CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEMATOLOGIA CLÍNICA E LABORATORIAL

Severo Rosa Franco Neto

PSEUDOTROMBOCITOPENIA

SÃO JOSÉ DO RIO PRETO

2017
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEMATOLOGIA CLÍNICA E LABORATORIAL

Severo Rosa Franco Neto

PSEUDOTROMBOCITOPENIA

Trabalho de Conclusão de
Curso apresentado como
exigência para obtenção do
Diploma de Pós Graduação no
Curso de Hematologia Clínica
e Laboratorial, da Academia
de Ciência e Tecnologia de
São José do rio Preto.

SÃO JOSÉ DO RIO PRETO

2017
 Agradecimentos

À Deus, pois proporcionou tudo o que tenho em minha vida, por ter me dado forças
a realização dessa vitória.

Aos meus pais pelo apoio, amor incondicional, por sempre acreditarem em mim e
pela presença em todos os momentos de minha vida, devido a eles esse trabalho
pode ser realizado.

À todos os amigos e familiares que estiveram em todos os momentos de minha vida

me apoiando.

Enfim, obrigado a todos.

Severo Rosa Franco Neto

Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.

Cora Coralina
 RESUMO

As plaquetas circulam no sangue e são fundamentais para formação dos trombos,

verdadeiros tampões que cessam o sangramento. Elas são produzidas na medula
óssea a partir da célula tronco hematopoiética. Por isso a plaquetopenia pode
causar fenômenos hemorrágicos. O EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) pode
atuar como ponte de ligação de anticorpos, acarretando agregação plaquetária com
diminuição do número de plaqueta (pseudotrombocitopenia) e satelitismo plaquetário
(plaquetas agregadas ao redor de neutrófilos), causando falsas leucopenia e
trombocitopenia. A pseudotrombocitopenia EDTA-dependente é atribuída a
autoanticorpos que, in vitro, reconhecem antígenos modificados ou expostos pela
ação do EDTA e baixa temperatura na membrana plaquetária. Objetivos: este
estudo têm como objetivo analisar e descrever de forma crítica dados da literatura a
respeito dos efeitos do uso do EDTA em interpretações de exames de hemograma e
as formas de prevenir com que o fenômeno da pseudotrombocitopenia não
aconteça. Metologia: foi realizada uma busca bibliográfica nas bases de dados
eletrônicas: Scientific Eletronic Library On- Line (SIELO), Literatura Latino-Americana
e do Caribe em Ciências da Saúde (LILACS), Medical Literature Analysis and
Retrieval System Online (MEDLINE) e Pub Med, referente a literatura publicada na
década de 2000 a 2013. Resultados: 6 artigos, 01 informe técnico, considerados
relevantes para a fundamentação da pesquisa. Conclusão: Vários são as formas de
prevenção da pseudotrombocitopenia, podendo ser pré e pós analíticos, sendo que
o exame fidedigno evita tratamentos medicamentoso e transfusões desnecessários.

Palavras-chave: Plaquetas, Trombocitopenia, pseudotrombocitopenia e EDTA.

 ABSTRACT

Platelets circulate in the blood and are essential for the formation of thrombi, caps
true to cease the bleeding. They are produced in the bone marrow from
haematopoietic stem cell. So can cause thrombocytopenia hemorrágicos. O
phenomena EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) can act as antibody binding
bridge, causing platelet aggregation decreased number of platelets
(pseudothrombocytopenia) and platelet sathelitism (aggregated around neutrophils
platelets) causing false leukopenia and thrombocytopenia. The EDTA-
pseudothrombocytopenia dependent is attributed to autoantibodies in vitro recognize
antigens modified or exposed by the action of EDTA and low temperature on
membrane plaquetária.Objetivos: This study aim to analyze and describe critically
the literature on the effects the use of EDTA in interpretations of tests: CBC and
ways to prevent the phenomenon of pseudothrombocytopenia not happen.
Methodology: A literature search was performed in electronic databases: Scientific
Electronic Library On-Line (Sielo), Literature Latin American and Caribbean Health
Sciences (LILACS), Medical Literature Analysis and Retrieval System Online
(MEDLINE) and Pub Med, referring to published literature in the 2000s to 2013.
Resultados: 6 articles, 01 technical report, considered relevant to the foundation of
the research. Conclusion: There are several ways to prevent
pseudothrombocytopenia and can be pre and post analytical, reliable exam being
that the drug treatments and avoiding unnecessary transfusions.

Keywords: Platelets, Thrombocytopenia, pseudothrombocytopenia and EDTA.

 Lista de abreviatura e siglas

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IgA Imunoglobulina A
GpIIb/IIIa Glicoproteína IIb/IIIa
PTT Púrpura Trombocitopênica Trombótica
SMD Síndromes mielodisplásicas
CHCM Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média
DMP Doenças Mieloproliferativas
VCM Volume Corposcular Médio
VPM Volume Plaquetário Médio
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 08

2. REVISÃO DE LITERATURA 10

3. RESULTADOS 14

4. CONCLUSÃO 16

5. REFERÊNCIAS 17
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1. Introdução

As plaquetas circulam no sangue e são fundamentais para formação dos

trombos, verdadeiros tampões que cessam o sangramento. Elas são produzidas na
medula óssea a partir da célula tronco hematopoiética. Por isso a plaquetopenia
pode causar fenômenos hemorrágicos. A contagem aceitável é em torno de 145.000
a 450.000 plaquetas/mm³ (Failace RR, Fernandes FB, Failace, 2009).
O ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA do inglês Ethylenediamine
tetraacetic acid) é o anticoagulante usado para a obtenção de sangue total para
realização do hemograma, porque reduz a agregação plaquetária e mantém a
morfologia e integridade das células sanguíneas. Ele tem ação bacteriostática; atua
como quelante, ligando-se fortemente ao cálcio iônico do plasma (íons bivalentes de
cálcio), bloqueando a agregação plaquetária e a cascata de coagulação; está
disponível na forma de sais dissódico, dipotássico e tripotássico. O EDTA pode atuar
como ligação entre os anticorpos, causando agregação plaquetária com redução do
número de plaqueta (pseudotrombocitopenia) e satelitismo plaquetário (plaquetas
agregadas ao redor de neutrófilos), ocasionando falsas leucopenias e
trombocitopenias (Martinho MSC et al, 2012).
A pseudotrombocitopenia por EDTA-dependente se atribui a autoanticorpos
que, in vitro, reconhecem antígenos modificados ou expostos pela ação do EDTA e
baixa temperatura na membrana plaquetária (Santos PCJL et al, 2013). A hipótese
mais provável é que a ligação ocorra no complexo da glicoproteína IIb/IIIa
(GpIIb/IIIa). As aglutininas podem ser do tipo imunoglobulina M, G ou A (IgM, IgG ou
IgA), e reagem mais fortemente à temperatura ambiente ou ao frio. A
pseudotrombocitopenia foi observada em diversos processos autoimunes, sepse,
hepatite C, toxemia da gravidez, púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) e
síndromes mielodisplásicas (SMD). A pseudotrombocitopenia, além do EDTA, foi
também observada com outros coagulantes, como citrato, oxalato e heparina
(Martinho MSC et al, 2012).
Primeiramente, o fenômeno foi reconhecido por Gowland et al. 1969 e
Watkins e Shulman 1970, que descreve um fator de soro que causou a aglutinação
das plaquetas in vitro na presença de EDTA e temperaturas abaixo de 37 ° C
(Gowland et al ,1969, - aput Morales Moreno et al,2001) .A descoberta deste
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fenômeno precocemente é de extrema importância, pois a falta de reconhecimento

desta falsa contagem de plaquetas pode causar realização de mais testes,
diagnósticos equivocados e corticoterapia prologando, tratamentos de suspensão e
até mesmo uma mudança de vida, por medo de sangramento (Berkman N, Michaeli
Y, ou R, Eldor 1991; apud Morales Moreno et al, 2001).
Desta forma este trabalho têm como objetivo analisar e descrever de forma
crítica dados da literatura a respeito dos efeitos do uso do EDTA em interpretações
de exames de hemograma e as formas de prevenir o acontecimento deste
fenômeno.
 10

2. Revisão de Literatura

As plaquetas são derivadas de megacariócitos, que são derivados de células-

tronco influenciados por fatores de crescimento e uma trombopoietina específica
(Puyo CA, 2001).

A pseudotrombocitopenia consiste na contagem baixa de plaquetas em

amostras de sangue colhidas em etilenedinitrilotetraacetato (EDTA). Essa
diminuição é conseqüente à aglutinação das plaquetas ou, mais raramente, à
formação de rosetas de plaquetas em torno dos neutrófilos, um fenômeno referido
como satelitismo plaquetário. A aglutinação das plaquetas pode resultar na formação
de grumos de tamanho similar aos dos leucócitos, e o contador automático é
incapaz de distinguir tais grumos, reconhecendo-os como leucócitos e fornecendo
contagem falsamente elevada ou pseudoleucocitose (Dusse LMS, et al, 2004).

Fatores pré-analíticos podem interferem no resultado da amostra, como os

frascos de coleta (que são de uso único, devem ter seu interior estéril), volume e
quantidade de anticoagulante proporcional ao volume de sangue a ser aspirado. Os
tubos podem ser de vidros ou plásticos, esses últimos têm maior tendência nos
laboratórios, há diferentes tamanhos de tubos (varia de 2 a 5ml de aspiração), que
viabiliza a coleta em crianças, recém-nascidos, adultos e idosos. A quantidade de
anticoagulante em cada tubo também é fator de relevância na qualidade da amostra
(Martinho MSC et al, 2012).

Em tubo plástico com EDTA a contagem de plaquetas é melhor realizada,

pois praticamente não há ativação da cascata de coagulação, o tubo de vidro e a
agitação causam a agregação plaquetária, as coletas em tubo de plástico é mais
recomendada pela biossegurança, além de evitar quebras e contaminação no
ambiente de trabalho (Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina
Laboratorial, 2010).

Deve ser realizada a homogeneização adequada, ou seja, de 8 a 10 vezes

lentamente, sem a presença de coágulos e o exame deve entrar no setor analítico
em até 4 horas (Failace RR, Fernandes FB, Failace R, 2009).
 11

Amostras com coágulo, volume inferior ao desejado, ausência de identificação

ou identificação inadequada são causas de rejeição da amostra (Lewis SM, Bain BJ,
2006). Em coletas com pequeno volume de sangue, a quantidade de EDTA fica
excessiva, tornando o meio hipertônico, podendo reduzir o tamanho dos eritrócitos,
aumentar a CHCM, degenerar os leucócitos, diminuir o VCM, inchar e desintegrar as
plaquetas e aumentar (por impedância) ou diminuir (por método óptico) o volume
plaquetário médio (VPM) (Martinho MSC et al,2012).
Há no Brasil um tubo/seringa com tampa lilás, utilizados em casos de
trombocitopenia, mas é recomendado que realize a leitura do exame o mais breve
possível para não haver a possibilidade de formação dos agregados (Clinical and
Laboratory Standards Institute, 2003).
Considerando a freqüência estimada, a pseudotrombocitopenia representa
um problema clínico de grande importância, uma vez que pode resultar em
diagnóstico errôneo, solicitação desnecessária de exames laboratoriais e conduta
terapêutica totalmente inadequada, incluindo a transfusão de plaquetas e, até
mesmo, a esplenectomia. Vale ressaltar que, de modo geral, os indivíduos em que
se detecta pseudotrombocitopenia não têm história clínica de sangramento e
marcadores auto-imunes. O tempo de sangria está normal e o volume plaquetário
médio (VPM) não é alterado, o que confirma que a diminuição das plaquetas
encontrada é, inquestionavelmente, induzida in vitro (Dusse LMS, et al, 2004).
A natureza fisiopatológica da pseudotrombocitopenia induzida pelo EDTA é,
ainda, incerta. No entanto, tem sido proposto que auto-anticorpos presentes no
plasma reconhecem e se ligam a um epitopo da glicoproteína IIb (GPIIb), integrante
do complexo GPIIb/IIIa da superfície plaquetária, promovendo a aglutinação das
plaquetas. Esse epitopo somente é exposto na presença de EDTA. A fisiopatologia
da produção de tais anticorpos é desconhecida e a presença desses no plasma é
flutuante, podendo alternar períodos em que se detecta ou não uma
pseudotrombocitopenia (Dusse LMS, et al, 2004).

Utilizando a técnica de imunofluorescência foi possível identificar várias

classes de anticorpos ligados ao epitopo da GPIb/IIIa, em casos de
pseudotrombocitopenia induzida pelo EDTA, como imunoglobulina da classe G (IgG)
(subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), imunoglobulina da classe M (IgM) e
imunoglobulina da classe A (IgA). Esses anticorpos reagem melhor em temperaturas
 12

inferiores à temperatura ambiente. A ligação anticorpo-GPIIb/IIIa foi detectada na

presença de vários sais do EDTA (Na2EDTA, K2EDTA, K3EDTA e MgEDTA) e do
etileno glycol bis -aminoetil éter (K2EGTA). Plaquetas de indivíduos portadores da
trombastenia de Glanzmann não reagem com esses anticorpos. A trombastenia de
Glanzmann é uma doença hemorrágica hereditária, associada a mutações dos
genes responsáveis pela síntese da GPIIb e GPIIIa, o que leva a um
comprometimento da agregação plaquetária. Tal observação confirma o
envolvimento da GPIIb/IIIa na aglutinação induzida pelo EDTA (Dusse LMS, et al,
2004).

Para evitar a pseudotrombocitopenia por EDTA, deve-se analisar a amostra

para o hemograma imediatamente após a coleta, não dando tempo para formação
dos agregados plaquetários (Santos PCJL et al, 2013).

O satelitismo plaquetário foi observado em monócitos basófilos, linfócitos e

neutrófilos. Para tentar liberar as plaquetas agregadas, pode-se aquecer a amostra a
37ºC, por dez minutos, homogeneizá-la por um minuto e realizar novamente a
contagem de plaquetas e o esfregaço (Santos PCJL et al, 2013). O uso de vórtex,
por três minutos, em amostras com pseudotrombocitopenia pode desagregar as
plaquetas em 43,6% dos casos. Se mesmo assim o problema não for solucionado,
solicitar a coleta de nova amostra em tubo contendo citrato de sódio 3,2% e, a partir
dessa amostra, aquecida a 37ºC, preparar e corar um novo esfregaço para verificar
se a agregação ainda continua e verificar a contagem de plaquetas no analisador
hematológico .Se o esfregaço com citrato liberar as plaquetas, pode-se corrigir a
contagem e estimar o valor em EDTA, multiplicando essa contagem por um fator de
correção de 1,2 (decorrente o volume de 0,5 mL de citrato a 3,2% (1/9) existente no
tubo tampa azul que dilui a amostra) ( Martinho MSC et al, 2012).
A coleta de sangue venoso com heparina ou fluoreto de sódio pode também
ser realizado para testar a desagregação plaquetária. Nos casos de intensa
trombocitose (DMP) pelo excesso de plaquetas na lâmina, pode ocorrer a falsa
impressão de que as plaquetas estão agregadas (Failace RR, Fernandes FB, 2009).
Diversos pesquisadores afirmam que o fenômeno da aglutinação in vitro das
plaquetas ocorre somente na presença de EDTA. Assim, amostras obtidas em citrato
de sódio, heparina ou oxalato de sódio forneceriam a contagem correta. No entanto,
 13

há quem afirme que esses anticoagulantes também são responsáveis por induzir
aglutinação, e a contagem correta somente poderia ser estimada utilizando-se
amostras sem anticoagulantes (Dusse LMS, et al, 2003).
 14

3. Resultados

O padrão-ouro para a conferência da pseudotrombocitopenia e satelitismo

plaquetário é a distensão sanguínea corado. É preciso constatar a presença de
agregados plaquetários isolados e agrupados nas diversas regiões da lâmina
(Failace RR, Fernandes FB, Failace, 2009).

As pseudotrombocitopenias representam aproximadamente 49% de

trombocitopenia em amostras analisadas em analisadores de hematologia. Destes,
72% deve-se a diamina ácido tetra-acético agregação de etileno (EDTA), que é
recomendado pelo Conselho Internacional para Padronização em Hematologia
(ICSH) anticoagulante para a realização de hematologia (Garcia Suarez J,et al,
1991).

Segundo Puyo CA (2001) a plaquetopenia é a causa mais comum de

sangramento anormal e costuma ser o resultado de quatro fatores, que podem atuar
em conjunto ou isoladamente: plaquetopenia, déficit na produção de plaqueta,
destruição aumentada e distribuição anormal. E para Morales M et al, (2001) a
pseudotrombocitopenia é prevalente em mulheres, possuindo 65 % dos casos.

A adição de algumas substâncias ao anticoagulante tem sido utilizada como

artifício para prevenir a aglutinação das plaquetas. Dessa forma, foi relatado que a
suplementação do EDTA com kanamicina evitou a aglutinação plaquetária. A
combinação de citrato de sódio e paraformaldeído também serviu como forma de
prevenção (Dusse LMS, et al, 2003).

O uso de aminoglicosídeos (canamicina) previamente à coleta da amostra no

tubo com EDTA impede a alteração da contagem de plaquetas. No contexto
anestésico é de pouca utilidade manter tubos prontos com canamicina, sendo que o
indicado seria enviar para análise amostras com citrato quando se suspeita de
pseudotrombocitopenia (Goodnough LT, 2003).

A pseudotrombocitopênia acontece em presença de outros coagulantes

também como a heparina e o citrato, porém foi observado que se a leitura do exame
acontece rapidamente em coleta realizada em tubo de EDTA, as chances de
acontecerem falsos resultados são mínimos (Santos PCJL et al, 2013).
 15

A rápida identificação de pacientes com pseudoplaquetopenia reverte-se em

diminuição dos riscos de transmissão de doenças infectocontagiosas, por evitar a
transfusão desnecessária de unidades de plaquetas, além de evitar medicalização
desnecessária; além disso o resultado dos exames devem ser guiados a terapêutica
do paciente, pois todos os exames têm uma margem de erros (Goodnough LT,
2003).
 16

4. Conclusão

O conhecimento dos dados clínicos do paciente é de grande importância para

se evitar a liberação de resultados incorretos. Quando há suspeita de
pseudotrombocitopenia, o diagnóstico pode ser confirmado fazendo-se a contagem
de plaquetas, imediatamente após a coleta do sangue em EDTA, e repetindo-se
após uma ou quatro horas, quando é verificada uma queda gradual dos resultados
obtidos.

Com tudo, as maneiras adequadas de armazenamento, transporte, coletas,

temperaturas, não suspensão de medicamentos, alterações brusca na dieta, uso de
anticoagulantes e técnicas e processamento adequado das amostras são fatores
influenciáveis e modificáveis e que podem facilmente através de orientações e
capacitações dos profissionais serem realizados de formas adequadas, reduzindo as
chances de erro no resultado dos hemogramas.
 17

Referências

1. Berkman N, Michaeli Y, ou R, Eldor A: dependentes de EDTA

pseudotrombocitopenia: um estudo clínico de 18 pacientes e revisão da
literatura. Am J Hema. 1991; 36:195-201.
2. Dusse LMS, Vieira LM, Carvalho MG, Pseudotrombocitopenia. Jornal
Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. Vol 40, n5, Rio de Janeiro,
Oct 2004.
3. Failace RR, Fernandes FB, Failace R. Hemograma. Manual de
interpretação. 5° ed. Porto Alegre: Artmed, 2009.
4. Garcia Suarez J, Merino JL, Rodríguez M, Velazco A, Moreno MC:
pseudotrombocitopenia: incidência, causas e métodos de
detecção. Sangue. Junho de 1991; 36 (3) :197-200
5. Goodnough LT — Risks of blood transfusion. Crit Care Med, 2003;31:S678-
S86
6. Gowland E,et al , 1969, apud Morales M , A Moreno , M Mejia e Y
Bustamante . Pseudotrombocitopenia EDTA-dependente: Papel da clínica e
detecção laboratorial correta contagem de plaquetas. Revista da Faculdade
de Medicina v.24 n.1 Caracas mar. 2001.
7. Lewis SM, Bain BJ. Hematologia prática. 9.ed. Porto Alegre: Artmed, 2006.
8. Martinho MSC et al. Hematologia em laboratório clínico. São Paulo: Sarvier,
2012(9).
9. Meira C, Oliveira D. Qualidade em laboratório clínico. São Paulo: Sarvier,
2012.
10. Morales M, A Moreno, M Mejia e Y Bustamante. Pseudotrombocitopenia
EDTA-dependente: Papel da clínica e detecção laboratorial correta contagem
de plaquetas. Revista da Faculdade de Medicina v.24 n.1 Caracas mar. 2001.
11. Puyo CA — Thrombocytopenia. Int Anesthesiol Clin, 2001; 39: 17-34.
12. Santos PCJL et al. Hematologia: Métodos e interpretação. São Paulo: Roca,
2013.
13. Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial. Gestão da
Fase Pré-Analítica. Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia
Clínica/Medicina Laboratorial, Rio de Janeiro (Brasil); 2010.
 18

14. Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial.

Recomendações d a Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina
Laboratorial para Coleta de Sangue Venoso. 2. Ed. Barueri: Manole, 2010.
15. Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial. Gestão da
Fase Pré-Analítica. Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia
Clínica/Medicina Laboratorial, Rio de Janeiro (Brasil); 2010. (11)