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Efeito de poliaminas exógenas no crescimento inical in vitro e nos teores de fenóis,

poliaminas e atividade da peroxidase em Aloe vera (L.) Burm.

1 2 3
MÓGOR, G. ; LIMA, G.P.P. ; MÓGOR, A.F.
1
Universidade Estadual Paulista – UNESP, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Botânica), Instituto
2
de Biociências, CP 510, CEP 18.618-000, Botucatu, SP.; Universidade Estadual Paulista – UNESP, Departamento
de Química e Bioquímica, Instituto de Biociências, CP 510, CEP 18.618-000, Botucatu, SP. e-mail: gpplima@
3
ibb.unesp.br; Prof. Dr. Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR.

RESUMO: Brotações laterais de plantas de Aloe vera ( L.) Burm. cultivadas in vitro, por 90 dias,
subcultivadas a cada 30 dias, sem adição de reguladores vegetais, foram inoculadas em meio de
cultura MS contendo ou não espermina e/ou espermidina. Após 30 dias de cultivo, as plantas
foram submetidas às análises bioquímicas, comparadas entre si e com plantas micropropagadas
com 90 dias de cultivo in vitro em meio contendo BAP e NAA (denominadas caracterização),
bem como com plantas matrizes (in vivo). Nas análises bioquímicas foram avaliados os níveis de
poliaminas livres, fenóis totais solúveis, flavonóides totais solúveis e atividade da peroxidase. A
aplicação exógena de espermina e espermidina promoveu grande número de perfilhos, bem como
aumento no teor de putrescina e flavonóides. Putrescina apresentou as alterações mais
significativas, podendo ser utilizada como marcadora de morfogênese em Aloe vera
micropropagada. Tecidos em ativo crescimento apresentaram alta atividade de peroxidase, assim
como aqueles com maior taxa de oxidação. Nestes tecidos também ocorreu maior teor de
flavonóides totais. A ação conjunta das poliaminas mostrou-se benéfica para o perfilhamento.

Palavras-chave: poliaminas, compostos fenólicos, peroxidase, micropropagação, Aloe

ABSTRACT: Effect of exogenous polyamines in the in vitro initial growth, in the contents
of phenols and polyamines contents, and peroxidase activity in Aloe vera (L.) Burm.
Lateral shoots of the Aloe vera ( L.) Burm. cultivated in vitro, without addition vegetal regulators,
for 90 days, were inoculated in MS culture-medium, containing or not spermine and/or spermidine.
After 30 days of cultivation, the plants were submitted to biochemical analysis together with
micropropagated plants – that were under in vitro cultivation for 90 days – (denominated as
characterization), and matrix plants (in vivo). The levels of free polyamines, total phenols, total
flavonoids, and the activity of peroxidase were evaluated in the biochemical analyses. The
exogenous application of spermidine have promoted large number of shoots. Spermidine and
spermine have promoted, when associated, an increase in the number of shoots as well as an
increase of the contents of putrescine and and flavonoids. The putrescine has presented the
most significant alterations, enabling to be utilized as marker of morphogenesis in the
micropropagated Aloe vera. Tissues under active growth have presented high activity of peroxidase
as well as those with greater rate of oxidation. In these tissues, there were noticed also higher
contents of total flavonoids, indicating the need of antioxidative compounds. The action of
polyamines jointly tseemed to be benefic for the shooting of micropropagated Aloe vera.

Key words: polyamines, phenolic compounds, peroxidase, micropropagation, Aloe

INTRODUÇÃO servem de modelo para a síntese de inúmeros

Os vegetais têm capacidade quase ilimitada medicamentos, sendo que grande parte dos
de sintetizar substâncias, que em muitos casos, são compostos secundários já isolados de plantas
utilizadas como defesa contra microrganismos, medicinais ainda está para ser estudado quanto às
insetos e herbívoros (Dempsey et al., 1993) e que suas atividades biológicas (Stangarlin et al., 1999).

Recebido para publicação em 06/12/2005

Aceito para publicação em 20/02/2007

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Neste sentido, diversos estudos têm sido realizados (Awad et al., 2000). Levando em consideração esses
na tentativa de se obter fármacos em plantas com fatores, tornam-se relevantes os estudos sobre as
potencial fitoterápico, acompanhado de um fontes naturais de flavonóides (Oliveira et al., 1999).
significativo aumento nos investimentos em pesquisa. As peroxidases são enzimas que participam
O problema maior é o material vegetal, o qual, devido de reações oxidativas e estão relacionadas com o
à grande procura, pode se tornar escasso e ainda, a controle da auxina endógena (Pedreño et al., 1990).
dependência da planta do campo pode ser um entrave Peroxidases tem sido usadas por diversos autores,
na produção destes fitoterápicos. assim como as poliaminas, como marcadoras
A cultura de tecidos vegetais tem sido bioquímicas de eventos morfogenéticos em plantas
freqüentemente usada como um modelo para estudar cultivadas in vitro (Lima et al., 1999; Lima et al., 2003).
desenvolvimento, assim como dos metabólitos Assim, como as poliaminas podem atuar em
presentes, devido maior facilidade de obtenção das diversas rotas metabólicas, este trabalho objetivou
plantas, quando estabelecido um protocolo (Arnaldos estudar a participação da espermidina e espermina
et al., 2001). Substâncias como poliaminas têm sido nos mecanismos de formação de compostos
utilizadas amplamente no cultivo in vitro, juntamente fenólicos, incluindo os flavonóides e na atividade da
com reguladores vegetais, principalmente as auxinas peroxidase, além dos teores endógenos de
e citocininas. A adição de poliaminas ao meio de poliaminas.
cultura tem mostrado efeito estimulador de
crescimento em várias plantas (Scott et al., 1998),
estando envolvidas na regulação do crescimento, MATERIAL E MÉTODO
divisão e diferenciação celular (Rajam, 1997). Durante O material vegetal utilizado (brotações laterais
os últimos anos, tem sido relatadas como eficientes de plantas de Aloe vera ( L.) Burm. cultivadas in vitro,
antioxidantes em sistemas experimentais, exercendo sem adição de reguladores vegetais, com 90 dias, foi
este efeito através da proteção de componentes inoculado em meio de cultura MS (Murashige &
celulares, tais como membranas, ácidos nucléicos e Skoog, 1962) acrescido de 30 g L-1 de sacarose, 100
ácidos graxos poli-insaturados, de danos oxidativos mg L-1 de inositol, 1,0 mg L-1 de tiamina e 6,0 g L-1 de
(Lovaas, 1991; Lovaas, 1996). As poliaminas e outros ágar, contendo 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido alfa-
reguladores vegetais podem modular eventos naftalenoacético (NAA) ou poliaminas espermidina
morfogênicos (Altamura et al., 1993). (Spd) e espermina (Spm) e mantidos em sala de
A espécie Aloe vera (L.) Burm. (Liliaceae), crescimento com temperatura de 25 ± 2°C, 85% U.R.,
também conhecida como babosa e tendo como fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de
sinonímia A. barbadensis Mill., apresenta baixo 1000 lux. A solução de poliaminas foi adicionada ao
rendimento no campo (Silva et al., 2000) e a meio de cultura MS, previamente autoclavado e
micropropagação poderia ser um método eficaz de resfriado (aproximadamente 45°C), com o auxílio de
produção de plantas (Hu et al., 2003). Diversos seringa descartável e filtros acopláveis MILLEXR –
compostos tem sido identificados em extratos de Aloe Millipore, contendo poros de 0,22 m, sendo este
vera, incluindo polissacarídeos e flavonóides (Lee et procedimento realizado em câmara de fluxo laminar.
al., 2000; Zhang et al., 2001). Posteriormente, o meio de cultura foi distribuído em
Os compostos fenólicos podem participar de frascos de vidro (268 mL de capacidade) previamente
reações de manutenção do nível adequado de esterilizados, com 40 mL de meio em cada frasco.
reguladores, essenciais para os diversos eventos Após o resfriamento completo do meio de cultura foi
morfogenéticos (Cvikrová et al., 1998). O papel dos realizada a inoculação, sendo colocada uma planta
fenólicos tem sido extensivamente estudado nos por frasco. Após a distribuição das plantas nos quatro
últimos anos, estando correlacionando entre as tratamentos, contendo 5 repetições (cada repetição
diversas ações, no controle do crescimento, já que a composta de 4 explantes), os frascos foram
relação crescimento e acúmulo de alguns destes distribuídos em delineamento experimental em blocos
compostos é igualmente inversa (Mader & Hanke, casualizados, com fotoperíodo de 16 horas,
1997) e podem agir como inibidores. Alguns deles intensidade luminosa de 1000 lux, por 30 dias. As
podem promover aumento na taxa de crescimento médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5%
(Li et al., 1993) e prolongar a ação das auxinas por de significância.
inibir a ação do ácido 3-indolilacético (IAA) (Krylov et Posteriormente, as plantas foram
al., 1994). Outra importância relatada aos compostos submetidas às análises bioquímicas, juntamente com
fenólicos é o estudo da atividade dos flavonóides, os plantas micropropagadas (90 dias de cultivo in vitro,
quais desempenham importante papel na saúde denominadas caracterização) e plantas matrizes (in
humana. As propriedades dos flavonóides são vivo), perfazendo 6 tratamentos com 4 repetições,
conhecidas nos processos anti-oxidativos, anti- distribuídos em delineamento experimental em blocos
microbianos, anti-mutagênicos e anti-carcinogênicos

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ao acaso, sendo as médias comparadas pelo teste Nas análises bioquímicas foram avaliados os
de Tukey a 5% de significância (Tabela 1). As plantas níveis de poliaminas, fenóis totais solúveis, flavonóides
referentes aos 90 dias de cultivo in vitro totais solúveis e atividade da peroxidase, em plantas
(caracterização), foram obtidas através da inoculação micropropagadas com 120 dias de cultivo in vitro (com
de ápices caulinares oriundos de brotações laterais adição de auxina e citocinina ou poliaminas exógenas),
de plantas in vivo (cultivadas em condições de campo, plantas micropropagadas com 90 dias de cultivo in
no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, vitro (caracterização) e plantas matrizes (in vivo).
Biológiocas e Agrícolas (CPQBA), da Universidade
Estadual de Campinas - UNICAMP). Os ápices Teor de poliaminas livres
caulinares foram inoculados em meio de cultura (MS A análise foi realizada de acordo com o
+ 8,88 mol L-1 de BAP + 5,36 mol L-1 de NAA), o método de Flores & Galston (1982) modificado por
qual, a partir de experimentos prévios, mostrou ser o Lima (1994). Amostras de material fresco (planta-mãe,
melhor meio indutor de organogênese na espécie perfilhos e rizomas) de plantas micropropagadas e
estudada. Nesta época, essas plantas foram amostras da planta matriz (epiderme e rizomas) foram
analisadas quanto aos teores de poliaminas pesadas e homogeneizadas em ácido perclórico 5%
endógenas livres, flavonóides totais solúveis, fenóis gelado e centrifugadas durante 20 minutos a 4oC.
totais solúveis e atividade da peroxidase. Alíquotas foram transferidas para tubo de ensaio,
Para as análises bioquímicas (poliaminas juntamente com cloreto de dansila
livres, flavonóides totais solúveis, fenóis totais solúveis (diaminophtylsulfonico- l)-(5 mg mL-1 de acetona) e
e atividade da peroxidase), as plantas micropropagadas de solução de Na2CO3 saturado. Foram adicionados
com 90 dias em meio MS acrescido de BAP e NAA e 100 L de prolina e os tubos após agitação foram
aquelas com 120 dias (90 dias em meio MS sem mantidos por 30 minutos no escuro. Em seguida,
adição de reguladores e cultivadas por 30 dias em 500 L de benzeno foram adicionados e os tubos
meio contendo ou não as poliaminas espermidina e novamente agitados. Alíquotas da fase orgânica foram
espermina), foram separadas em planta-mãe retiradas e submetidas à cromatografia de camada
(explante inicial), perfilhos e rizomas, enquanto as delgada.
plantas matrizes (oriundas do campo) foram As placas empregadas (20 x 20 cm de 500
separadas em epiderme e rizomas. Nas plantas de espessura, recobertas com camada de sílica gel
matrizes o gel (mucilagem) não foi utilizado nas 60G), foram ativadas a 100 oC por 2 horas. Os
análises, enquanto as micropropagadas foram solventes cromatográficos utilizados foram a mistura
utilizadas inteiras, ou seja, sem separação da clorofórmio:trietilamina (5:1), para a separação das
epiderme com o gel, devido a grande dificuldade de poliaminas putrescina, espermidina e espermina. A
separação. As análises realizadas na epiderme da separação cromatográfica foi realizada por 1 hora a
planta matriz (in vivo) foram comparadas com a 25oC, sendo todo o processo acompanhado por luz
planta-mãe (explante inicial com 90 dias de cultivo) e UV. Padrões de poliaminas foram processados da
com as que receberam tratamentos (ausência ou mesma maneira. Após esse processo, as placas
presença de espermidina e/ou espermina por mais foram secas e as poliaminas quantificadas por
30 dias, 120 dias de cultivo). Essas análises também espectroscopia de emissão de fluorescência em
foram realizadas nos respectivos rizomas. A análise aparelho VDS (Video Documentation System), através
dos perfilhos foram feitas apenas nas plantas do programa Image Pro-IPW, no Laboratório de Física
micropropagadas, tanto com 90 dias, como com 120 e Biofísica do Instituto de Biociências (UNESP) -
dias de cultivo in vitro. Botucatu. Os teores de poliaminas livres foram
expressos em nmol put g mf-1, nmol spd g mf-1 e
nmol spm g mf-1.
TABELA 1. Tratamentos submetidos às análises
bioquímicas.
Teor de fenóis totais solúveis
A análise foi realizada de acordo com o
método espectrofotométrico Folin-Denis (Horwitz,
1995). Amostras de material seco e moído de plantas
micropropagadas (planta-mãe, perfilhos e rizomas) e
amostras da planta matriz (epiderme e rizomas) foram
coletadas, pesadas e colocadas em tubos de
centrífuga. Em cada tubo foi adicionado acetona 70%
e água destilada. Em seguida foram levados para
banho ultrassônico e centrifugados a 10.000 rpm. O
sobrenadante foi colocado em frascos e mantidos em
gelo. Alíquotas de 0,1 mL foram transferidas para tubos

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de ensaio e o volume completado com água destilada. de etanol absoluto. A leitura da absorbância foi
Adicionou-se o reagente Folin-Denis e a solução realizada a 505 nm. A atividade específica da
saturada de Na2CO3. peroxidase foi expressa em mol de H2O2 decomposto
Após agitação dos tubos, estes foram min-1 mg-1 de proteína.
mantidos em repouso por 45 minutos e a leitura da
absorbância realizada a 725 nm. Os resultados foram
expressos em g fenóis (ácido tânico) g-1 ms-1. RESULTADO E DISCUSSÃO
As plantas com 120 dias de cultivo in vitro
Teor de flavonóides totais solúveis foram submetidas às análises bioquímicas,
A análise foi realizada de acordo com o juntamente com plantas com 90 dias de cultivo in
método espectrofotométrico adaptado de Santos & vitro (caracterização) e plantas matrizes (in vivo).
Blatt (1998) e Awad et al. (2000). Amostras de material O maior valor de putrescina (Tabela 2) na
fresco foram pesadas e maceradas em 20 mL de planta-mãe (in vitro) foi encontrado no tratamento
solução A (metanol 70% e ácido acético 10%). contendo a mistura das poliaminas espermidina e
Posteriormente, foram levados ao banho ultrassônico espermina, o qual apresentou diferenças significativas
e após filtragem, centrifugados a 10.000 rpm. Após a dos demais tratamentos. Resultados semelhantes
transferência do sobrenadante para tubos de ensaio foram encontrados quando se analisou o teor dessa
foram acrescentados cloreto de alumínio e ácido diamina no número de perfilhos (Tabela 6). Esses
acético 10%, sendo em seguida agitados e mantidos valores poderão estar relacionados com o maior
em repouso durante 30 minutos. A leitura da perfilhamento obtido nesse tratamento em relação aos
absorbância foi realizada a 425 nm e os resultados demais, sugerindo que os teores de putrescina
expressos em g flavonóides (rutina/quercetina) g-1 aumentam em tecidos em crescimento ativo (Rey et
m s-1. al., 1994). Diversos autores, entre eles Galston &
Kaur-Sawhney (1995), relatam que a putrescina,
Atividade da peroxidase (E C 1.11.1.7) assim como as demais poliaminas, é requerida para
A análise foi realizada de acordo com o o crescimento e desenvolvimento ótimo de várias
método espectrofotométrico de Allan et al. (1974) plantas. Esse fato se deve provavelmente a essa
modificado por Lima et al. (1999). Amostras de amina ser a precursora de espermidina e espermina
material fresco de plantas micropropagadas e (Bouchereau et al., 1999). Assim, a partir desses
amostras da planta matriz foram pesados e resultados, nota-se que o efeito exógeno das
macerados em tampão fosfato 0,2 M, pH 6,7. Após poliaminas, principalmente espermidina e espermina
centrifugação, foi adicionada solução de peróxido de foi positivo no crescimento e perfilhamento. O efeito
hidrogênio e fenol. Os tubos contendo o sistema de estimulante no crescimento e formação de brotos por
reação foram mantidos em banho-maria por 5 poliaminas exógenas tem sido comprovado e
minutos, sendo interrompida a reação com adição recomendado por diversos autores (Bouchereau et
al., 1999).

TABELA 2. Teores de putrescina na epiderme da planta matriz (in vivo) e planta-mãe (explante inicial) dos tratamentos
in vitro; rizoma da planta matriz (in vivo) e dos tratamentos in vitro; perfilhos (brotações laterais de plantas in vitro),
expressos em nmol de putrescina grama de matéria fresca-1.

As médias seguidas de mesma letra na horizontal não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade.

Quanto aos teores de putrescina nos NAA (3,75 perfilhos), espermina (2,12 perfilhos) e
perfilhos, o tratamento contendo a combinação de espermidina (6,75 perfilhos), conseqüentemente
espermidina e espermina apresentou valores mais maior atividade meristemática. Tal resultado concorda
elevados. Esse tratamento induziu maior número de com os de Maki et al. (1991), sugerindo que a
perfilhos (8,50) em relação à aplicação de BAP + putrescina deve agir no controle do progresso das

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fases de mitose nas células, evidenciando aumento maiores que os encontrados para putrescina.
dos teores durante esse período. Desai & Metha (1985) Provavelmente, este resultado se deve ao meio de
também verificaram em explantes foliares de cultivo, propício ao crescimento e desenvolvimento,
Passiflora sp., que os teores de putrescina onde putrescina poderia estar sendo convertida em
aumentaram durante a emissão de brotações. espermidina e espermina (Marton & Morris, 1987;
Geralmente os teores de poliaminas estão Galston & Kaur-Sawhney, 1995). Nota-se que a
associados com crescimento ativo dos tecidos, Meijer aplicação das poliaminas isoladas ou em combinação
& Simmonds (1988) relataram que os teores de não induziram aumento no teor de espermina quando
putrescina estão relacionados com as mudanças comparado com o tratamento contendo BAP e NAA,
ocorridas em função do processo de diferenciação. tanto nas folhas (epiderme/planta-mãe) como no
Neste trabalho, na associação de espermina e rizoma. Resultado inverso pode ser observado nos
espermidina ocorreu maior número de perfilhos, perfilhos, que por estarem provavelmente em ativo
diferindo estatisticamente quanto ao teor de putrescina desenvolvimento, apresentaram maiores níveis dessa
dos demais tratamentos, apresentando valor superior. poliamina.
Assim, o maior valor encontrado de putrescina no Scott et al. (1998) citam que as poliaminas,
tratamento contendo as duas poliaminas pode estar apesar de desempenharem papéis positivos em vários
relacionado com a maior emissão de perfilhos. Quanto sistemas de cultura, em alguns casos mostram-se
aos teores de putrescina no rizoma aos 120 dias, os ineficientes. Segundo Rugini et al. (1992), os diferentes
tratamentos contendo BAP + NAA, espermina e a efeitos que as poliaminas apresentam para um
combinação de espermina + espermidina apresentaram mesmo evento podem estar relacionados com a
os maiores valores, não ocorrendo diferenças aplicação de uma concentração inadequada à
significativas entre estes tratamentos. espécie, ou à altas concentrações endógenas já
Verifica-se que há aumento dos teores de existentes no tecido, o que poderia explicar os
espermina na planta-mãe (Tabela 3) aos 90 dias de resultados encontrados neste trabalho, podendo
cultivo in vitro em relação ao encontrado na epiderme ocorrer ação das poliaminas oxidases, gerando
da planta matriz. Resultado inverso é observado no peróxidos (Smith, 1985) ou mesmo à reconversão à
rizoma. Os teores, nos órgãos analisados, foram putrescina (Tassoni et al. 2000).

TABELA 3. Teores de espermina na epiderme da planta matriz (in vivo) e planta-mãe (explante inicial) dos tratamentos
in vitro; rizoma da planta matriz (in vivo) e dos tratamentos in vitro; perfilhos (brotações laterais de plantas in vitro),
expressos em nmol de espermina. grama de matéria fresca-1.

As médias seguidas de mesma letra na horizontal não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de
5% de probabilidade

TABELA 4. Teores de espermidina na epiderme da planta matriz (in vivo) e planta-mãe (explante inicial) dos
tratamentos in vitro; rizoma da planta matriz (in vivo) e dos tratamentos in vitro; perfilhos (brotações laterais de
plantas in vitro), expressos em nmol de espermidina. grama de matéria fresca-1.

As médias seguidas de mesma letra na horizontal não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de
5% de probabilidade

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A Tabela 4 evidencia que o teor de Uma das funções dos fenóis está relacionada com a
espermidina na planta aos 90 dias de cultivo foi maior modulação do desenvolvimento vegetal, pela
e difere significativamente dos demais valores regulação do catabolismo do ácido indolacético (IAA)
encontrados na epiderme/planta-mãe. A aplicação e outra função importante está relacionada com o
exógena de espermidina não induziu o teor endógeno aumento da rigidez da parede celular e
ao aumento. Esse resultado, assim como do conseqüentemente, a formação das ligações
encontrado para espermina, pode ter sido devido à fenólicas com compostos da parede e a perda da
época analisada, já que essas substâncias poderiam extensibilidade, diminuindo o crescimento celular
ter sido metabolizadas, ou através de enzimas de (Volpert et al., 1995; Kroon & Williamson, 1999;
interconversão (Tassoni et al., 2000) ou através de Arnaldos et al., 2001). O teor de fenóis encontrado
enzimas oxidativas, que promovem a degradação nos tratamentos contendo poliaminas exógenas está
dessas substâncias (Smith, 1985). de acordo com o papel dos fenóis descrito na
O uso de poliaminas exógenas no meio de literatura, isto é, há uma relação inversa com o
cultura, de acordo Takeda et al., 2002 é uma maneira potencial de crescimento (Nakamura et al., 1998) e
simples de elevar os níveis endógenos de poliaminas as poliaminas como são compostos relacionados
e algumas vezes, induzir regeneração. com o crescimento de células e tecidos, promoveram
Poliaminas exógenas (putrescina, espermidina, o resultado esperado. Plantas cultivadas em meio
espermina) isoladas ou em combinação, resultaram contendo BAP e NAA aos 120 dias apresentaram
num aumento de crescimento de calos, os quais menor índice de massa e número de perfilhos, se
apresentaram formação de brotações e raízes com comparadas com as cultivadas em meio contendo
maior freqüência que o controle em Pinus virginiana espermidina combinada ou não com espermina,
Mill. e putrescina ou espermidina isoladas foram os apresentando o maior teor de fenóis totais. Este teor
melhores tratamentos para crescimento de calos, encontrado pode também ser devido à presença da
formação de brotos e enraizamento desta espécie auxina no meio de cultura, já que os fenóis estão
(Tang et al., 2004). Neste trabalho, o uso de relacionados com este regulador (Arnaldos et al.,
espermidina foi também o melhor tratamento tanto 2001).
para produção de massa (fresca/seca), como para A associação de espermina e espermidina
indução de brotação (perfilhos), aplicada tanto exógenas promoveu o maior número de perfilhos
isolada, quanto em combinação com espermina. (8,50) e apresentou também baixo teor de fenóis
Mader & Hanke (1997) afirmaram que os totais, além do maior teor de putrescina.
níveis de putrescina livre aumentaram em cultivo in Os compostos fenólicos são substratos
vitro de soja, especialmente no período inicial, antes principais de peroxidases, enzimas relacionadas com
do crescimento se tornar restrito para a expansão o crescimento e organogênese (De Klerk, 1996;
celular e a diminuição no teor de putrescina foi Kanmegne & Omokolo, 2003).
associada com o final da divisão celular. Neste As maiores atividades da enzima peroxidase
trabalho, a putrescina causou as alterações mais (Tabela 8) ocorreram na epiderme da planta matriz,
significativas, podendo, neste caso, ser utilizada como na caracterização e no uso exógeno da combinação
marcador bioquímico para o aumento do número de das poliaminas espermidina e espermina. Entre as
plantas. funções atribuídas às peroxidases em plantas, estão
O teor de fenóis (Tabela 5) em plantas aquelas relacionadas ao estresse (Castillo, 1992). Em
cultivadas in vitro com 90 dias (caracterização) foram relação à planta matriz (cultivada em condições de
maiores na folha da planta-mãe, quando comparados campo e analisada 6 horas após a coleta, devido ao
com os demais tratamentos e a aplicação exógena transporte do material vegetal, mesmo que em
de espermina induziu valores semelhantes condições de temperatura baixa), a alta atividade
significativamente. Quando se utilizou espermina observada tanto nas folhas como no rizoma poderia
combinada com espermidina, os tecidos analisados ser atribuída ao possível estresse causado pelos
mostraram os menores teores de fenóis totais fatores externos. Já em relação ao aumento verificado
solúveis. Quanto ao rizoma, a mesma tendência pode na caracterização, este fato poderia ser devido às
ser observada, porém os menores teores são sucessivas subculturas ou manipulação. Aumento de
verificados na planta matriz. Em relação aos perfilhos, atividade da peroxidase durante a subcultura de
aqueles cultivados em meio contendo espermina e tecidos in vitro também foi noticiada por Laukkanen
espermidina combinadas e aplicadas exógenamente, et al. (1999) em Pinus sylvestris, onde observaram
mostraram valores altos, menores apenas que a que durante a transferência de meios, os tecidos
planta cultivada in vitro com 90 dias. Nota-se que apresentaram maior atividade da peroxidase e os
ocorreu correlação inversa entre os teores de fenóis, autores ainda atribuem que esse aumento poderia
aplicação de poliaminas exógenas e crescimento estar relacionado com a lignificação das células.
(massa seca e número de perfilhos – Tabelas 6 e 7).

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TABELA 5. Teores de fenóis totais na epiderme da planta matriz (in vivo) e planta-mãe (explante inicial) dos
tratamentos in vitro; rizoma da planta matriz (in vivo) e dos tratamentos in vitro; perfilhos (brotações laterais de
plantas in vitro), expressos em g fenóis (ácido tânico). grama de matéria seca-1.

As médias seguidas de mesma letra na horizontal não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de
5% de probabilidade

TABELA 6. Número médio de perfilhos nos tratamentos, aos 30, 60 e 90 dias da instalação do experimento.

As médias seguidas de mesma letra na horizontal não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey
ao nível de 5% de probabilidade

Nos rizomas, nota-se os maiores valores para 1996) e provavelmente, poderiam interferir na atividade
atividade da peroxidase em todas as plantas in vitro. da peroxidase. Nas folhas de Aloe vera, verifica-se
Foi verificada a presença de oxidação em todos os que na aplicação de espermina ou espermidina
rizomas testados (escurecimento), tanto na isoladas não ocorreu diferenças, o mesmo para o
caracterização, provenientes de 90 dias de cultivo in tratamento contendo BAP + NAA, porém
vitro, como nos tratamentos contendo BAP + NAA e apresentaram atividade menor em relação a aplicação
aqueles contendo espermina e/ou espermidina da mistura das duas poliaminas. A alta atividade
exógena. observada neste tratamento poderia ser relacionada
Devido a taxa de oxidação observada, não com o ativo crescimento observado neste tratamento,
foi retirado o rizoma durante os subcultivos referentes tanto para folhas, como para os perfilhos, pois a
à caracterização, pois em experimentos prévios foi peroxidase tem sido descrita na literatura como
observado que a retirada dos rizomas acentuavam a possível marcador de organogênese (Kanmegne &
oxidação. A atividade da peroxidase apresenta Omokolo, 2003; Bonfill et al., 2003; De Klerk, 1996),
alterações em tecidos com oxidação e/ou apresentando alterações na atividade antes dos
necrosados. A atividade desta enzima, assim como eventos morfogênicos se manifestarem (Gaspar et
da polifenoloxidase (capazes de catalisar a formação al., 1985; Anderson et al., 1986) e no caso específico
e polimerização de quinonas de compostos fenólicos) de perfilhos, o tratamento com espermina e
muda significativamente durante o cultivo in vitro. Tal espermidina foi o que induziu maior numero de
polimerização pode causar o escurecimento dos perfilhos, maior teor de putrescina e apresentou alta
tecidos, pela conversão dos precursores coloridos em atividade da enzima, podendo neste caso a enzima
polímeros marrons e a atividade de enzimas oxidativas peroxidase ser também tomada como indicador de
aumenta durante esse processo (Laukkamen et al., crescimento ativo em Aloe vera. Por outro lado, como
1999). Provavelmente, neste trabalho, a alta atividade descrito em Kanmegne & Omokolo (2003), parece
da peroxidase em rizomas está relacionada com a que cada evento morfogenético que ocorre
formação de compostos oxidados, que tornariam o (calogênese, rizogênese, formação de brotos, etc.)
rizoma escurecido, sendo também exsudado para o estaria caracterizado por um padrão de isoperoxidase
meio de cultura. específico, necessitando neste caso de estudos mais
As poliaminas são descritas como aprofundados sobre o papel bioquímico de
substâncias que podem prevenir ou diminuir a peroxidases ácidas e básicas.
oxidação, agindo como possível antioxidante (Lovaas, Os teores de flavonóides encontrados no

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presente estudo (Tabelas 9 e 10), principalmente nos substâncias. Tanto com base em quercetina ou rutina,
rizomas de plantas tratadas com espermidina e a nota-se que a aplicação de espermidina e a
associação de espermina e espermidina foram associação de espermina e espermidina induziram
maiores que o relatado em maçã por Awad et al. teores elevados de flavonóides nas folhas da planta-
(2000), fruto que apresenta grandes níveis dessas mãe.

TABELA 7. Massa seca da planta-mãe, perfilhos e rizomas das plantas de Aloe vera (L.) Burm., aos 120 dias do
início do experimento.

As médias seguidas de mesma letra na horizontal não diferem significativamente entre si pelo teste de
Tukey ao nível de 5% de probabilidade

TABELA 8. Atividade de peroxidase na folha (epiderme) da planta matriz (in vivo) e planta-mãe (explante inicial)
dos tratamentos in vitro; rizoma da planta matriz (in vivo) e dos tratamentos in vitro; perfilhos (brotações laterais de
plantas in vitro), expressos em mol de H2O2 decomposto. min.-1mg. de proteína-1.

As médias seguidas de mesma letra na horizontal não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de
5% de probabilidade

TABELA 9. Teores de quercetina na folha (epiderme) da planta matriz (in vivo) e planta-mãe (explante inicial) dos
tratamentos in vitro; rizoma da planta matriz (in vivo) e dos tratamentos in vitro; perfilhos (brotações laterais de
plantas in vitro), expressos em g fenóis (ácido tânico) grama de matéria seca-1.

As médias seguidas de mesma letra na horizontal não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nível
de 5% de probabilidade

Resultados semelhantes são observados no relacionado com o possível papel antioxidante dessas
rizoma, enquanto que nos perfilhos apenas a substâncias. Esse efeito pode ser devido
associação das duas poliaminas promoveu os principalmente às espécies reativas de oxigênio
maiores valores. Nos rizomas, onde foi também (ERO), envolvendo radical superoxido (O2-), radical
observada alta atividade da peroxidase, por hidroxila (OH-) e peróxido de hidrogênio (H2O2), sendo
provavelmente estarem relacionadas com estresse, o peróxido o maior contribuinte para as ERO (Apel &
os níveis de flavonóides podem ter sido maior devido Hirt, 2004). Starzyinsk & Mareczek (2003) encontraram
à alta taxa de oxidação observada no tecido, causando correlação positiva entre o conteúdo de flavonóides
o escurecimento. O aumento poderia estar em brócolis e a atividade antiradical livre, medida via

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DPPH (1,1-difenil-2-picritidrazil), indicando que os do IAA em baixas concentrações (Mathesius, 2001).

fenóis solúveis analisados tem um papel importante Os flavonóides que inibem a atividade da IAA oxidase
como componente do sistema antioxidante. poderiam agir como um substrato alternativo para a
Possivelmente, os teores encontrados neste trabalho peroxidase, protegendo o IAA de oxidação (Kefeli &
estejam relacionados com a proteção aos tecidos do Dashek, 1984), favorecendo o crescimento. Os
rizoma, órgão que apresentou maior nível de oxidação flavonóides também podem inibir a oxidação do IAA
nestas plantas estudadas. pela remoção de peróxido de hidrogênio, o qual é
Nos perfilhos, os maiores teores de produzido na ação oxidativa que precede a atividade
flavonóides foram observados nos tratamentos que da peroxidase e é necessário para oxidação do IAA
usaram a combinação das duas poliaminas e que (Galston et al., 1950).
apresentaram maior perfilhamento, assim como maior Assim, os maiores teores de flavonóides
teor de putrescina. Provavelmente essa combinação encontrados no rizoma poderiam estar relacionados
e os teores usados das poliaminas tenham com os danos oxidativos, tentando preservar o tecido,
proporcionado um sistema conveniente de pois o mesmo apresentava-se escurecido
crescimento, além da possível proteção dos tecidos externamente, porém internamente, no local onde
contra danos oxidativos gerados por exudatos do cresciam os perfilhos, o tecido estava sem sinais de
rizoma, podendo ter promovido aumento dos oxidação.
flavonóides. Os valores observados nos perfilhos no
Outra relação que poderia ser citada é a dos tratamento contendo a associação de espermidina e
flavonóides e IAA, já que os flavonóides parecem espermina, poderia estar relacionado ao ativo
proteger esse regulador (Wagner et al., 1988). Diversos crescimento encontrado, além da possibilidade da
trabalhos mostram a ação de flavonóides específicos ação conjunta ter sido benéfica para o perfilhamento
(quercetina e rutina) inibindo IAA oxidase em altas de Aloe vera micropropagada.
concentrações, mas que podem acelerar a catálise

TABELA 10. Teores de rutina na folha (epiderme) da planta matriz (in vivo) e planta-mãe (explante inicial) dos
tratamentos in vitro; rizoma da planta matriz (in vivo) e dos tratamentos in vitro; perfilhos (brotações laterais de
plantas in vitro), expressos em g fenóis (ácido tânico) grama de matéria seca-1.

As médias seguidas de mesma letra na horizontal não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade

CONCLUSÃO
Ocorreu correlação inversa entre teores de APEL, K.; HIRT, H. Reactive oxygen species: Metabolism,
fenóis e aplicação de poliaminas em plantas de Aloe oxidative stress, and signal transduction. Annual Review
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mostrou-se benéfica para o perfilhamento. ARNALDOS, T.L. et al. Changes in phenol content during
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