. coli.

Os plasmídeos vêm sendo ao longo dos anos os vetores mais utilizados em engenharia
genética, e a busca de inovações que tornassem o processo de clonagem molecular mais
simplificado e eficiente levou ao desenvolvimento dos vetores para clonagem do tipo TA15, para
clonagem direta de insertos de DNA obtidos a partir da amplificação por PCR. A partir do
conhecimento de que a Taq DNA polimerase também possui a atividade de terminal transferase não
dependente de molde e, dessa forma, adiciona uma desoxiadenosina monofosfato à extremidade 3'
do produto de PCR, foi desenvolvido um tipo de vetor já na forma linearizada, contendo em sua
extremidade 3' uma desoxitimidina monofosfato, os assim denominados T-vectors.

Dessa forma, ao misturar o produto de PCR com o vetor na presença da DNA ligase,
obtém-se o plasmídeo circular covalentemente ligado, pronto para ser utilizado na transformação
genética. molens ob o Mais recentemente, foi desenvolvido um tipo de T-vector já acoplado com a
topoisomerase I do vírus Vaccinia, e foi desenvolvida toda uma família de vetores denominados
TOPO®. Esse vetor também é comercializado na forma linearizada e representou uma grande
inovação, pois possibilitou a ligação direta de produtos de PCR dispensando o uso da DNA ligase,
devido à adição em suas extremidades de topoisomerases ativadas que catalisam a ligação do
inserto ao vetor (Figura 1.10). Desde então, essa tecnologia vem sendo amplamente utilizada, e já
existem também vetores com topoisomerases capazes de fazer a ligação de insertos com
extremidades abruptas (blunt ends).

As marcas de seleção mediadas pela resistência a antibióticos e/ou inativação de função do

gene da ẞ-galactosidase, embora eficientes no processo de clonagem molecular, mesmo após
tratamento com fosfatase alcalina, certa porcentagem do vetor plasmidial recirculariza sem o inserto.
Assim, visando a minimizar essas ocorrências, foi desenvolvido um novo tipo de seleção que
denominamos positiva (ou Kamikaze). Citamos como exemplo a inserção do gene ccdB, que codifica
uma proteína letal para E. coli, em forma de fusão com o gene lacZ16. A seleção é feita baseada na
disrupção da função dos genes fusionados após a ligação do inserto.

Caso haja a recircularização do plasmídeo sem o inserto, a proteína letal é expressa e causa
a morte da E. coli hospedeira, permitindo apenas o crescimento de clones recombinantes. Ao longo
dos anos, as limitações, como número de cópias e tamanho da sequência de DNA a ser clonada,
nortearam a evolução dos vetores de clonagem no sentido de superá-las.

Para facilitar o processo de clonagem molecular e expressão de genes heterólogos em

hospedeiras de difícil manipulação foram desenvolvidos os vetores bifuncionais (shuttle vectors),
capazes de se duplicar e serem selecionados em dois hospedeiros diferentes, sendo um deles a E.
coli hospedeira, de manipulação muito fácil. Além disso, vetores foram desenvolvidos com o objetivo
de garantir a expressão ou expressão/ secreção das proteínas recombinantes em altos níveis em
diferentes tipos de células hospedeiras para aplicações biotecnológicas. A seguir, serão
apresentados importantes tipos de vetores.

1.1.1. Bacteriófados Λ

Devido à necessidade de clonar fragmentos de DNA grandes e, ainda assim, introduzi-los em

E. coli eficientemente para a construção de bibliotecas de genes de seres eucariontes (com genomas
grandes), desenvolveram-se derivados de bacteriófagos & de cujo interior do DNA era possível retirar
cerca de 20 Kb (não essencial para o ciclo lítico do fago) com digestão com enzimas de restrição e
substituir essa sequência por DNA exógeno, reconstituindo-se um DNA recombinante de cerca de 50
Kb.

Para a introdução desse DNA recombinante na E. coli hospedeira, o DNA era empacotado
com um extrato de proteínas do capsídeo viral e, em seguida, colocado em contato com a hospedeira
para que a infecção ocorresse. Para ocorrer o empacotamento adequadamente, além de ter tamanho
da ordem de 50 Kb +/- 5 Kb, o DNA deve conter uma sequência de cerca de dezessete nucleotídeos
que fica na região das extremidades coesivas (stick ends), denominada de COS (cohesive ends)17.

Dessa forma, já no final da década de 1970 era possível introduzir DNA na célula hospedeira
com eficiência de 108 clones/ug de DNA, o que zou a construção das primeiras bibliotecas
genômicas humanas completas, das quais foram isolados os primeiros genes humanos completos.
 1.1.2. Bacteriófagos M13

Os bacteriófagos tipo M13 são vírus de DNA fita simples com cerca de 6 Kb. Quando
empacotado, seu genoma se apresenta em forma de fita simples, porém, durante sua fase de
replicação no interior da E. coli seu genoma se mantém em forma duplex (dupla fita). Essa
característica despertou o interesse dos pesquisadores, pois facilmente seria possível isolar o DNA
do fago em forma de fita simples a partir dos fagos obtidos no exterior da hospedeira (no meio de
cultura) e em forma duplex no interior da E. coli.

A forma duplex pode servir para a digestão com enzimas de restrição e clonagem de DNA
heterólogo em seu interior como se fosse um plasmídeo, e a forma de fita simples foi usada por um
bom tempo para o sequenciamento pelo método dideoxi de Sanger e, até hoje, para realizar
mutagênese sítio dirigida 18. Fagos M13 têm sido usados também para a construção de bibliotecas
de peptídeos randômicos ligados às proteínas do fago, em um processo denominado de phage
display. Há limitação de tamanho do inserto a ser clonado no interior do genoma viral, pois são fagos
tipo bastonetes e, caso se clone um inserto muito grande (maior que 5-6 Kb), a estrutura do fago
pode não suportar e quebrar.

1.1.3. Cosmídeos

Antes do advento da eletroporação, para se realizar transformação genética de E. coli

(introdução de DNA nas células) utilizava-se o método do CaCl,. Por esse procedimento, quanto
maior o tamanho do fragmento a ser clonado, menos eficiente era o processo. Por isso, idealizou-se
uma estratégia que permitia introduzir DNA plasmidial com de cerca de 50 Kb no interior da E. coli
com alta eficiência. Para tanto, introduziu-se o sítio COS do fago A no interior do vetor plasmidial de
clonagem 19.

Caso o vetor tivesse cerca de 5 Kb, como era o caso do pBR322, era possível clonar no
interior de um de seus genes de resistência a antibióticos fragmentos de até 45 Kb, empacotar com
proteínas do capsídeo do fago A e, então, introduzi-los nas células da hospedeira bacteriana com
altíssima eficiência. No interior da célula, a molécula se comportava como um plasmídeo. Esse tipo
de vetor tem sido de grande relevância na produção de bibliotecas genômicas para fins de seleção
de genes específicos e para a determinação da sequência genômica completa.

1.1.4. BAC

São vetores derivados do plasmídeo conjugativo F de bactérias, que são muito grandes, (de
100 a 200 Kb. Separa-se do plasmídeo F sua origem de replicação, que é de baixo número de
cópias, pois atua de forma sincronizada com a hospedeira, e os genes necessários para sua
estabilização e partição, juntando-se a genes marcadores de seleção, como de resistência a
antibióticos e/ou da ẞ-galactosidase.

Dessa forma o vetor plasmidial fica pequeno, da ordem de 10 Kb, e dessa forma pode
receber insertos enormes (de 100 a 200 Kb e permanecer estável no interior da E. coli após sua
introdução, que ocorre geralmente por eletroporação. Dessa forma, pode-se fazer com relativa
facilidade bibliotecas genômicas de grandes fragmentos de DNA.

1.1.5. YACs

A levedura de cerveja, a Saccharomyces cerevisiae, é o microrganismo eucarionte mais

estudado até o momento, e já nos anos 1980 suas estruturas cromossomais importantes já haviam
sido clonadas e caracterizadas como origens de replicação cromossomais (autonomously replicating
sequences - ARS), telômeros (TEL) e centrômeros, além de diversos genes de vias metabólicas
importantes que foram utilizados como marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2).
 Nesse contexto foi possível construir vetores equivalentes a minicromossomos da levedura,
contendo esses importantes elementos ligados à parte de um vetor plasmidial bacteriano para ser
manipulado facilmente na E. coli durante sua construção. Nesse tipo de vetor era possível clonar
fragmentos grandes de DNA, de até 1 milhão de pares de bases.

1.2. Expressão

Os vetores utilizados para expressar o peptídeo ou proteína codificados pelo segmento de

DNA inserido, denominados vetores de expressão, são veículos que, como podemos ver na Figura
1.11, a seguir, além da origem de replicação e marca genética de seleção, contêm uma região
promotora, uma região codificadora do sítio de ligação ao ribossomo (ribosomal binding site RBS),
códon de início da tradução seguido de pelo menos um sítio de restrição para inserção em fase da
sequência de inserto, a fim de que a proteína possa ser expressa, além de uma sequência
terminadora de transcrição.

De maneira geral, o principal objetivo do uso de vetores de expressão é obter altos níveis de
RNAs mensageiros estáveis, que são traduzidos resultando em grandes quantidades da proteína ou
peptídeo de interesse. Para atingir esse objetivo, um elemento importante é que o vetor deve possuir
um promotor forte. Os promotores mais utilizados para a expressão em E. coli são, geralmente,
baseados no promotor do operon lac, no promotor PL do fago A, ou no promotor do fago T720, que
está presente na família de vetores pET, um dos mais utilizados atualmente.

Estes promotores podem também ser híbridos de diferentes promotores, por exemplo, o
promotor tac, que é um híbrido dos promotores trp e lac¹¹. Os promotores utilizados nos vetores de
expressão são normalmente indutíveis, ou seja, a síntese de proteínas é induzida apenas quando
necessária. O sistema de expressão contém elementos de controle de um operon bacteriano
(promotor/operador e gene regulador que codifica a proteína repressora). A expressão do gene
heterólogo ocorre então ao adicionar ao meio de cultivo um indutor, tais como a arabinose e o
isopropil-B-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG).

A expressão da proteína, contudo, também pode ser constitutiva em alguns vetores de

expressão. Um promotor fraco em geral só é utilizado em casos nos quais a proteína recombinante
necessita ficar em menor concentração na hospedeira ou quando é tóxica para a hospedeira, embora
um baixo nível de síntese de proteína constitutiva possa ocorrer mesmo em vetores de expressão
com os promotores controlados. Há ainda os vetores termoinduzíveis, que são baseados no promotor
P, do fago A, para os quais foi desenvolvida uma molécula repressora termossensível. No caso de
vetores de expressão para leveduras, tem sido utilizado muito para Pichia pastoris o promotor da
enzima álcool oxidase (AOX1), que é induzível por metanol.

No que se refere ao sítio de ligação do ribossomo (região Shine Dal- garno), o que tem sido
mais usado, por ser muito eficiente, é do gene da proteína 10 do fago T7. Em relação a terminadores
de transcrição, um bom vetor de expressão combina um promotor forte com um terminador de
transcrição também bastante eficiente.

Para E. Coli, terminadores Rho independentes, como o do operon TRP, têm sido utilizados.
Um tipo especial de vetor de expressão o que, além de programar a expressão da proteína
heteróloga, promove também sua secreção. Para tanto, o vetor ou sequência codificadora da
proteína deve conter a região que codifica o peptídeo-sinal, que é uma região situada logo na região
aminoterminal de proteína, que a direciona em células eucarióticas para o retículo endoplasmático,
de onde as proteínas a serem secretadas seguem então o caminho do complexo de Golgi e, por
meio de vesículas de secreção, são lançadas ao meio extracelular.

Em células procarióticas, o peptídeo-sinal dirige as proteínas para o espaço peri plasmático.

Os peptídeos-sinais têm tamanhos, com algumas exceções, de 18 a 30 aminoácidos, o que equivale
no DNA a 54 a 90 pares de nucleotídeos.

A experiência tem demonstrado que os peptídeos-sinais de um determinado organismo são

capazes de funcionar em outros, mesmo que sejam taxonomicamente muito distantes, como
eucariontes e procariontes. Isso se deve ao fato de a estrutura do peptídeo-sinal ser mais importante
que sua sequência de aminoácidos para o processo de secreção. Os peptídeos-sinais têm
normalmente na região inicial (aminoterminal) pelo menos um aminoácido carregado positivamente,
um núcleo central hidrofóbico e aminoácido final neutro com uma cadeia lateral pequena.

O peptídeo-sinal é reconhecido pela maquinaria de translocação da célula e, logo após ser

translocado para o retículo endoplasmático, é clivado do restante da proteína pela peptidase-sinal.
Diferentes peptídeos-sinais têm sido utilizados para dirigir para a secreção peptídeos heterólogos. Os
mais comuns são: o da proteína A de staphylococcus aureus e de a-amilase de Bacillus subtilis, o do
fator a de S. cerevisiae para leveduras e o de imunoglobulinas G (IgGs) para secreção em células de
mamíferos em cultura.

1.2.1. Com cauda de fusão

Após a expressão do produto do gene, geralmente é necessário purificar a proteína

expressa. O processo de separação da proteína de interesse, a partir da grande maioria das
proteínas da célula hospedeira, pode ser trabalhoso e demorado. A fim de tornar o processo de
purificação mais fácil, uma sequência peptídica (TAG) eleita pode ser adicionada à região
aminoterminal ou carboxiterminal da proteína recombinante, alterando-se a sequência de seu gene.

Essa sequência ligada à proteína de interesse será utilizada para a purificação da proteína
recombinante por cromatografia de afinidade e depois será removida pela ação de uma protease
específica. Por exemplo, pode-se adicionar à proteína recombinante seis histidinas (HIS6) e, com
isso, purificá-la por cromatografia de afinidade com resinas que tenham átomos de níquel
imobilizados. A Tabela 1.2 a seguir mostra diferentes tags utilizadas para facilitar a purificação e as
resinas utilizadas nos processos cromatográficos de afinidade.

1.3. Integrativos

São vetores bifuncionais que possuem marcadores genéticos para dois tipos de hospedeiras
diferentes, porém com uma única origem de replicação funcional em apenas uma das hospedeiras.
Isso faz com que transforme e replique em uma das hospedeiras, mas na outra para que ocorra
transformação genética há necessidade do vetor se integrar ao seu genoma.

Caso contrário, não há replicação, o marcador de seleção não se expressa adequadamente

e nem outros genes que se deseje expressar. Os vetores integrativos são muito comumente
utilizados para expressão de proteínas heterólogas em leveduras e contam com a grande capacidade
das leveduras de fazer recombinação homóloga. Por essa razão é que nas leveduras pode-se fazer
gene disruption com facilidade.