Tecnologia de Enzimas

Enzyme Technology

1ª Série de Exercícios / Exercises – 1st Series

1. O que é um Biocatalisador? Que tipos de Biocatalisadores conhece?

What is a Biocatalyst? Which types of Biocatalysts do you know?

2. Enuncie fatores a considerar na escolha de um biocatalisador num processo com aplicação

industrial.
State factors to consider when choosing a biocatalyst in a process with industrial
application.

3. Descreva os níveis de organização estrutural numa enzima, evidenciando a repercussão de

cada nível na relação estrutura-função.
Describe the levels of structural organization in an enzyme, highlighting the impact of each
level on the structure-function relationship.

4. Descreva o tipo de forças responsáveis pelo enrolamento de proteínas e enzimas e porque

são mais relevantes na manutenção da estrutura tri-dimensional.
Describe the type of forces responsible for folding proteins and enzymes and why they are
most relevant in maintaining the three-dimensional structure.

5. Deduza a equação cinética de Michaelis-Menten para uma reacção enzimática simples com
um substrato e um produto.
Derive the Michaelis-Menten kinetic equation for a simple enzymatic reaction with a
substrate and a product.

a. Como procederia experimentalmente para determinar as constantes cinéticas?

How would you proceed experimentally to determine the kinetic constants?

b. Como pode representar os dados experimentais para facilitar essa determinação?

How can you represent the experimental data to facilitate this determination?

6. O que entende por atividade catalítica e específica?

What do you understand by catalytic and specific activity?

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7. A catalase é uma enzima muito reativa que decompõe peróxido de hidrogénio em oxigénio
e água. Esta proteína é tetramérica, consistindo em 4 sub-unidades idênticas, cada uma
contendo um sítio activo. O peso molecular da enzima é 240 000. A reação obedece à
cinética de Michaelis-Menten, com um valor de KM de 1.1 M a pH 7.0 e 30 ºC.
Catalase is a very reactive enzyme that breaks down hydrogen peroxide into oxygen and
water. This protein is tetrameric, consisting of 4 identical subunits, each containing an active
site. The molecular weight of the enzyme is 240,000. The reaction follows Michaelis-Menten
kinetics, with a KM value of 1.1 M at pH 7.0 and 30 ºC.

a. Estime o número de turnover para a catalase, sabendo que a velocidade inicial da

reacção foi estimada em 0.57 M.s-1 para uma concentração inicial de substrato de
0.15 M e uma concentração de enzima de 30 g/ml.
Estimate the turnover number for catalase, knowing that the initial reaction rate
was estimated to be 0.57 M.s-1 for an initial substrate concentration of 0.15 M and
an enzyme concentration of 30 g/ml.

b. Nestas condições, calcule kcat e a constante de especificidade para o substrato.

Under these conditions, calculate kcat and the specificity constant for the substrate.

8. Considere os dados experimentais da tabela que indicam as condições iniciais da hidrólise

de 4-NPMC a 30 ºC e pH 8.1 por um anticorpo catalítico. A concentração do anticorpo é de
1 M. Para efeitos comparativos, incluem-se também os dados experimentais de hidrólise
de BTEE por tripsina a 30 ºC e pH 7.5. A concentração da enzima é de 3.34 mM e cerca de
80% da enzima encontra-se ativa.
Consider the experimental data in the table that indicate the initial conditions for the
hydrolysis of 4-NPMC at 30 ºC and pH 8.1 by a catalytic antibody. The antibody
concentration is 1 µM. For comparative purposes, experimental data on BTEE hydrolysis by
trypsin at 30 ºC and pH 7.5 are also included. The enzyme concentration is 3.34 mM and
around 80% of the enzyme is active.

Determine os valores de kcat e KM para o anticorpo catalítico e a tripsina.

Determine the kcat and KM values for the catalytic antibody and trypsin.

Anticorpo/antibody Tripsina/Trypsin
Concentração substrato Velocidade inicial Concentração substrato Velocidade inicial
Substrate concentration Initial rate Substrate concentration Initial rate
(M) (M/min) (M) (M/min)
210 14.0 20 330
110 11.3 15 300
85 9.80 10 260
64 7.84 5 220
42 6.67 2.5 110

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9. A velocidade inicial de uma reação catalisada por uma enzima foi determinada na presença
de vários inibidores, A, B e C para várias concentrações de substrato S. Determine a
constante de inibição KI para cada um dos inibidores bem como o modo de inibição exercido.
The initial rate of a reaction catalyzed by an enzyme was determined in the presence of
several inhibitors, A, B and C for various concentrations of substrate S. Determine the
inhibition constant KI for each of the inhibitors as well as the mode of inhibition exerted.

Velocidade inicial / Initial rate (nmole/min)

Concentração substrato Sem inibidor A - 5M B - 25M C - 0.1M
Substrate concentration No inhibitor
(mM)
0.2 8.34 3.15 5.32 4.33
0.33 12.48 5.06 6.26 5.56
0.5 16.67 7.12 7.07 8.75
1 25 13.3 8.56 14.8
2.5 36.2 26.2 9.45 23.6
4 40 28.9 9.6 28.5
5 42.6 31.8 9.75 30

10. A glucose isomerase é utilizada na produção de xaropes de frutose. A reação é:

Glucose isomerase is used in the production of fructose syrups. The reaction is:
Glucose  Frutose
Para esta reação / for this reaction: H0 = 5,73 kJ.g.mol-1; S0 = 0,0176 kJ.g.mol-1.K-1

a) Calcule as constantes de equilíbrio da reação a 50 ºC e 75 ºC

Calculate the equilibrium constants of the reaction at 50 ºC and at 75 ºC
(R=8.3144 J.g.mol-1.K-1)

b) Uma empresa tem por objetivo desenvolver uma mistura de açúcares mais doce, contendo
uma maior concentração de frutose. Considerando somente a situação de equílibrio, seria
mais vantajoso operar a reacção a 50 ºC ou a 7 5ºC?
A company aims to develop a sweeter sugar mixture, containing a higher concentration of
fructose. Considering only the equilibrium situation, would it be more advantageous to
operate the reaction at 50 ºC or 75 ºC?

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11. A enzima álcool dehidrogenase catalisa a oxidação de alcoóis a aldeídos. A reacção envolve
a transferência de eletrões para NAD+:
The enzyme alcohol dehydrogenase catalyzes the oxidation of alcohols to aldehydes. The
reaction involves the transfer of electrons to NAD+:
Etanol + NAD+  acetaldeido + NADH + H+

Esta reação foi investigada através da monitorização da absorvância ao longo do tempo a

340 nm (NADH absorve a este comprimento de onda, NAD+ não absorve a este comprimento
de onda; ambas as espécies absorvem a 260 nm). As concentrações do enzima e etanol
foram de 1,5 mM e 0,5 M, respectivamente, tendo-se variado a concentração inicial de
NAD+.
This reaction was investigated by monitoring absorbance over time at 340 nm (NADH
absorbs at this wavelength, NAD+ does not absorb at this wavelength; both species absorb
at 260 nm). The enzyme and ethanol concentrations were 1.5 mM and 0.5 M, respectively,
with varying initial concentration of NAD+.

A340 em diferente tempos / at different times (min)

+
[NAD ] (mM) 0,5 1,5 2,5 3,5 4,5
1,5 0,009 0,025 0,041 0,055 0,069
2 0,012 0,034 0,055 0,074 0,091
2,5 0,015 0,042 0,068 0,092 0,114
3 0,017 0,051 0,081 0,110 0,137
5 0,029 0,084 0,135 0,182 0,226
10 0,056 0,164 0,264 0,357 0,445

As leituras de absorvância foram feitas numa célula de 1 cm, o coeficiente de extinção molar
para NADH é de 340 = 6,22x103 cm-1.M-1. Calcule o valor da constante de Michaelis-Menten e a
constante de velocidade, kcat.
Absorbance readings were taken in a 1 cm cell, the molar extinction coefficient for NADH is 340
= 6.22x103 cm-1.M-1. Calculate the value of the Michaelis-Menten constant and the rate
constant, kcat.

12. A enzima penicilina amidase (PA) é utilizado na hidrólise de cerca de 30 000 toneladas de
penicilina G por ano. Esta enzima pode ser produzida no periplasma de células de E. coli. A
enzima ativa possui Ca2+ como cofactor, apesar de não estar directamente envolvido na
função biológica. Durante ou após a translocação do pro-enzima para o periplasma,
observa-se ativação da enzima devido a proteólise intra e inter-molecular. A otimização da
produção de PA em células de E. coli de estirpes selvagens (WT) e recombinadas foi avaliada.
Os resultados deste processo encontram-se na seguinte tabela:
The enzyme penicillin amidase (PA) is used in the hydrolysis of approximately 30,000 tons
of penicillin G per year. This enzyme can be produced in the periplasm of E. coli cells. The
active enzyme has Ca2+ as a cofactor, although it is not directly involved in biological

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function. During or after translocation of the pro-enzyme to the periplasm, activation of the
enzyme is observed due to intra- and inter-molecular proteolysis. The optimization of PA
production in E. coli cells from wild-type (WT) and recombinant strains was evaluated. The
results of this process can be found in the following table:

Células e condições de Concentração de PA

Processo influenciado cultivo activo
Factor
Process affected Cells and cultivation Active PA concentration
conditions (mg/g CDW)
. Formação de corpos
24 1.7
de inclusão / Inclusion
. Estirpe Selvagem /
bodies are formed
Temperatura 28 Wild type strain 1.9
Temperature
. Ativação de PA no
(ºC) 32 . Meio LB, shake-flask / 0.5
periplasma / PA is
LB medium, shake flask
activated in the
36 < 0.1
periplasm
0 . Estirpe Selvagem / 1.9
28 Wild type strain 1.6
Concentração de
. Ativação de PA no
Glucose 56 1.5
periplasma / PA is . Meio LB, shake-flask /
Glucose
140 activated in the LB medium, shake flask 1.0
concentration
periplasm
(M) 280 0.2
.T=?
560 < 0.1
WT . Shake-flask 3.3
DH5 3.1
.T=?
Estirpe cellular K5 Todos os processos / 7.0
Strain JM109 All processes 10.8
. Meio minimal /
TOP10 minimal medium 5.7
BL21DE 52.0

3 . Adição de cofactor no . Estirpe/strain = ? 1.9

citoplasma (necessário
10 para translocação .T=? 7.9
Concentração de membranar) / Cofactor
Ca2+ (M) addition in the . Meio minimal/minimal
100 cytoplasm (required medium 14.0
for membrane
1000 translocation) . Shake-flask 20.2

. Estirpe/strain = ?
0 . Adição de cofactor no 1
citoplasma (necessário .T=?
0.48 para translocação 16
Concentração de membranar) / Cofactor . Meio minimal/minimal
Ca2+ (mM)* addition in the medium
2.4 cytoplasm (required 40
for membrane .
4.8 translocation) Fermentador/fermenter 35
2L
* Condições: elevada densidade celular, com alimentação exponencial de glucose com diferentes concentrações de Ca2+
/ Conditions: high cell density, with exponential glucose feeding with different concentrations of Ca2+.

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a) Que temperatura escolheria para o processo? Porque se observa uma menor concentração
de PA activo com o aumento de temperatura?
Which temperature would you choose for the process? Why is a lower concentration of
active PA observed with increasing temperature?

b) Dê uma explicação para a necessidade de se manter os níveis de glucose abaixo de 50 M.

Give an explanation for the need to keep glucose levels below 50 M.

c) De acordo com os dados, elabore sobre as vantagens de se utilizarem estirpes recombinadas

para a produção de proteínas de interesse comercial.
According to the data, elaborate on the advantages of using recombinant strains for the
production of proteins of commercial interest.

d) Explique o racional do estudo sumarizado na tabela e preencha os campos em branco (?),

justificando a resposta.
Explain the rationale for the study summarized in the table and fill in the blank fields (?),
justifying your answer.

e) Que condições seriam as mais vantajosas para a produção de PA em larga escala? Que tipo
de equipamento considera mais apropriado para este propósito?
Which conditions would be the most advantageous for large-scale PA production? What
type of equipment do you consider most appropriate for this purpose?

13. A enzima tPA (tissue plasminogen activator) é utilizado para dissolver coágulos de sangue
para o tratamento de tromboses. Esta enzima pode ser produzida em bactéria, numa forma
biologicamente inactiva (corpos de inclusão) ou numa forma activa em células eucariotas
(neste caso a enzima pode ser produzida numa forma glicosilada). Sabe-se que o
rendimento de produção de enzima (em g enzima/L fermentador) é de ~5 gL-1 para bactérias
e de 0.05 gL-1 para as células eucariotas (CHO). Os passos requeridos para a purificação de
tPA para fins terapêuticos, quando produzido em bactérias (E) ou células eucariotas (F)
encontram-se esquematizados na figura abaixo. Que processo escolheria para a produção
da enzima em larga escala?
The enzyme tPA (tissue plasminogen activator) is used to dissolve blood clots for the
treatment of thrombosis. This enzyme can be produced in bacteria, in a biologically inactive
form (inclusion bodies) or in an active form in eukaryotic cells (in this case the enzyme can
be produced in a glycosylated form). It is known that the enzyme production yield (in g
enzyme/L fermentor) is ~5 gL-1 for bacteria and 0.05 gL-1 for eukaryotic cells (CHO). The
steps required for the purification of tPA for therapeutic purposes, when produced in
bacteria (E) or eukaryotic cells (F) are outlined in the figure below. What process would you
choose to produce the enzyme on a large scale?

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