Ensaios Pre Clinicos

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"JULIO DE MESQUITA FILHO"

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS DE ARARAQUARA
P rog ra ma d e Pó s- G ra d ua ção em C i ên c i as
Fa rm ac êu t i ca s,
Ár ea d e P esq u is a e Des en vo l vi me nt o d e
Fá rmac os e M ed i ca ment o s.
ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS DE HÍBRIDOS

FTALIMÍDICOS E PRÓ-FÁRMACOS TAURÍNICOS
DERIVADOS DE ANTIINFLAMATÓRIOS NÃO
ESTERÓIDES
EDNIR DE OLIVEIRA VIZIOLI
Orientadora: Profa. Dra. Chung Man Chin
ARARAQUARA - SP
2009
Ednir de Oliveira Vizioli

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"JULIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS DE HÍBRIDOS

FTALIMÍDICOS E PRÓ-FÁRMACOS TAURÍNICOS
DERIVADOS DE ANTIINFLAMATÓRIOS NÃO
ESTERÓIDES
EDNIR DE OLIVEIRA VIZIOLI
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e
Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte
dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Chung Man Chin
ARARAQUARA - SP
2009

Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
Vizioli, Ednir de Oliveira

V864e Ensaios pré-clínicos de híbridos ftalimídicos e pró-fármacos taurínicos
derivados de antiinflamatórios não esteróides / Ednir de Oliveira Vizioli. –
Araraquara, 2009.
128 f.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de

Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação
em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Chung Man Chin
. 1.Ensaios pré clínicos. 2. Antiinflamatórios. 3.Taurina. 4. Pró-

fármacos. 5.Híbridos ftalimídicos. I.Chung Man Chin orient.. II.Título.
CAPES: 40300005

Candidato: Ednir de Oliveira Vizioli.
Título da Tese: En s ai os pr é-c lí n ic os d e hí br id os f t alim ídic os e p ró -

f ár m ac os t aurí nic o s der iv a dos de ant iinf lam at ór io s nã o est er ói de s.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de defesa da Dissertação de Mestrado,
em sessão pública realizada em 14/12/2009, consideraram o candidato:
( ) REPROVADO (X) APROVADO
1) Examinador (Prof. Dr. Leoberto Costa Tavares)_________________________
2) Examinador (Profa. Dra.Veni Maria Andres Felli)________________________
3) Examinador (Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies)___________________________
4) Examinador (Profa. Dra. Maria do Carmo Longo)________________________
5) Presidente (Profa. Dra. Chung Man Chin) ______________________________

Dedicatória
Aos meus heróis:
Ariovaldo Vizioli e
Maria Inês de Oliveira Vizioli.
&
Profa. Dra. Chung Man Chin
“Amo como ama o amor.

Não conheço nenhuma outra
razão para amar senão amar.
Que queres que te diga, além
de que te amo, se o que quero
dizer-te é que te amo?”
Fernando Pessoa

Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
A DEUS, e a Nossa Senhora de Fátima (minha protetora) pelo mundo

maravilhoso que sempre se apresenta que nos faz refletir nos momentos de
angústia;
À Profª. Drª. Chung Man Chin, por ter acreditado no tema. Pela orientação
técnico-científica, profissional e valorosa companhia; bem como por tanto amor que
reside em seu ser, iluminando todos os alunos que são agraciados com sua
dedicação. Não ha palavras que possam esclarecer tamanha admiração, carinho e
amor;
Aos amigos Prof. Dr. Osni Lazaro Pinheiro por ter me mostrado o valor da
ciência em minha iniciação científica, e ao Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies que teve
muita influência nos meus projetos, pesquisador este que sempre deixou
transparecer muito amor em seus atos;
A Profª. Drª. Maria do Carmo Longo, pelo apoio, convivência e ensinamentos,

bem como por sua valorosa contribuição na obra;
Aos membros da banca Prof. Dr. Leoberto Costa Tavares e Profa. Dra.Veni
Maria Andres Felli pelo cuidado e auxilio na obra.
À Cristiane Fátima Guarido e Marcos Fiaschetti por mostrar-me a paixão de

ser farmacêutico e de ensinar;
Ao Prof. Dr. José Carlos Nassute, por sua alegria;
À Profª. Drª. Adélia Emília de Almeida e Profª. Drª. Márcia da Silva por sua
agradável presença;
Ao grande amigo Osmar Redondo, técnico, operador experimental assíduo de

meu trabalho dono de uma encantadora áurea paterna, bem como sua esposa Sueli
por tecer uma forte e eterna aliança;

Agradecimentos
A toda equipe do Lapdesf (Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento de

Fármacos), pela confiança depositada, Antônio Távora de Albuquerque Silva, Eliana
Ometto Pavan Serafim, Lúcia Fioravanti de Castro, Priscila Longhin Bosquese ao
Prof. Dr. Jean Leandro do Santos, Renato Farina Menegon, Lorena Blau pela
amizade e docência de bancada, Paulo (Escobar), Mateus (Pinduca), Dudu,
grandiosas pessoas que tive o prazer de conviver;
A equipe da Fundecif e EMS Sigma Pharma pelo suporte financeiro.
Aos iniciantes científicos Rafael Consolin Chelucci e Richard Chiquetto pela

amizade e indiscutível participação neste trabalho;
Aos Prof. Dr. Wilton Rogério Lustri e Prof. Dr. Roberto Cuan Ravinal, pela
inestimável companhia, apoio e contribuição neste trabalho.
Aos amigos de república e convívio, pelos momentos agradáveis;
Aos meus avós, Maria Bastos Borges de Oliveira, Rinaldo Vizioli e Santina
Milk Vizioli, padrinhos Valter Fadel e Silene de Oliveira Fadel pelas orações e amor
devotados e a todos os meus familiares as quais os amo;
A toda equipe da biblioteca da FCF (Unesp), pelo auxílio na busca e aquisição

do material bibliográfico utilizado durante o trabalho;
A toda equipe da secretaria de Pós-Graduação, pelo excelente trabalho e

valiosas orientações;

Where are we ?
“This is not the end.

It is not even the beginning of the end.
But it is, perhaps, the end of the beginning.”
W. Churchill

Sumário
página
Resumo................................................................................................................................. i
Abstract................................................................................................................................ ii
1.INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 2
1.1 Planejamento de novos fármacos antiinflamatórios....................................................... 2
1.2 Processo inflamatório..................................................................................................... 26
2. OBJETIVO..................................................................................................................... 39
3. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 41
3.1. Material......................................................................................................................... 41
3.2. Métodos ........................................................................................................................ 41
3.2.1. Preparação dos compostos hibridos ftalimídicos (aine-ftd) e pró-fármacos

taurínicos (aine-tau) derivados de antiinflamatórios não esteróide (AINEs)............... ....... 41
3.2.1.1. Preparação de AS-ftd (N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-hidroxi

benzamida).............................................................................................................................. 42
3.2.1.2. Preparação de nap-ftd (N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-(6-metoxi-2-naftil)

propanamida)........................................................................................................................... 43
3.2.1.3. Preparação de dic-ftd (2-{2-[(2,6-diclorofenil)amino]fenil}-N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-

isoindol-2il) acetamida).............................................................................................................. 44
3.2.1.4. Preparação de ibu-ftd (N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-(4-isobutilfenil)

propanamida)........................................................................................................................... 45
3.2.1.5. Preparação de ceto-ftd (2-(3-benzoilfenil)-N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)

propanamida)........................................................................................................................... 46
3.2.1.6. Preparação de nap-tau (ácido 2-{[2-(6-metoxi-2-naftil) propanoil]amido}

etanosulfônico)......................................................................................................................... 48
3.2.1.6. Preparação de ibu-tau (ácido 2-{[2-(4-isobutilfenil) propanoil] amido} etanosulfônico]})... 48
3.2.1.7. Preparação de indo-tau (ácido 2-{[4-clorobenzamida-5-metoxi-2-metil-indol-3-acetil]

amido}etanosulfônico)............................................................................................................... 49
3.2.1.8. Preparação de AS-tau (ácido 2-[(2-hidroxibenzoil) amido] etanosufônico)....................... 49

3.2.1.9. Preparação de dic-tau (ácido 2-{[2-(2,6-diclofenil)amino] fenil} acetil) amido]}
etanosulfônico)........................................................................................................................ 50
3.2.2. Ensaios biológicos...................................................................................................... 50
3.2.2. 1. Animais.................................................................................................................. 50
3.2.2.2. Atividade antiinflamatória aguda (modelo de edema de pata)..................................... 51
3.2.2.3. Teste de gastrotoxicidade........................................................................................ 52
3.2.2.4. Atividade analgésica (modelo de contorção abdominal)................................................ 53
3.2.2.5. Atividade antiinflamatória crônica (colite ulcerativa distal)........................................ 53
3.2.2.6. Análise histopatológica........................................................................................... 54
a) Classificação macroscópica............................................................................................. 54
b) Classificação microscópica.............................................................................................. 55
3.2.2.7. Planejamento estatístico.......................................................................................... 55
4. RESULTADOS............................................................................................................... 57
4.1 Atividade antiinflamatória aguda.................................................................................. 57
4.2. Atividade analgésica..................................................................................................... 60
4.3. Teste de gastrotoxicidade.............................................................................................. 61

4.4. Atividade antiinflamatória crônica................................................................................ 65
5. DISCUSSÃO................................................................................................................... 73
5.1 Atividade antiinflamatória aguda.................................................................................. 73
5.2. Atividade analgésica..................................................................................................... 74
5.3. Teste de gastrotoxicidade.............................................................................................. 76

5.4. Atividade antiinflamatória crônica................................................................................ 81
6. RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS................................................................ 89

7. CONCLUSÃO................................................................................................................ 92
8. PERSPECTIVAS........................................................................................................... 94
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 96

LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Etapas multi e interdisciplinares para invenção e/ou incrementação

terapêutica............................................................................................................................. 4
Figura 2. Estruturas da cimetidina e seu bioisóstero, ranitidina.......................................... 5
Figura 3. Analogos da lovastatina....................................................................................... 5
Figura 4. Mecanismo de bioativação do omeprazol pelo meio ácido e sua ligação e

inibição da bomba protônica (ATPase-SH).......................................................................... 6
Figura 5. Esquema do processo de latenciação................................................................... 7
Figura 6. Fármacos administrados em associação; pró-fármacos recíprocos ligados

diretamente entre si e pró-fármacos recíprocos ligados via agente espaçante...................... 8
Figura 7. Ação de azoredutases do cólon no metabolismo de sulfassalazina para a

obtenção de mesalazina (5-ASA) e do pró-fármaco recíproco olsalazina, na obtenção de
duas moléculas de mesalazina.............................................................................................. 9
Figura 8. Obtenção de pró-fármaco recíproco de naproxeno e propilfenazona,

diretamente ligado................................................................................................................ 10
Figura 9. Obtenção de pró-fármaco recíproco de naproxeno e propilfenazona com agente

espaçante................................................................................................................... 10
Figura 10. Pró-fármacos recíprocos derivado de ibuprofeno e doador de óxido nítrico

(NO)...................................................................................................................................... 11
Figura 11. Biossíntese de NO.............................................................................................. 11
Figura 12. Taurina............................................................................................................... 12
Figura 13. Planejamento dos pró-fármacos recíprocos derivados de taurina e AINEs....... 15
Figura 14. Representação do funil do desevolvimento de novos fármacos........................ 16
Figura 15. Construção de uma série de AINEs capazes de interferir no avanço da

Doença de Alzheimer, inibindo a atividade da acetilcolinesterase (AChE), utiliuzando a
técnica de hibridação............................................................................................................ 18
Figura 16. Representação da hidridação como estratégia de modificação molecular......... 19
Figura 17. Recém nascido e criança com focomelia........................................................... 22
Figura 18. Molécula da talidomida, com seu grupo ftalimídico e glutarimídico................ 23
Figura 19. Protótipo antiasmático hidrido LASSBio-468................................................... 23

Figura 20. Antiasmáticos, sintetizado pela técnica de hibridação molecular...................... 24
Figura 21. Protótipo antiasmático hidrido LASSBio-468 e seu metabolito ativo

LASSBio-596....................................................................................................................... 25
Figura 22. Hibridação molecular entre a subunidade ftalimidica da talidomida com os

AINEs.................................................................................................................................... 26
Figura 23. Mecanismo e participação de mediadores químicos e celulares no processo de

inflamação aguda............................................................................................................. 27
Figura 24. Cascata do ácido araquidônico............................................................................ 28

inflamação crônica................................................................................................................. 30
Figura 26. Geração de metabólicos do ácido araquidônico (AA) e do ácido

docosaexaenóico (DHA)....................................................................................................... 33
Figura 27. Exemplos de AINEs seletivos da cicloxigenase-2 (COX2).............................. 37
Figura 28. Esquema de tratamento adotado para realização experimental de colite

ulcerativa............................................................................................................................... 54
Figura 29. Ensaio de atividade antiinflamatória aguda (modelo de edema de pata) AINEs e
seus derivados latenciado e/ou hibrido, por via oral............................................................. 58
Figura 30. Ensaio de atividade antiinflamatória aguda (modelo de edema de pata) AINEs e
seus derivados latenciado e/ou hibrido, por via oral............................................................. 59
Figura 31. Ensaio de atividade analgésica periférica (modelo de contorção abdominal) AINEs
e seus derivados hibridos, por via oral.................................................................................. 61
Figura 32. Fotografia dos estômagos dos ratos tratados com dose única (300 µM) de
AINEs, mistura física equimolar dos AINEs e taruina, AINE-tau e AINE-ftd..................... 64
Figura 33. Foto representativa do intestino grosso dos ratos na administração por via oral
em doses repetidas (300 µM) dos padrões tratados com celecoxibe, mesalazina e
sulfassalazina, do controle positivo de colite ulcerativa e controle negativo....................... 70
Figura 34. Foto representativa do intestino grosso dos ratos na administração por via oral
em doses repetidas (300 µM) dos padrões AINES, AINE-tau e AINE-ftd........................... 71
Figura 35. Mecanismo de secreção ácida pelo estômago..................................................... 77
Figura 36. Mecanismo de formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) pelos

leucócitos durante o processo inflamatório........................................................................... 78
Figura 37. Mecanismo de ação proposto para mesalazina, taurina e talidomida na

inibição do processo inflamatório intestinal.......................................................................... 85

Figura 38. Fotografia dos órgãos durante autópsia de animal com colite ulcerativa,
tratado com diclofenaco 300 µM (v.o.) por 5 dias................................................................ 86
Figura 39. Fases da pesquisa de novos fármacos indicando os estágios das pesquisas dos
derivados ftalimídicos e taurínicos........................................................................................ 87
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Diferenças entre o processo inflamatório agudo e crônico.............................. 31
Quadro 2. Classificação dos AINEs não seletivos............................................................. 35
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Efeito ulcerogênico dos AINEs e mistura física (AINE + taurina)................... 63
Tabela 2. Análise macro e microscópica do colon e estado geral dos ratos com colite
ulcerativa tratados com AINEs e seus derivados taurínicos e ftalimídicos......................... 67
Tabela 3. Análise macro e microscópica do colon e estado geral dos ratos com colite
ulcerativa tratados com celecoxib, mesalazina, sulfassalazina e derivados dic-tau e nap-
tau i.p. (150 µM).................................................................................................................. 68
Tabela 4. Valores de DL50 aguda (v.o) dos AINEs e toxicidade observada para o
tratamento de colite ulcerativa com AINEs......................................................................... 69
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Método de reação geral para preparação dos compostos AINE-ftd............... 41
Esquema 2. Método de reação geral para preparação dos compostos AINE-tau............... 47

i
RESUMO
A inflamação é uma reação de defesa e reparo fisiológico, importante em resposta a agressões

físicas, químicas ou biológicas ao organismo, que geram o aparecimento dos quatro sinais
cardinais dor, edema, calor, rubor, incluindo, muitas vezes a perda de função do tecido ou
órgão. O processo inflamatório agudo é imediato e inespecífico contra o agente agressor,
podendo evoluir para crônico, caso haja a permanência do agente agressivo e é caracterizado
pelo aumento de celularidade e outros elementos teciduais. Várias substâncias estão
envolvidas no processo inflamatório, como a prostaglandinas, histamina, serotonina e
citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, 1L-6, IL-8, TNF-α, NF-κB. Estima-se que exista na
terapêutica, mais de 50 antiinflamatórios não esteróides (AINEs) diferentes, mas nenhum
deles totalmente destituído de efeitos tóxicos, como a gastrotoxicidade, mesmo os compostos
mais novos, seletivos para receptores COX2, como o celecoxibe. Por este motivo nenhum
AINEs é recomendado para utilização em processos inflamatórios crônicos. Neste sentido,
Vizioli (2006) e Castro (2008), planejaram pró-fármacos taurínicos e híbridos ftalimídicos,
respectivamente, obtendo resultados promissores como antiinflamatórios potenciais
destituídos de gastrotoxicidade. O presente trabalho visa realizar os testes pré-clinicos de
atividade antiinflamatória aguda e crônica. Os resultados demostraram que que todos os
derivados testados não apresentam gastrotoxicidade em relação ao padrão AINE testado, sem
alteração significativa da resposta inflamatória aguda, com exceção do derivado de
ibuprofeno N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-(4-isobutilfenil) propanamida, que
demonstrou atividade inferior. Em estudo de atividade inflamatória crônica, todos os
compostos ftalimídicos e taurínicos mostraram-se superior aos AINEs padrão, com
diminuição de mortalidade e exclusão dos sinais clínicos como sangramento, perda de peso
aumento da freqüência de evacuações. Os derivados de diclofenaco e naproxeno, ácido 2-{[2-
(2,6-diclofenil)amino] fenil} acetil) amido]} etanosulfônico e ácido 2-{[2-(6-metoxi-2-naftil)
propanoil]amido} etanosulfônico quando administrados intraperitonealmente promoveram
100% de supressão da colite ulcerativa, enquanto que os fármacos mesalazina e
sulfassalazina, fármacos padrão utilizados terapeuticamente no tratamento da doença
apresentaram apenas 67 % de remissão. Estes dados apontam para uma nova classe
revolucionária de AINEs.

ii
ABSTRACT
Inflammation is a defense and repair physiologic reaction important in response to an

physical, chemical or biological aggression of the body, providing the appearance of the four
cardinal signs of pain, swelling, heat, redness, including often the loss of function of the tissue
or organs. The acute inflammatory process is immediate and nonspecific against the
aggressive agent and it is characterized by increased cellular and other tissue elements. Series
of substances are involved in the inflammatory process such as prostaglandins, histamine,
serotonin and pro-inflammatory cytokines such as 1L-6, IL-8, α-TNF, NF- κB. It is estimated
that exists more than 50 different non steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) drugs in
the market, but none of them are wholly without side effects such as gastro toxicity, even the
newer compounds, selective to COX2 receptors, as the celecoxib. For this reason none of
NSAIDs is recommended for use in chronic inflammatory diseases. In this sense, Vizioli
(2006) and Castro (2008), planned new taurine prodrugs and phtalimide hybride NSAIDs,
respectively, showing promising results as anti-inflammatory without toxicity. This work
aims to accomplish pre-clinical assay by acute and chronic models of inflammation. The
results showed that all derivatives tested have no gastro toxicity when compared with the
NSAIDs standard. No significant inflammatory response was observed with the exception
toibuprofen derivative N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-(4-isobutilfenil)
propanamide, which showed less activity. In the chronic inflammatory study activity all
compounds phthalimide and taurine showed increase of activity compared to standard
NSAIDs with decrease of the mortality and exclusion of the clinical signals such as bleeding,
weight loss, and increased defecation rate. The derivatives of diclofenac and naproxen, 2-{[2-
(2,6-diclophenyl)amino] phenyl} acethyl) amide]} etanosulfonic acid e 2-{[2-(6-methoxy-2-
naphtyl) propanoy]amide} etanosulfonicacid when administered via intraperitonium further
100 % of ulcerative colitis suppression, while the mesalazine and sulfasalazine, the current
drugs used forthe treatment of the disease showed only a 67% remissision. These data aim for
the new revolution class of NSAIDs.

INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Planejamento de novos fármacos antiinflamatórios
O planejamento de novos fármacos com potencial atividade antiinflamatória

e/ou com redução dos efeitos tóxicos inerentes ao mecanismo de ação é sustentado
pela ampla utlização no tratamento de patologias, cujos processos de base
permeiam pela resposta inflamatória.
O processo inflamatório sempre recebeu um grande destaque na ciência por

ser o primeiro sinal biológico em qualquer estado de anormalidade, e os
antiinflamatórios não esteróides (AINEs) possuem um impacto positivo sobre a
qualidade de vida do paciente, por incorporar benefícios como, por exemplo, a
melhoria de dores músculo-esqueléticas, e em algumas doenças que são
acompanhadas da cronicidade inflamatória como a artrite reumatóide (GABRIEL &
MATTESON, 1995).
Os AINEs, porém, ao alterar a atividade das prostaglândinas, inibindo as

isoformas de ciclooxigenases constitutivas (COX1) e induzidas (COX2), geram
reações adversas graves em pacientes pré-dispostos e/ou que utilizam por um
periodo prolongado.
Em 1995, uma revisão sobre o consenso do uso de AINEs na artrite

reumatóide foi elaborada, sendo apresentadas as vantagens e desvantagens. Entre
os perigos do uso, encontram-se as reações gastrointestinais (GI) como dispepsia
severa, úlceras duodenais e gástricas com complicações que promoveram a
hospitalização, realização de procedimentos cirúrgicos e até mesmo a morte. O
estudo sugere a utilização intervencionista de misoprostol, um análogo sintético de
prostaglandina, como medida de controle das complicações GI (GABRIEL &
MATTESON, 1995).
Em 1999, uma correlação farmacoeconômica apresentou a gastropatia na

utilização de AINEs como fator de terapia associativa e aumento dos custos
(WALAN & WAHLQVIST, 1999). No mesmo ano, o laboratório farmacêutico Merck
Sharp & Dohme lançou nos Estados Unidos e mais de 80 países o VIOXX®
2
(rofecoxib, inibidor seletivo de COX2), com a promessa de redução dos efeitos
adversos (GI) comuns à classe, atingindo um faturamento mundial de US$ 2,5
bilhões, em 2003 (REYNALES, 2009). Entretanto, em 2004, observou-se que esta
classe nova de antiinflamatórios promovera toxicidade cardiovascular, fato que
provocou a retirada do medicamento deste mercado mundial (LANGTON, HANKEY
& EIKELBOOM, 2004).
Assim sendo, a utilização de inibidores seletivos de COX2 devem ser

cautelosos e em condições específicas, devido seu efeito adverso severo sobre o
sistema cardiovascular e benefícios incertos sobre o sistema GI (INOTAI & VINCZE,
2008).
Na Italia, em 2002 uma campanha intitulada de Projeto Gardenia teve meta

de avaliar as prescrições de antiinflamatórios esteróides (AIEs) e AINEs com o
objetivo de orientar o uso racional e minimizar as reações adversas. Os resultados
foram positivos em relação à redução dos problemas relacionados a esta classe
terapêutica (SCARPATO et al, 2002).
Neste sentido, baseado nas recentes tecnologias e protocolos terapêuticos,

para pacientes com risco médio de distúrbios gastrointestinais, a prescrição deve ser
de medicamentos AINEs não específicos que apresentem sistemas de liberação
lenta, associados ou não com inibidores de bomba de prótons (IBP) e, utilização
com cautela para os AINES seletivos COX2 (INOTAI & VINCZE, 2008).
A análise de associações ligadas ao controle de úlceras pela administração

de AINEs, em 1000 pacientes tratados com IBP e 1000 não tratados, demonstrou
que 95% dos não tratados apresentaram problemas gastrointestinais, constatando o
aumento dos valores totais com o tratamento, a fim de reduzir os custos com
internação ou procedimentos por complicação (VONKEMAN et al, 2008)
Com base nestes dados, observa-se a necessidade de novos

antiinflamatórios, destituídos de efeitos adversos. Entretanto, o planejamento de
novos fármacos através da modificação radical, isto é, a criação de uma molécula
totalmente nova, é um processo de alto custo que envolve milhões de dólares e a
participação de equipes com diversos profissionais em etapas interdisciplinares
(DIMASI, HANSEN & GRABOWSKI, 2003; SANTOS, 2007; BARREIRO, 2009). A
3
figura 1 mostra a complexidade e as diversas ferramentas que podem ser utilizadas
no planejamento de novas moléculas biologicamente ativas.
Figura 1. Etapas multi e interdisciplinares para invenção e/ou incrementação terapêutica de

um fármaco (modificado de BARREIRO, 2009).
Tendo em vista a magnitude dos caminhos e processos na descoberta dos

fármacos, destacam-se estratégias baseadas na modificação molecular de fármacos
ou protótipos conhecidos, citado por Sir James Black, ganhador do prêmio Nobel em
medicina e fisiologia em 1988. Entre as técnicas de modificação molecular
(modificação incremental), podemos citar: latenciação, bioisosterismo, hibridação,
anelação entre outras (WERMUTH, 2008).
A modificação molecular tem permitido a obtenção de compostos

antiinflamatórios ativos, incluindo processos que consistem, basicamente, na
“reciclagem” de substâncias antes descartadas por problemas de toxicidade,
farmacocinética e outros.
Tendo o protótipo como ponto de partida, inicia-se a síntese dos análogos

obtendo compostos com maior potência, especificidade e segurança além de
possibilitar melhor aceitabilidade pelos pacientes e adesão ao tratamento, como por
exemplo, a ranitidina, obtida como bioisóstero da cimetidina (figura 2), apresentando
4
maior tolerabilidade e menor incidência de interações com outros medicamentos,
além de diminuição dos efeitos adversos como ginecomastia (BARREIRO, 2002;
OLIVEIRA, CASSAL & PIZARRO, 2003).
N
O
N
2
H
N
S
S
N
H
N
H
N
N
H
N
H
cimetidina ranitidina
Figura 2. Estruturas da cimetidina e seu bioisóstero, ranitidina.
Por vezes, estes novos compostos são denominados “me too” por serem
cópias dos protótipos, entretanto é possível observar vantagens na rapidez, no
desenvolvimento demonstrando melhoramento das características físico-químicas
como pKa, logP, solubilidade e estabilidade, farmacocinéticas e/ou terapêuticas
Esta estratégia é utilizada pela indústria farmacêutica para produzir fármacos

promissores sobre o aspecto econômico garantindo assim uma parcela prestigiosa
do mercado. Entre os exemplos mais famosos encontram-se os análogos da
lovastatina: sinvastatina, provastatina, fluvastatina, atorvastatina, etc (FERREIRA &
KOROLKOVAS, 1980; WERMUTH, 2008).
Figura 3. Analogos da lovastatina.
5
A química farmacêutica e medicinal destaca os processos modificação
molecular vinculado a técnica de latenciação e hibridação molecular, sendo as mais
frequentemente utilizadas em todo o mundo (CHUNG & FERREIRA, 1999;
BARREIRO et al, 2002; LIMA & BARREIRO, 2004; SILVA et al, 2005). Ambas serão
detalhadas a seguir, em face de utilização das mesmas neste trabalho.
O processo de latenciação visa a obtenção de pró-fármacos (compostos

latentes), inativos per si, sendo bioativados in vivo (STELLA & NARINGREKAR,
1985; HSIEH, HUNG & FANQ, 2009). O pró-fármaco clássico apresenta ligação
bioreversível, entre o fármaco (ou protótipo) e outra molécula chamada de
transportador, este podendo ou não apresentar atividade biológica, porém, isento de
toxidade.
Os bioprecursores são formas latentes que não possuem grupos

transportadores, mas necessitam de reação química ou enzimática, in vivo, para
exercerem suas atividades. Um exemplo de fármaco bioprecursor é o omeprazol, um
inibidor de bomba protônica, (figura 4) (SILVA et al, 2005; WERMUTH, 2008;
TESTA, 2009).
Figura 4. Mecanismo de bioativação do omeprazol pelo meio ácido e sua ligação e inibição
da bomba protônica (ATPase-SH).
O omeprazol está entre os quatro medicamentos, juntamente com aciclovir,

sinvastatina e enalapril, que rendem bilhões de dolares às indústrias farmacêuticas
no mundo, considerados “blockbusters”, que apresentam como principio esta técnica
6
de modificação molecular demonstrando as razões de sucesso para o emprego no
planejamento de novos fármacos. (ETTMAYER et al, 2004).
Mediante a escolha de transportador adequado, é possível promover aumento

de biodisponibilidade, diminuição da toxicidade, prolongamento da ação e aumento
da seletividade (SINGH & SHARMA, 1994; CHUNG & FERREIRA, 1999).
Os Pró-fármacos Mistos apresentam características de pró-fármacos

clássicos e de bioprecursores, enquanto os Dirigidos apresentam transportadores
capazes de carregar seletivamente o fármaco do local administrado para o sítio de
ação. (SILVA et al, 2005).
A liberação de fármacos no local de ação via pró-fármacos, tem gerado

grande interesse para aumentar a seletividade. Isto porque podem diminuir os
efeitos adversos dos protótipos dos quais derivam, além de, incrementar o arsenal
terapêutico (CASTRO et al, 2004). A figura 5 mostra o esquema do processo de
latenciação.
Figura 5. Esquema do processo de latenciação. A barreira representa os problemas

limitantes do fármaco. Ao atravessar a barreira, in vivo, o pró-fármaco é bioativado,
liberando o fármaco para promoção da atividade (modificado de SILVA et al, 2005).
Além da seletividade e diminuição da toxicidade, o emprego da latenciação

visa corrigir problemas como:
7
instabilidade ou solubilidade inadequada na formulação ou frente aos fluidos
gastrintestinais,
características organolépticas desagradáveis para uso,
equilíbrio hidrófilo-lipófilo inadequado para atravessar membranas biológicas e
alta taxa de biotransformação ou eliminação pré-sistêmica.
Sendo assim, o transportador pode ser um segundo fármaco e a união entre

estes dois fármacos pode acontecer diretamente através de ligação lábil ou por meio
de um grupo espaçante, o qual poderia facilitar o acesso enzimático do derivado por
torná-lo mais exposto para hidrólise, descartando as possibilidades de impedimento
estérico (Figura 6) (MENGER & ROURK, 1997).
Figura 6. Fármacos administrados em associação (1); Pró-fármacos recíprocos ligados

diretamente entre si (2); Pró-fármacos recíprocos ligados via agente espaçante (3).
Os pró-fármacos recíprocos não são tão recentes, já que vários compostos

foram introduzidos na terapêutica antes do conhecimento de pró-fármaco
propriamente dito. A sulfassalazina, introduzida na terapêutica em 1942 para o
tratamento de colite ulcerativa, é clivada em sulfapiridina e ácido 5-
aminossalicílico (5-ASA, mesalazina) por ação de azorredutases do cólon. Após a
descoberta de que o 5-ASA era o responsável pela atividade farmacológica, foram
desenvolvidos vários outros pró-fármacos derivados dele, incluindo o pró-fármaco
8
recíproco de duas moléculas de 5-ASA, a olsalazina (figura 7) (VILASECA et al.,
1990).
Figura 7. Ação de azoredutases do cólon no metabolismo de sulfassalazina para a

obtenção de mesalazina (5-ASA) e do pró-fármaco recíproco olsalazina, na obtenção de
duas moléculas de mesalazina. (modificado de NIELSEN & MUNCK, 2007).
A utilização do processo de latenciação na obtenção de pró-fármacos

AINEs podem reduzir os efeitos adversos gástricos provocados pelos AINEs,
permitindo seu uso crônico.
Por exemplo, Shela, Khedr & Elsherief (2002) sintetizaram uma série de
pró-fármacos recíprocos derivados do naproxeno e propilfenazona (figura 8), com
atividade analgésica e antipirética, obtendo maior tolerabilidade.
9
Figura 8. Obtenção de pró-fármaco recíproco de naproxeno e propilfenazona, diretamente
ligado (SHELA, KHEDR & ELSHERIEF, 2002).
O uso de agentes espaçantes (figura 9) facilita a hidrólise dos fármacos

ativos, devido ao menor impedimento estérico das enzimas no processo de
conversão. (PARMESHWARI et al, 2007).
Figura 9. Obtenção de pró-fármaco recíproco de naproxeno e propilfenazona com agente

espaçante (SHELA, KHEDR & ELSHERIEF, 2002).
Outro exemplo inclui uma nova de série de AINEs derivados do ibuprofeno

com reduzida toxicidade gástrica e potente ação antiagregante foi obtida através da
ligação com furoxanos e furazonas (figura 10) (LOLLI et al, 2001).
Estes compostos foram obtidos baseados em trabalhos utilizando-se

doadores de óxido nítrico (NO) com o objetivo de reduzir os efeitos GI e vasculares
provocados pelos AINEs (BANDARAGE et al, 2000; UCHIDA et al, 2001;
MAHMOUD, MOHAMED & ABDALLAHA, 2001; RANATUNGE et al, 2006).
10
O
ESPAÇADOR
AINE O
ONO2
CH3
O
CH3
O O R
CH3
N N
O (O)n
Figura 10. Pró-fármacos recíprocos derivado de ibuprofeno e doador de NO (grupo

furoxâmico) (LOLLI et al, 2001).
Nesta mesma direção, derivados do ácido acetilsalicílico como doadores de

NO, que apresentam atividade antiinflamatória, antiplaquetária e gastroprotetora
promissora foram descritos por CENA, et al. em 2003 e novas pesquisas apontam
como futuros candidatos a fármacos AINES, inibidores seletivos de COX2 com
capacidade de doar NO (ABDELLATIF et al, 2008).
O NO é um segundo mensageiro químico, com o papel de ativar ou inibir

diversas moléculas alvo, merecendo destaque na regulação do tônus vascular e
resposta imunológica (BARRETO, CORREIA, MUSCARÁ, 2005).
Existem três isoformas de NO sintase (NOS) sendo duas constitutivas cálcio

dependentes: endotelial, eNOS e neuronal, nNOS e uma induzida, a iNOS não
dependente de cálcio. O NO é produzido pela oxidação do nitrogênio guanidinico
terminal de L-arginina pela NO sintase (NOS) na presença de coenzimas como a
nicotinamida adenina difosfato (NADPH) e a calmudolina (CaM) no caso da
isoformas constitutivas (figura 11) (THOMAS, 2003). O NO é rapidamente
convertido em dióxido de nitrogênio (NO2) e, em seguida, em formas mais estáveis
como nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-) (PALMER, FERRIGE, MONCADA, 1993).
NH2 NH-OH O
H2 N H2N H2N
NH NH3 NH NH3 NH NH3
CaM / NOS
O CaM / NOS O O
NADPH / O2
NADPH / O2 L-citrulina O
L-arginina O O
NO
óxido nitrico
Figura 11. Biossíntese de NO.
11
A iNOS está presente em grande quantidade no durante o processo
inflamatório, no qual o NO produzido provoca lesão oxidativa aos microorganismos
invasores (DINERMAN et al, 1994; THOMAS, 2003). Neste sentido, é possível
observar um aspecto marcante desta molécula: a sua capacidade de ser benéfica ou
potencialmente tóxica conforme a concentração ou depuração tecidual. Alguns
autores, como Schmidt & Walter (1994), denominam muito apropriadamente o NO
como uma “faca de dois gumes” (double-edgedsword).
De fato, Palumbo, Cioffi e DÍschia (2001) solicitaram patente CAN

137:346227, AN 2002:894293 e ITRM20000039 A, para compostos inibidores de
NOS visando usos diversos, incluindo em processos inflamatórios, reforçando a
expectativa de segurança dessa terapia com a justificativa de normalisar os níveis
de NO, impedindo, desta forma, a presença ativa e exacerbada da iNOS e inibindo a
cascata do ácido araquidônico (PALUMBO, CIOFFI & DÍSCHIA, 2001).
A taurina é um aminoácido não clássico, possuindo em sua estrutura um

grupo sulfônico ao invés de carboxílico (figura 12), classificado como um nutriente
condicionalmente essencial, importante durante o desenvolvimento dos mamíferos,
porém, na maioria das vezes, é esquecido e não adicionado à lista de aminoácidos
essenciais.
Figura 12. Taurina.
Em 2006, Vizioli planejou uma série de pró-fármacos recíprocos derivados de

taurina e testou o potencial inibitório de iNOS em cultura de células macrofagicas do
exsudato peritoneal de camundongos (estimulados com LPS). Tendo em vista que a
taurina possui a capacidade de inibir iNOS presente em macrófagos no processo
inflamatório, o objetivo do estudo foi observar se a ligação amídica dos AINEs à
taurina, provocaria alteração na atividade de ambos.
12
O experimento foi realizado por método indireto de detecção de NO, através
de seus metabólitos, utilizando o nitrito como controle positivo e aminoguanidina um
inibidor enzimático seletivo, como controle negativo. Os resultados demonstraram
que os pró-fármacos apresentaram diminuição da produção de NO, similarmente à
da taurina, sugerindo que a ligação dos AINEs à taurina não modificou esta
atividade, e consequentemente, a taurina poderia apresentar efeito sinérgico na
atividade antiinflamatória.
Além disso, um teste de viabilidade celular foi realizado no intuito de

comprovar que a diminuição da produção de NO não decorreu por morte celular.
Estes resultados impulsionaram o depósito da patente PI

0000220802234957/ 2008 e PCT – WO 2009/124371, de novos compostos
derivados de taurina, processo de sua preparação e composições farmacêuticas
contendo os mesmos, em parceria com a Empresa Farmacêutica EMS-Sigma
Pharma (VIZIOLI et al, 2008).
A taurina apresenta caráter anfótero em pH fisiológico, bem como alta

hidrossolubilidade e baixa lipossolubilidade (FOOS & WU, 2002). É o aminoácido
intracelular mais abundante no organismo e está presente em concentrações
elevadas no músculo esquelético, sendo mais evidente nas fibras de oxidação lenta
tipo I (39,2 mmol/kg/massa seca) que nas fibras tipo II (9,6 mmol/kg/massa seca)
(WARD et al, 1999; DAWSON et al, 2002; CUISINIER et al, 2001).
Este aminoácido recebeu pouca atenção dos pesquisadores até 1993, sendo
mais explorado como pró-anabólico (WAITZBERG, 2002). Até as décadas passadas
a única função atribuída a esse aminoácido era de emulsificar lipídios no sistema
digestivo para facilitar seu transporte (SHIRLEY, 1994).
Atualmente, sabe-se que a taurina está envolvida em inúmeras funções

fisiológicas, entre elas: fator trófico no desenvolvimento do sistema nervoso central;
manutenção da integridade estrutural da membrana; antiagregante plaquetário;
regulação do transporte e ligação do cálcio; antioxidante e imunomodulação
(BALASUBRAMANJAN, SOMASUNDARAM & FELIX, 2004; KOUZUKI et al, 1998;
WETTSTEIN & HÄUSSINGER, 1997).
13
A taurina é considerada um substrato indispensável durante o estresse
catabólico, sendo utilizada como pró-anabólico em bebidas energéticas, uma vez
observado fadiga da musculatura esquelética tendo sido relacionado com a redução
deste aminoácido. Terapeuticamente, é utilizada em formulações enterais como
suplemento para neonatos, para o desenvolvimento da retina. (FÜRST & STEHLE,
1994).
As pesquisas demonstraram que a taurina, no sistema imunológico, modula a

ação de células T (MARCINKIEWICZ et al, 1998) e reduz a presença de neutrófilos
no processo inflamatório (MARCINKIEWICZ, GRABOWSKA & CHAIN, 1998).
Aditivamente, in vitro, inibe a geração outros mediadores macrofágicos inflamatórios
(MARCINKIEWICZ, 1995), bem como a expressão celular da COX2, sobre ação pós-
transcricional, inibindo consequentemente, a PGE2 (QUINN; PARK & SCHULLER-
LEVIS, 1996; LIU et al, 1998), sem alterar o padrão de resposta vascular e
resistência periférica, demonstrados em experimentos de vaso-relaxamento em
órgãos isolados de aorta, artéria renal e mesentérica de coelhos (NIU et al, 2007).
Motawi, Abd Elgawad, e Shahin, em 2007, investigaram o envolvimento da

infiltração de neutrófilos, produção de NO e estresse oxidativo, na promoção da
ulceração gástrica, induzida pela indometacina. Os experimentos demonstraram um
efeito antioxidante da taurina quando associado a este AINE, normalizando as
atividades da glutationa redutase e superóxido dismutase.
Takeuchi e colaboradores, em 1995, sugeriram que a taurina apresenta

atividade gastroprotetora por reduzir a secreção de ácidos aumentando a liberação
lumial de ânions bicarbonato. Este pesquisador demonstrou, também, que esta
atividade gastroprotetora não se devia à inibição da secreção ácida no estômago.
Além disso, o pré-tratamento de ratos com inibidores da síntese de óxido nítrico (NG-
nitro-L-arginina metilester - L-NAME) e de indometacina não afetou o efeito protetor
da taurina.
Em 2000, o mesmo grupo publicou trabalho sobre o papel da interação

endógena da PG e do NO na regulação da secreção ácida que induz dano no
estomago de ratos, sugerindo o papel fundamental do NO nos mecanismos de lesão
(TAKEUCHI et al, 2000).
14
Com base nestes conhecimentos e, na busca de antiinflamatórios mais
potentes e destituídos de toxicidade, os pró-fármacos recíprocos planejados por
Vizioli (2006) seguiu conforme a figura 13, esperando-se que in vivo, os AINES e a
taurina fossem liberados.
Figura 13. Planejamento dos pró-fármacos recíprocos derivados de taurina e AINES (AS,
ibuprofeno, naproxeno, diclofenaco e indometacina) (VIZIOLI, 2006).
Na figura 14, observa-se uma representação esquemática da dificuldade para

o lançamento de um novo fármaco no mercado. São necessários milhões de dólares
no desenvolvimento de moléculas que nem sempre chegam a ser comercializadas.
15
Figura 14. Representação do funil do desevolvimento de novos fármacos (fonte:
http://www.daiichisankyo.com.br/imgs/pictures/img_ped_cone.jpg, acesso 17/11/2009).
Neste sentido, a utilização de um medicamento AINE já consagrado na

terapêutica, contendo a taurina como transportador (inovação incremental) seria
uma alternativa a essas dificuldades, uma vez que a toxicidade da taurina em
humanos é praticamente nula (SHAO & HATHCOCK, 2008).
Shao e Hathcock (2008) publicaram um estudo de revisão sobre toxicidade

clínica de aminoácidos, no intuito de estabelecer a segurança da suplementação
destes, incluindo a taurina. Os resultados demonstraram nenhum efeito adverso em
pacientes que utilizaram dose superior a 10 g por dia durante 6 meses e em
pacientes que utilizaram doses que variam de 500 mg à 1500 mg por dia por um
período de 12 meses.
Para que a indústria farmacêutica dê prosseguimento a uma pequisa de

novos fármacos, evoluindo para pesquisa clínica, exige-se a prova de conceito. Os
efeitos de atividade anfiinflamatória aguda e gastroproteção devem ser comprovados
científicamente. Caso este fato se comprove para este grupo de pró-fármacos, a
utilização destes poderá revolucionar a terapêutica de antiinflamatórios.
16
Além da obtenção de pró-fármacos recíprocos, outro processo de modificação
molecular pode ser utilizado na obtenção de bioligantes ou protótipos em que sejam
incluídas, na mesma molécula, propriedades farmacodinâmicas de duas moléculas
diferentes, de forma a assegurar uma melhor eficácia terapêutica, por sinergismo de
ação.
Nesse caso, o desenho estrutural, baseado no mecanismo de ação, deve

considerar fatores estruturais mais complexos, de maneira a assegurar à mesma
molécula planejada o reconhecimento molecular por dois alvos terapêuticos,
simultaneamente.
A hibridação molecular é um processo de modificação molecular que leva em

consideração o desenho de uma molécula com propriedade dual e, como as formas
latenciadas, apresentam vantagens farmacocinéticas sobre a administração
concomitante de dois fármacos distintos (BARREIRO et al, 2002).
O termo ligante múltiplo (LM) foi recentemente proposto por Espinhosa-

Fonseca (2006), para denominar um fármaco com a capacidade de ser reconhecido
por mais de um receptor, antes chamados de ligantes duais e heterodímeros. As
vantagens do LM são:
1. Inibição de diferentes alvos de uma mesma rota metabólica por uma única
molécula, aumentado a eficácia terapêutica;
2. Para uma molécula de estrutura química simplificada, pode-se não somente

alterar a biodisponibilidade na célula, mas também sua capacidade de ser
eficientemente eliminada depois de sua ação, devido à facilidade dos sistemas de
distribuição e excreção.
Quando se planeja a obtenção de compostos híbridos deve-se levar em

consideração, a relação estrutura química atividade dos compostos assim como dos
seus receptores (SANTOS, 2007).
A busca por novos LM prototipos ativos, em geral requer o planejamento de

uma série de derivados híbridos moleculares. A utilização desta ferramenta para
descoberta de novos fármacos antiinflamatórios permite a obtenção de compostos
com atividade, por vezes, superior aos AINEs, capazes de atuar em processos
17
crônicos degenerativos como a doença de Alzheimer, conforme exemplo da figura
15 (ROCHA & VIEGAS-Jr, 2008).
Figura 15. Construção de uma série de AINEs capazes de interferir no avanço da Doença
de Alzheimer, inibindo a atividade da acetilcolinesterase (AChE), utiliuzando a técnica de
hibridação (ROCHA & VIEGAS-Jr, 2008).
O processo de obtenção de híbridos está intimamente relacionado com a

estratégia de obtenção de pró-fármacos recíprocos, sendo que a principal diferença
está no fato de que os pró-fármacos devem ser hidrolisados para apresentarem
ação biológica, enquanto que os híbridos podem atuar “per si” em seus receptores
específicos, exercendo suas ações (figura 16).
18
Fármaco A Receptor A
Grupos
Fármaco B farmacofóricos Receptor B
espaçador
Hibrido A-B Hibrido A/B Hibrido A-espaçante-B
Figura 16. Representação da hidridação como estratégia de modificação molecular. O

hidrido A-B é obtido através da ligação dos dois fármacos. O híbrido A/B, através da ligação
dos dois grupos farmacofóricos ou pontos de interação com os receptores A e B e o híbrido
A-espaçante-B, representa os dois grupos farmacofórios ligados por meio de um agente
espaçante.
A talidomida, um fármaco introduzido no Mercado farmacêutico em 1956 pela

Chemie Grunenthal, indústria farmacêutica alemã, com atividade sedativa,
comercializado com o nome de Contergan®, teve em 1958, sua utilização expandida
sendo para mulheres grávidas para o combate de náuseas. (TSENG et al, 1996;
GROSSHANS & ILLY, 1984). Os efeitos teratogênicos provocados por este
fármaco marcou o mundo. Este fato conhecido como a “tragédia da talidomida”,
levou à sua retirada do mercado, em 1961 (TSENG et al, 1996).
Entretanto, em 1965, um dermatologista israelense chamado de Sheskin,

para tratar seus pacientes portadores de hanseníase sofrendo por insônia,
prescreveu talidomida. Por sua surpresa, observou que além dos efeitos hipnóticos,
o fármaco foi capaz de atenuar as feridas (eritema nodoso) provocadas pelo
Mycobacterium leprae. (GROSSHANS & ILLY, 1984; STIRLING, 1988; ORDI-ROS et
al, 2000; LIMA et al, 2001; WANNMACHER, 2005).
De fato, os efeitos benéficos da talidomida podem ser atribuídos à sua

atividade antiinflamatória, imunomoduladora e angiogênicas (BORGES &
FROEHLICH, 2003).
19
O mecanismo de ação ainda não está totalmente esclarecido, entretanto,
sabe-se que a talidomida é capaz de inibir a quimiotaxia de linfócitos e neutrófilos.
Diminui, também, os níveis de citocinas como TNF-α e IFN-γ e estimula linfócitos T
supressores. Além disso, observou-se que talidomida apresenta um papel na
regulação dos linfócitos T auxiliaries (TH1 e TH2), aumentando a produção de TH2,
das citocinas como IL-4 e IL-5 e inibindo a produção de linfócitos inflamatórios (TH1)
e da citocina IFN-γ, em células periféricas de sangue estimuladas por antígenos e
mitógenos (TSENG et al, 1996, BORGES & FROEHLICH, 2003).
Apesar de a sua propriedade angiogênica estar sendo correlacionado com a

sua eficácia no tratamento de alguns tipos de neoplasias, em julho de 1998, o FDA
(Food and Drug Administration) aprovou a indicação da talidomida apenas para o
tratamento do eritema nodoso lepromatoso (ENL). (MARRIOT et al, 1999).
A maioria dos pacientes com ENL apresenta febre, perda de peso, fraqueza
muscular, nefrite, linfadenite, úlceras plantares, artralgias e leucocitose.
Adicionalmente, podem desenvolver dores, nódulos eritematosos na pele e no tecido
subcutâneo, o qual se acredita tratar de vasculite ou paniculite associado com
deposição de complexo imune e elevados níveis de TNF-α e IFN-γ e a resposta da
talidomida é expressiva, com taxas de resposta acima de 90 %, com melhora dentro
de poucos dias e completa resolução em 2 semanas (LVER et al, 1971).
Em pesquisa clínica com pacientes com ENL, os efeitos adversos mais

comuns relatados foram sonolência e constipação e todos os outros efeitos foram
leves a moderados e não resultaram na interrupção do tratamento. A longo prazo
mostrou redução das taxas de neurites e polineurites induzidas pela ENL
(CALABRESE & FLEISCHER, 2000).
Apesar da aprovação pelo FDA para o tratamento somente da hanseníase, a

talidomida tem sido indicada para o tratamento de várias outras doenças como a
Síndrome de Behcet, o pioderma gangrenoso, lúpus eritematoso discóide e
sistemico, eritema multiforme, nevralgia pós-herpética, prurido urêmico, nodular e
actínico, líquen plano, necrose epidérmica tóxica, infiltrado linfocítico de Jessner,
histiocitose da célula de Langerhans em adulto, sarcoidose, doença enxerto versus
doença do hospedeiro e estomatite aftosa (KYRIAKIS et al, 2000; AZULAY, 2004).
20
A talidomida mostrou ser benéfica, também, no tratamento da estomatite
aftosa recorrente, uma doença ulcerativa muito comum da mucosa oral,
caracterizada por dor e úlceras, devido à atividade em inibir o aumento da resposta
quimiotáxica dos neutrófilos (HUTTON & RODGERS, 1987; RADOMSKY & LEVINE,
2001).
Além disso, devido aos seus efeitos imunomoduladores e antiangiogênicos,

foram iniciados, em 1997, ensaios clínicos para o tratamento de mieloma múltiplo
refratário. A resposta foi positiva não somente em refratários ou recaídos, mas
também como terapia de indução e/ou de manutenção da remissão
(BITTENCOURT, 2004). Nestes pacientes, a talidomida tem mostrado o
aparecimento de alguns casos hipertensão pulmonar (ANTONIOLI et al, 2005) e
mais raramente, com trombose arterial (FERRI et al, 2009)
A utilização da talidomida nos processos inflamatórios em doenças sem cura,

graves e/ou de tratamento agressivo como o linfoma de células da zona do manto,
tem sido reportada com sucesso (DAMAJ et al, 2003).
Sem dúvida alguma, a redescoberta da talidomida é um marco importante

para a ciência, pois abre portas para a obtenção de novos compostos. Entretanto, a
teratogenicidade e neurotoxicidade devem ser fatores de preocupação médica,
sendo a correlação risco x benefício, avaliada.
Atualmente, vários grupos de pesquisa tem se esforçado no desenvolvimento

de AINEs análogos da talidomida, para o tratamento de processos inflamatórios
crônicos, a partir da técnica de hibridação molecular com o objetivo de melhorar as
suas propriedades de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) e
reduzir, principalmente, seus efeitos teratogênicos, procurando manter os grupos
farmacofóricos e excluindo os toxicofóricos.
A teratogenicidade é o efeito mais deletério da talidomida. Devido a sua

característica lipossolúvel, é capaz de atravessar a membrana placentária e causar
danos irreversíveis, levando o feto a desenvolver anormalidades da orelha externa,
oculares, malformações do trato gastrintestinal e genitourinário, provocar hipobastia
dos ossos e até mesmo a ausência total dos ossos, com apenas uma dose de 50 mg
(TSENG et al, 1996; CALABRESE & FLEISCHER, 2000; McBRIDE, 1977). A
focomelia é observada com muita freqüência com o uso de talidomida. O
21
encurtamento dos braços, pernas e a ausência de dedos nas mãos são comuns
(figura 17).
A) B)
Figura 17. Recém nascido e criança com focomelia.

(Fonte: A) http://dermatology.cdlib.org e B) http://www.quimicaorganica.net)
Para minimizar o problema, nos EUA há um programa especial de educação

na prescrição de talidomida segura para gestantes (System for Thalidomide
Education and Prescribing Safety) [Website: http://www.celgene.com/steps/].
A talidomida não apresenta toxicidade aguda e a dose tóxica fatal é

considerada virtualmente improvável, entretanto o aparecimento de neuropatia pode
ser limitante para o prosseguimento do tratamento. A incidência do aparecimento de
neuropatia é cerca de 11% e comumente ocorre quando a dose é superior a 200 mg
diários. As reações de hipersensibilidade podem aparecer, tipicamente, 2 a 10 dias
após o tratamento.
Atualmente, vários grupos de pesquisa tem se esforçado no desenvolvimento

de análogos da talidomida com o objetivo de melhorar as suas propriedades
farmacocinéticas e reduzir seus efeitos teratogênicos, procurando manter os grupos
farmacofóricos e excluindo os toxicofóricos, visando a descoberta e desenvolvimento
de novas moléculas para o tratamento de câncer e doenças imunológicas.
Os relatos da relação estrutura x atividade da talidomida e análogos

revelaram o potencial farmacofórico do anel ftalimídico na atividade anti-TNF-α,
mecanismo evidenciado como responsável pelos seus novos efeitos terapêuticos, ao
mesmo tempo em que denotam a irrelevância do grupamento glutarimida,
responsável pela toxicidade.
22
O planejamento de novos análogos da talidomida destituídos de
teratogêncidade torna-se possível a partir dos estudos que relacionam o efeito
teratogênico da talidomida com o grupamento glutarimida (figura 18) (LIMA et al,
2001).
atividade toxicidade
O
* O
N
NH
O O
Ftalimida Glutarimida
Figura 18. Molécula da talidomida, com seu grupo ftalimídico em vermelho e glutarimídico
em azul.
LIMA e colaboradores (2002) demostraram a atividade antiinflamatória do

composto LASSBio-468 (Figura 19) apresentando a capacidade de inibir macrófagos
quando estimulados com endotoxinas do tipo lipopolissacaridica (LPS) em até 72%,
evidenciando a contribuição do grupo ftalimida em modular as ações do TNF-α.
O
O
N S
O
N
O
Figura 19: LASSBio-468 (LIMA et al, 2002).
Nos portadores de doenças inflamatórias crônicas, os níveis da citocina pró-

inflamatória TNF-α encontram-se elevados, o qual desencadeia uma série de
alterações deletéricas como o desenvolvimento de doenças autoimunes,
inflamatórias e imunopatológicas por exacerbar o processo inflamatório
(AGGARWAL et al, 2002; SURYAPRASAD & PRINDIVILLE et al, 2003; KODAMAA,
23
DAVIS & FAUSTMAN, 2005; POPA et al, 2007; CLARK, 2007; KOCH et al, 2007;
SCHENK et al, 2007).
Uma dessas doenças, a asma, acomete as vias aéreas com a participação de

muitas células e elementos celulares, em particular, os mastócitos, eosinófilos,
linfócitos T, macrófagos, neutrólfilos e células epiteliais. O processo inflamatório
instalado causa, também, um aumento associado da resposta exacerbada pré-
existente dos brônquios a uma variedade de estímulos. Adicionalmente, evidências
indicam que ocorre uma fibrose da membrana subendotelial que pode contribuir para
as anormalidades da função pulmonar.
O tratamento mais potente e eficaz para a asma inclui o uso de

corticosteróides (antiinflamatório esteróide, AIE), cromolina e nedocromila
(dessensibilizantes antiinflamatórios), agonistas β2, metilxantinas e anticolinérgicos
(NIH, 2009; ROTTIER & DUIVERMAN, 2009).
Com base nestes conhecimentos, híbridos com atividade dual, derivados de

inibidores de TNF-α e AIEs foram obtidos com sucesso para o tratamento da asma,
agindo de forma sinérgica no processo inflamatório (figura 20).
Figura 20. Antiasmáticos, em destaque o composto 5, sintetizado pela técnica de

hibridação molecular, em vermelho grupo fármacofórico inibidor de prostaglandina PDE4 e
em azul o grupo ftalimídico inibidor de TNF-α (LIMA et al, 2002).
24
Os resultados os trabalhos demostram a relevância terapêutica de fármacos
anti-inflamatórios no controle da resposta asmática de fase tardia ou crônica,
consagrando os inibidores de TNF-α como potenciais protótipos antiinflamatórios
(figura 21).
O S
O S
O
O
N
N
H
N
N
O
O
H
S
S
O
LASSBio-468 LASSBio-596
Figura 21. Protótipo antiasmático hidrido LASSBio-468 e seu metabolito ativo LASSBio-596
( adaptadbrio de LIMA & De LIMA, 2009).
Com base nestes estudos, Castro, em 2008, obteve uma série híbridos
derivados de AINEs que levam em consideração somente o grupo ftalimídico. Assim
sendo, compostos híbridos que poderão agir de maneira sinérgica, inibindo a COX2
e citocinas inflamatórias como TNF-α com potencial atividade para doenças
inflamatórias crônicas, como a artrite reumatóide e colite ulcerativa.
Os resultados desta pesquisa demonstraram a abolição da gastrotoxicidade

provocada pelos AINEs, com a manutenção da atividade antiinflamatória em modelo
de inflamação aguda, edema de pata de rato induzido por carragenina, o que levou
ao depósito da patente INPI 020090033479, em parceria com a empresa
Farmacêutica EMS-Sigma Pharma, em 2009. Da mesma forma que para os pró-
fármacos taurínicos, a prova de conceito para doenças inflamatórias crônicas se faz
necessária para o prosseguimento da pesquisa.
Entretanto, este planejamento representa uma inovação radical. A molécula,

sendo totalmente nova, deve seguir todos os trâmites de pesquisa, incluindo os
testes toxicológicos, o que prolonga o tempo de estudo, e aumenta a complexidade
em relação a uma inovação incremental. Para as doenças crônicas, ainda não há na
terapêutica, fármaco AINE destituído de reações adversas. Nesse sentido, caso as
pesquisas confirmem os indicativos de atividade, será, também, uma revolução na
25
terapia antiinflamatória para doenças crônicas, o qual beneficiará milhões de
indivíduos no mundo inteiro. A figura 22 mostra o esquema do planejamento e os
compostos obtidos.
Figura 22. Hibridação molecular entre a subunidade ftalimidica da talidomida com os AINEs
(AS, diclofenaco, naproxeno, ibuprofeno, cetoprofeno).
1.2. Processo inflamatório
A inflamação apresenta-se como uma resposta não especifica, descrita

desde 3000 a.C. pelos egípcios. Já no primeiro século d.C. havia registros dos sinais
cardinais de inflamação, como rubor, tumor, calor, dor. Rudolf Virshow (1821-1905)
adiciona a perda de função, como um quinto sinal cardinal da inflamação identificado
como alteração inicial do fluxo sanguíneo, para o tecido lesado, resultante da
dilatação arteriolar e abertura dos leitos capilares (ROBBINS, 2000). Os eventos
vasculares caracterizam-se com o acúmulo de líquido extravascular, gerando o
edema (BOGLIOLO, 2009).
26
Na inflamação aguda (figura 23) os neutrófilos aderem ao endotélio e migram
para o local da injúria através de fatores quimiotáticos, conhecido como diapedese
(CARMAN, 2009). Moléculas de adesão são expressas de forma a facilitar a
migração leucocitária, entre elas, as selectinas (sub-tipos P, E e L), de expressão
primária, que desaceleram o fluxo sanguíneo, promovendo um aumento da
viscosidade com estase vascular. As de expressão secundária são as integrinas,
pertencentes à superfamília das imunoglobulinas (ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 e
VCAM-1). Esta fase é considerada definitiva para o extravasamento dos leucócitos
nos sítios de inflamação (ARNAUT, 1997; SKARE, 1999; MOREIRA & CARVALHO,
2001).

inflamação aguda.
Ao mesmo tempo, ocorre a ativação da fosfolipase A2 que transforma os

fosfolipídeos de membrana em ácido araquidônico (AA), sendo substrato inicial para
a cascata enzimática, que alimenta à inflamação (figura 24).
27
Figura 24. Cascata do ácido araquidônico.
O objetivo do sistema imune é mediar uma resposta inata a fim de destruir e

fagocitar os agentes agressores, e caso haja sucesso, o estímulo é bloqueado.
Quando a relação de tempo é sustentada ocorre a transição do processo agudo para
o crônico (MONTENEGRO, 1999).
O processo inflamatório está envolvido em uma série de situações, inlcuindo

o envelhecimento. Recentemente, pesquisadores sugeriram uma interrelação do
envelhecimento do tecido hematopoético, TNF-α e artrite reumatóide. (WILLIAMS-
SKIPP et al, 2009). Outros processos de agressão progressiva no envelhecimento
por estresse oxidativo e inflamação gerando falha renal (PUCHADES et al, 2009),
não poderiam ser tratados com AINEs tradicionais devido seus efeitos vasculares
adversos que incluem a própria nefrotocicidade associada a outros tratamentos,
porém a utilização de inibidores de iNOS e TNF-α se tornam atraentes.
Na doença de Alzheimer o potencial terapêutico está intimamente

relacionado com o log P do fármaco, como requisito para atravessar a barreira
28
hematoencefálica (BHE) e, sabendo da participação do processo inflamatório no
envelhecimento cerebral e a formação de placa β-amilóides, foram sintetizados pró-
fármacos de amantadina com AINEs (PRINS et al, 2009).
A intima participação da inflamação na sinalização e transdução de

mediadores oncogênicos gerando certos tipos de câncer (AGGARWAL et al, 2009),
é mais um motivo de alvo de estudo deste processo.
Na estenose de valva aorta, insuficiência cardíaca congestiva, infarto, estão

envolvidos complicações multifatorias que podem estar ligadas a uma doença
inflamatoria crônica, a aterosclerose. Neste sentido, foram síntetizados hibridos
como potencial ativador do receptor de adenosina (A2AR), protegendo a deficiência
de apolipoproteina E, e AINEs tendo em vista o papel central da inflamação (WANG,
et al, 2009).
Com efeito, a viabilização desta ferramenta imunológica ocorre com a

participação de sinalizadores antiinflamatórios e pró-inflamatórios e a inter-relação
determina o processo saúde-doença.
A inflamação crônica é seguida de danos e reparos mal sucedidos, em que se

observa a incapacitação do órgão acometido; apresentando leucócitos da linhagem
mielóide como macrófagos, e da linhagem linfóide como linfócitos T, linfócitos B e
plasmócitos. Nestas situações, reações imunes são criadas contra os próprios
tecidos, então os auto-antígenos resultam em uma reação autoperpetuadora, como
mostra a figura 25 (COTRAN & BRISCOE, 1997).
29
inflamação crônica.
O processo inflamatório crônico pode ser tratado por diferentes intervenções

terapêuticas, visto sua complexidade e a diversidade de mediadores fisiológicos
envolvidos (BARREIRO et al, 2001). No quadro 1 constam as principais: diferenças
entre o estágio agudo e crônico.
30
Quadro 1. Diferenças entre o processo inflamatório agudo e crônico.
INFLAMAÇÃO AGUDA INFLAMAÇÃO CRÔNICA
Duração Curta (dias) Longa (semanas, meses a anos)
Início Agudo Insidioso
Especificidade não específica Específica (se resposta imunitária ativada)
Células neutrófilos e macrófagos Macrófagos, linfócitos, plasmócitos e

Inflamatórias fibroblastos
Alterações Vasodilatação Neovascularização

Vasculares
Sinais Cardinais Presente Ausente
Fibrose Menor freqüência Presente

(deposição de
colagénio)
Manifestações Ausente Presente

Sistêmicas
Alterações Fatores plasmáticos: Fagocitose, resposta imunitária, reparação

Sangue complemento e imunoglobulinas, (tecido de granulação), febre baixa, perda
Periférico com febre habitualmente alta, de peso, anemia com variáveis alterações
neutrocitose e linfocitose (vírus). nos leucócitos e aumento das
imunoglobulinas.
fonte: ROBBINS, 2000; BRASILEIRO-FILHO, 2009.
No processo inflamatório, os lipídeos presentes na membrana celular são

biologicamente convertidos em sinalizadores, que se decompõem depois de
cessado o estímulo (SERHAN, HAAEQQSTROM & LESLIE, 1996).
O AA ou 5, 8, 11,14-ácido eicosatetraenóico, é oriundo de fontes

alimentares e da conversão do ácido linoléico (Ômega 6), não se apresenta
livremente intracelular (citoplasma), sendo esterificado em fosfolipídeos de
membrana. É liberado pela ação da fosfolipase A2 por estímulos mecânicos,
químicos, físicos ou ainda por outros mediadores como o sistema complemento
(BOZZA et al, 1997).
31
Quando da ativação da cascata do A.A, os seus metabólitos são sintetizados
por duas principais vias enzimáticas, as cicloxigenases (COX) ou PGHS
(Prostaglandina Sintetase ou Prostaglandina Endoperóxido Sintetase) que geram
prostaglandinas (PG) e tromboxanos (TX), e as lipoxigenases produzindo
leucotrienos (LTC) e lipoxinas. A primeira pode ser inibida por AINES e a segunda
por corticóides que irão inibir toda a cascata do AA, por ação indireta na inibição da
fosfolipase A2 (OKUYAMA & AIHARA, 1986).
A COX na sua isoforma 1 é expressa constitutivamente, presente em

condições fisiológicas em todos os tecidos do organismo, principalmente em
plaquetas, o qual leva a formação de TXA2. Também é encontrada na mucosa
gástrica, onde catalisa a biosíntese de PG citoprotetoras, e no endotélio vascular e
tecido renal (RAZ et al, 1989; VANE et al, 1998; HOWARD & DELAFONTAINE,
2004).
A isoforma 2 (COX2 ou PGHS2) é induzível na presença de citocinas (IL-1, IL-

2 e do TNF- α, fatores de crescimento e endotoxinas, sendo expressa
caracteristicamente por células envolvidas no processo inflamatório, como
macrófagos, monócitos e sinoviócitos (VANE et al, 1998; KUMMER & COELHO,
2002; CARVALHO et al, 2004).
Por exemplo, os tecidos sinoviais de pacientes com artrite reumatóide

expressam altas taxas de COX2. Em modelos animais de artrite, a expressão de
COX2 aumenta em paralelo com a produção de PG e inflamação clínica. Em
experimentos in vitro, revelaram um aumento de COX2 após a estimulação com
citocinas pró-inflamatórias em vários tecidos como sinoviócitos, condrócitos,
osteoblastos, monócitos e macrófagos. A COX2 está aumentada em alguns tipos de
neoplasias, particularmente no cancer de cólon. Os mecanismos desta interrelação
da “super expressão” e potencial neoplásico incluem a resistência à apoptose
(Crofford, 1997)
Por outro lado, evidências mostram a existência de COX2 constitutivo nos rins
e miocárdio e o seu papel fisio e patológico no coração ainda encontra-se em
investigação (WANG & STREICHER, 2008; KWAK et al, 2009)
Trabalhos de CHANDRASEKHARAN e colaboradores, em 2002, descrevem

uma terceira isoforma, possível variante da COX1, pois é derivada do mesmo gene
32
dessa isoforma, denominada de COX3, o qual encontra-se distribuída principalmente
no córtex cerebral, medula espinhal e coração, sendo mais sensível ao paracetamol,
sugerindo que a inibição da COX3 poderia representar o mecanismo central primário
de analgesia promovida pelos AINEs (CHANDRASEKHARAN et al, 2002;
CARVALHO et al, 2004).
Por outro lado, o metabolismo de ácidos graxos Ômega 3, como o

docosahexaeóico (DHA), tem apresentado um efeito anti-oxidante e antiinflamatório,
agindo na retroalimentação negativa das cascatas inflamatórias (PARK, LIM & KIM,
2009). O esquema da figura 26 mostra a cascata pró-inflamatória e antiinflamatória.
Figura 26. Geração de metabólicos do ácido araquidônico (AA) e do ácido docosaexaenóico

(DHA). Em (1) ocorre a desestabilização da bicamada lipídica celular com exposição do AA,
que será substrato da COX2 formando prostaglandinas. Em (2) ocorre o recrutamento das
células do sistema imune, com a degranulação de histamina. Em (3) ocorre a sensibilização
de nociceptores com liberação tissular de neurocinas, alimentando a inflamação. (adaptado
de BRASILEIRO-FILHO, 2009)
A atividade celular torna-se competente ao inibir ou estabilizar principalmente

fatores nucleares pró-inflamatórios como o NFκB e TNF-α, como exemplo a
33
transcrição de uma proteína ligante de TNF-α, e a expressão de IκB ligante de NFκB
(LANTZ et al, 1990).
A ativação do sistema nervoso autônomo parassinpático tem efeito dose

dependente em bloquear citocinas pró-inflamatórias (HANSEN, 2001), bem como o
sistema neuroendócrino ao influenciar o sistema imune, ativando ou inibindo com a
liberação de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) (BLALOCK, 1994).
Como é possível observar, o processo inflamatório está presente em diversas

doenças como também no processo de envelhecimento, e seu mecanismo é
extremamente complexo. Dessa forma a existência de substâncias que possam
bloquear tal processo, torna-se escandalosamente milionária para as Indústrias
farmacêuticas.
No entanto, apesar de todos os esforços, no mercado farmacêutico, estima-se

a existência de mais de 50 AINEs diferentes, nenhum deles é ideal no controle ou na
modificação dos sinais e sintomas da inflamação ou mesmo destituído de potencial
reação adversa (RANG, DALE & RITTER, 2001; SOUZA & FERRÃO, 2006).
A utilização dos AINEs está associada ao risco de efeitos adversos

gastrintestinais, devido à inibição não seletiva das COXs. (DUBOIS et al, 2004). No
estômago, as PGs são essenciais para a proteção e manutenção de fluxo sanguíneo
da mucosa, promovendo controle negativo na liberação ácida, com estimulação da
secreção de bicarbonato e muco. Além disso, é responsável por promover a
regulação das células de movimento e reparação da mucosa (HAWKINS & HANKS,
2000).
No caso da aspirina, o dano da mucosa gástrica é incrementado pelo efeito

direto por inibição da fosforilação oxidativa mitocondrial, causando erosões da
mucosa e hemorragias podem ser observadas após 90 minutos de ingestão de um
único comprimido (HAWKINS & HANKS, 2000).
No quadro 2 encontram-se exemplos de fármacos AINEs não seletivos

enquanto a figura 27, de AINES seletivos COX2.
34
Quadro 2. Classificação dos AINEs não seletivos.
CLASSIFICAÇÃO DOS AINES
CLASSE FÁRMACOS ESTRUTURAS
O OH
ácido acetil salicílico O O
CH3
O OH
SALICILATOS
diflunisal OH
F F
fenilbutazona N
CH3 O
PIRAZOLONA
CH3
N CH3
dipirona N
O
O N S O-
Na+
CH3 O
OH
diclofenaco O Cl
HN
ÁCIDO FENILACÉTICO Cl
Cl
O
indometacina
N CH3
INDOLACÉTICO CH3
O
O OH
35
F
sulindaco
O
CH3
OH
S
O
O OH
naproxeno
CH3
CH3
O
CH3
O
ibuprofeno CH3
OH
ÁCIDO PROPIÔNICO CH3
O CH3
O
cetoprofeno
OH
ácido mefenâmico
N CH3
ÁCIDO FENILANTRANÍLICO H
CH3
HO O
piroxicam OH HN N
N
S CH3
O O
ÁCIDO ENÓLICO
O O
S CH3
tenoxicam N
H
N
S
OH O N
Fonte:Castro, 2008
36
rofecoxibe
celecoxibe
etoricoxibe
valdecoxibe
parecoxibe
Figura 27. Exemplos de AINEs seletivos COX2
Com o advento de fármacos AINEs mais seletivos (COX2), observou-se, após

larga utilização, o aparecimento dos efeitos adversos cardíacos. Segundo Brasileiro-
Filho (2009), novos fármacos antiinflamatórios deverão conter propriedades de
bloquear a adesão e migração de leucócitos, interferirem na expressão, síntese ou
liberação de citocinas, sobretudo NO e TNF-α.
37
OBJETIVO
38
2. OBJETIVO
Avaliar os derivados de AINEs obtidos pelo do processo de latenciação, com

caracteristicas imunomoduloras sobre a inibição de iNOS e derivados de AINEs
obtidos pelo processo de hibridação, com caracterísitcas duais em inibição de COX
e TNF-α, como novos protótipos candidatos a fármacos para tratamento de doenças
inflamatórias aguda e crônico.
2.1. Objetivos específicos:
• Avaliar a atividade antiinflamatória dos compostos ftalimídicos e

taurínicos em modelo de inflamação aguda e crônica;
• Avaliar a atividade analgésica periférica dos derivados ftalimídicos;
• Avaliar da gastrotoxicidade dos compostos ftalimídicos e taurínicos;
• Avaliar os efeitos tóxicos do tratamento agudo e crônico com os

compostos ftalimídicos e taurínicos.
39
MATERIAL & MÉTODOS
40
3. MATERIAL & MÉTODOS
3.1. MATERIAL
3.1.1. Reagentes e Solventes
Acetato de etila P.A. (Synth), ácido acético glacial P.A. (J. T. Baker); ácido
ácido sulfúrico P.A. (Merck); anidrido ftálico (J. T. Baker); bicarbonato de sódio
(Synth); clorofórmio (Synth); diclofenaco (Galena); diclorometano P.A. (Synth);
dietilcianofosfanato (DEPC), hidrato de hidrazina 25% (J. T. Baker), hidróxido de
sódio (Synth); sulfato de sódio anidro (Synth), metanol P.A. (Merck); cetoprofeno
(Galena), salicílico (Galena); ibuprofeno (Galena); indometacina (Galena),
naproxeno (Galena); taurina (Ajinomoto), mesalazina (Purifarma), sulfassalazina
(Purifarma)
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Preparação dos compostos AINE-ftd e AINE-tau.
Os compostos as-ftd, nap-ftd, dic-ftd, ibu-ftd, ceto-ftd e as-tau, nap-tau, ibu-tau,

indo-tau, dic-tau) utilizados neste trabalho foram preparados segundo os métodos
estabelecidos por Castro (2008) e Vizioli (2006), para obtenção de massa para os
testes biológicos. As análises de identificação foram realizados foram realizadas
pela Central Analítica – IQ-USP, SP, utilizando-se equipamento de RMN da marca
Brüker modelo DRX 400. no intuito de confirmação estrutural.
O
O
O
O
R
C
H
O
H
H
N
N
H
N
H
O
N
3
2
R
O
H
O
C
H
N
H
N
H
3
O
2
Esquema 1. Método de reação geral para preparação dos compostos AINE-ftd.
41
3.2.1.1. Preparação de AS-ftd (N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-
hidroxibenzamida):
HO
O O
N NH
O AS-ftd
salicilato de metila: reagiu-se o ácido salicílico (0,1 mol) com 40 mL de metanol

anidro em presença de ácido sulfúrico conc (8 gotas), sob refluxo, por 5 horas. O
excesso de solvente foi eliminado por evaporação rotatória e resfriamento, o resíduo
formado foi adicionado a 10 mL de tetracloreto de carbono, neutralizado com
solução saturada de bicarbonato de sódio. A mistura foi lavada com água e a fase
orgânica recolhida e seca com sulfato de sódio anidro, seguida de destilação do
filtrado sob pressão reduzida. Rendimento: 70%. Produto oleoso, com
características (odor) do salicilato de metila.
salicilato de 2-hidroxibenzohidrazida: reagiu-se 77,5 mol de salicilato de metila

(10 mL) com 50 mL de metanol e 31 mL de hidrato de hidrazina a 25%, em refluxo
(70 oC) por 16 horas. Após o resfriamento, filtrou-se o sólido branco formado.
Rendimento: 90%.
Híbrido as-ftd: reagiu-se 3,28 mmol de salicilato de 2-hidroxibenzohidrazida, 15 mL

de ácido acético glacial e 3,28 mmol de anidrido ftálico, a 130 oC e agitação por 3
horas. Após resfriamento, o produto formado foi filtrado e lavado com água.
Rendimento: 85%. RMN 1H (400MHz; DMSOd): δ 6,99-7,08 (H2 e H4; 2H); 7,51 (H3;
ddd; 1H; Jorto=8,36 Hz e Jmeta=1,71 Hz ); 7,94 (H5; dd; 1H; Jorto=7,85 Hz e Jmeta=1,71
Hz); 7,96 (H8; m; 2H; Jorto=8,7 Hz e Jmeta=2,73 Hz); 8,02 (H7; m; 2H; Jorto=8,7 Hz e
13
Jmeta=2,73 Hz); 11,10 (H1 ou H6; 1H) ppm. RMN C (400MHz; DMSO-d6): δ 166,35;
165,47; 158,15 ; 135,6; 134,94; 130,14; 129,73; 124,03; 119,81; 117,46; 115,3 ppm.
42
3.2.1.2. Preparação de de nap-ftd (N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-(6-
metoxi-2-naftil)propanamide):
OCH3
O O
N NH CH3
O nap-ftd
metil 2-(6-metoxi-2-naftil)propanoato: reagiu-se 3 mmol de naproxeno com 50 mL

de metanol anidro e ácido sulfúrico conc (2 gotas), sob refluxo, por 6 horas. O
produto formado após resfriamento foi separado por filtração e lavado com água.
Rendimento: 95%.
2-(6-metoxi-2-naftil)propanohidrazida: reagiu-se 3 mmol de metil 2-(6-metoxi-2-

naftil) propanoato, com 50 mL de metanol e 8 mL de hidrazina a 25%, sob refluxo,
por 24 horas. Após resfriamento, o produto formado foi separado por filtração e
lavado com água. Rendimento: 76%.
Híbrido nap-ftd: reagiu-se 1,63 mmol de 2-(6-metoxi-2-naftil)propanohidrazida com

10 mL de ácido acético glacial e 1,63 mmol de anidrido ftálico, sob refluxo a 130 oC
por 3 horas. Após resfriamento com banho de gelo, o pH da reação foi mantido a
7,0, com NaOH 20%, para a formação de um precipitado amarelo claro. O produto
formado foi filtrado e lavado com água. Rendimento: 80%. RMN 1H (400MHz;
DMSO-d6): δ 1,53 (H4; d; 3H ); 3,88 (H12; s; 3H); 4,06 ( H5; q; 1H); 7,18 (H11; dd;
1H; Jorto=8,87 Hz e Jmeta=2,56 Hz); 7,32 (H9; d; 1H; Jmeta=2,56 Hz); 7,52 (H6; dd; 1H;
Jorto=8,53 Hz e Jmeta=1,54 Hz); 7,82 (H7, H8 e H10; d; 3H); 7,94 (H1 e H2; 4H); 10,89
13
(H3; s; 1H) ppm. RMN C (400MHz; DMSO-d6): δ 173,03; 157,21; 135,9; 135,26;
133,37; 130,6; 129,48; 129,21; 128,41; 126,88; 126,36; 125,64; 123,7; 118,74;
105,76; 55,19; 42,95; 18,73 ppm.
43
3.2.1.3. Preparação de dic-ftd (2-{2-[(2,6-diclorofenil)amino]fenil}-N-(1,3-dioxo-
1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)acetamida):
Cl
O O
HN
N NH
Cl
O dic-ftd
acetato de metil {2-[(2,6-diclorofenil)amino]fenil}: reagiu-se 1,68 mmol de

diclofenaco, 40 mL de metanol e ácido sulfúrico concentrado (3 gotas). A reação foi
mantida sob refluxo por 6 horas. Resfriou-se a reação adicionando-se cerca de 4 mL
de gelo e neutralizando a reação com solução de bicarbonato de sódio saturada. O
precipitado formado foi filtrado e lavado com água. Rendimento de 90%.
2-{2-[(2,6-diclorofenil)amino]fenil}acetohidrazida: reagiu-se 1,61 mmol de

acetato de metil {2-[(2,6-diclorofenil)amino]fenil} com 20 mL de metanol de 6 mL de
hidrato de hidrazina a 25%, sob refluxo, por 24 horas. Após o qual se adicionou
cerca de 4 mL de gelo. A mistura reacional foi mantida em geladeira por 8 horas
para formação de precipitado branco, o qual foi filtrado por pressão reduzida e
lavado com água. Rendimento: 90%.
Híbrido dic-ftd: reagiu-se 3,22 mmol de 2-{2-[(2,6-diclorofenil)amino] fenil}

acetohidrazida com 3,22 mmol de anidrido ftálico e 7 mL de ácido acético glacial,
mantendo a reação sob agitação e refluxo por 4 horas. Após resfriamento, o produto
formado foi filtrado sob pressão reduzida e lavado com água. Rendimento: 96%.
1
RMN H (400MHz; DMSO-d6): δ 11,1 (N-H; 1H); 7,95 (m; 4H); 7,52 (dd; 1H); 7,50
(dd; 1H); 7,46 (d; 1H); 7,31 (N-H; d); 7,17 (ddd; 1H); 7,08 (ddd; 1H); 6,91 (ddd; 1H);
13
3,82 (s; 2H) ppm. RMN C (400MHz; DMSO-d6): δ 170,68; 164,81; 142,77; 136,96;
135,20; 129,37; 129,06; 123,84; 123,70; 120,79; 115,99; 36,39 ppm.
44
3.2.1.4. Preparação de ibu-ftd (N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-(4-
isobutilfenil)propanamida):
O O
N NH
O ibu-ftd
2-(4-isobutilfenil)propanoato de metila: reagiu-se 1,45 mmol de ibuprofeno com

20 mL de metanol e ácido sulfúrico conc (2 gotas), sob agitação, à temperatura
ambiente por 24 horas. O solvente foi evaporado por pressão reduzida, obtendo um
sólido branco. Rendimento 90%.
2-(4-isobutilfenil)propanohidrazida: reagiu-se 1,45 mmol de 2-(4-

isobutilfenil)propanoato de metila com 20 mL de metanol e 10 mL de hidrato de
hidrazina a 25%, sob agitação a 50 oC por 24 horas. Após o qual foi adicionado
cerca de 4 mL de gelo. O precipitado formado foi filtrado e lavado com água gelada.
Rendimento 55%.
Híbrido ibu- ftd: reagiu-se 1,45 mmol de 2-(4-isobutilfenil) propanohidrazida com

1,45 mmol de anidrido ftálico e 7 mL de ácido acético glacial, em refluxo por 5 horas.
Após o qual foi resfriado e neutralizado (pH = 7) com solução de NaOH 20%. O
precipitado formado foi filtrado e lavado com água. Rendimento: 78% RMN 1H
(400MHz; DMSO-d6): δ 0,86 (H1; d; 6H ); 1,39 (H7; d; 3H); 1,81 (H2; m; 1H); 2,41
(H3; d; 2H); 3,64 (H6; q; 1H); 7,11 (H4; dd; J= 8,0 Hz; 2H); 7,19 (H5; dd; J= 8,0 Hz;
13
2H); 7,89 (H10; m; J= 9,2 Hz; 2H); 7,94 (H8; s; 1H); 8,11 (H9; m; 2H) ppm. RMN C
(400MHz; DMSO-d6): δ 173,22; 172,52;154,99; 139,84; 138,11; 135,39; 132,7;
129,57; 129,08; 128,98; 127,42; 127,23; 127,17; 125,32; 123,8; 44,34; 29,71; 22,97;
ppm.
45
3.2.1.5. Preparação de ceto-ftd (2-(3-benzoilfenil)-N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-
isoindol-2-il)propanamida):
O O O
N NH CH3
O ceto-ftd
2-(3-benzoilfenil) propanoato de metila: reagiu-se 1,96 mmol de cetoprofeno com

50 mL de metanol e ácido sulfúrico concentrado (2 gotas), a 50 oC, por agitação por
8 horas . O solvente foi eliminado sob pressão reduzida, obtendo-se um produto
sólido amorfo de coloração branca com rendimento de 90%.
2-(3-benzoilfenil) propanohidrazida: reagiu-se 1,86 mmol de 2-(3-benzoilfenil)

propanoato de metila com 50 mL de metanol e 9 mL de hidrato de hidrazina a 25%,
sob refluxo por 24 horas. O solvente foi eliminado sob pressão reduzida, seguida da
adição de cerca de 4 mL de gelo, formando um precipitado branco, o qual foi filtrado
e lavado com água. Rendimento 75%.
Híbrido ceto-ftd: reagiu-se 1,86 mmol de 2-(3-benzoilfenil)propanohidrazida com 10

mL de ácido acético glacial e 1,86 mmol de anidrido ftálico, sob agitação, à 130 oC,
por 5 horas. Após o qual a mistura foi resfriada com banho de gelo e neutralizada
(pH = 7) com solução de hidróxido de sódio 20%. O precipitado formado foi filtrado e
1
lavado com água. Rendimento: 65%. RMN H (400 MHz; DMSO-d6): δ 1,45 (d; 3H );
4,01 (s; 1H); 7,58 (dd; 1H; J = 8,1 Hz); 7,66 (dd); 7,78 (dd); 7,94 (m); 8,13 (m; 2H);
orto
8,07 (m; 2H) 9,16 (s; 1H) ppm.
46
Método geral de preparação dos AINES-tau
Reagiu-se 1 mol de AINE solubilizado em DMF previamente seca sob peneira

molecular. Adiciona-se sequencialmente, em banho de gelo, 0,9 ml de
dietilcianofosfonato (DEPC), 1,2 mol de taurina e 7,8 mL de trietilamina previamente
seca sob peneira molecular. A reação é mantida por 2 horas sob agitação a
temperatura ambiente.
Ao final da reação, o excesso de base é removido através de arraste por
nitrogênio, e o restante é tratado com clorofórmio, filtrado e o solvente eliminado por
evaporação à pressão reduzida. O resíduo obtido é adicionado, em pequenas
porções, sobre uma solução aquosa saturada e gelada de NaHCO3. O precipitado
formado é recolhido por filtração, lavado com pequena porção de água gelada e
seco sob pentóxido de fósforo. A massa seca obtida é triturada sob THF sendo o
resíduo sólido filtrado e seco, conforme esquema a seguir.
H
N
O
O
S
O
H
2
S
O
H
3
R
N
H
R
O
H
D
E
C
P
Esquema 2. Método de reação geral para preparação dos compostos AINE-tau.
47
3.2.1.6. nap-tau (ácido 2-{[2-(6-metoxi-2-naftil) propanoil]amido}
etanosulfônico):
O
OH
S
O NH
O
O nap-tau
RMN 1H (400 MHz, DMSOd6): 1,37 (3H, d, J = 6,90); 2,67 (2H, t, J = 7,15); 2,94 (3H,
s); 2,96 (2H, t, J = 7,15); 3,66 (1H, q, J = 6,90); 6,59 (2H); 7,10 (1H, dd, J = 5,10; J =
1,66); 7,25 (1H, d, J = 8,08); 7,43 (1H, dd, J = 9,26 J = 4,29); 7,68 (1H, dd, J = 8,08 J
13
= 5,10); 7,73 (1H, d, J = 4,29); 8,09 (1H, d, J = 9,26) e RMN C (400 MHz,
DMSOd6): 19,4; 36,5; 55,2; 46,8; 40,2; 105,7; 106,8; 118,4; 125,3; 129,0; 132,9;
138,9; 149,3; 154,0; 156,8; 176,7.
3.2.1.7. ibu-tau (ácido 2-{[2-(4-isobutilfenil) propanoil] amido} etanosulfônico]}):
O
OH
S
O NH O
ibu-tau
RMN 1H (400 MHz, DMSOd6): 0,85 (6H, d, J = 6,85); 1,27 (3H, d, J = 7,36); 1,78 (1H,
hept., J = 6,85); 2,38 (2H, d, J = 7,38); 2,63 (2H, t, J = 7,15); 2,92 (2H, t, J = 7,15);
3,44 (1H, q, J = 7,36); 3,70 (2H); 6,58 (1H, dd, J = 5,12 J = 1,65); 7,02 (1H, dd, J =
5,12 J = 1,65); 7,17 (1H, dd, J = 5,12 J = 1,65); 8,10 (1H, dd, J = 5,12 J = 1,65) e
13
RMN C (400 MHz, DMSOd6): 19,3; 22,1; 29,6; 36,6; 44,2; 46,3; 50,2; 106,6; 127,0;
128,4; 138,4; 140,8; 149,2; 176,5.
48
3.2.1.8. indo-tau (ácido 2-{[4-clorobenzamida-5-metoxi-2-metil-indol) 3-acetil]
amido} etanosulfônico):
Cl
O O
OH
S
O NH
O indo-tau
RMN 1H (400 MHz, DMSOd6): 2,17 (3H, s); 2,50 (2H, s); 2,66 (2H, t, J = 7,15); 2,95
(2H, t, J = 7,15); 3,42 (3H, s); 3,73 (2H); 6,58 (1H, d, J = 1,66); 6,68 (1H, dd, J = 5,11
J =1,66); 6,94 (1H, dd, J = 6,93 J = 1,35); 7,05 (1H, dd, J = 6,93 J = 1,35); 7,63 (2H,
13
dd, J = 3,38 J = 1,35); 8,10 (1H, d, J = 5,11) e RMN C (400 MHz, DMSOd6): 13,4;
32,5; 36,4; 38,6; 55,3; 102,1; 107,3; 114,4; 110,9; 116,6; 129,0; 131,6; 133,8; 133,9;
134,5; 149,2; 155,4; 167,8; 173,2.
3.2.1.9. AS-tau (ácido 2-[(2-hidroxibenzoil) amido] etanosufônico):
OH O O
OH
S
NH
O
AS-tau
RMN 1H (400 MHz, DMSOd6): 2,73 (2H, t, J = 7,15); 3,02 (2H); 3,04 (2H, t, J = 7,15);
6,60 (1H, ddd, J = 7,42 J = 7,42 J = 1,95); 6,62 (1H, dd, J = 7,42 J = 1,95); 6,71 (1H,
dd, J = 7,42 J = 7,42 J = 1,95); 7,65 (1H, dd, J = 7,42 J = 1,95) e RMN 13C (400 MHz,
DMSOd6): 35,9; 47,4; 106,7; 115,8; 129,8; 131,3; 145,8.
49
3.2.1.10 dic-tau (ácido 2-{[2-(2,6-diclofenil)amino] fenil} acetil) amido]}
etanosulfônico):
O O
OH
S
Cl NH O
NH
Cl dic-tau
RMN 1H (400 MHz, DMSOd6): 2,64 (t, 2H, J = 7,15); 2,93 (t, 2H, J = 7,15); 2,96
(s,2H); 3,39 (3H); 6,24 (d, 1H, J = 8,23); 6,58 (dd, 1H, J = 5,10 J = 1,66); 6,72 (dd,
1H, J = 7,53 J = 7,53); 6,92 (ddd, 1H, J = 8,47 J = 8,47 J = 1,66); 7,07 (ddd,1H, J =
8,47 J = 8,47 J = 1,66); 7,45 (d, 1H, J = 8,23); 8,09 (dd, 1H, J = 8,47 J = 1,66) e RMN
13
C (400 MHz, DMSOd6): 36,9; 50,8; 44,4; 106,6; 115,4; 119,7; 123,7; 125,6; 128,2;
128,9; 129,9; 138,0; 143,2; 149,2; 175,2.
3.2.2 Ensaios Biológicos
Os trabalhos foram submetidos para o Comitê de Ética em Pesquisa da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Unesp, Araraquara, sob parecer favorável
protocolo CEP/FCF/CAr. nº 09/2007 e nº 24/2009 para execução dos ensaios
biológicos.
A estruturação das propostas foi realizada conforme os princípios éticos na

experimentação animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA.
3.2.2.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar (250-280 g) e camundongos Swiss (20-25 g)

sendo 6 animais por grupo experimental, mantidos em condições ambientais do
biotério, com temperatura controlada em 24 ºC (± 1) e ciclo circadiano de 12 horas,
em caixas plásticas (50 x 40 x 20) com no máximo 6 animais por caixa, iniciando o
período de luz as 7:00 horas. Os animais receberam alimento e água ad libitum.
50
3.2.2.2. Atividade antiinflamatória aguda (modelo de edema de pata) (baseado
em WINTER, RISLEY & NUSS, 1962).
Os experimentos de inflamação aguda foram realizados seguindo o modelo

de edema de pata, em que se induziu a formação de exudato inflamatório com a
carragenina 200µg / pata
O grupo controle recebeu por via subplantar o agente químico irritante,

carragenina, na pata posterior direita e salina na pata posterior esquerda. Os
compostos a serem testados foram administrados por via oral a outros grupos de
animais, 60 minutos antes da carragenina (subplantar).
Na execução dos experimentos, os compostos tiveram como veículo a goma

arábica 5% e foram administradas por via oral (gavage), utilizando doses de 100 µM/
Kg e 300 µM/ Kg. As doses dos compostos em mg/Kg estão listados a seguir:
COMPOSTOS PESO MOLECULAR (g/mol) DOSE EQUIVALENTE À DOSE EQUIVALENTE À
100 µM EM mg/Kg 300 µM EM mg/Kg

ácido salicílico 138,12 13,81 41,43
as-ftd 228,12 22,81 68,43
as-tau 245,27 24,53 73,59
naproxeno 230,26 23,03 69,09
nap-ftd 374,26 37,43 112,29
nap-tau 337,41 33,74 101,22
diclofenaco sódico 318,13 31,81 95,43
dic-ftd 439,29 43,93 131,79
dic-tau 402,28 40,23 120,69
ibuprofeno 206,3 20,63 61,89
ibu-ftd 350,3 35,03 105,09
ibu-tau 313,45 31,35 94,05
cetoprofeno 254,3 25,43 76,29
ceto-ftd 398,3 39,83 119,49
indometacina 357,79 35,78 107,34
indo-tau 464,94 46,49 139,47
Taurina 125,15 12,52 37,56
celecoxibe 381,38 38,14 114,42
sulfassalazina 398,39 39,84 119,52
mesalazina 153,14 15,31 45,93
51
As espessuras (mm) das patas posteriores foram medidas antes e após os
tratamentos, de hora em hora, por 6 horas após a administração da carragenina. Os
resultados foram expressos pela diferença entre as leituras das patas antes e após
os tratamentos. Após 7 horas do início do experimento, os animais sofreram
eutanásia com CO2.
3.2.2.3 Teste de gastrotoxicidade:
A ulcerogênese gástrica foi verificada nos mesmos animais dos grupos

utilizados para o modelo de edema de pata, acrescido de grupo tratado com a
mistura física taurina e antiinflamatório (equimolar, 300 µM de taurina para 300 µM
de AINE).
Após eutanásia em CO2, os animais tiveram seus estômagos removidos,

abertos no sentido da maior curvatura e lavados com solução salina. Exposta a
mucosa, esta foi observada através de um microscópio-estereoscópio Leica MZAPO,
quanto a coloração e integridade. No caso da existência de lesões, estas foram
contadas e medidas através do programa LIDA user, obtendo-se o número de
ulcerações com diferentes graus de lesão, seguindo o índice de ulcerogênese
gástrica (I.U.G.), que obedece a critérios numéricos para a classificação das lesões
da mucosa gástrica (CIOLI et al., 1974; DARLING et al, 2004):
Grau 1 : lesões < 1,5 mm

Grau 2: lesões de 1,5 à 2,5 mm
Grau 5: lesões > 4,5 mm
A análise segue critérios quantitativos relacionados à medida da área de

lesão. Os achados fotográficos encontram-se no aumento de 8 ou 16 vezes.
52
3.2.2.4 Atividade analgésica (modelo de contorção abdominal) para os
derivados ftalimídicos:
A avaliação antinociceptiva foi realizada através da observação do número de

contorções abdominais induzida por ácido acético administrada via intraperitoneal
(COLLIER et al, 1968).
Foram utilizados camundongos machos suíços, albinos, pesando de 20 - 25

g, mantidos em jejum por um período de aproximadamente 8 horas.
Os derivados hibridos foram solubilizados em goma arábica 5% e

administradas por via oral (gavage) nas doses de 100 e 300 µM/Kg de acordo com
RIBEIRO e colaboradores (2000).
Após a administração dos compostos híbridos ou controle (5% goma arábica),

injetou-se ácido acético 0,1 N (0,1 mL/10g de peso) na cavidade peritoneal dos
animais e em seguida iniciou-se a contagem das contorções abdominais durante 30
minutos.
3.2.2.5 Atividade antiinflamatória crônica (modelo colite ulcerativa distal):
O protocolo experimental foi baseado na indução de colite ulcerativa por ácido

acético e realizado seguindo critérios de Fabia et al (1992) e Vassalo et al (2007).
O grupo controle positivo de colite ulcerativa distal recebeu 2 mL per rectum

do agente químico irritante, ácido acético, na concentração de 4% sob auxilio de um
cateter/sonda gástrica de Levine nº 4, o qual 8 cm do mesmo foi introduzido e
mantido por um período de exposição de 1 minuto.
O controle negativo de colite ulcerativa distal recebeu o mesmo tratamento

descrito anteriormente, porém o agente irritante foi substituído por NaCl 0,9%. Após
a administração do ácido acético, no quinto dia, ocorreu a administração dos
compostos a serem estudados, diariamente, por mais 5 dias, com doses de 100 e/ou
300 µM, via oral ou i.p.
53
Todos os animais foram pesados no inicio e no término do experimento, para
avaliar a variação de massa corpórea e avaliados no sentido de observar o aumento
da frequência de fezes e a presença sangramento, segundo descrito por Sutherland
et al. (1987). Após o 10º. dia (da indução da colite) e 5º. dia do início do tratamento,
os animais foram autopsiados e os intestinos enviados para análise histológica,
conforme figura 28.
Figura 28. Esquema de tratamento adotado para realização experimental de colite

ulcerativa.
3.2.2.6 Analise histopatológica
Os intestinos grossos dos animais foram removidos ao termino do

experimento respeitando os limites anatômicos do reto, ampola retal, colo sigmóide,
colo descendente, colo transverso e ascendente, e enviados para realização de
biópisa pelo Instituto de Patologia Cirúrgica e citopatológica Dr Nicolino Lia Neto
(IPC) de Araraquara e avaliados segundo a classificação fornecida pelo laboratório.
a) Classificação macroscópica:
Segundo a aparência da mucosa intestinal, foi utilizado método semi-

quantitativo segundo:
54
Grau 0: normal
Grau 1: levemente friável
Grau 2: moderadamente friável
Grau 3: exudato, com sangramento espontâneo
b) Classificação microscópica:
As laminas foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) para analise, e os

achados fotográficos segue aumento de 40 e 100 vezes.
Foi utilizado como critério a observação de ulceração, necrose e hipreplasia

linfóide folicular do intestino grosso, em que se obteve uma tabela de graduações
histopatológicas utilizando método semi-quantitativo segundo:
Ulceração:
Grau 0: ausência
Grau 1: somente camada mucosa/submucosa
Grau 2: até a camada muscular própria
Necrose:
Grau 0: ausência
Grau 1: colite mucosa necrosante
Grau 2: pancolite necrosante
3.2.2.7 Planejamento estatístico
Os resultados foram submetidos ao teste de homogeneidade de variância

(Teste de Levene). Os resultados com p não significativo (acima de 0,05) foram
posteriormente submetidos à Análise de Variância (ANOVA). Se a ANOVA fornecer
resultado significativo, será seguida por teste de comparações múltiplas (análises
post hoc) como o teste de Newman Keuls. Valores de p iguais ou inferiores a 0,05
foram considerados significantes, quando houve comparação das médias foi
empregado o teste de Tukey.
55
RESULTADOS
56
4. RESULTADOS
4.1 Atividade antiinflamatória aguda (modelo de edema de pata)
Os resultados obtidos para a atividade antiinflamatória do derivado nap-tau

encontram-se na figura 29. Na dose 100 µM demonstra que o mesmo não responde
igualmente ao padrão naproxeno nas primeiras 5 horas, isto é, apresenta atividade
antiinflamatória inferior ao padrão. Entretanto, ao observar os efeitos com a
administração da dose de 300 µM, a atividade se mantém semelhante ao AINE
padrão, com excessão à terceira hora. Este fenômeno não ocorre com nap-ftd,
sendo que a atividade antiinflamatória nas duas doses são semelhantes ao padrão.
Para o pró-fármaco dic-tau, o mesmo comportamento se observa com ambas

as doses estudadas, até a 3ª hora, com diminuição da atividade antiinflamatória em
relação ao diclofenaco padrão, se igualando a partir de então. Para o híbrido dic-ftd,
a atividade antiinflamatória foi superior ao latenciado dic-tau na segunda hora,
apresentando atividade similar ao diclofenaco padrão a partir da 3ª. hora (figura 29).
Os resultados obtidos com o derivado de ibuprofeno também se encontram na

figura 29. Observam-se similaridade estatística entre o composto ibu-tau e o padrão
ibuprofeno, nas duas doses. Os resultados obtidos para o derivado híbrido de
ibuprofeno (ibu-ftd) apresentam um perfil diferenciado em relação aos demais
derivados, com diminuição da atividade antiinflamatória em relação ao padrão.
57
carragenina carragenina
naproxeno (100 µM) naproxeno (300 µM)
nap-ftd (100 µM) nap-ftd (300 µM)
nap-tau (100 µM) nap-tau (300 µM)
diclofenaco (100 µM) diclofenaco (300 µM)
dic-ftd (100 µM) dic-ftd (300 µM)
dic-tau (100 µM) dic-tau (300 µM)
ibuprofeno (100 µM) ibuprofeno (300 µM)
ibu-ftd (100 µM) ibu-ftd (300 µM)
ibu-tau (100 µM) ibu-tau (300 µM)
Figura 29. Ensaio de atividade antiinflamatória aguda (modelo de edema de pata) AINEs e seus derivados latenciados e/ou hibridos, por via
oral. Controle positivo (carragenina, sem tratamento): A) na dose de 100 µM; em B) na dose de 300 µM. No eixo das ordenadas = tempo em
horas, e abcissas = espessura em mm. (*p < 0,05 em relação a carragenina, **p < 0,05 em relação a carragenina/AINEs e ***p < 0,05 em
relação ao hibrido/latenciado - ANOVA).
58
ácido salicílico (100 µM) ácido salicílico (300 µM)
AS-ftd (100 µM) AS-ftd (300 µM)
AS-tau (100 µM) AS-tau (300 µM)
indometacina (100 µM) indometacina (300 µM)
indo-tau (100 µM) indo-tau (300 µM)
cetoprofeno (100 µM) cetoprofeno (300 µM)
ceto-ftd (100 µM) ceto-ftd (300 µM)
Figura 30. Ensaio de atividade antiinflamatória aguda (modelo de edema de pata) AINEs e seus derivados latenciados e/ou hibridos, por via
oral (v.o). Controle positivo (carragenina, sem tratamento): A) na dose de 100 µM; em B) na dose de 300 µM. No eixo das ordenadas = tempo
em horas, e abcissas = volume em mm3. (*p < 0,05 em relação a carragenina e **p < 0,05 em relação a carragenina e AINEs - ANOVA).
59
Na figura 30 encontram-se os resultados obtidos com o derivado salicílico as-
tau (100 µM). Observa-se uma atividade inferior ao padrão até a 2ª hora, se
igualando a partir de então. Para a dose de 300 µM, este efeito ocorre apenas na 1ª.
hora. Para o híbrido AS-ftd, a atividade antiinflamatória se mantém igual ao padrão
AS.
O derivado indo-tau, apresentou efeito antiinflamatório nas duas doses menor

na 1ª hora, se mantendo igual ao padrão após este período, enquanto o derivado de
cet-ftd apresenta perfil antiinflamatório semelhante com as duas doses testadas,
após a segunda hora de inflamação ao cetoprofeno, chegando a ser superior na
concentração de 100 µM, após a 5ª hora (figura 30).
4.2 Atividade analgésica (modelo de contorção abdominal) para os derivados

ftalimídicos:
Na figura 31 estão apresentados os resultados obtidos de atividade

analgésica para os derivados ftalimídicos, comparados com a dipirona, utilizada
como controle da analgesia.
Todos os compostos apresentaram atividade analgésica de inibição da

contorção abdominal induzida por ácido acético. O naproxeno apresenta atividade
inferior ao observado com a administração da dipirona nas duas doses testadas,
enquanto que o derivado nap-ftd mostrou atividade significativamente superior ao
naproxeno e semelhantemente à dipirona, também em ambas as doses. Os
resultados obtidos com cetoprofeno seguem o mesmo padrão aos observados com
naproxeno.
O AS, diclofenaco e seus derivados ftalimídicos (AS-ftd e dic-ftd) mostraram

atividade analgésica inferior ao controle dipirona em ambas as doses. Entretanto,
quando comparados com seus respectivos AINEs padrão (as e diclofenaco), nas
doses de 100 µM, a atividade foi semelhante enquanto na dose de 300, a atividade
foi significativamente superior.
Com ibuprofeno e seu derivado ibu-ftd apresentam o mesmo perfil de

atividade, sendo observado atividade analgésica semelhante à dipirona na dose de
60
100 µM e inferior quando adminstrado na dose de 300. A modificação molecular não
alterou o perfil de atividade analgésica do ibuprofeno.
dipirona dipirona
naproxeno cetoprofeno
nap-ftd ceto-ftd
100 µM 300 µM 100 µM 300 µM
dipirona dipirona
ibuprofeno ácido salicílico
ibu-ftd AS-ftd
100 µM 300 µM 100 µM 300 µM
dipirona
diclofenaco
dic-ftd
100 µM 300 µM
Figura 31. Ensaio de atividade analgésica periférica (modelo de contorção abdominal)

AINEs e seus derivados hibridos, por via oral. Controle positivo (ácido acético, sem
tratamento, 100% de contorção). No eixo das ordenadas = porcentagem de inibição das
contorções, e abcissas = doses de 100 e 300 µM. (*p < 0,05 em relação ao controle positivo
(90 ± 5 contorções em 30 minutos) e **p < 0,05 em relação ao AINEs padrão, ***p < 0,05
em relação aos híbridos AINE-ftd - ANOVA).
4.3 Gastro-ulceração ou gastrotoxicidade
A tabela 1 mostra os resultados obtidos de gastro-ulceração, através do

número de lesões (úlceras) observadas com a administração dos AINEs e mistura
física de AINEs com taurina.
Todos os AINEs padrões testados provocaram um número médio de

úlcerações de 48 a 69, observando extensão de lesão compatível com a
61
classificação máxima I.U.G. em grau 5. A ordem decrescente de número de lesões
foi:
Total de lesões: dic > ceto > ibu > indo > AS > nap
Grau 5: indo > AS > ceto > ibu > dic > nap
Grau 1: nap > dic > ceto > ibu > AS > indo
As misturas físicas dos AINEs com taurina provocaram um número médio de

ulcerações que variaram de 5 a 41, observando extensão de lesão em grau 1 a 3.
Total de lesões: AS + tau > indo+ tau > ibu + tau > dic+ tau > nap+ tau
Grau 3: indo + tau > AS + tau > ibu+ tau
Grau 1: dic+ tau = nap + tau
Para o ácido salicílico, foi observado além das lesões com pontos
hemorrágicos, assinaladas, uma marcante alteração da mucosa. A mistura física
com taurina mostrou redução na gastrotoxicidade para grau 1 com os derivados
naproxeno e diclofenaco. Com ibuprofeno e as, a redução foi menor, com grau 3.
Enquanto que para todos os derivados AINE-tau e AINE-ftd correspondentes, a
gastro-ulceração foi nula (figura 32).
A indometacina, além do grau 5 de lesão, observa-se alteração na coloração

do tecido gástrico. Com a mistura física com taurina, a lesão reduz para 3 e para a
indo-tau, foi possível observar uma ligeira alteração da coloração da mucosa, mas
sem a presença de lesões. O cetoprofeno, também promoveu grau de lesão 5,
enquando seu derivado, o tecido se mostrou integra sem lesão.
Os resultados demonstraram que a presença de taurina (mistura física),

reduziu o índice de lesão dos AINES (de grau 5 para grau 3 ou 1). Em todas as
associações a redução da área de lesão foi acompanhada por inalteração da
mucosa gástrica e de pontos hemorrágicos. A figura 32 mostra as fotografias das
mucosas gástricas.
62
Tabela 1. Efeito ulcerogênico dos AINEs, mistura física e pró-fármacos.
Composto Número (Grau 1) (Grau 2) (Grau 3) (Grau 4) (Grau 5)

de
ulceras
naproxeno 48 ± 11 37,6 ± 5,3 1,4 ± 3,4 3,1 ± 6,1 3,6 ± 4,2 2,3 ± 2,1
(78,3 %) (2,9 %) (6,4 %) (7,6 %) (4,8 %)
nap + tau * 5±3 5±3 - - - -

(100 %)
nap-tau 0 - - - - -
diclofenaco 69 ± 6 43 ± 7,8 2,9 ± 2,5 6,62 ± 3,2 5,1 ± 2,1 4,6 ± 1,9
(62,0 %) (4,3 %) (9,6 %) (7,4 %) (6,7 %)
dic + tau * 8±3 8±3 - - - -

(100 %)
dic-tau 0 - - - - -
ibuprofeno 66 ± 7 29 ± 1,3 14,8 ± 7,5 5,5 ± 5,2 10,6 ± 9,25 6,1 ± 3,3
(44,0 %) (22,4 %) (8,4 %) (16 %) (9,2 %)
ibu + tau * 26 ± 9 23,3 ± 2,2 1,3 ± 1,3 1,4 ± 3,4 - -

(89,5 %) (5,2%) (5,3%)
ibu-tau 0 - - - - -
ácido 52 ± 10 13,7 ± 7,2 8,8 ± 8,2 6,4 ± 4,1 9,6 ± 5 13,5 ±

salicílico (26,2 %) (17,0 %) (12,3 %) (18,5 %) 3,2
(26,0%)
AS + tau * 41 ± 4 25,8 ± 2,8 12,6 ± 3,3 2,6 ± 2,2 - -

(30,7 %) (6,3%)
(63,0 %)
AS-tau 0 - - - - -
indometacina 57 ± 11 4,5 ± 9,1 8,4 ± 10,2 9,6 ± 5,4 12,9 ± 6,3 21,6 ±
(7,9 %) (14,8 %) (16,6 %) (22,7 %) 4,8 (38,0
%)
indo + tau * 29 ± 8 6 ± 1,05 11,7 ± 5,1 11,3 ± 6,7 - -

(40,2 %) (39,0 %)
(20,8 %)
indo-tau 0 - - - - -
cetoprofeno 67 ± 4 38,5 ± 6,6 4,1 ± 12,3 6,4 ± 4,1 9,5 ± 7,6 8,5 ± 3,2
(57,5%) (6,1%) (9,5%) (14,2%) (12,7%)
*Diferenças significativas entre os grupos tratados com naproxeno, diclofenaco, ibuprofeno, ácido salicílico, indometacina ou
cetoprofeno (*P < 0,05 - Tuckey).
63
Figura 32. Fotografia dos estômagos dos ratos tratados com dose única (300 µM) de AINEs, mistura física equimolar dos AINEs e taruina,
AINE-tau e AINE-ftd em aumento de 8 ou16 vezes em microscópio-estereoscópio Leica MZAPO. Encontram-se circulados as lesões com
quadro hemorrágico; nd = dados não disponíveis.
64
4.4 . Atividade antiinflamatória crônica (modelo colite ulcerativa distal):
Os resultados das análises microscópicas dos testes da atividade

antiinflamatória crônica mostraram que todos os AINEs testados diminuriam as
ulcerações/necrose provocados pela colite. Entretanto, os animais perdem peso,
ocorre aumento da freqüência de fezes e a melema (fezes com sangue digerido)
está presente. Ocorre um aumento na mortalidade, com exceção do grupo AS, onde
não houve morte dos animais (tabela 2).
Os resultados observados com os grupos tratados com os derivados

ftalimídicos mostraram diminuição nos quadros de ulcerações/necrose. A melhor
resposta foi observada com o grupo ceto-ftd > nap-ftd > ibu-ftd = AS-ftd > dic-ftd.
Com os derivados taurínicos, todos os derivados demonstraram eficácia

semelhante, com a regressão do quadro de ulceração e necrose em 5 dos 6 animais
testados. Com exceção do grupo ibu-tau, todos os outros derivados não causaram
mortalidade dos animais.
Os mesmos experimentos foram realizados utilizando os medicamentos:

celecoxib (antiinflamatório seletivo COX2), sulfassalazina e mesalazina, fármacos
utilizados na terapêutica para o tratamento de colite ulcerativa, comparando-se com
os derivados dic-tau e nap-tau, administrados i.p. na dose de 150 µM. Os resultados
demonstraram que o celecoxib promove a reversão da colite 50% dos animais, e os
fármacos sulfassalazina e mesalazina revertem 87%, enquanto que a adminstração
i.p. dos derivados dic-tau e nap-tau promoveram a reversão da colite de todos os
animais testados, isto é, resposta positiva em 100% dos animais (tabela 3).
As figura 33 mostra as fotografias dos cólons do grupo controle negativo, com

a presença da mucosa normal e hiperplasia linfóide folicular. Ressalta-se que a
introdução do cateter/sonda gástrica de Levine nº 4, gera um estímulo mecânico
imunológico, resultando em uma resposta hiperplásica com grau máximo 2 na tabela
de graduação histopatológica ao utilizar método semi-quantitativo, apresentado a
seguir.
65
Grau 0: ausência; Grau 1: até dois centros germinativos contíguos; Grau 2: mais de
dois centros germinativos contíguos. Por apresentar este valor em todos os grupos,
desconsiderou-se este dado nas análises histopatológicas.
A figura 33 mostra, também, as fotografias do controle positivo com a

presença de ulceração e necrose provocada pela indução da colite pelo ácido
acético, com destruição total da mucosa e submucosa, presença de pancolite
necrosante e do sistema fagocitário mononuclear e a presença de tecido necrosado
quando do tratamento com celecoxibe, sulfassalazina e mesalazina.
A figura 34 mostra as fotografias comparativas dos cólons dos animais

tratados com AINEs e derivados taurínicos e ftalimídicos. É possível observar a
recuperação dos tecidos quando do tratamento com os derivados ftalimídicos e
taurínicos.
Com relação à toxicidade, com a dose de 62 mg/kg de ibuprofeno promoveu a

morte de 1 animal no primeiro dia de tratamento enquanto que o derivado taurínico.
promoveu também a mortalidade de 1 animal, mas somente no 3º. dia. É possível
observar que a dose de 62 mg/kg é bem abaixo da DL50 (cerca de 17 vezes menos),
o que não deveria causar nenhuma mortalidade. A tabela 4 mostra uma correlação
da DL50 aguda (dose única) encontrado na literatura e a toxicidade observada dos
AINEs durante o experimento.
Entre todos os derivados ftalimídicos, o dic-ftd promoveu a morte de 2

animais, no último dia de tratamento, contra a morte de 4 animais (2 no 2º.dia e 2 no
3º.dia de tratamento) com o padrão de diclofenaco.
O derivado ftalimídico AS-ftd se mostrou mais eficaz do que seu padrão, mas
apenas para 50% dos animais contra 16% do AINE correspondente, AS. A resposta
obtida para o derivado ceto-ftd foi muito boa, sendo a melhor do grupo ftalimídico,
com regressão total da necrose em 85% dos animais e ausência de mortalidade.
O derivado indo-tau, além de não causar mortalidade, Além das vantagens

sobre o aspecto de toxicidade do derivado taurínico, temos uma ação terapêutica
pronunciada do derivado com restabelecimento de 84% dos animais tratados contra
os 34% do fármaco matriz.
66
Tabela 2. Análise macro e microscópica do colon e estado geral dos ratos com colite ulcerativa tratados com AINEs e seus
derivados taurínicos e ftalimídicos.
Ulceração/ nap nap-tau nap-ftd dic dic-tau dic-ftd ibu ibu-tau ibu-ftd AS AS-ftd indo indo-tau ceto ceto-ftd
Necrose* n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
0 2 (34) 5 (84) 5 (84) 1 (14) 5 (84) 2 (34) 4 (66) 5 (84) 3 (50) 1 (16) 3 (50) 2 (34) 5 (84) - 6 (86)
1 4 (66) 1 (16) 1 (16) 6 (86) 1 (16) 4 1 (16) 1 (16) 3 (50) 5 (84) 3 (50) 4 (66) 1 (16) 6 (100) 1 (14)
2 - - - - - - 1 (16) - - - - - - - -
Aparência da
mucosa**
0 - 6 (100) - - 5 (84) 3 - 6 (100) 4 (66) - 4 (66) - 4 (66) - 5 (72)
1 - - 5 (84) - 1 (16) 3 - - 2 (34) - 2 (34) - 2 (34) - 2 (28)
2 1(16) - 1 (16) - - - 2 (34) - - 1 (16) - - - 2 (34) -
3 5 (84) - - 7 (100) - - 4 (66) - - 5 (84) - 6 (100) - 4 (66) -
Mortalidade 50% - - 57% - 33% 16% 16% - - - 50% - 67% -
(n/dia) (2/3º e (2/2º e (2/5º) (1/1º) (1/3º) (3/2º) (2/2º e
1/4º) 2/3º) 2/3º)
Peso (%) - 20 +3 +6 - 15 +1 - 11 +2 +2 +6 -4 +4 -8 +7 -7 + 18
Freqüência ⁭ ⁭ ⁭ N N ⁭ ⁭ ⁭ N N ⁭ ⁭ ⁭ N N ⁭ ⁭ ⁭ ⁭ ⁭ ⁭ ⁭ ⁭ ⁭ ⁭ ⁭ ⁭ N
de fezes
Melema + - - + - - + - - + - + - + -
* Analise microscópica: Grau 0: ausência; Grau 1: somente camada mucosa/submucosa;Grau 2: até a camada muscular própria
** Analise macroscópica: Grau 0: normal; Grau 1: levemente friável; Grau 2: moderadamente friável;Grau 3: exudato, com sangramento espontâneo;
⁭ = aumento; N = normal; n = número de animais; + = presença, - = ausência
nap = naproxeno; dic = diclofenaco; ibu = ibuprofeno; AS = ácido salicílico; indo = indometacina; ceto = cetoprofeno.
67
Tabela 3. Análise macro e microscópica do colon e estado geral dos ratos com colite ulcerativa tratados com celecoxib,
mesalazina, sulfassalazina e derivados dic-tau e nap-tau i.p. (150 µM).
Ulceração/ CELECOXIBE MESALAZINA SULFASALAZINA DIC-TAU NAP-TAU

Necrose*
0 3 4 4 6 6
1 - - - - -
2 3 2 2 - -
Aparência da
mucosa**
0 - - - 5 6
1 2 3 4 1 -
2 4 3 2 - -
3 - - - - -
Mortalidade (n/dia) - - - - -
Peso (%) + 4,6 % + 4,5% +2% + 15 % + 11 %
Freqüência de fezes ⁭⁭⁭ ⁭⁭⁭ ⁭⁭⁭ N N
Melema N N N N N
* Analise microscópica: Grau 0: ausência; Grau 1: somente camada mucosa/submucosa;Grau 2: até a camada muscular própria
** Analise macroscópica: Grau 0: normal; Grau 1: levemente friável; Grau 2: moderadamente friável;Grau 3: exudato, com sangramento espontâneo;
⁭ = aumento; N = normal; n = número de animais.
68
Tabela 4. Valores de DL50 aguda* (v.o) dos AINEs e toxicidade observada para o tratamento de colite ulcerativa com AINEs.
AINE DL50 ratos normais (mg/kg) Toxicidade dos ratos com

colite (mg/kg)
naproxeno 534 69
diclofenaco 150 95
ibuprofeno 1050 -
indometacina 242 107
cetoprofeno 300 < 76
AS 891 -
*Mortalidade de 50% dos animais durante o período experimental.

* Merck Index, 1996.
69
Controle positivo Controle negativo
Controle positivo Controle positivo
Controle positivo Controle positivo

*
Figura 33. Foto representativa do intestino grosso dos ratos na administração por via oral em doses repetidas (300 µM) dos padrões
tratados com celecoxibe, mesalazina e sulfassalazina, do controle positivo de colite ulcerativa (indução com ácido acético, per rectum sem
tratamento) e controle negativo (salina 0,9% de NaCl, per rectum, sem tratamneto), aumento de 40 e 100 vezes (HE). * SFM = Sistema
fagocitário mononuclear.
70
nd nd
nd
Figura 34. Foto representativa do intestino grosso dos ratos na administração por via oral em doses repetidas (300 µM) dos padrões
AINES, AINE-tau e AINE-ftd, aumento de 40 ou 100 vezes (HE); nd = dados não disponíveis.
71
DISCUSSÃO
72
5. DISCUSSÃO
5.1 Atividade antiinflamatória aguda (modelo de edema de pata)
No planejamento dos pró-fármacos taurínicos, buscava-se atividade

recíproca, isto é, uma potencialização da atividade antiinflamatória da taurina e
AINEs, pela taurina possuir a capacidade de inibir iNOS presente nos
macrófagos durante o processo inflamatório.
Entretanto, em estudo de inibição de NO, Vizioli (2006) demonstrou a

inibição de iNOS pela taurina, mas não pelos AINEs. Os derivados taurínicos,
suprimiram a produção de NO, similarmente à da taurina, sugerindo que a
ligação dos AINEs à taurina não modificaria esta atividade.
Desta forma, estes resultados experimentais já evidenciavam a

possibilidade da manutenção da atividade antiinflamatória dos pró-fármacos,
uma vez que a enzima iNOS demonstrou reconhecer e se ligar sem restrições
estéricas com a molécula obtida. Portanto, o fato dos pró-fármacos AINEs
taurínicos apresentarem uma atividade antiinflamatória similar aos referidos
padrões era previsível e o efeito inferior ao fármaco matriz nas primeiras horas,
também, tendo em vista de que o pró-fármaco deve ser bioativado para exercer
sua ativiadade (SILVA et al, 2005).
Neste sentido, esperava-se que os pró-fármacos fossem clivados por

amidases, para liberar os respectivos AINEs-tau. Confimando esta hipótese, os
pró-fármacos apresentaram o mesmo perfil, variando de 1 a 3 horas para
liberação total da substância ativa. Com exceção do ibuprofeno, a introdução
da taurina não alterou a atividade antiinflamatória, sugerindo que este
transportador não modificou as propriedades físico-químicas/conformacionais
do ibuprofeno significativamente de forma a alterar sua interação com o
receptor. Estudos conformacionais e de hidrólise serão necessários para
comprovação desta suposição.
Os derivados ftalimídicos foram planejados por hibridação molecular,

esperando-se atividade sinérgica na inibição de COX2 e TNF-α, visando a
73
possível utilização em doenças inflamatórias crônicas, como colite ulcerativa e
e artrite reumatóide, que envolvessem a participação de diversos mediadores
pró-inflamatórios como citocinas, interleucinas, NF-κB, TNF-α.
Os resultados experimentais obtidos para os compostos híbridos

ftalimídicos mostraram que estes não alteraram significativamente a atividade
antiinflamatória aguda dos AINES padrão.
O experimento de edema de pata induzido por carragenina é um modelo

de inflamação aguda, observada pela ativação da cascata do ácido
araquidônico, ativando a síntese de prostaglandinas pró-inflamatórias. Este
mecanismo é inibido por AINEs via inibição de COX2, não tendo a participação
de agentes pró-inflamatórios como o TNF-α. Desta forma, os resultados estão
de acordo com os ensaios realizados.
5.2 Atividade analgésica (modelo de contorção abdominal) para os

derivados ftalimídicos
Estudos de Ribeiro, 2000, demonstraram o papel da talidomida na

atividade antiinflamatória e analgésica, por mecanismos de inibição de TNF-α,
e estimulo de fatores antiinflamatórios como a IL-10. Neste sentido, com o
objetivo de comprovar esta hipótese, foi realizado estudo de atividade
analgésica para os compostos híbridos ftalimídicos.
Castro, 2008, ao realizar experimentos com o diclofenaco e seu derivado

hibrido nas concentrações de 1 µM e 100 µM, observou baixa atividade dos
mesmos, sendo que em 100 µM, descreve inibição de apenas 16%. Neste
trabalho, foi constatada inibição de 10 e 12% para o diclofenaco e derivado
respectivamente, para a dose de 100 µM.
Segundo Nakaema e colaboradores, em 2005 em concentração de 50

mg/Kg (157 µM) o diclofenaco já apresenta atividade analgésica com 36,6% de
inibição. Porém, na dose de 300 µM a resposta analgésica do diclofenaco foi
de 38,4% e do dic-ftd de 47,1%, sugerindo que este não é um bom modelo de
estudo para o diclofenaco e seus respectivos derivados.
74
Os resultados mostraram que todos os AINEs estudados,
isoldadamente, não são bons analgésicos, quando comparados com a dipirona.
Entretanto, o processo de hibridação melhorou a atividade analgésica dos
AINEs, com exceção do ibuprofeno. Com naproxeno e cetoprofeno, houve um
incremento significativo nas duas doses estudadas atingindo os valores de
atividade analgésica da dipirona.
Este incremento se deve ao fato de que o estímulo inflamatório induzido

pelo ácido acético que foi administrado na cavidade peritonial estimula a
liberação de uma cascata de citocinas com potencial efeito hiperalgésico,
iniciado pela presença de TNF-α local. Após o estimulo nocivo doloroso, a
resposta pode ocorrer por duas vias clássicas: a primeira que envolve a
liberação de PGs e a segunda que induz a produção de aminas
simpatomiméticas (CUNHA et al., 1992).
Além disso, ambas as vias, dependendo dos fatores estimulatórios como

a natureza agressiva, a intensidade e o tempo de duração, interferem na
liberação de TNF-α, o que determinam a produção de bradicinina, o qual
apresenta potente ação sobre a permeabilidade vascular, gerando
vasodilatação arteriolar e pode causar quimiotaxia para células inflamatórias. A
bradicinina, pode também induzir dor por ação direta sobre as fibras nervosas
(SIQUEIRA JR, DANTAS, 2000).
Os resultados, de acordo com este mecanismo, foram dependentes da

estrutura química o qual o grupo ftalimídico foi ligado. Muito provavelmente,
para os compostos naproxeno e cetoprofeno, a hibridação, não alterou a
capacidade do grupo ftalimídico em promover sua atividade analgésica.
Com relação ao AS e diclofenaco, apesar da modificação molecular não

ter ocasionado melhora na resposta antinociceptiva em relação à dipirona,
promoveu melhor resposta em relação aos AINEs padrão, demonstrando
potencialização do efeito analgésico, enquanto que para o composto
ibuprofeno, esta modificação não foi eficaz para esta atividade.
75
5.3 Gastro-ulceração ou gastrotoxicidade
Os AINES, por ação inibitória de COX1 das células parietais, promovem

o maior efeito adverso relatado para esta classe de fármacos, a
gastrotoxicidade.
As PGE2 são responsáveis pela modulação da produção ácida do

estômago. Além disso, promovem a produção de muco e bicarbonato, o qual
mantém a parede do estômago com pH fisiológico, protegido do meio gástrico.
Com a sua inibição pela ação dos AINEs, o mecanismo protetor do estômago
torna-se falho, podendo provocar ulcerações e hemorragias.
Modificações moleculares em antiinflamatórios com a introdução de

transportadores, apresentam vantagens em relação à toxicidade, devido a um
perfil de liberação diferenciado, que pode ser observado através do teste de
edema de pata. Entretanto, era de se esperar que o perfil de gastro-ulceração
para o ibu-tau apresentasse atividade similar ao ibuprofeno, uma vez que o
efeito antiinflamatório não foi alterado em função do tempo.
Tal fato não ocorreu, sugerindo assim, que há, além do fator de
liberação, um efeito significativo protetor da taurina quando o mesmo está
ligado ao AINE.
Este efeito protetor gástrico da taurina não se deve a um efeito direto no

bloqueio COX1 gástrica, mas muito provavelmente, por suas ações indiretas
provocadas por esta inibição pelos AINEs.
76
Figura 35. Mecanismo de secreção ácida pelo estômago.
Conforme a figura 35, a secreção gástrica inicia-se na fase cefálica, com

a estimulação do nervo vago atuando no sistema nervoso entérico, estimulando
a liberação de gastrina pelas células G no estômago. Por vez, a gastrina
estimula as células tipo enterocromafins (ECL) a liberar histamina, que atua
sinergicamente com a acetilcolina na liberação de HCl. As células D liberam
somastostatina, que atua na regulação paracrina, inibindo a liberação de
gastrina. O mecanismo de defesa da mucosa gástrica envolve a produção de
muco e liberação de bicardonato pelas células epiteliais superficiais, através de
ativação de COX1 e liberação de PGs (BRASILEIRO-FILHO, 2009).
Durante o uso de AINES, a inibição de COX1, gera um processo

inflamatório devido ao excesso de ácido e falha do sistema de defesa gástrica.
Na migração de leucócitos ao tecido inflamado ocorre a extrusão de enzimas
hidrolíticas, estocadas nos grânulos citoplasmáticos dos neutrófilos, como
77
mieloperoxidase (MPO), presente em grande quantidade nos grânulos
azurófilos, o qual geram dano, em conjunto com o NADPH oxidase de
membrana, pela formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e oxidação
de biomoléculas (VELOSSA, 2007).
Este mecanismo é de extrema importância para o sistema de defesa

contra microorganismos durante a fagocitose. Duas emzimas são essenciais
para este processo: NADPH oxidase, que catalisa a redução monovalente do
oxigênio molecular e ânion superóxido e a MPO, que utiliza o peróxido de
hidrogênio para oxidar o íon cloreto a ácido hipocloroso (HOCl). A figura 36
mostra o mecanismo de formação de EROs pelos leucócitos durante o
processo inflamatório.
Figura 36. Mecanismo de formação de EROs pelos leucócitos durante o

processo inflamatório (adaptado de VELOSSA, 2007)
78
Entre os EROs, encontramos:
.
O ânion superóxido (O2 -) gerado após redução monoeletrônica do
oxigênio que ocorre com quase todas as celulas, e na ativação de
neutrófilos, monócitos, macrófagos e eosinófilos A sua forma
protonada é o radical hidroxiperoxil (HO2.-), sendo esta espécie,
mais reativa que o próprio superóxido. (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 1990).
O oxigênio singlete (1O2), estado excitado de oxigênio, por não
apresentar os elétrons desemparelhados não é considerado um
radical, mas é altamente reativo podendo oxidar facilmente
lípideos de membranas biológicas. (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 1990)
O peróxido de hidrogênio (H2O2), através da dismutação
enzimática, pela superóxido dismutase (SOD) ou espontânea do
radical superóxido, Mesmo não sendo um radical livre é altamente
tóxico, produz o radical hidroxil, (HO.) um dos radicais mais
reativos conhecidos, sendo capaz de reagir com membranas
biológicas ou proteínas ligadas ao íon Fe++ (FERREIRA &
MATSUBARA, 1997).
O NO e peroxinitrito (OONO-) formam-se a partir da ativação da
NOS. O NO é uma espécie reativa do nitrogênio, que, em meio
aquoso pode formar outras espécies reativas. O OONO- é um
. .
potente oxidante, produto de reação do O2 - com NO .
O HOCl, produto da oxidação do cloreto, é catalisada pela
mieloperoxidase. Sendo a espécie oxidante mais abundante,
pode dar origem a ao radical hidroxil e o oxigênio singlete.
Apresenta um alto padrão de intoxicação celular, haja vista que os
mamíferos não apresentam enzimas catalíticas capazes de
detoxicar oxidantes clorados (LAPENNA & CUCCURULLO,
1996). As cloraminas, como a monocloramina (NH2Cl) é formada
pela reação de HOCl com amônia. Sendo esta muito lipossolúvel,
é mais reativa que HOCl.
O estudo das EROs torna-se importante no momento em que observa-

se o seu aparecimento em diversas doenças. No processo de aterosclerose,
por exemplo, foi encontrado mieloperoxidades, sugerindo segundo Wasil e
colaboradores, já em 1987 a necessidade do desenvolvimento de fármacos
que possam ser aplicados na terapêutica como antiinflamatórios capazes de
antagonizar a HOCl, protegendo moléculas alvo biologicamente importantes.
Trabalho de Lapenna e Cuccurullo, 1996, sugere que as cloraminas,

particularmente a NH2Cl estão relacionadas à injúria gástrica, observada em
79
presença de infecção por Helicobacter pylori, que produz altas quantidades de
amônia.
Com relação às ações oxidativas, Kourounakis e colaboradores (2000),

sintetizaram pró-fármacos de n-acetilcisteína com antiinflamatórios. O estudo
demonstrou que os derivados apresentam redução a toxicidade gástrica, porém
em concentrações elevadas, a atividade mucolítica da n-acetilcisteína, devido a
presença do grupo SH da cisteína, prejudica a própria mucosa, potencializando
a toxicidade gástrica.
Ainda, ao administrar doses de 1,82 mg/Kg de n-acetil cisteína durante 4

(quatro) dias observou 80 % de óbito, sendo superior aos AINEs padrões que
apresentaram índice de 50% de mortalidade (KOUROUNAKIS et al, 2000).
Um dos mecanismos de ação da gastroproteção da taurina proposto,

segundo Grimble, 1994, envolve a interação da taurina com o peróxido de
hidrogênio e o cloreto na reação da mieloperoxidade, gerando taurina
cloramina (Tau-Cl), um produto que também é pró-oxidante, porém de baixa
reatividade, neutralizando, assim, a formação de radicais livres durante o
processo inflamatório.
Adicinalmente, a Tau-Cl seria capaz de inibir a formação de mediadores

inflamatórios como NO, TNF-alfa e PGE2. Este efeito parece ser observado
com a Tau-Cl, mas não pela taurina isoladamente, dose dependente
(MARCINKIEWICZ et al, 1998).
Em 2006, Kontny e colaboradores observaram, também, a inibição pela

Tau-Cl da proliferação de sinoviocitos FLS (fibroblast like synoviocytes), células
que participam do processo de sinovite e hiperplasia sinovial, considerados
como fatores importantes na caracterização da artrite reumatóide.
Klam e Shacter (2005) demonstraram que a Tau-Cl minimizam os efeitos

de respostas inflamatórias incontroláveis responsáveis pela morte celular
(necrose) causadas pela HOCl.
Estes dados sugerem fortemente que a ação gastroprotetora do pró-

fármaco taurínico seja não somente por suas ações imunomoduladoras, que
envolvem mecanismos múltiplos, como a participação no processo de apoptose
e regulação da cascata inflamatória, por inibição de fatores pró-inflamatórios
80
como o TNF-α, o NFκB e a iNOS, como também na inibição da formação de
EROs, formando Tau-Cl.
Os compostos híbridos, porém, também apresentaram efeito

gastroprotetor, observado para todos os compostos testados, inclusive para o
derivado ibuprofeno. Tendo como base os resultados de atividade
antiinflamatória aguda, esta hibridação modificou sua estrutura tridimensional
no sentido de que sua ação COX2 diminuísse. Dessa forma, é possível sugerir
que o mesmo pudesse acontecer com a enzima COX1, igualmente e, portanto,
não promover gastroulceração por perda da atividade antiinflamatória COX1 e 2.
No entanto, o padrão de proteção em 100% ocorreu para todos os compostos,
o que sugere o mesmo mecanismo de proteção para todos os compostos,
incluindo o ibuprofeno.
Tendo em vista que a lesão no estômago pela ação da inibição em

COX1 gera um processo inflamatório com a presença de TNF-α, é possível
supor que os compostos híbridos apresentaram esta atividade, inibindo TNF-α,
tornando-os capazes de controlar o processo inflamatório. Esta hipótese
deverá ser comprovada com o testes posteriors de atividade inibidora de TNF-
α.
5.4 Atividade antiinflamatória crônica (modelo colite ulcerativa distal):
As doenças inflamatórias intestinais (DII) compreendem um amplo

espectro de afecções de etiologia desconhecida, que leva a cronicidade.
Apesar de seu gatilho inicial não estar totalmente descrito, sabe-se que
ocorre uma superprodução de mediadores pró-inflamatórios tais como
citocinas, metabolitos do A.A. (VOWINKEL et al, 2004) e EROs (REIFEN et al,
2004; CETINKAYA et al, 2005).
A administração de antiinflamatórios, como os aminosalicílicos

(mesalazina e sulfassalasina) vão de encontro com a patogênese (PRAVDA,
2005), porém não há terapia clinica definitiva (CORMAN, 2005).
81
Segundo Wallace, em 1992, a idéia da utilização de agentes anti-TNF-
α,já era amplamente difundido, uma vez que o TNF-α está associado com a
injúria tissular e indução de IL-1β e PGE2.
No modelo experimental de doença de Crohn, qualquer segmento

digestivo é afetado enquanto que na colite ulcerativa ocorre um infiltrado
leucocitário na mucosa e ulceração do epitélio do cólon e reto. A apresentação
clínica envolve ataques de sangramento retal, diarréia, eliminação de muco,
dor abdominal e perda de peso. Existem manifestações extra-intestinais como
doença hepática, renal, artrite e amiloidose (ITZKOWITZ & YIO, 2004), descrito
como “teoria de indução radical da colite ulcerativa”, em que deste modo, a
difusão inicial de espécies reativas comprometeria a barreira local da mucosa e
causaria uma transitória ativação imune, podendo gerar tais manifestações
com subseqüente propagação (PRAVDA, 2005).
Existem vários modelos animais para indução de colite, entre eles, o

ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) e dextrano sulfato de sódio,
ambos os métodos são altamente agressivos, atingindo além da camada
mucosa e sub-mucosa, a camada muscular e serosa, sendo que o TNBS
apresenta um alto potencial necrosante com índices de mortalidade que
chegam a 40% dos animais submetidos à este protocolo. Descrito por
Macpherson e Pfeiffer (1978), a aplicação de solução de ácido acético per
rectum intraluminal, promove uma colite difusa sobre resposta inflamatória
inespecífica.
Optou-se por utilizar ácido acético a 4% como agente irritante da

mucosa, por apresentar padrões de similaridade com a colite ulcerativa
humana (FABIA et al, 1992). Concentrações maiores como 8% aumentam o
risco de mortalidade (VASSALLO et al, 2007; FABIA et al., 1992).
O tratamento se iniciou a partir do 5º (quinto) dia após a indução, pois é

esperada uma uniformidade do grupo sobre a apresentação da colite após este
período (FABIA et al, 1992). Ressalta-se que a introdução do cateter, gera um
estímulo imunológico mecânico, resultando em uma resposta hiperplásica com
mais de dois centros germinativos em toda extensão da submucosa, sendo
82
classificado microscopicamente com grau máximo de 2. Por apresentar este
valor em todos os grupos, desconsiderou-se este dado nas análises.
Os resultados demonstraram que os AINEs, quando administrados em

animais com colite inflamatória intestinal induzida por ácido acético aumentam
a toxicidade, para a maioria dos AINEs estudados, aumentando os quadros de
mortalidade.
Estes resultados suportam a hipótese de que a administração de AINEs

acrescido ao processo inflamatório intestinal promoveu uma potencialização
dos efeitos inflamatórios, com a inibição de COX1, gerando a formação de
agentes pró-oxidantes. O aumento da toxicidade variou de 1,58 a 7,74 vezes,
isto é, diminuindo a margem de segurança em até 87%.
Estes resultados estão de acordo com o estudo de revisão de Kefalakes

e colaboradores (2009), que discute a exacerbação da inflamação intestinal
associado a AINES, observada em pesquisas clínicas, relatos de casos, artigos
de revisão e outros. Os autores mostraram evidências substanciais de
confirmação deste agravamento, porém, ao comparar com os inibidores
seletivos COX2, os dados são conflitantes, demonstrando segurança em
relação aos AINES tradicionais, mostrando que os AINEs seletivos são mais
seguros, quando utilizados em tratamento a curto prazo.
De fato, a inibição das prostaglandinas parece estar envolvida com os

efeitos adversos do tratamento. Mais uma vez, a formação de HOCl pode estar
envolvida como promotora de um processo inflamatório paradoxal dos AINEs.
A dose utilizada para o AS foi de 41 mg/kg acido salicílico, que não

promoveu morte nos animais. Ressalta-se que este valor foi 21,7 vezes menor
que a DL50.
Ambas as modificações moleculares, hibridação ou latenciação, não

causaram mortalidade (com exceção de ibuprofeno) tendo a freqüência de
fezes normalizada e ausência de sangramento. Os animais não perderam peso
durante o tratamento, sugerindo um perfil de alimentação normal. Além disso,
foi observado regressão da ulceração e necrose.
83
Os derivados taurínicos obtiveram melhor resposta para os derivados
dic-tau, ibu-tau em relação aos derivados ftalimídicos, enquanto que a resposta
de nap-tau e nap-ftd se mostraram semelhante.
O celecoxibe, inibidor seletivo de COX2, a mesalazina e sulfassalazina

foram testados com o objetivo de comparação com os AINES modificados.
Além disso, tendo em vista que os derivados taurínicos apresentaram alta
solubilidade em água, buscou-se observar a atividade dos compostos nap-tau e
dic-tau, intra-peritonealmente, na dose de 150 µM.
Os resultados por nós obtidos, demonstraram que tanto a mesalazina,

como a sulfassalazina apresentaram o mesmo potencial terapêutico (84% de
regressão da ulceração e necrose). Já para o celecoxibe foi verificado uma
remissão em 50% dos animais, o que sugere que a inibição seletiva de COX2
não é o unico fator envolvido na propagação do processo inflamatório intestinal
(NIELSEN & MUNCK, 2007). A atividade dos derivados administrados i.p. foi
surpreendente, com remissão total da ulceração e necrose, fato este que
evidencia o papel imunomodulatório da taurina no processo inflamatório
crônico.
O mecanismo proposto para atividade da taurina nos processos

inflamatórios intestinais envolve a inibição de iNOS, TNF-α, NF-κB,
interleucinas conforme a figura 37.
84
Figura 37. Mecanismo de ação proposto para mesalazina, taurina e talidomida
na inibição do processo inflamatório intestinal (adaptado de NIELSEN &
MUNCK, 2007).
Além disso, a taurina por formação das cloraminas potencializa o efeito

protetor gástrico e intestinal. Com os derivados ftalimídicos, a resposta na
regressão da ulceração e necrose foi devido à atividade inibitória de TNF-α.
Pelo mecanismo de indução de colite, o processo inflamatório promove a

ativação dos mediadores pró-inflamatórios, entre eles, o TNF-α. A presença de
outras citocinas pró-inflamatórias induz a liberação de NF-κB do complexo
inativo NF-κB-lκB o qual promove a ativação de TNF-α, gerando uma
retroalimentação positiva transcricional da cascata inflamatória.
A talidomida apresenta um papel na inibição de TNF-α e estimula a

transcrição de citocinas antiinflamatórias e pro-anabolicas como a IL-4 e IL-10.
Os resultados dos derivados ftalimídicos vêm de encontro com os resultados
85
obtidos por Prakashi e colaboradores, 2008, que observaram a atividade
antiinflamatória intestinal da talidomida em ratos (dose dependente).
O efeito mais acentuado dos derivados taurínicos sugere que o

mecanismo da taurina inclui a inibição de iNOS, além da inibição do feedback
positivo da cascata inflamatória descrito acima.
Com o inibidor seletivo COX2, o efeito sobre a inflamação evitou apenas

o sangramento, mas não a freqüência das fezes. Os grupos dos animais
tratados com AINEs ao final do experimento apresentaram graus de lesão
variados com tumefação e necrose de órgãos, conforme observado pela figura
38.
A B
Figura 38. Fotografia dos órgãos durante autópsia de animal com colite
ulcerativa, tratado com diclofenaco 300 µM (v.o.) por 5 dias. A) tumefação
hepática, e B) aspecto necrótico dos rins.
Eventos visualizados na figura 38 foram observados para os derivados

ftalimídicos, porém, em menor intensidade. Já com os derivados taurínicos,
todos os orgãos foram preservados.
Os resultados das biopsias do intestino grosso dos AINEs mostraram

necrose de toda a parede, enquanto que os derivados taurínicos, a mucosa
apresenta-se íntegra, ou em processo de transição escamoso-glandular que
indica restabelecimento da mucosa, demonstrando que a taurina apresentou
um papel regenerador da necrose.
Estes resultados demonstram que os pró-fármacos antiinflamatórios

taurínicos, são potenciais candidatos a fármacos antiinflamatórios para teste
86
clínico, em substituição aos AINEs clássicos. A figura 39 mostra as fases de
desenvolvimento de um novo fármaco e o estágio da qual se encontra os
estudos com os derivados taurínicos e ftalimídicos.
Figura 39. Fases da pesquisa de novos fármacos indicando os estágios das

pesquisas dos derivados ftalimídicos e taurínicos.
A pesquisa com os derivados taurínicos se encontra mais avançada que

os derivados ftalimídicos, necessitando de ensaios de hidrólise, provando a
clivagem destes pró-fármacos em AINEs e taurina in vivo. Ambos já
conhecidos e utilizados em terapêutica e em bebidas energéticas
respectivamente, facilitariam o registro destes compostos novos, junto aos
orgãos reguladores (ANVISA).
87
RESUMO DOS
RESULTADOS
88
6. RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS
Os derivados ftalimídicos AS-ftd, dic-ftd, nap-ftd, ceto-ftd apresentaram

atividade antiinflamatória (aguda) em modelo de edema de pata similar
aos referidos padrões quando adminstrados nas doses de 100 e 300
µM, v.o. e atividade antiinflamatória (crônica) em modelo de colite
ulcerativa, superior aos referidos padrões, na dose de 300 µM, v.o.
O derivado ibu-ftd mostrou atividade inferior ao ibuprofeno quando

testado em modelo de edema de pata e colite ulcerativa, sugerindo que
a hibridação molecular possa ter alterado a biodisponibilidade e/ou
interação com receptor.
Os derivados ftalimídicos AS-ftd, dic-ftd, nap-ftd, ceto-ftd apresentaram

atividade superior em promover analgesia em modelo de contorção
quando comparados com seus padrões, enquanto que a atividade de
ibu-ftd não foi significativamente diferente, quando adminstrados nas
doses de 100 e 300 µM, v.o.
Os derivados ftalimídicos não apresentaram gastrotoxicidade com dose

de 300 µM, similarmente observado por Castro (2008) na dose de 100
µM.
Os derivados taurínicos, AS-tau, dic-tau, ibu-tau, nap-tau, indo-tau são

apresentaram atividade antiinflamatória (aguda) em modelo de edema
de pata inferior na primeira e segunda horas seguida de atividade similar
ao AINES padrões, quando adminstrados nas doses de 100 e 300 µM,
v.o.
A taurina atenuou a gastrotoxicidade dos AINEs, quando misturado em

proporções equimolares enquanto que os pró-fármacos recíprocos
taurínicos com AINEs, mostraram-se destituídos desta toxicidade,
quando adminstrados nas doses de 100 e 300 µM, v.o.
Os AINEs clássicos promovem aumento de toxicidade em animais com

colite ulcerativa, potencializando a mortalidade..
89
No moldelo de inflamação crônica (colite ulcerativa), os derivados
taurínicos mostraram atividade superior aos AINES padrão, com
diminuição de mortalidade e exclusão dos sinais clínicos como
sangramentos, perda de peso e aumento da frequencia de evacuações
(aumento de fezes), quando adminstrados na dose de 300 µM, v.o.
Todos os derivados taurínicos são hidrossolúveis, permitindo a

adminitração parenteral. Os derivados dic-tau e nap-tau, administrados
i.p. na dose de 150 µM apresentaram supressão da colite em 100%,
superior ao valor observado pela administração v.o. de 300 µM de
mesalazina e sulfassalazina (67% de remissão total), fármacos de
referência para o tratamento de colite ulcerativa.
Todos os AINES-tau são potenciais candidatos a fármacos AINEs para

estudo de fase clínica I.
90
CONCLUSÃO
91
7. CONCLUSÃO
Atualmente, não existem no mercado mundial, AINEs destituídos de

gastrotoxicidade que está entre as reações adversas também provocados
pelos agentes específicos, como o celecoxibe. Neste sentido, a busca de novos
AINEs é de extrema importância, tendo em vista o envolvimento do processo
inflamatório como gatilho de diversas doenças. Os derivados híbridos
ftalimídicos (Castro, 2008) planejados com o objetivo de tratamento em
inflamações crônicas, se mostraram igualmente eficazes em relação aos
padrões AINEs, nos modelos de inflamação aguda e superior em modelo de
colite ulcerativa e analgesia, entretanto, estudos ainda devem ser conduzidos
em modelo de artrite reumatóide. Enquanto os resultados obtidos para os
derivados taurínicos (Vizioli, 2006) foram surpreendentes, mostrando atividade
antiinflamatória aguda e crônica e destituídos de qualquer toxicidade gástrica,
obtendo remissão total das lesões ulcerativas do cólon, o que não acontece
com os fármacos utilizados no mercado para o tratamento da colite, como a
mesalazina e sulfassalazina. Estes dados, são promissores para o avanço em
testes clínicos e se confirmando em humanos, será uma grande evolução no
tratamento de processos inflamatórios, principalmente para aqueles pacientes
que atualmente necessitam do medicamento, mas são impossibilitados de usá-
los, como por exemplo, hipertensos, diabéticos, pacientes com disfunções
renais/ hepáticos, entre outros.
92
PERSPECTIVAS
93
8. PERSPECTIVAS
Para os derivados ftalimídicos:
Teste de atividade analgésica central: modelo hot plate;

Teste de atividade antiinflamatória em modelo de artrite reumatóide;
Teste de reatividade vascular;
Agregação plaquetária;
Análise histopatológico: rins, fígado e coração.
Para os derivados taurínicos:
Teste de hidrólise;
Análise histopatológico: rins, fígado e coração;
Teste de reatividade vascular;
Agregação plaquetária
Ensaios de toxicidade em laboratório certificado pela Anvisa;
Estudos de escalabilidade (aumento de escala sintética para a obtenção dos
compostos).
94
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
95
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS (segundo NBR 6023/2002)
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

"JULIO DE MESQUITA FILHO"

ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS DE HÍBRIDOS

EDNIR DE OLIVEIRA VIZIOLI

Orientadora: Profa. Dra. Chung Man Chin

Ednir de Oliveira Vizioli

ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS DE HÍBRIDOS

EDNIR DE OLIVEIRA VIZIOLI

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Orientadora: Profa. Dra. Chung Man Chin

Ednir de Oliveira Vizioli

Vizioli, Ednir de Oliveira

Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de

. 1.Ensaios pré clínicos. 2. Antiinflamatórios. 3.Taurina. 4. Pró-

Ednir de Oliveira Vizioli

Título da Tese: En s ai os pr é-c lí n ic os d e hí br id os f t alim ídic os e p ró -

A Comissão Julgadora dos trabalhos de defesa da Dissertação de Mestrado,

em sessão pública realizada em 14/12/2009, consideraram o candidato:

( ) REPROVADO (X) APROVADO

1) Examinador (Prof. Dr. Leoberto Costa Tavares)_________________________

2) Examinador (Profa. Dra.Veni Maria Andres Felli)________________________

3) Examinador (Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies)___________________________

4) Examinador (Profa. Dra. Maria do Carmo Longo)________________________

5) Presidente (Profa. Dra. Chung Man Chin) ______________________________

Ednir de Oliveira Vizioli

Aos meus heróis:

Profa. Dra. Chung Man Chin

“Amo como ama o amor.

Ednir de Oliveira Vizioli

A DEUS, e a Nossa Senhora de Fátima (minha protetora) pelo mundo

A Profª. Drª. Maria do Carmo Longo, pelo apoio, convivência e ensinamentos,

À Cristiane Fátima Guarido e Marcos Fiaschetti por mostrar-me a paixão de

Ao Prof. Dr. José Carlos Nassute, por sua alegria;

Ao grande amigo Osmar Redondo, técnico, operador experimental assíduo de

Ednir de Oliveira Vizioli

A toda equipe do Lapdesf (Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento de

A equipe da Fundecif e EMS Sigma Pharma pelo suporte financeiro.

Aos iniciantes científicos Rafael Consolin Chelucci e Richard Chiquetto pela

Aos amigos de república e convívio, pelos momentos agradáveis;

A toda equipe da biblioteca da FCF (Unesp), pelo auxílio na busca e aquisição

A toda equipe da secretaria de Pós-Graduação, pelo excelente trabalho e

Ednir de Oliveira Vizioli

“This is not the end.

Ednir de Oliveira Vizioli

1.1 Planejamento de novos fármacos antiinflamatórios....................................................... 2

1.2 Processo inflamatório..................................................................................................... 26

3.2. Métodos ........................................................................................................................ 41

3.2.1. Preparação dos compostos hibridos ftalimídicos (aine-ftd) e pró-fármacos

3.2.1.1. Preparação de AS-ftd (N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-hidroxi

3.2.1.2. Preparação de nap-ftd (N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-(6-metoxi-2-naftil)

3.2.1.3. Preparação de dic-ftd (2-{2-[(2,6-diclorofenil)amino]fenil}-N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-

3.2.1.4. Preparação de ibu-ftd (N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)-2-(4-isobutilfenil)

3.2.1.5. Preparação de ceto-ftd (2-(3-benzoilfenil)-N-(1,3-dioxo-1,3-diidro-2H-isoindol-2-il)

3.2.1.6. Preparação de nap-tau (ácido 2-{[2-(6-metoxi-2-naftil) propanoil]amido}

3.2.1.6. Preparação de ibu-tau (ácido 2-{[2-(4-isobutilfenil) propanoil] amido} etanosulfônico]})... 48

3.2.1.7. Preparação de indo-tau (ácido 2-{[4-clorobenzamida-5-metoxi-2-metil-indol-3-acetil]

3.2.1.8. Preparação de AS-tau (ácido 2-[(2-hidroxibenzoil) amido] etanosufônico)....................... 49

Ednir de Oliveira Vizioli

3.2.2. Ensaios biológicos...................................................................................................... 50

3.2.2.2. Atividade antiinflamatória aguda (modelo de edema de pata)..................................... 51