UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

LUCAS SERRA MARTIN

Triagem de compostos orgânicos para incorporar matrizes híbridas

baseadas em sílica pela técnica sol-gel

Lorena
2015
 LUCAS SERRA MARTIN

Triagem de compostos orgânicos para incorporar matrizes híbridas

baseadas em sílica pela técnica sol-gel

Dissertação apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre
em Ciências do Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química na área de Processos Catalíticos e Biocatalíticos

Orientadora: Profa. Dra. Heizir Ferreira de Castro

Versão Original

Lorena
2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
 Dedico este trabalho aos meus pais que sempre
estiveram ao meu lado em todos os momentos e aos
amigos que me acompanham de perto e sempre me apoiam
 AGRADECIMENTOS

À minha mãe Myrian e ao meu pai Vitoriano, por todo o carinho e apoio em todos os
momentos.

Aos meus irmãos Vitoriano Jr e Júlia, com os quais eu aprendo e convivo e me

inspiram na realização deste trabalho.

À minha namorada Milena, com a qual eu divido todos os momentos de alegria e

tristeza.

À minha orientadora Profa. Dra. Heizir Ferreira de Castro, pela excelente orientação
e pela oportunidade concedida de desenvolver este trabalho. Agradeço pela dedicação,
atenção, paciência e ensinamentos que foram fundamentais para meu aprimoramento como
pessoa e profissional.

A todos os professores e funcionários da Escola de Engenharia de Lorena, que

contribuíram direta ou indiretamente para a concretização deste trabalho.

Aos amigos de laboratório que me acompanharam e me ajudaram nessa fase: Lucas,

Emanuelle, Eduardo, Juan, Rafael, Heitor, Sara, Ana Karine, Annie, Renata, Braz, Flávia,
Daniela, Weriton.

Aos professores Patrícia, Pedro e Larissa por me auxiliarem em todos os momentos

do trabalho em que precisei.

Em especial agradeço a ajuda do companheiro de laboratório e aluno de iniciação

científica Pedro, que me ajudou muito durante grande parte experimental do trabalho.

Agradeço o apoio financeiro concedido pelo CNPQ.

 RESUMO
MARTIN, L. S. Triagem de compostos orgânicos para incorporar matrizes híbridas
baseadas em sílica pela técnica sol-gel. 2015. 116 p. Dissertação (Mestrado em Ciências)
– Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena/ SP, 2015.

O presente projeto teve como objetivo selecionar componentes orgânicos para obtenção de
compósitos híbridos pela técnica sol-gel utilizando como precursor tetraetilortossilicato
(TEOS) visando avaliar o efeito do agente orgânico na evolução do sol para gel e nas
propriedades finais dos suportes para imobilizar a lipase microbiana de Burkholderia
cepacia. Foram testados três compostos orgânicos β-ciclodextrina (βCD),
carboximetilcelulose (CMC) e hidroxietilcelulose (HEC) e os resultados obtidos foram
comparados com o comportamento já estabelecido para o polivinilálcool (PVA), tanto em
termos morfológicos como atividade catalítica em meio aquoso (hidrólise de triacilgliceróis)
e meio orgânico (síntese de éster de cadeia curta e longa). A motivação do estudo está
diretamente relacionada com a elevada afinidade do suporte híbrido SiO2-PVA pelo glicerol,
sendo uma das limitações do uso deste suporte para imobilizar lipases com finalidade de
aplicação em reações de transesterificação conduzidas em fluxo contínuo. As características
morfológicas e estruturais dos suportes resultantes foram determinadas empregando técnicas
convencionais, indicando similaridade das propriedades estruturais, fornecendo suportes
com áreas superficiais entre 361,6 a 529,7 m2 g-1 e morfologia amorfa. A diferença marcante
entre os suportes foi verificada quanto a capacidade de adsorção do subproduto da reação de
transesterificação, sendo verificado que a substituição do polivinilálcool por β-ciclodextrina
reduziu em até 50% a habilidade do suporte hibrido em absorver glicerol. Os componentes
derivados de celulose apresentaram resultados similares aos obtidos com o polivinilálcool.
Em termos de afinidade pelo glicerol os resultados obtidos permitiram a classificação dos
suportes híbridos na seguinte ordem crescente: SiO2-CMC > SiO2-PVA > SiO2-HEC > SiO2-
βCD. Quanto a afinidade dos suportes para imobilização da lipase de B. cepacia, os valores
de atividade hidrolítica dos derivados imobilizados, nas condições adotadas, revelaram que
todos os suportes tiveram o mesmo tipo de interação com a enzima resultando em valores de
recuperação de atividade na faixa de 56 - 63%, valores próximos aos normalmente obtidos
pela matriz de SiO2-PVA (68%). Os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) determinados
indicaram que a lipase imobilizada nos diferentes tipos de suporte, apresentou afinidade
semelhante pelo substrato azeite de oliva. Os valores determinados de Km e Vmax da lipase de
B. cepacia na forma livre (Km = 410 mM e Vmax =12391 Ug-1) mostraram que independente
do suporte, a imobilização reduziu aproximadamente 60% da afinidade da enzima pelo
substrato. Em meio orgânico, tanto as reações de esterificação como de transesterificação
mediadas pelos derivados imobilizados apresentaram desempenho similar com atividade de
esterificação da ordem de 118 µM.g-1min-1 e rendimentos de formação de ésteres
etílicos da ordem de 98,30%. De uma forma geral, os resultados obtidos foram promissores
e permitiram selecionar o composto orgânico βCD para substituir com vantagens o
polivinilálcool no preparo de matrizes hibridas para imobilização da enzima lipase. O menor
poder hidrofílico desta matriz em relação às outras matrizes testadas pode ser creditado a
estrutura cíclica da βCD que reduziu a capacidade do suporte SiO2-βCD em adsorver
glicerol, principal subproduto da reação de transesterificação. Testes em processos
conduzidos em fluxo contínuo são sugeridos para comprovação da eficiência dessa matriz.

PALAVRAS-CHAVE: Imobilização. Sol-gel. Suporte híbrido. Lipase. Biodiesel.

 ABSTRACT

MARTIN, L. S. Screening of organic components to incorporate silica-based hybrid

matrices by sol-gel technique. 2015. 116p. Dissertation (Master of Science) - Escola de
Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena/SP, 2015.

The objective of this work was to select organic compounds for preparing hybrid composites
by the sol-gel technique using tetraethylorthosilicate (TEOS) as precursor aiming at
evaluating the effect of the organic agent in the transformation of the sol into gel and in the
final properties of the matrices for immobilizing lipase from Burkholderia cepacia. Three
organic components β-cyclodextrin (βCD), carboxymethylcellulose (CMC) and
hydroxyethylcellulose (HEC) were tested. The organic component polyvinyl alcohol (PVA)
was used as control taking into consideration its morphological properties and the catalytic
activity of the immobilized derivative in aqueous medium (triacylglycerols hydrolysis) and
organic medium (synthesis of short and long chain esters). The motivation of this work was
directly related with the high affinity of the matrix polysiloxane-polyvinyl alcohol (SiO2-
PVA) by the glycerol, limiting the use of the immobilized derivative in the transesterification
reactions running on a continuous flow. The morphological and structure properties of the
resulting matrices was determined using conventional techniques, showing similar structure
properties, with surface area values between 361.6 and 529.7 m2g-1 and amorphous
morphology. The main difference among the matrices were observed regarding their ability
to adsorb glycerol, the main byproduct of the transesterification reaction. It was verify that
the replacement of the polyvinyl alcohol by β-cyclodextrin reduced in about 50% the hybrid
composite capacity to adsorb glycerol. On the other hand, the cellulose components showed
similar results as the polyvinyl alcohol. Considering as an evaluated parameter the glycerol
affinity, the achieved results allowed classifying the hybrid composites as follows: SiO2-
CMC > SiO2-PVA > SiO2-HEC > SiO2-βCD. The performance of the hybrid composites for
immobilizing lipase from B. cepacia, through the hydrolytic activity reveal that all the
matrices show the same interaction with the lipase, resulting in activity recovered values
between 56-63%, which is close to the value attained by SiO2-PVA matrix (68%). The
kinetic parameters (Km and Vmax) values determined for free lipase (Km = 410 and Vmax =
12391 Ug-1), showed that independely of the immobilization support the affinity of the
enzyme for the substrate was reduced by 60%. In organic medium, all the immobilized
derivatives showed similar behavior on both esterification and transesterification reactions
attaining esterification activity of 118 µM.g-1min-1 and ethyl ester yields of 98.30%.
Overall, the results were promising and allowed selecting the organic component βCD to
replace, with advantages, the use of PVA for preparing hybrid composites. The lower
hydrophilic capacity of this matrix compared with the others matrices can be explained by
the cyclic structure of the βCD that reduced the capacity of the SiO2-βCD matrix in the
glycerol adsorption, the main byproduct of the transesterification reaction. Assays carried
out in packed bed reactor running on a continuous basis are propose to confirm the efficiency
of this matrix.

KEYWORDS: Immobilization. Sol-gel. Lipase. Hybrid materials. Biodiesel.

 LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1. – Reações catalisadas por lipases ..................................................................... 23
Figura 3.2. – Representação da estrutura tridimensional da conformação aberta da lipase
de B. cepacia. ....................................................................................................................... 27
Figura 3.3. –Técnica de adsorção física (a) e ligação covalente (b) para a imobilização de
enzimas. ............................................................................................................................... 29
Figura 3.4. –Técnica de encapsulação para a imobilização de enzima .............................. 30
Figura 3.5. – Processo e produtos obtidos pela técnica sol-gel .......................................... 31
Figura 3.6. – Processo de formação do PVA ...................................................................... 34
Figura 3.7. – Esquema de reações envolvidas na preparação da matriz híbrida de SiO2-
PVA. .................................................................................................................................... 35
Figura 3.8. – Representação esquemática da β -ciclodextrina ............................................ 36
Figura 3.9. – Representação esquemática das ciclodextrinas ............................................. 37
Figura 3.10. – Esquema das reações envolvidas na preparação da matriz híbrida de SiO2-
βCD. ..................................................................................................................................... 37
Figura 3.11. – Mecanismo de formação da carboximetilcelulose ...................................... 38
Figura 3.12. – Esquema de reações envolvidas na preparação da matriz híbrida de SiO2-
CMC..................................................................................................................................... 39
Figura 3.13. – Mecanismo de formação do hidroxietilcelulose.......................................... 40
Figura 3.14. – Esquema de reações envolvidas na preparação da matriz híbrida de SiO2-
HEC. .................................................................................................................................... 41
Figura 3.15. – Evolução da produção de biodiesel no mundo entre 2000 a 2012. ............. 46
Figura 3.16. – Mecanismo da reação de transesterificação, em que R1, R2 e R3 são as
cadeias do ácido graxo, e R4 é o grupo alquil do álcool ..................................................... 52
Figura 3.17. – Fluxograma de produção enzimática do biodiesel ...................................... 55
Figura 4.1. – Esquema de síntese, ativação dos suportes híbridos e imobilização da lipase
B. cepacia............................................................................................................................. 62
Figura 4.2. – Ilustração do aparato experimental utilizado nas reações de etanólise do óleo
de palmiste ........................................................................................................................... 63
Figura 4.3. – Curva padrão do glicerol ............................................................................... 66
Figura 5.1. – Espectros na região do infravermelho das matrizes híbridas ........................ 76
Figura 5.2. – Difratometria de Raios X das matrizes híbridas............................................ 77
Figura 5.3. – Espectros na região do infravermelho da lipase de B.cepacia na forma livre e
imobilizada nos suportes híbridos........................................................................................ 81
Figura 5.4. – Difratometria de Raios X da lipase de B.cepacia imobilizada nos suportes
híbridos ................................................................................................................................ 82
Figura 5.5. – Perfis das curvas de velocidade de reação da lipase B. cepacia livre (a) e dos
derivados imobilizados em (b) SiO2-βCD, (c) SiO2-CMC, (d) SiO2-HEC e (e) SiO2-PVA. 83
Figura 5.6. – Estabilidade térmica da lipase B. cepacia livre e dos derivados imobilizados
nos suportes híbridos SiO2- βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-PVA............................... 85
Figura 5.7. – Perfil do consumo do butanol ( ) e ácido butírico ( ) e formação do butirato
de butila ( ) na reação de esterificação mediada pela lipase de B. cepacia imobilizada nos
suportes híbridos: (a) SiO2-βCD, (b) SiO2-CMC, (c) SiO2- HEC, (d) SiO2-PVA (40 °C, 180
rpm). ..................................................................................................................................... 87
Figura 5.8. – Perfil de formação dos ésteres de etila a partir da reação de transesterificação
do óleo de palmiste com etanol, catalisada pela lipase B. cepacia imobilizada em diferentes
suportes híbridos: (a) SiO2- βCD, (b) SiO2-CMC, (c) SiO2-HEC, (d) SiO2-PVA............... 89
 LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1. – Aplicações industriais das lipases ................................................................. 25
Tabela 3.2. – Classificação de algumas lipases de acordo com sua especificidade............ 26
Tabela 3.3. – Os dez países com maior potencial mundial de produção de biodiesel. ....... 45
Tabela 3.4. – Especificações do biodiesel estabelecidas pela Resolução 14/2012 (ANP). 47
Tabela 3.5. – Características das principais culturas oleaginosas no Brasil. ...................... 48
Tabela 3.6. – Principais países produtores do óleo de palmiste, em 2014. ......................... 49
Tabela 3.7. – Área plantada com palma no Brasil .............................................................. 49
Tabela 3.8. – Composição em ácidos graxos do óleo de palmiste. ..................................... 50
Tabela 3.9. – Comparação do processo de produção de biodiesel pela rota enzimática e
química................................................................................................................................. 56
Tabela 3.10. – Trabalhos publicados para a produção enzimática de biodiesel utilizando
óleo de palmiste como matéria-prima .................................................................................. 57
Tabela 4.1. – Principais equipamentos utilizados durante a realização do trabalho ........... 60
Tabela 4.2. – Concentrações dos reagentes utilizados na etapa de dosagem do glicerol.... 66
Tabela 4.3. – Condições operacionais para quantificação da concentração de butanol e
butirato de butila por cromatografia de fase gasosa. ........................................................... 69
Tabela 4.4. – Condições de operação para a determinação dos ésteres de etila ................. 70
Tabela 5.1. – Rendimentos de sólidos obtidos em todas as etapas envolvidas no preparo
dos suportes híbridos ........................................................................................................... 74
Tabela 5.2. – Área superficial específica, volume de poros e diâmetro médio de poro para
os suportes de SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-PVA. ......................................... 75
Tabela 5.3. – Adsorção de glicerol e porcentagens de recuperação mássica de solução
empregando diferentes matrizes híbridas ............................................................................ 78
Tabela 5.4. – Parâmetros obtidos da imobilização da lipase B. cepacia em diferentes
suportes híbridos. ................................................................................................................. 79
Tabela 5.5. – Área superficial específica, volume de poros e diâmetro médio de poro para
a lipase de B. cepacia imobilizada nos suportes híbridos SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC
e SiO2-PVA. ......................................................................................................................... 80
Tabela 5.6. – Parâmetros cinéticos da lipase B. cepacia livre e imobilizada nos diferentes
suportes híbridos .................................................................................................................. 84
Tabela 5.7. – Estabilidade térmica dos derivados de B. cepacia imobilizados em diferentes
tipos de suporte .................................................................................................................... 86
Tabela 5.8. – Atividade de esterificação, conversão molar de butanol e produtividade na
síntese do butirato de butila mediada por diferentes derivados imobilizados. .................... 88
Tabela 5.9. – Perfil dos ésteres de etila nas amostras de biodiesel obtidas por catálise ..... 90
Tabela 5.10. – Propriedades das amostras de biodiesel purificadas ................................... 91
 LISTA DE ABREVIAÇÕES

ANP Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis

MAG Monoacilgliceróis
DAG Diacilgliceróis
TAG Triacilgliceróis
AGL Ácidos graxos livres
PNPB Programa nacional de produção e uso do biodiesel
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
PVA Álcool polivinílico
βCD β-ciclodextrina
CMC Carboximetilcelulose
HEC Hidroxietilcelulose
 SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 17
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 21
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................ 23
3.1. Lipases .......................................................................................................................... 23
3.1.1. Lipase de Burkholderia cepacia ............................................................................... 26
3.2. Imobilização de lipases ................................................................................................. 28
3.3. Suportes híbridos utilizados na imobilização de enzimas ............................................ 30
3.3.1. Processo sol-gel ......................................................................................................... 31
3.3.2. Suporte híbrido polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) ................................. 33
3.3.3. Suporte hibrido SiO2-β-Ciclodextrina (SiO2-βCD) ................................................... 36
3.3.4. Suporte híbrido SiO2-Carboximetilcelulose (SiO2-CMC) ......................................... 38
3.3.5. Suporte híbrido SiO2-Hidroxietilcelulose (SiO2-HEC) ............................................. 40
3.3.6. Utilização de matrizes hibridas como suporte de imobilização da enzima lipase ..... 42
3.4. Biodiesel ....................................................................................................................... 44
3.5. Matérias-primas para a produção de biodiesel ............................................................. 48
3.6. Tecnologias de produção de biodiesel .......................................................................... 51
3.6.1 Transesterificação ....................................................................................................... 51
3.6.2. Catálise homogênea e heterogênea ............................................................................ 53
3.7. Síntese de biodiesel por catálise enzimática ................................................................. 54
3.8. Produção de biodiesel a partir do óleo de palmiste ...................................................... 56
4. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 59
4.1. Materiais ....................................................................................................................... 59
4.1.1. Enzima ...................................................................................................................... 59
4.1.2. Suportes de imobilização ........................................................................................... 59
4.1.3. Materiais de partida .................................................................................................. 59
4.1.4. Outros reagentes ....................................................................................................... 59
4.2. Equipamentos................................................................................................................ 60
4.3. Metodologia Experimental ........................................................................................... 60
4.3.1. Síntese dos suportes híbridos ..................................................................................... 60
4.3.2. Ativação dos suportes híbridos .................................................................................. 61
4.3.3. Imobilização da lipase de Burkholderia cepacia em diferentes tipos de suporte ...... 61
4.3.4. Síntese dos ésteres de alquila ..................................................................................... 62
4.3.5. Separação do biocatalisador e purificação do biodiesel ............................................ 63
4.4. Métodos de análise....................................................................................................... 63
4.4.1. Caracterização dos suportes híbridos ......................................................................... 63
4.4.1.1. Área superficial ....................................................................................................... 63
4.4.1.2 Difração de Raios-X (DRX) .................................................................................... 64
4.4.1.3. Espectroscopia na região do Infravermelho (IV) .................................................... 64
4.4.1.4. Testes de adsorção do glicerol dos suportes híbridos ............................................. 65
4.4.1.5. Quantificação de glicerina em meio sintético ......................................................... 65
4.4.2. Propriedades dos derivados imobilizados .................................................................. 67
4.4.2.1 Dosagem de atividade hidrolítica da lipase livre e imobilizada .............................. 67
4.4.2.2. Dosagem da umidade dos derivados imobilizados ................................................. 68
4.4.2.3 Estabilidade térmica da lipase livre e dos derivados imobilizados .......................... 68
4.4.2.4. Determinação dos parâmetros cinéticos da lipase livre e imobilizada ................... 68
4.4.2.5. Determinação da atividade de esterificação dos derivados imobilizados ............... 68
4.4.3. Caracterização do biodiesel ....................................................................................... 69
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 73
5.1. Preparo dos suportes híbridos ....................................................................................... 73
5.2. Caracterização dos suportes híbridos preparados ......................................................... 74
5.2.1. Análise morfológica dos suportes .............................................................................. 74
5.2.2. Análise na região do infravermelho dos suportes ...................................................... 75
5.2.3. Difração de raios-X dos suportes ............................................................................... 76
5.2.4. Testes de afinidade do suporte pelo glicerol .............................................................. 77
5.3. Caracterização dos derivados imobilizados preparados ............................................... 78
5.3.1. Imobilização da lipase de Burkholderia cepacia em diferentes suportes híbridos .... 78
5.3.2. Análise morfológica dos derivados imobilizados ...................................................... 79
5.3.3. Análise de infravermelho dos derivados imobilizados .............................................. 80
5.3.4. Difração de raios-X dos derivados imobilizados ....................................................... 81
5.3.5. Parâmetros cinéticos dos derivados imobilizados ..................................................... 82
5.3.6. Estabilidade térmica da lipase de B. cepacia livre e imobilizada nos diferentes tipos
de suporte ............................................................................................................................. 85
5.4. Aplicação das preparações de lipases imobilizadas em meio orgânico ........................ 86
5.5. Síntese de ésteres de etila por transesterificação .......................................................... 88
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 93
REFERÊNCIAS................................................................................................................... 95
APÊNDICES ..................................................................................................................... 107
 17

1. INTRODUÇÃO

O termo biocatálise se refere ao uso da enzima, como biocatalisador, em

transformações químicas. Essa utilização de enzimas como biocatalisadores é muito
dinâmica e evoluiu expressivamente nos últimos anos. Enzimas apresentam como principais
vantagens: alta estabilidade, alta eficiência catalítica, elevada especificidade além de
permitir a obtenção de produto com melhor qualidade quando comparado a outros métodos
catalíticos. Essas características contribuem para a utilização destes biocatalisadores em
diversos segmentos industriais (POLSHETTIWART et al., 2011; TORRELO; HANEFELD;
HOLLMANN, 2015).
Dentre os processos químicos industriais, os de maior interesse estão as reações
catalisadas pelas lipases, que representam 35% das biotransformações realizadas. Esse
potencial é destacado por sua versatilidade tanto em processos hidrolíticos quanto em
processos de síntese (DE CASTRO et al., 2010; PAQUES; MACEDO, 2006). As lipases
apresentam diversas aplicações, podendo ser utilizada na indústria de alimentos
(modificação de óleos e gorduras), na síntese de compostos orgânicos (RIBEIRO et al.,
2011; ADLERCREUTZ, 2013).
Idealmente os sistemas catalisados por lipases devem ser tratados especificamente
de acordo com as condições do meio e generalizações devem ser praticadas com cautela. Os
principais obstáculos na aplicação deste processo comparado ao processo tradicional da
síntese química são: o alto custo do biocatalisador e baixa estabilidade térmica. Uma maneira
de superar essas limitações é protegendo a configuração nativa da enzima por meio de
imobilização utilizando suportes sólidos, resultando em efeitos benéficos na sua
estabilidade, por meio das interações físico-químicas entre o suporte e as moléculas da
enzima (ZANIN; MORAES, 2004; VUJCIC et al., 2011). Essa técnica auxilia também na
dispersão homogênea da enzima no meio reacional, sendo essencial para a condução de
reações enzimáticas (DE CASTRO et al., 2008).
O termo imobilização se refere à localização ou confinamento da enzima. Essa
tecnologia envolve basicamente a escolha de um suporte e de um método de imobilização
que resulte num derivado imobilizado ativo e estável. Determinados parâmetros devem ser
levados em consideração para a seleção do método de imobilização como a atividade global
do derivado imobilizado, características como regeneração do suporte e inativação, os custos
do procedimento de imobilização, a toxicidade dos reagentes de imobilização e as
 18

propriedades finais desejadas para o derivado imobilizado (MALCATA et al, 1990; ZANIN;
MORAES, 2004; MOHAMAD et al., 2015).
Existe um grande número de suportes disponíveis para aplicações industriais. Esses
suportes são escolhidos especificamente para cada processo, tendo como parâmetros de
escolha o custo do processo, a especificidade, a biocompatibilidade e a disponibilidade do
produto (EŞ; VIEIRA; AMARAL, 2015). Os resultados mais eficientes, entretanto, são
obtidos por meio da utilização de suportes industrializados, de alto custo e de reagentes para
a ativação dos suportes, também de custo elevado. Desta forma, o estudo da imobilização de
enzimas em matrizes alternativas aumentou nos últimos anos. Entre os suportes testados
merecem destaque a quitina e quitosana (GOMES; PEREIRA; DE CASTRO, 2004;
PEREIRA et al., 2001); resíduos agroindustriais como celulignina (PEREZ et al., 2007) e
matrizes híbridas de materiais orgânicos e inorgânicos, tais como sílica-álcool polivinílico
(PAULA et al., 2008; SANTOS et al., 2008b), sílica-quitosana (SIMÕES et al., 2011), sílica-
celulose (XIE; YU; SHI, 2009), sílica-carboximetilcelulose (SALAMA et al., 2015), sílica-
hidroxietilcelulose (KAPSABELIS; PRESTIDGE, 2000) e sílica-β-ciclodextrina (FARAJI;
HUSAIN; HELALIZADEH, 2011).
Em função das vantagens oferecidas pelos suportes híbridos que combinam os
atributos físico-químicos dos materiais inorgânicos e orgânicos, permitindo a manipulação
da hidrofilicidade e hidrofobicidade, carga iônica, porosidade e propriedades mecânicas em
geral, a matriz sílica-álcool polivinílico tem sido utilizada com sucesso em reações de
biotransformação com lipases, em regime descontínuo, obtendo produtos de interesse
industrial como ésteres aromatizantes (BRUNO et al., 2005), monoacilgliceróis (FREITAS
et al., 2009), ésteres de açúcares (PAULA et al., 2008) e biodiesel (CARVALHO et al.,
2013).
Apesar deste bom desempenho, limitações foram constatadas nas reações
transesterificação de óleo vegetal com etanol conduzidas em reator de leito operando em
fluxo contínuo (SIMÕES et al., 2015; FIDALGO, 2014), em função da retenção do glicerol
formado como subproduto no leito catalítico, o qual é adsorvido sobre o suporte enzimático,
ocasionando redução da atividade enzimática. O fenômeno envolvido nesta perda de
atividade é atribuído à formação de uma barreira hidrofílica em torno da enzima, resultando
em limitações de difusão do substrato hidrofóbico da fase orgânica para a enzima. Desta
forma, a redução da hidrofilicidade do suporte de imobilização poderá reduzir a retenção do
 19

glicerol no leito catalítico e aumentar o tempo de meia-vida da enzima imobilizada,

permitindo a manutenção de uma operação estável do reator por períodos mais longos.
Contribuindo para este desenvolvimento, o presente trabalho teve como objetivo
selecionar componentes orgânicos que possam substituir o álcool polivinílico para obtenção
de compósitos híbridos pela técnica sol-gel que permitam obter suportes com menor caráter
hidrofílico, entretanto preservando as adequadas características da matriz SiO2-PVA para
imobilização da enzima lipase. O trabalho experimental foi direcionado visando à obtenção
de biocatalisadores imobilizados ativos para condução de reações de biotransformações
reversíveis, como a produção de ésteres de cadeia curta (butirato de butila) e longa
(biodiesel).
 21

2. OBJETIVOS

O presente trabalho teve por objetivo obter amostras ativas e estáveis de lipase
imobilizada em suportes híbridos, tornando possível sua aplicação em biotransformações de
compostos de interesse do setor óleo-químico. Levando em consideração estes aspectos, o
objetivo global do projeto foi alcançado por meio da execução das seguintes etapas:

Preparo de diferentes tipos de suportes híbridos e a caracterização das propriedades

texturais e morfológicas e capacidade de adsorção de glicerol

Imobilização da lipase de Burkholderia cepacia nos suportes preparados e a

caracterização dos derivados imobilizados quanto aos parâmetros cinéticos e
estabilidade térmica

Utilização da lipase de B. cepacia imobilizada nos diferentes tipos de suporte para

mediar reações em meio orgânico como síntese de ésteres por esterificação e
transesterificação.
 23

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Na revisão bibliográfica são abordados os principais temas relacionados ao trabalho,

iniciando com informações sobre lipase, imobilização de enzimas e a utilização dos suportes
híbridos na etapa de imobilização, seguindo com a síntese de biodiesel e as matérias-primas
envolvidas no processo.

3.1. Lipases

Lipases (glicerol éster hidrolases – E.C. 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a
hidrólise de ligações éster, com maior especificidade para triacilgliceróis com ácidos graxos
de cadeia longa. Muito embora esta classe de enzima seja conceitualmente hidrolítica, em
meio orgânico as lipases catalisam a reação reversa (esterificação). Estes dois processos
básicos podem ser combinados numa sequência lógica para resultar em reações de
interesterificação (acidólise, alcoólise e transesterificação), dependendo dos reagentes de
partida empregados, como ilustra a Figura 3.1 (DE CASTRO et al., 2004).

Figura 3.1. – Reações catalisadas por lipases

Fonte: DE CASTRO et al., 2004.

 24

As lipases são comumente encontradas na natureza, podendo ser obtidas a partir de

fontes de tecidos animais, vegetais ou células microbianas. Entretanto, as lipases
provenientes de microrganismos são as mais utilizadas industrialmente, por apresentarem
procedimentos mais simples de obtenção, serem mais estáveis e terem propriedades bem
mais diversificadas que as de outras fontes. Estas enzimas não requerem cofatores, são
regioespecíficas, atuam em larga faixa de pH e apresentam a capacidade única de atuar
apenas na interface óleo/água (DE CASTRO et al., 2010).
Diferentes fontes de lipase tem a capacidade de catalisar a mesma reação, porém o
desempenho pode ser diferente sob as mesmas condições reacionais (YAHYA;
ANDERSON; MOO-YOUNG, 1998).
A gama de reações passíveis de serem catalisadas por esta classe de enzimas, aliada
à sua boa estabilidade em solventes orgânicos, tornam os lipases excelentes biocatalisadores
em estágios intermediários de processos químicos convencionais e na catálise de reações
químicas que envolvam substratos insolúveis em meio aquoso. Além disso, as suas
características de químio, régio e/ou de estereosseletividade tornam estes biocatalisadores os
mais utilizados na síntese orgânica.
A versatilidade das lipases como catalisador é também evidente pelo número de
processos em fase de desenvolvimento ou em fase de implantação industrial, entre os quais
podem ser destacados: os processos de modificação da estrutura de óleos e gorduras visando
à obtenção de produtos enriquecidos com ácidos graxos essenciais, ésteres, emulsificantes,
biodiesel e lipídeos estruturados, entre outras aplicações, como listado na Tabela 3.1.
Atualmente, o emprego de lipases para mediar a reação de síntese de biodiesel representa
um campo de vasta aplicação para estas enzimas (RIBEIRO et al., 2011), sendo essa a
aplicação objeto do presente projeto.
 25

Tabela 3.1. – Aplicações industriais das lipases

Indústria Ação Produto ou aplicação
Detergentes Hidrólise de gorduras Remoção de óleos

Derivados de Hidrólise da gordura do leite, Desenvolvimento de agentes

laticínios maturação de queijos, flavorizantes em leite, queijos
modificações de manteigas e manteiga

Panificação Melhorador de aromas Prolongar a vida de prateleira

Bebidas Aromas Bebidas

Carnes e peixes Desenvolvimento de flavors Remoção de gordura, produtos

de carnes e peixes

“Health foods” Transesterificação Produção de alimentos com

apelo nutricional

Gorduras e óleos Transesterificação/ Manteiga de cacau, ácidos

hidrólise graxos, Monoacilgliceróis,
biodiesel

Química Enantiosseletividade, Construção de blocos

síntese quirais

Farmacêutica Transesterificação, Lipídeos específicos,

hidrólise digestivos

Cosméticos Síntese Emulsificantes, umidificantes

Limpeza Hidrólise Remoção de gorduras

Couro Hidrólise Produtos de couro

Fonte: Adaptado de SHARMA; CHISTI; BANERJEE, 2001.

Com relação à especificidade, a literatura relata que é controlada pelas propriedades

moleculares da enzima, pela estrutura do substrato e por fatores que afetam a ligação enzima-
substrato (DE CASTRO et al, 2010). As lipases podem ser classificadas de acordo com sua
especificidade posicional (não específicas ou 1,3-específicas) ou quanto à especificidade por
ácidos graxos (Tabela 3.2). Além disso, as lipases podem apresentar ainda especificidade
estereoquímica, atuando particularmente sobre um dos isômeros ópticos.
A especificidade pelo substrato consiste na capacidade de distinguir as características
estruturais das cadeias dos ácidos graxos, tais como: o comprimento, número, posição ou
configuração das duplas ligações, presença de ramificações, bem como a natureza da cadeia
de ácido graxo (ácido graxo, alquil éster ou glicerol éster). Em reações envolvendo
 26

triacilgliceróis e álcoois, as lipases distinguem também o tamanho e tipo de álcool

empregado na reação (GHAMGUI; KARRA-CHAÂBOUNI; GARGOURI, 2004).

Tabela 3.2. – Classificação de algumas lipases de acordo com sua especificidade

Lipase Atuação Exemplos

Candida rugosa
Penicillium cyclopium,
Catalisam a hidrólise do TAG gerando
Não específicas Staphylococcus aureus
ácidos graxos livres e glicerol, de modo
Corynebacterium acnes,
aleatório.
Pseudomonas fluorescens
Burkholderia cepacia

Mucor miehei
Rhizopus oryzae
Catalisam a hidrolise do TAG gerando
Aspergillus niger
1,3-específicas ácidos graxos livres provenientes
Rhizopus delemar
especificamente das posições sn-1 e sn-3.
Lipase pancreática
Penicillium roqueforti

Ácido graxo Catalisam a hidrólise de tipos específicos

Geotrichum candidum
específicas de ácidos graxos nas moléculas do TAG.

Fonte: DE CASTRO et al., 2010.

3.1.1. Lipase de Burkholderia cepacia

A espécie Burkholderia cepacia é uma bactéria Gram-negativa, aeróbica, que

apresenta uma temperatura ótima de crescimento entre 30 e 35ºC e utiliza mais de 200
compostos como fonte de carbono e energia (PADILHA, 2010). Essas bactérias são
produtoras de lipases extracelulares que apresentam como características elevada atividade
e estabilidade. Apresentam massa molecular de 33 kDa, estabilidade em solventes orgânicos,
estabilidade térmica e em diferentes valores de pH, possuindo um pH ótimo entre 7 e 8.
Lipases de B. cepacia possuem elevado grau de enantiosseletividade, sendo também
utilizada na resolução quiral de racematos, produzindo enantiômeros puros.
Em escala industrial a lipase de B. cepacia é manufaturada pela Amano
Pharmaceuticals (Japão) em formulações enzimáticas disponíveis tanto na forma solúvel
como imobilizada. É obtida por fermentação submersa de uma linhagem selecionada de B.
 27

cepacia, e posteriormente purificada por precipitação com etanol. Apresenta cerca de 25%
de proteína e alguns aditivos ou estabilizantes como dextrinas e CaCl2 (AMANO, 2015).
As lipases obtidas dessa fonte microbiana possuem em seu sítio ativo a presença da
tríade catalítica formada por resíduos de aminoácidos de serina, histidina e aspartato
(JAEGER; REETZ, 1998; AMANO, 2015). As estruturas tridimensionais determinadas por
SCHRAG et al. (1997) da conformação aberta da lipase B. cepacia são favorecidas pela
presença de solventes ou de interface óleo-água. Ao contrário, em condições aquosas a
estrutura fechada é favorecida. Estas estruturas indicam que a ativação interfacial resulta de
uma mudança conformacional na enzima, pela reorganização da estrutura terciária e de um
amplo movimento da tampa hidrofóbica para expor o sítio ativo. A tampa hidrofóbica, por
sua vez, tem seu maior contato com o resto da proteína na conformação fechada por
interações, quase sempre de van der Waals, da hélice α4 com a hélice α9 e as duas fitas β
antiparalelas (Figura 3.2), englobando os resíduos 214-228 da molécula (SCHRAG et al.,
1997; KIM et al., 1997). As fitas β estão representadas como setas em verde e as hélices em
azul. A posição do íon Ca2+ está indicada em amarelo e os resíduos da tríade catalítica estão
mostrados em vermelho.

Figura 3.2. – Representação da estrutura tridimensional da conformação aberta da lipase

de B. cepacia.

Fonte: Adaptado (SCHRAG et al., 1997).

 28

3.2. Imobilização de lipases

O mecanismo de atuação das lipases é bastante complexo e dependente de certas

estruturas típicas das lipases. Além disso, o teor de água tem um efeito primordial em seu
comportamento, afetando diretamente a hidratação da enzima ou indiretamente alterando a
natureza do meio de reação (YAHYA; ANDERSON; MOO-YOUNG, 1998). Quando a água
é substituída por um solvente orgânico, alterações na conformação nativa da enzima podem
ocorrer tanto na estrutura terciária como nas mais proeminentes estruturas secundárias (α-hélice
e a conformação β) acarretando, desta maneira, a sua desestabilização. Com o objetivo de
assegurar uma conformação enzimática cataliticamente ativa em meio orgânico, a molécula de
enzima deve ter uma camada de hidratação definida, separando o solvente do contato com a
superfície da proteína e contribuindo para o aumento da sua flexibilidade interna (DE CASTRO
et al., 2008). Outra maneira de proteger a configuração nativa da enzima é por meio de sua
imobilização em suportes sólidos (ZANIN; MORAES, 2004). A imobilização também auxilia
na dispersão homogênea da enzima no meio, o que é essencial, para a condução de reações
enzimáticas (DE CASTRO et al., 2008). Além disso, a imobilização da enzima tem um efeito
benéfico na sua estabilidade térmica, em função das interações físicas e químicas entre o
suporte e as moléculas da enzima, permitindo ainda a recuperação da enzima do meio
reacional, para uma posterior reutilização (YAHYA; ANDERSON; MOO-YOUNG, 1998;
GUISÁN, 2006).
Existe uma grande diversidade de métodos aplicados na técnica de imobilização de
enzimas, porém, não há nenhum método que seja aplicável para todas as enzimas. Sendo
assim, em cada aplicação de enzima imobilizada é necessário escolher o método mais simples
e de menor custo resultando em uma enzima imobilizada contendo elevada estabilidade
operacional e uma alta retenção de atividade (ZANIN; MORAES, 2004). A enzima pode ser
confinada fisicamente no interior de uma matriz ou ligada ao suporte sólido. O método de
imobilização pode ser classificado quanto ao tipo de interação que é responsável pela ligação
entre a enzima e o suporte, como meios químicos ou físicos. Os métodos para a imobilização
de enzimas podem ser divididos em três categorias: adsorção física num suporte, ligação
covalente em um suporte e encapsulamento (CARVALHO; LIMA; SOARES, 2015), como
ilustrado nas Figuras 3.3 e 3.4.
A adsorção física é um dos métodos mais simples e mais utilizados para imobilizar
enzimas, não alterando facilmente o seu sítio ativo. A enzima é imobilizada em um suporte
 29

sólido por ligações de baixa energia, tais como ligações de hidrogênio, hidrofóbicas e ligação
de van der Waals. Vários materiais podem ser usados nesta técnica e a escolha de cada um
deles irá depender das suas propriedades, como por exemplo, a força mecânica, a
estabilidade física e química, o caráter hidrofóbico/hidrofílico, a capacidade de adsorção de
enzima e o custo (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004; CARVALHO;
LIMA; SOARES, 2015).
A ligação covalente é um método que envolve a modificação química de um resíduo
de aminoácido na superfície do suporte por meio da utilização de agentes bifuncionais para
imobilização eficiente e irreversível da enzima. Isso ocorre por meio da formação de uma
ligação covalente da enzima com um material insolúvel em água, pela fixação da enzima em
uma matriz por ligação covalente ou pela formação de ligações cruzadas numa matriz
(DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004; CARVALHO; LIMA; SOARES,
2015).

Figura 3.3. –Técnica de adsorção física (a) e ligação covalente (b) para a imobilização de
enzimas.

Fonte: Adaptado (CARVALHO; LIMA; SOARES, 2015).

A imobilização via encapsulação baseia-se no “confinamento” da enzima em meio

semipermeável reticulado ou microcápsula. Os meios poliméricos reticulados devem ter
poros pequenos o suficiente para não permitir a passagem das enzimas, mas oferecer
passagem livre aos substratos e produtos. Isso permite que as enzimas permaneçam na
solução, mas que fiquem protegidas de efeitos externos. Apesar da vantagem de não
ocorrência de alteração estrutural da enzima, esse método pode não ser aplicável em alguns
casos, por exemplo, se o substrato da enzima for grande e não passar pelos poros do suporte
(DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004; CARVALHO; LIMA; SOARES,
2015).
 30

Figura 3.4. –Técnica de encapsulação para a imobilização de enzima

Fonte: Adaptado (CARVALHO; LIMA; SOARES, 2015).

3.3. Suportes híbridos utilizados na imobilização de enzimas

O suporte a ser escolhido para a etapa de imobilização de enzimas é responsável por

uma boa contribuição no desempenho desta enzima. Um suporte escolhido minuciosamente
pode aumentar o tempo de meia-vida da enzima imobilizada, enquanto que uma escolha
equivocada pode afetar o desempenho global do processo (ZANIN, MORAES, 2004).
Para selecionar um suporte deve-se ter conhecimento de suas propriedades físicas e
químicas, bem como a possibilidade de reutilização do material. As características mais
importantes a serem observadas na seleção de um suporte são: permeabilidade,
insolubilidade, área superficial, capacidade de regeneração, natureza hidrofóbica ou
hidrofílica, morfologia e composição, resistência ao ataque microbiano, resistência mecânica
e custo. Estes suportes podem ser classificados como orgânicos e inorgânicos, e também de
acordo com a sua morfologia, podendo ser materiais porosos, não porosos e de estrutura de
gel (ZANIN; MORAES, 2004).
Vários trabalhos são encontrados na literatura que tratam das diferentes técnicas de
imobilização de lipases, caracterização dos complexos ativados e aplicações em reações que
se processam em meio aquoso ou não aquoso (SCHMID et al., 2002; SALIS; MONDUZZI;
SOLINAS, 2007). Entretanto, as mais recentes tecnologias de imobilização de enzimas
requerem materiais com propriedades multifuncionais que não são encontradas nos materiais
convencionais. Materiais híbridos orgânico-inorgânico constituem uma alternativa para a
produção de novos materiais multifuncionais, com uma larga faixa de aplicações. Esses
materiais apresentam como vantagens o fato de serem acessíveis e reutilizáveis. A síntese
desses materiais híbridos pode ser alcançada por modificação da estrutura inorgânica com
os componentes orgânicos, obtendo um sistema que consegue combinar a durabilidade e a
estabilidade inorgânica com a plasticidade e as propriedades específicas normalmente
 31

associadas aos materiais orgânicos.

Dentre os materiais híbridos orgânico-inorgânicos podem ser citados os
biocompósitos que são produzidos por meio da biomineralização natural. Nestes materiais,
os minerais inorgânicos são depositados e crescem in situ na matriz polimérica orgânica em
condições moderadas, que controlam o processo de biomineralização envolvendo as etapas
de nucleação, seleção polimorfa, direção do crescimento cristalino e orientação
cristalográfica dos minerais.
Um sistema usado para estudar a deposição dos minerais inorgânicos in situ em uma
matriz polimérica orgânica é o processo sol-gel, sendo este, o mais empregado. Os materiais
de partida utilizados no processo sol-gel incluem alcóxidos metálicos, Me(OR)n, e uma
pequena porção de ácidos ou bases como catalisador (JOSÉ; PRADO, 2005; TODOROVA;
CHERNEV; DJAMBAZOV, 2014; YANO; IWATA; KURITA, 1998).

3.3.1. Processo sol-gel

A técnica sol-gel pode ser definida como uma rota de preparação de um material
inorgânico, a partir de reações de precursores moleculares em solução resultando materiais
com novas características, apresentando como vantagens baixo custo, fácil preparação e
equipamentos acessíveis (TODOROVA; CHERNEV; DJAMBAZOV, 2014). A Figura 3.5
mostra um esquema de obtenção destes materiais pela técnica sol-gel.

Figura 3.5. – Processo e produtos obtidos pela técnica sol-gel

Fonte: Adaptado (MAURITZ, 1998).

 32

O processo sol-gel envolve o controle de muitas variáveis, tais como o tempo, a

temperatura da reação, a concentração dos reagentes, a natureza do catalisador, o iniciador
da reação de polimerização (HCl, HBr, HF, NH OH). Essas variáveis determinam as
4

características finais do material, incluindo a densidade de reticulação, homogeneidade do

produto, porcentagem de hidrólise e condensação de grupos reativos. Além disso, podem-se
utilizar aditivos químicos (polietilenoglicol (PEG), polivinilálcool (PVA), líquidos iônicos e
albumina) com a finalidade de melhorar o rendimento do processo e obter materiais com
melhores propriedades estruturais refletindo em melhor estabilidade térmica e química da
enzima, possibilitando assim, modificações no controle de porosidade, nas propriedades
mecânicas e um ajuste no balanço hidrofílico/hidrofóbico (PAULA et al., 2007; FICANHA
et al., 2015). Como o processo sol-gel ocorre em condições amenas de temperatura e pressão
atmosférica, polímeros orgânicos instáveis termicamente podem ser incorporados com
materiais inorgânicos para a obtenção de híbridos orgânico-inorgânicos (YANO; IWATA;
KURITA, 1998).
Vários compostos orgânicos podem ser empregados na síntese destas matrizes,
porém os biopolímeros são considerados como os mais promissores por possuírem baixo
custo, biocompatibilidade, baixa toxicidade e propriedades multifuncionais (SMITHA et al.,
2008). Os precursores mais comumente utilizados são os silicatos, entre os quais, o mais
estudado é o tetraetilortossilicato (TEOS) (JOSÉ; PRADO, 2005).
Os silicatos são componentes inorgânicos que podem ser facilmente transformados,
por meio de um precursor, em monólitos, matrizes porosas, filmes ou película para
revestimentos. Esses materiais apresentam uma alta elasticidade térmica e podem suportar
elevadas pressões assim como a habilidade de suportar meios e materiais externos agressivos
(TODOROVA; CHERNEV; DJAMBAZOV, 2014).
A química da técnica sol-gel tem como base reações de polimerização inorgânica,
sendo um processo relativamente simples envolvendo uma reação composta por três etapas
(INGERSOLL; BRIGHT, 1997; YANO; IWATA; KURITA, 1998).
Na primeira etapa, tem-se a hidrólise de um alcóxido, podendo este ser um metal ou
um semi-metal levando assim a formação do produto hidroxilado e do álcool correspondente,
conforme mostrado na reação 3.1:

Me(OR) + H O → Me( ) (OH) + ROH 3.1

Em que:
 33

Me = Na, Ba, Cu, Al, Si, Ti, Ge, V, W, Y;

R = CH3, C2C5, C3H7, C4H9,..., CnH2n+1.

Na segunda etapa, ocorre uma condensação entre um grupo não hidrolisado

pertencente ao alcóxido e um grupo hidroxila, ou entre dois grupos de hidroxila, gerando
uma formação de uma mistura coloidal, conhecida como sol, conforme mostrado nas reações
3.2 e 3.3:

MeOR + HOMe– →– MeOMe– +ROH 3.2

MeOH + HOMe– →– MeOMe– +H 3.3

Na terceira etapa, ocorre a policondensação dos colóides, acompanhados por uma

reticulação, formando assim uma rede tridimensional vítrea e porosa (AVNIR et al., 2006;
NOUREDDINI; GAO, 2007).
A biocompatibilidade de precursores silanos como o TEOS, com diferentes
biopolímeros tais como quitosana (SIMÕES et al., 2011; SILVA et al., 2011b), celulose
(XIE; YU; SHI, 2009), álcool polivinílico (PAULA et al., 2008; SANTOS et al., 2008b) e
carragenana (SHCHIPUNOV, 2003) é amplamente reportada na literatura.
Para o desenvolvimento deste trabalho foram selecionados três compostos orgânicos:
β-ciclodextrina (βCD); carboximetilcelulose (CMC) e hidroxietilcelulose (HEC) para
formação do suporte híbrido. Os resultados obtidos foram comparados com aqueles
reportados utilizando álcool polivinílico como componente orgânico.

3.3.2. Suporte híbrido polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA)

O álcool polivinílico (PVA) possui uma estrutura química relativamente simples com
grupos de hidroxilas nas laterais. O monômero, álcool vinílico, não existe em uma forma
estável sendo rearranjado para o seu tautômero, acetaldeído. Sendo assim, o PVA é
produzido por polimerização do acetato vinílico para acetato polivinílico (PVAc), seguido
da hidrólise do PVAc em PVA, conforme esquematizado na Figura 3.6 (HASSAN; PEPPAS,
2000).
 34

Figura 3.6. – Processo de formação do PVA

Fonte: Adaptado de HASSAN; PEPPAS, 2000.

O PVA é um dos polímeros mais utilizados devido as suas excelentes propriedades

mecânicas. Sua solubilidade em água irá depender do grau de hidrólise e de polimerização.
Usualmente o PVA com um grau de hidrólise igual ou maior a 98,5% pode ser dissolvido
em água a 70°C, sendo esta, a prática mais comum no preparo desta solução (WANG;
TURHAN; GUNASEKARAN, 2004).
O suporte de polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) é uma matriz híbrida
obtida pela técnica sol-gel, a partir do componente de tetraetilortossilicato (TEOS) e álcool
polivinílico (PVA). A reação de polimerização sol-gel para a formação da matriz de SiO2-
PVA pode ser dividida em três etapas como mostra a Figura 3.7 (SANTOS et al., 2008a).
 35

Figura 3.7. – Esquema de reações envolvidas na preparação da matriz híbrida de SiO2-

PVA.

Etapa 1 – Hidrólise
ROH
OR OR
OR Si OR H2O OR Si OH
OR catalisador ácido OR
n n

Etapa 2 – Condensação

Alternativa I
H2O
OR OR
HO Si OR
OR Si OR
OR
OR O
Alternativa II
OR Si OH H2O OR
OR OR
OR Si
n
OR Si OH
OR OR
n
n

Etapa 3 – Formação da matriz híbrida de SiO2-PVA

OR

Si OR
OR
O O OH OH OH OH
OH
OR n n
OR
Si C O
CH3
OR
n

OH O OH O O OH O OH
n n
C O RO Si O Si RO Si O Si
CH3 OR OR OR OR

matriz híbrida de SiO2-PVA

Fonte: SANTOS et al, 2008a.

A matriz híbrida constituída de polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) tem

sido testada com sucesso para imobilização de diferentes fontes de lipase, incluindo pâncreas
de porco (PAULA et al., 2007), Mucor miehei (BRUNO et al., 2005), Pseudomonas
fluorescens (SANTOS et al., 2008b), Candida rugosa (PAULA et al., 2008), Burkholderia
cepacia (FREITAS et al., 2009), Rhizopus oryzae (PAULA et al., 2010) e Penicillium
camembertii (FREITAS et al., 2010; MENDES et al., 2011).
 36

3.3.3. Suporte hibrido SiO2-β-Ciclodextrina (SiO2-βCD)

As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos, podendo ser constituídos por um

número variável de unidades de glicose, que são obtidos pela ação da enzima ciclodextrina-
α-glicosiltransferase (CGTase), sobre o amido (SZEJTLI, 1994). As ciclodextrinas mais
comuns apresentam entre seis e oito unidades de D (+)-glicopiranose unidas por ligações α
(1,4) e são denominadas de α-(6 unidades), β-(7 unidades) e γ-(8 unidades) ciclodextrinas
(OZMEN; SEZGIN; YILMAZ, 2009).
Para a obtenção das ciclodextrinas naturais, é necessário adotar uma série de etapas,
iniciando pelo cultivo do microrganismo que irá produzir a CGTase, seguida da separação e
purificação da enzima obtida. A enzima CGTase obtida promove a degradação enzimática
do amido fornecendo uma mistura de dextrinas e por fim a separação, purificação e
cristalização das ciclodextrinas (SALTÃO; VEIGA, 2001). As Figuras 3.8 e 3.9 mostram a
estrutura tronco-cônica e molecular das ciclodextrinas.
Dentre as características mais importantes das ciclodextrinas, podem ser citadas a
presença de uma cavidade que irá permitir a formação de complexos de inclusão. Com isto,
pode-se alterar a solubilidade de fármacos, aumentar a estabilidade, modelar a velocidade
de dissolução e proteger as mucosas da irritação causada por determinados fármacos
(SALTÃO; VEIGA, 2001).

Figura 3.8. – Representação esquemática da β -ciclodextrina

Fonte: Adaptado (SZEJTLI, 1990).

 37

Figura 3.9. – Representação esquemática das ciclodextrinas

OH OH OH
O
OH O
O OH O
O O
OH OH
HO
O O OH O
HO O OH O
OH HO
O
HO OH
HO O
HO O HO OH OH HO
OH HO O OH
O O HO O
HO HO
OH OH
OH
HO O
HO O O O OH
O OH O
OH HO OH
OH
OH OH O O
O OH
HO O
OH OH
O OH HO HO OH
OH HO HO O O
O O HO OH HO OH HO
HO O OH
HO O O O O
O O
O OH
O HO
HO
HO

α- Ciclodextrina β- Ciclodextrina γ- Ciclodextrina

Fonte: Adaptado (OZMEN; SEZGIN; YILMAZ, 2009).

O suporte de SiO2-βCD é uma matriz híbrida, obtida pela técnica sol-gel, a partir do
componente de tetraetilortossilicato (TEOS) e β-ciclodextrina (βCD). A reação de
polimerização sol-gel para a formação da matriz de SiO2-βCD é esquematizada na Figura
3.10, tomando por base o mecanismo sugerido por TEIXEIRA, 2011.

Figura 3.10. – Esquema das reações envolvidas na preparação da matriz híbrida de SiO2-
βCD.
OH O OH O
O OH O OH
OH OH
HO O O HO O
O O
HO HO
O OH O OH
HO OH OH
O O O

HO O
O OR O OR
HO O Cl HO
O O Si OR O O Si OR
-HCl O
OH HO OH HO

OH O OH O O
O O O
OH OH
Si O HO Si
HO O OH HO O O HO OH O
HO OR
OR
O O O O O
O O
HO HO

OH O
O OH Enzima
OH
O O NH2
O HO
HO
O OH
OH
O O

O Enzima O
O OR
O HN OH O Si OR
CHOH
HO
O
OH O O
O
OH
O HO Si
O HO OH O
Enzima OR
O O
HN OH
O
HO

Fonte: Adaptado (TEIXEIRA, 2011).

 38

3.3.4. Suporte híbrido SiO2-Carboximetilcelulose (SiO2-CMC)

A celulose é usualmente convertida em derivados por esterificação. Entre esses

derivados, a carboximetilcelulose (CMC), um biopolímero aniônico, é normalmente
comercializado como sal de sódio. É incolor, inodoro, atóxico e em função de seu baixo
custo é considerado o mais importante derivado da celulose solúvel em água (BONO et al.,
2009; SILVA et al., 2011a).
Existem duas principais reações para converter a celulose em carboximetilcelulose:
o primeiro procedimento é a reação de alcalinização entre a celulose e a soda cáustica
formando o álcali de celulose e a segunda reação é seguida por carboximetilação, que é a
reação entre o álcali com o ácido monocloroacético (SAPUTRA; QADHAYNA;
PITALOKA, 2014). A Figura 3.11 ilustra o esquema de formação da carboximetilcelulose.

Figura 3.11. – Mecanismo de formação da carboximetilcelulose

Fonte: Adaptado (CERRUTTI; FROLLINI, 2009).

A CMC pode ser encontrada de várias maneiras, dependendo do grau de substituição,

do tamanho das partículas, viscosidade e características de hidratação, apresentando
estabilidade em pH ácido. Esse composto apresenta diversas aplicações, como por exemplo,
na indústria alimentícia, de cosméticos, farmacêutica e na fabricação de detergentes (BONO
et al., 2009; SILVA et al., 2011a).
O suporte de SiO2-CMC é uma matriz híbrida, obtida pela técnica sol-gel, a partir do
componente de tetraetilortossilicato (TEOS) e carboximetilcelulose (CMC). O mecanismo
da reação de polimerização sol-gel para a formação da matriz de SiO2-CMC é proposto
conforme esquematizado na Figura 3.12, tomando por base o mecanismo adotado para
formação do hibrido TEOS/ quitosana (SILVA et al., 2011b).
 39

Figura 3.12. – Esquema de reações envolvidas na preparação da matriz híbrida de SiO2-

CMC.

E ta p a 1 - h id ró lis e
H
n S i(O C 2H 5 )4+ H 2 O n S i(O C 2H 5)3O H + C 2H 5O H

E ta p a 2 - p o lic o n d e n s a ç ã o

O O
n S i(O C 2H 5 )3 O H + n S i(O C 2 H 5)4 O Si O Si O + n RO H
O O
n

O O
n S i(O C 2 H 5)3 O H O Si O Si O + n H 2O
O O
n

Etapa 3 – Formação da matriz híbrida de SiO2-CMC

OH
H C H 2O C H 2O O N a OH H
H H
H O + m S i (O C H 2 H 5 )4
O H O
H H O
OH H C H 2O C H 2O O N a
H
OH
n
HCl
-

O
O Si O
OH
OH
OH
O
O O
C H 2O C H 2 O O N a
O O OH
OH OH O
-

HO
N aO O C H 2O H 2C O Si O
O
O CH2 O O
O
C O - N a+
O
H
O
-

O O
OH OH O Si O
O Si O
O O O
O C H 2O C H 2 O O N a

O
O Si O
O

Fonte: Adaptado (SILVA et al., 2011b).

 40

3.3.5. Suporte híbrido SiO2-Hidroxietilcelulose (SiO2-HEC)

A hidroxietilcelulose (HEC) assim como a carboximetilcelulose (CMC), é um dos

muitos derivados da celulose. A HEC é um polímero solúvel em água e não iônico.
Apresenta como características a capacidade de suspender, espessar, emulsificar, aglutinar,
estabilizar, formar películas, de dispersar e de reter a água (MACHADO et al., 2009).
Existem duas reações para a conversão da celulose em hidroxietilcelulose (HEC).
Primeiro ocorre à alcalinização da celulose, sendo esta intumescida com hidróxido de sódio
e gerando a álcali celulose, esta então reage com o óxido de etileno gerando assim o éster de
HEC. Neste processo os átomos de hidrogênio pertencentes aos grupos hidroxilas da
molécula da celulose são substituídos por grupos hidroxietil, conferindo a nova molécula, a
solubilidade em água (MACHADO et al., 2009). A Figura 3.13 mostra a formação do
composto de hidroxietilcelulose.

Figura 3.13. – Mecanismo de formação do hidroxietilcelulose

( , )
[C H O (OH) ] + C H O !!!!!!!" [C H (OH) (OC H OH)]

Fonte: Adaptado (GLOOR; MAHLMAN; ULLRICH, 1950).

A HEC apresenta várias aplicações industriais, sendo utilizada principalmente na

indústria farmacêutica, podendo ser utilizado também como agente espessante na área da
oftalmologia, sendo usado em preparações de lente de contato. Também pode ser usada
como agente revestimento de película na confecção dos tablets (ROWE; SHESKEY;
OWEN, 2006).
O suporte de SiO2-HEC é uma matriz híbrida, obtida pela técnica sol-gel, a partir do
componente de tetraetilortossilicato (TEOS) e hidroxietilcelulose (HEC). A reação de
polimerização sol-gel para a formação da matriz de SiO2-HEC é esquematizada na Figura
3.14, tomando por base o mecanismo proposto para formação do hibrido TEOS/ quitosana
(SILVA et al., 2011b).
 41

Figura 3.14. – Esquema de reações envolvidas na preparação da matriz híbrida de SiO2-

HEC.

E ta p a 1 - h id ró lis e
H
n S i(O C 2H 5)4+ H 2O n S i(O C 2 H 5 )3 O H + C 2 H 5O H

E ta p a 2 - p o lic o n d e n s a ç ã o

O O
n S i(O C 2H 5)3O H + n S i(O C 2H 5)4 O Si O Si O + n RO H
O O
n

O O
n S i(O C 2H 5)3O H O Si O Si O + n H 2O
O O
n

Etapa 3 – Formação da matriz híbrida de SiO2-HEC

OH
CH 2O(CH 2) 2O(CH 2 )2 OH
H OH H
H H
H O m Si (OCH 2H 5 )4
O H O +
H H O
H
H OH CH 2O(CH 2 )2 O(CH 2) 2OH
OH
n
HCl
-

O
O Si O
OH
OH
OH
O
O O
CH 2O(CH 2) 2O(CH 2 )2 OH
O O OH O
-

OH OH HO O Si O
HO(CH 2) 2O(CH 2 )2 OH 2C
O O
O CH 2 O
O O
(CH 2)2
O
(CH 2)2
O O
-

OH OH OH
O Si O
H O O O
O CH 2 O(CH 2) 2O(CH 2) 2OH
O Si O
O
O
O Si O
O

Fonte: Adaptado (SILVA et al., 2011b).

 42

3.3.6. Utilização de matrizes híbridas como suporte de imobilização da enzima lipase

A matriz de polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) tem sido amplamente

investigada como suporte de imobilização de diferentes enzimas, em particular da enzima
lipase. Os trabalhos desenvolvidos abrangem testes de modificação da estrutura da matriz
com diversos agentes de ativação como glutaraldeído (PAULA et al, 2008), epicloridrina
(SANTOS et al, 2008a) e metaperiodato (PAULA et al, 2010). As propriedades estruturais
e morfológicas dessa matriz também já foram comprovadas nos testes referentes a eficiência
de imobilização de diferentes fontes de lipase, tais como Candida rugosa (PAULA et al,
2007), lipase de pâncreas de porco (PAULA et al, 2007), lipases bacterianas como
Pseudomonas fluorescens (MOREIRA, 2007) e Burkholderia cepacia (FREITAS et al,
2009; DA RÓS et al, 2010), lipases fúngicas como Penicillium camberteti (FREITAS et al,
2010) e Rhizopus orizae (PAULA et al, 2010), resultando em derivados imobilizados com
elevada atividade catalítica para mediar reações típicas da lipase em regime descontínuo,
incluindo etanólise e glicerólise de óleos vegetais (FREITAS et al, 2009), esterificação de
carboidratos (RUFINO et al, 2010) e interesterificação da gordura do leite com óleos
vegetais (PAULA et al, 2010).
Apesar deste bom desempenho, limitações foram constatadas quando os derivados
imobilizados em suporte SIO2-PVA foram usados para mediar reações de transesterificação
de óleo vegetal com etanol em reator de leito operando em fluxo contínuo. Nesse tipo de
processo, principalmente quando o reator estiver operando em baixa vazão de substrato, foi
verificado que o glicerol formado como subproduto foi incorporado ao biocatalisador
imobilizado, diminuindo o coeficiente de partição entre o substrato e a superfície da lipase,
ocasionando redução da atividade enzimática. O fenômeno envolvido nesta perda de
atividade é atribuído à formação de uma barreira hidrofílica em torno da lipase, resultando
em limitações de difusão do substrato hidrofóbico da fase orgânica para a enzima. Para
contornar essas limitações diferentes estratégias já foram pesquisadas (DORS et al, 2012;
COSTA-SILVA, 2013).
Dors et al (2012) avaliaram a produção de biodiesel por meio da reação de
transesterificação do óleo de palma com etanol utilizando como biocatalisador lipase de
Pseudomonas fluorescens imobilizada em SiO2-PVA. Para reduzir a afinidade do suporte
pelo glicerol, o reator foi alimentado com substrato (óleo de palma e etanol, razão molar 1:9)
na presença de solvente (terc-butanol) ou emulsificante (Triton 100X). A utilização de terc-
 43

butanol como solvente (30% em relação ao meio reacional) mostrou ser a estratégia mais
adequada para aumentar a formação dos ésteres de etila. Este melhor desempenho foi
atribuído não apenas a miscibilidade dos materiais de partida (óleo e etanol), mas também
às propriedades específicas do terc-butanol, que por ser um solvente polar moderado foi
capaz de dissolver os produtos formados (ésteres de etila) e subproduto liberado (glicerol).
Isso permitiu manter estável a operação do reator em relação à concentração do éster sob
condição de estado estacionário por até 10 dias, minimizando a diminuição da concentração
do produto, como resultado da perda de atividade da enzima.
Apesar da eficiência dessa técnica, o uso de solventes reduz a produtividade global
do sistema e aumenta o custo do processo, pois requer temperaturas mais elevadas para
recuperação do terc-butanol.
Costa-silva, 2013 investigou uma estratégia diferente para reduzir a adsorção do
glicerol no sistema imobilizado (B. cepacia imobilizada em SiO2-PVA) em processos de
transesterificação em reator de leito fixo operando fluxo contínuo. Para tanto, adotou a
incorporação de uma coluna extratora de glicerol em reator de leito fixo em dois estágios
operando com substrato óleo de coco e etanol (razão molar 1:12) na ausência de solvente. A
coluna extratora de glicerol foi recheada com a resina catiônica Lewatit GF 202,
especialmente desenvolvida para a purificação do biodiesel removendo glicerol,
monoglicerídeos, sais e sabão. O sistema forneceu concentração em ésteres de etila na faixa
de 58,10±2,08 (g.g-1), correspondendo a rendimentos médios de transesterificação de
98±3,45 e produtividade na faixa de 41,54±1,51 mgéster.g-1meio.h-1. As amostras de biodiesel
de óleo de coco purificadas apresentaram viscosidade cinemática média a 40°C de 5,32 ±
0,74 mm2.s-1, valor que atende a norma americana ASTM (D6751) e a brasileira pela
resolução ANP n°42/04. A lipase apresentou tempos de meia-vida superior a 500 h,
demonstrando satisfatória estabilidade operacional. O emprego de uma configuração de
reatores de leito fixo em série pode elevar os níveis de rendimento de transesterificação,
aumentar a produtividade de biodiesel, por consequência reduzir o custo global do processo.
Os resultados obtidos demonstram a viabilidade técnica da síntese enzimática de biodiesel
em reatores de leito fixo conectados em série, incorporando uma coluna extratora de glicerol.
Desta forma, verifica-se que a elevada afinidade do glicerol pelo suporte de
imobilização SiO2-PVA é uma limitação para se obter uma operação estável em reatores de
leito operando em fluxo contínuo. A substituição do PVA por molécula orgânica com menor
poder hidrofílico poderá amenizar as limitações difusionais e a inativação da lipase
 44

imobilizada no leito catalítico e permitir o alcance de elevadas taxas de conversão por um

maior período de tempo.
Entre os compostos orgânicos propostos para desenvolvimento neste trabalho, apenas
a β–Ciclodextrina já foi explorada para obtenção do híbrido SiO2-β–Ciclodextrina (SiO2-
βCD) e utilizada como suporte para imobilizar a lipase B. cepacia (TEIXEIRA, 2011). A
eficiência do biocatalisador foi testada com sucesso na síntese de biodiesel a partir do óleo
de babaçu em processo descontínuo.

3.4. Biodiesel

Problemas ambientais e aumento de custos associados aos combustíveis fósseis vêm

estimulando a investigação de fontes alternativas de energia, como aquelas de origem
renovável. Os biocombustíveis, que utilizam biomassa para a sua produção, como óleos
vegetais, são um exemplo da categoria. Porém, óleos vegetais não podem ser diretamente
queimados em motores diesel modernos, devido à elevada viscosidade, densidade, massa
molecular e gravidade específica. Assim, são necessárias modificações químicas para uso
desses materiais, com a conversão de triglicerídeos em ésteres alquílicos de ácidos graxos,
componentes do biodiesel (DUPONT et al., 2009; SHAHID; JAMAL, 2011).
A produção de biodiesel conta com uma ampla variedade de óleos vegetais,
comestíveis ou não comestíveis, com diferentes composições em ácidos graxos. Óleos
comestíveis, como os de canola, de soja, de girassol e de milho têm sido utilizados para a
síntese de biodiesel, alcançando perfis favoráveis para substituição parcial ou total do diesel
mineral. Óleos extraídos de fontes vegetais não comestíveis, a exemplo do pinhão-manso,
vêm sendo considerados igualmente adequados (KOH; MOHD-GHAZI, 2011).
O biodiesel é interessante por várias razões, como toxicidade mínima e alta
biodegradabilidade, podendo substituir o petrodiesel em diversas aplicações, tais como
motores de combustão interna e caldeiras, sem grandes modificações. Contém vantagens
como a diminuição da produção de material particulado e de emissões de monóxido de
carbono, dado que sua combustão é menos incompleta. Seu teor de enxofre é mínimo se
comparado ao diesel mineral e uma propriedade lubrificante mais acentuada que o
combustível de origem fóssil é também notada. A Tabela 3.3 lista os países com maior
potencial de produção de biodiesel (ATABANI et al., 2012).
 45

Tabela 3.3. – Os dez países com maior potencial mundial de produção de biodiesel.

Potencial para produção de

Colocação País
biodiesel (L.106)
1 Malásia 14540
2 Indonésia 7595
3 Argentina 5255
4 EUA 3212
5 Brasil 2567
6 Países Baixos 2496
7 Alemanha 2024
8 Filipinas 1234
9 Bélgica 1213
10 Espanha 1073
Fonte: Adaptado (ATABANI et al., 2012).

Entretanto, deve ser observado que o biodiesel na forma pura possui algumas
desvantagens com relação ao diesel mineral, como menor poder calorífico, maior densidade
em baixas temperaturas, aumento de emissões de óxidos de nitrogênio, além de requerer
melhorias com relação à estabilidade oxidativa, impedindo a deterioração do produto com o
tempo (SHARMA; SINGH, 2009).
Desde janeiro de 2005, pela lei 11.097/05, distribuidoras e refinarias brasileiras
foram autorizadas a adicionar 2% de biodiesel ao diesel (B2). Este percentual passou a ser
obrigatório em 2008 e, devido ao crescimento da oferta, o governo tornou a mistura de 7%
de biodiesel ao diesel (B7) obrigatória em 2014. Entre 2005 e 2012, após a criação do PNPB
(Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel), houve um aumento expressivo no
volume de biodiesel produzido no país conforme ilustrado na Figura 3.15 (ANP, 2014;
PADULA et al., 2012; SOUZA; SEABRA, 2013).
 46

Figura 3.15. – Evolução da produção de biodiesel no mundo entre 2000 a 2012.

Legenda: Barra cinza escuro: Produção global; Barra cinza claro: Produção brasileira.
Fonte: ANP (2014)

Especificações físico-químicas para o biodiesel (a exemplo de ponto de ebulição,

número de cetano, viscosidade cinemática e índice de acidez) são agrupadas em normas. Em
território nacional, esta regulamentação é realizada pela Resolução 14/2012 da ANP. No
continente europeu, a norma que determina a qualidade do biodiesel é denominada EN
14214, enquanto que nos Estados Unidos, a norma que contém esta função tem a designação
de ASTM 6751 D (DABDOUB; BRONZEL; RAMPIN, 2009). A fim de maximizar o
aproveitamento de fontes vegetais nacionais, a especificação brasileira é flexível em alguns
itens, nos quais são necessárias apenas anotações para referência, como listado na Tabela
3.4.
 47

Tabela 3.4. – Especificações do biodiesel estabelecidas pela Resolução 14/2012 (ANP).

Característica Unidade Limite Método

ABNT ASTM D EN/ISSO
NBR
Aspecto - LII - - -
Massa específica a 20º C kg/m3 850-900 7148 1298 EN ISO 3675
14065 4052 EN ISO 12185
Viscosidade cinemática a mm2/s 3,0-6,0 10441 445 EN ISO 3104
40ºC
Teor de água, máx. mg/kg 350 - 6304 EN ISO 12937
Contaminação total, máx. mg/kg 24 - - EN ISO 12662
Ponto de fulgor, mín. ºC 100,0 14598 93 EN ISO 3679
Teor de éster, mín. % massa 96,5 15342 - EN 14103
Resíduo de carbono % massa 0,050 - 4530 -
Cinzas sulfatadas, máx. % massa 0,020 6294 874 EN ISO 3987
Enxofre total, máx. mg/kg 10 5453 EN ISO 20846
EN ISO 20884
Sódio + potássio, máx. mg/kg 5 15554 - EN 14108
15555 EN 14109
15553 EN 14538
15556
Cálcio + magnésio, máx. mg/kg 5 15553 - EN 14538
15556
Fósforo, máx. mg/kg 10 15553 4951 EN 14107
Corrosividade ao cobre, 3h - 1 14359 130 EN ISO 2160
a 50ºC, máx.
Número de cetano - Anotar - 613 EN ISO 5165
6890
Ponto de entupimento de ºC 5-19 14747 6371 EN 116
filtro a frio, máx.
Índice de acidez, máx. mg KOH/g 0,50 14448 664 EN 14104

Glicerol livre, máx. % massa 0,02 15341 6584 EN 14105

EN 14106
Glicerol total, máx. % massa 0,25 15344 6584 EN 14105

Monoacilglicerol, máx. % massa 0,80 15342 6584 EN 14105

15344
15908
Diacilglicerol, máx. % massa 0,20 15342 6584 EN 14105
15344
15908
Triacilglicerol, máx. % massa 0,20 15342 6584 EN 14105
15344
15908
Metanol e/ou etanol, máx. % massa 0,20 15343 - EN 14110
Índice de iodo g/100g Anotar - - EN 14111
Estabilidade à oxidação a h 6 - - EN 14112
110ºC, mín. EN 15751
Fonte: ANP (2015).
 48

3.5. Matérias-primas para a produção de biodiesel

No Brasil, 85,81% do biodiesel produzido em escala industrial é derivado do óleo de

soja. Entretanto, o óleo de soja está inserido na cadeia alimentícia, o que leva a busca de
matérias-primas alternativas para a produção de biodiesel, como os óleos vegetais de
andiroba, babaçu, coco, macaúba, palma, pinhão-manso e gorduras residuais como sebo
bovino. A potencialidade nacional quanto à produção de óleos vegetais é garantida pela
diversidade de culturas que podem ser produzidas no país (OLIVEIRA; MANTOVANI,
2009).
As práticas agrícolas adotadas no cultivo das espécies produtoras de biodiesel são
aspectos determinantes da eficiência econômica e energética do processo de obtenção de
biodiesel. Devido à diversidade climática e a grande extensão territorial, diversas culturas
são indicadas para a síntese de biodiesel no país, conforme mostrado na Tabela 3.5 que lista
algumas dessas espécies, bem como o potencial produtivo de cada uma.

Tabela 3.5. – Características das principais culturas oleaginosas no Brasil.

Espécie Origem do Teor de óleo Meses de colheita Rendimento
óleo (%) por ano (t de óleo/ ha)
Dendê Polpa do fruto 22 12 3-6
Coco Fruto 55-60 12 1,3-1,9
Babaçu Amêndoa 66 12 0,1-0,3
Girassol Grão 38-48 3 0,5-0,9
Canola Grão 40-48 3 0,5-0,9
Amendoim Grão 40-43 3 0,6-0,8
Palmiste Amêndoa 40 12 0,39
Soja Grão 18 3 0,2-0,4
Algodão Grão 15 3 0,1-0,2
Fonte: Adaptado (SILVA; FREITAS, 2008; AGROPALMA, 2012).

O óleo de palmiste apresenta como vantagem o fato de que seu fruto, a palma,
apresenta uma cultura perene e com colheita contínua durante todo o ano. Isso diminui os
dispêndios energético e financeiro para a produção dessa espécie e evita a sazonalidade do
fornecimento de matéria-prima, um bônus imenso em relação aos cultivos anuais (SILVA;
FREITAS, 2008).
A maior parte da área plantada da palmeira situa-se na Ásia (Indonésia, Malásia) e,
o restante, distribuída entre África, América Latina e Caribe. A Indonésia é destacada como
o maior produtor mundial do óleo de palmiste, seguida pela Malásia e Nigéria. A Tabela 3.6
lista os principais países produtores do óleo de palmiste.
 49

Tabela 3.6. – Principais países produtores do óleo de palmiste, em 2014.

País Produção (toneladas)
Indonésia 3.800,00
Malásia 2.350,00
Nigéria 330,00
Tailândia 180,00
Colômbia 108,00
Papua e Nova guiné 60,00
Equador 55,00
Camarões 50,00
Honduras 50,00
Gana 44,00
Brasil 42,00
Fonte: USDA, 2014.

O cultivo da palma é muito dependente de características climáticas, principalmente

da temperatura (deve apresentar um valor entre 25-28ºC) e da umidade relativa do ar
(umidade em torno de 75-90%) (BASTOS et al., 2001). Sendo assim, as principais
plantações e produções se concentram na região Norte do Brasil, principalmente nos estados
do Pará e do Amazonas, assim como na faixa litorânea do estado da Bahia. Favorecida pelas
condições de tropicalidade climática, ambas as regiões detêm praticamente toda a produção
da palma brasileira (Tabela 3.7) (SOUZA, 2012).

Tabela 3.7. – Área plantada com palma no Brasil

Estado do Brasil Área plantada (ha)
Paráa 180.000,00
b
Bahia 5.800,00
Amazonasb 2.400,00
a b
Dados referentes ao ano de 2013. Dados referentes ao ano de 2008
Fonte: ABIOVE, 2013; SOUZA, 2012.

A palmeira é uma planta monóica que produz (para cada árvore) cachos pesando
entre 10 e 25 kg contendo entre 1000 até 3000 frutos por cacho. Os frutos apresentam
conformação esférica e coloração roxa (quase preta) e sua cor se torna laranja-avermelhada
quando está madura. Cada fruto consiste em uma semente envolvida em uma casca cercada
por um mesocarpo.
 50

A palmeira começa a dar frutos com 30 meses depois de plantada e irá continuar
produzindo frutos pelos próximos 20-30 anos, garantindo assim o fornecimento de óleo. A
palmeira apresenta o cultivo mais eficiente do mundo, no que diz respeito a produção de
óleo vegetal, necessita apenas de 0,26 hectares de área plantada para produzir 1 tonelada de
óleo vegetal, enquanto que a soja, o girassol e a colza requerem 2,22; 2 e 1,52 hectares
respectivamente, para produzir a mesma quantidade. O fruto da palma produz dois tipos de
óleos: do mesocarpo é extraído o óleo de palma e da amêndoa é extraído o óleo de palmiste
(MPOC, 2015).
Quanto ao processo de extração do óleo de palmiste, inicialmente tem-se a quebra do
fruto da palma por meio de um quebra-nozes obtendo assim uma mistura de mesocarpo e a
amêndoa do fruto. Após esta etapa, a separação da mistura mesocarpo e amêndoa do fruto é
realizada por meio de um banho de argila. A densidade da mistura tem que ser suficiente
para que a casca (mesocarpo) afunde e a amêndoa flutue no topo da mistura. As amêndoas
são então colocadas em cestas e lavadas com água limpa, sendo na sequencia levadas para a
etapa de secagem. Em seguida, as amêndoas são esmagadas e a pasta resultante é misturada
com uma pequena proporção de água e submetida a aquecimento liberando assim o óleo de
palmiste (FAO, 2002).
Em função da possibilidade de cultivo de diferentes oleaginosas no Brasil e, sabendo,
a priori, que a qualidade do biodiesel depende da matéria-prima precursora, selecionou-se
para a execução do presente trabalho, o óleo de palmiste como matéria-prima lipídica que
apresenta composição rica em ácidos graxos saturados, conforme indicado na Tabela 3.8.

Tabela 3.8. – Composição em ácidos graxos do óleo de palmiste.

Ácido graxo Composição
(% em peso)
Ácido caprílico 4,4
Ácido cáprico 3,7
Ácido láurico 48,3
Ácido mirístico 15,6
Ácido palmítico 7,8
Ácido esteárico 2,0
Ácido oleico 15,1
Ácido linoleico 2,7
Fonte: Adaptado (MPOC, 2015).
 51

3.6. Tecnologias de produção de biodiesel

3.6.1 Transesterificação

A produção de biodiesel mais amplamente empregada na indústria se baseia na

reação de alcoólise, também denominada transesterificação, de óleos vegetais com um álcool
de cadeia curta (metanol ou etanol) na presença de catalisadores.
A transesterificação é considerada a melhor rota para a utilização dos óleos vegetais
como alternativa ao diesel fóssil, pois confere ao produto (biodiesel) características como
viscosidade e índice de cetano muito próximas às apresentadas no diesel. Os óleos e gorduras
quando submetidos ao processo de transesterificação sofrem quedas bruscas nos valores do
ponto de névoa e viscosidade, podendo assim o combustível obtido ser queimado
diretamente em motores diesel sem a necessidade de adaptação (FUKUDA; KONDO;
NODA, 2001).
Para a obtenção de um biocombustível de alta qualidade, algumas características
técnicas são imprescindíveis, tais como: a reação de transesterificação deve ser completa,
refletindo a ausência total de ácidos graxos remanescentes, e o biodiesel produzido deve ser
de alta pureza, não contendo traços de glicerina residual ou álcool excedente de reação
(KNOTHE et al., 2006).
A reação acorre numa sequência consecutiva e reversível de três etapas reacionais.
A primeira etapa envolve a formação de diacilgliceróis a partir dos triacilgliceróis. Na
segunda, os diacilgliceróis são convertidos em monoacilgliceróis e na última, esses são
convertidos em glicerina. Em todas essas etapas são produzidos ésteres de cadeia carbônica
longa, como esquematizado na Figura 3.16.
Embora a relação estequiométrica da reação seja de 1:3 (óleo e álcool), normalmente
é empregado um excesso de álcool para favorecer a formação do produto final (DABDOUB;
BRONZEL; RAMPIN, 2009; BRUNSCHWIG; MOUSSAVOU; BLIN, 2012).
O excesso de álcool na reação não exerce efeitos sobre as características físico-
químicas do biodiesel. Entretanto, razões molares muito elevadas entre o álcool e o óleo
podem interferir na etapa de separação da glicerina, pois ocorre um aumento na solubilidade
do meio reacional. Quando a glicerina permanece na solução, ela pode alterar o equilíbrio
da reação para a esquerda, diminuindo assim o teor de éster (MEHER; VIDYA-SAGAR;
NAIK, 2006).
 52

Figura 3.16. – Mecanismo da reação de transesterificação, em que R1, R2 e R3 são as

cadeias do ácido graxo, e R4 é o grupo alquil do álcool

Fonte: Adaptado (ALVES, 2012).

A utilização de metanol na transesterificação normalmente é preferida por razões

econômicas (menor custo que o etanol) e também relacionada ao processo de produção
(maior polaridade e isento de água). Contudo, a transesterificação utilizando etanol em vez
de metanol tem sido sugerida como uma alternativa mais limpa e mais sustentável para a
produção de biodiesel (STAMENKOVIC; VELICKOVIC; VELJKOVIC, 2011). Além
disso, o etanol possui dois átomos de carbono na sua cadeia e, portanto, apresenta maior
massa molar que o metanol, o que significa um ganho de produtividade de massa na síntese
de ésteres etílicos de ácidos graxos, resultando em uma maior quantidade de biodiesel por
unidade de óleo (BRUNSCHWING; MOUSSAVOU; BLIN, 2012).
A opção de utilização de etanol no Brasil é bastante atrativa devido à grande vocação
agrícola e a já consolidada indústria do etanol no país, e é natural a ideia de substituição do
álcool metílico pelo etílico na produção de biodiesel. Mesmo considerando algumas
desvantagens técnicas existentes na produção do biodiesel pela rota etílica (mais lenta,
consome mais álcool, maior dificuldade de separação), o biodiesel etílico possui viscosidade
maior que o biodiesel metílico, promovendo maior lubricidade. Destaca-se ainda que
 53

biodiesel etílico gera significativamente menos opacidade na fumaça que o biodiesel

metílico, sua temperatura de combustão é menor, significando, entre outras coisas, uma
redução nas emissões de NOx (STAMENKOVIC; VELICKOVIC; VELJKOVIC, 2011;
BRUNSCHWING; MOUSSAVOU; BLIN, 2012).

3.6.2. Catálise homogênea e heterogênea

Na alcóolise, a catálise pode ser homogênea ou heterogênea. Os catalisadores

heterogêneos atuam em forma sólida, sem se misturar com o meio reacional, ao passo que
os homogêneos se solubilizam durante a reação, a exemplo dos álcalis hidróxido de sódio e
de potássio. Tais bases são utilizadas frequentemente em processos industriais de biodiesel
e possuem como vantagens a rápida produção de ésteres, rendimentos muito elevados e
condições brandas de pressão, temperatura e razão molar álcool/óleo. Entretanto, a
purificação do biodiesel produzido é dispendiosa, requerendo diversas séries de lavagem, o
que consome muita água e gera efluentes corrosivos (BORGES; DÍAZ, 2012).
O emprego de catalisadores homogêneos inclui também os de caráter ácido, em que
ácidos inorgânicos como o ácido sulfúrico são misturados diretamente com o meio reacional,
ocorrendo simultaneamente reações de esterificação de ácidos graxos livres (AGL) e de
transesterificação de triglicerídeos para a formação de ésteres. Este tipo de catálise é mais
indicado para óleos com teores de AGL elevados, entretanto, a utilização de ácidos causa
corrosão em equipamentos industriais, além de apresentar cinética lenta, aumentando o
tempo de reação (TALEBIAN-KIAKALAIEH; AMIN; MAZAHERI, 2013).
Os catalisadores heterogêneos são tão diversos quanto os básicos (a exemplo de
óxidos de metais alcalino-terrosos), os ácidos (como fosfato de vanádio e zircônia sulfatada)
e lipases imobilizadas. Esses catalisadores podem ser reutilizados, diminuindo custos globais
do processo. Desvantagens ocorrem com a limitação de difusão no meio, tornando a reação
mais lenta. Além disso, há o emprego de condições de reação menos brandas no caso da
catálise química, incluindo temperaturas, pressões e razões molares entre álcool/óleo mais
altas (LEUNG; WU; LEUNG, 2010; SEMWAL et al., 2011).
O desenvolvimento de catalisadores heterogêneos mais eficientes, portanto, tem sido
o objetivo para tornar a produção de biodiesel ambientalmente favorável e reduzir custos de
manutenção. Assim, atualmente, tem havido grande interesse no desenvolvimento do
processo enzimático de produção de biodiesel, devido às desvantagens dos processos
químicos. Na literatura existe uma série de trabalhos científicos publicados indicando que as
 54

enzimas são promissoras nesta área como catalisadores (MOREIRA et al., 2007, AL-
ZUHAIR, 2007, FJERBAEK; CHRISTENSEN; NORDDAHL, 2009; ROBLES-MEDINA
et al., 2009, VASUDEVAN; BRIGGS, 2008). As enzimas que catalisam a reação entre o
triacilglicerol e o álcool para a produção de ésteres são as lipases.

3.7. Síntese de biodiesel por catálise enzimática

A produção enzimática de biodiesel utilizando a lipase oferece uma rota para a

produção de biodiesel com maior número de vantagens econômicas e ambientais quando
comparada a rota química (CHRISTOPHER; KUMAR; ZAMBARE, 2014):

1. Altas conversões em reações utilizando temperaturas mais amenas;

2. Alta seletividade e especificidade da trans/esterificação em relação aos substratos;
3. Utilização de menores razões molares álcool/óleo;
4. Evita a formação de reações paralelas;
5. Fácil separação;
6. Fácil recuperação do glicerol;
7. Eliminação dos custos de tratamento associados com a recuperação dos catalisadores
químicos;
8. Oportunidade de reutilizar a enzima e aumentar a sua estabilidade através da
imobilização de enzimas.

Embora a catálise enzimática tenha algumas limitações, principalmente associadas

às velocidades reduzidas de reação, custos mais elevados e perda de atividade ou inibição
enzimática, a rota enzimática para a produção de biodiesel é atualmente considerada como
uma alternativa sustentável e em crescente ascensão com enzimas mais eficientes e de menor
custo de produção (BRUN et al., 2011). Especificamente, as velocidades das reações
enzimáticas geralmente são baixas. Embora a lipase tenha um potencial de reutilização, ela
tende a perder atividade ao final do processo e pode ser desativada por álcoois de cadeia
curta e glicerol. O alto custo das enzimas também é uma limitação para a sua aplicação
industrial no processo de produção de biodiesel. O tempo de meia-vida da enzima e a
imobilização da enzima são fatores importantes para a redução do custo do processo. Logo,
aumentar o desempenho e a estabilidade da lipase assim como reduzir os custos ligados a
equipamentos industriais é um ponto crucial para o aumento da comercialização da lipase
para a produção de biodiesel.
 55

Diferentes propriedades físico-químicas das matérias-primas incluindo a composição

de ácidos graxos, o conteúdo de ácidos graxos livres, a umidade, e outras impurezas podem
afetar o processo de produção enzimática de biodiesel, assim como as propriedades finais do
produto. Embora meio reacional contendo co-solvente (hexano, terc-butanol, entre outros)
aparentemente aumente o tempo de meia-vida da enzima, o custo de manutenção desse
sistema é muito caro devido ao elevado custo para a recuperação do solvente. Nesse sentido,
um sistema livre de solventes é uma escolha viável para a produção enzimática de biodiesel
(HAMA; KONDO, 2013).
Um fluxograma do processo de produção enzimática de biodiesel é demonstrado na
Figura 3.17 (CHRISTOPHER; KUMAR; ZAMBARE, 2014). A Tabela 3.9 apresenta uma
comparação do processo de produção pelas vias enzimática e pela catálise homogênea
(ROBLES-MEDINA et al., 2009).

Figura 3.17. – Fluxograma de produção enzimática do biodiesel

Fonte: Adaptado (CHRISTOPHER; KUMAR; ZAMBARE, 2014).

 56

Tabela 3.9. – Comparação do processo de produção de biodiesel pela rota enzimática e

química
Parâmetro Processo enzimático Catálise homogênea
Rota alcalina Rota ácida
Conteúdo de ácidos Os AGL são Formação Os AGL são
graxos livres na convertidos em de sabão convertidos em
matéria-prima biodiesel biodiesel
Conteúdo de água no Não interfere na Formação de sabão Causa a desativação
material atuação da lipase, A hidrólise do óleo do catalisador
entretanto, aumenta a gera a formação de
taxa de hidrólise mais sabão
Percentual de Elevado, próximo de Alta, normalmente Alta, normalmente
biodiesel (conversão) 90% maior do que 96% maior do que 90%
Velocidade de reação Baixa Alta Alta
Recuperação de Fácil, glicerol de boa Complexa, glicerol Complexa, glicerol
glicerol qualidade de baixa qualidade de baixa qualidade
Reuso e recuperação Fácil Difícil Difícil
do catalisador

Custo energético Baixo Médio Alto

(T 20-50ºC) (T 60-80ºC) (T > 100ºC)
Custo do catalisador Alto Baixo Baixo
Impacto Baixo Alto Alto
Ambiental Tratamento da água Tratamento da água Tratamento da água
de lavagem não é de lavagem é de lavagem é
necessária necessário necessário
Fonte: Adaptado de ROBLES-MEDINA et al., 2009.

3.8. Produção de biodiesel a partir do óleo de palmiste

Dentre as possibilidades de se produzir biodiesel utilizando óleos vegetais, a

utilização do óleo de palmiste como matéria-prima ainda é pouco reportada na literatura,
porém os trabalhos científicos publicados nesta área mostram que a reação de
transesterificação enzimática de biodiesel utilizando óleo de palmiste apresenta resultados
semelhantes aos demais óleos vegetais (SOUMANOU; BORNSCHEUER, 2003; ABIGOR
et al., 2000; OLIVEIRA; OLIVEIRA, 2000; OLIVEIRA; OLIVEIRA, 2001). A Tabela 3.10
apresenta exemplos de trabalhos publicados utilizando o óleo de palmiste como matéria-
prima para produção enzimática de biodiesel.
 57

Tabela 3.10. – Trabalhos publicados para a produção enzimática de biodiesel utilizando

óleo de palmiste como matéria-prima
Biocatalisador Razão molar Condições Rendimento Referência
óleo/álcool operacionais (%)
Pseudomonas 1:1 no início Reator de 74 SOUMANOU
fluorescens (AK) tanque agitado, BORNSCHEUER
imobilizada em 1:3 no final 24 h a 40ºC (2003)
polipropileno EP
100
Lipase PS 30 1:4 Reator de 72 ABIGOR et al
tanque agitado, (2000)
8 h a 40ºC
Novozym 435 1:10 Reator de 63,2 OLIVEIRA
tanque agitado, OLIVEIRA
4 h a 40ºC (2000)
Lipozyme IM 1:3 Reator de 77,5 OLIVEIRA
tanque agitado, OLIVEIRA
6 h a 40 ºC (2001)
Fonte: próprio autor

Soumanou e Bornscheuer (2003) estudaram a produção de biodiesel por

transesterificação enzimática do óleo de palmiste com metanol utilizando a lipase
Pseudomonas fluorescens (AK), imobilizada em polipropileno EP 100, como catalisador.
As condições da reação foram: temperatura de 40 ºC; 200 rpm de agitação; razão molar
óleo/álcool 1:1 no início, após 4 horas de reação a razão molar se tornou 1:2, e após 8 horas
tornou-se 1:3; tempo de reação = 24 horas. Foi utilizado um reator de tanque agitado (2 mL)
e ao final do processo foi alcançada uma conversão em ésteres de 74%.
Abigor et al (2000) avaliaram a produção de biodiesel por transesterificação
enzimática do óleo de palmiste com etanol utilizando a lipase PS 30 como catalisador. As
condições da reação foram: temperatura de 40ºC; 250 rpm de agitação; razão molar
óleo/álcool 1:4; tempo de reação = 8 horas. Ao final do processo foi alcançada uma
conversão em ésteres de 72 %.
Oliveira e Oliveira (2000) estudaram a produção de biodiesel por transesterificação
enzimática do óleo de palmiste com etanol utilizando a lipase Novozym 435 como
catalisador. As condições da reação foram: temperatura de 40ºC; 1000 rpm de agitação;
razão molar óleo/álcool 1:10; tempo de reação = 4 horas. Foi utilizado um reator de tanque
agitado de 300 mL e obtido um rendimento de 63 % em conversão de ésteres.
Oliveira e Oliveira (2001) estudaram a produção de biodiesel por transesterificação
enzimática do óleo de palmiste com etanol utilizando a lipase Lipozyme IM como
 58

catalisador. As condições da reação foram: temperatura de 40 ºC; 200 rpm de agitação; razão
molar óleo/álcool 1:3; tempo de reação = 6 horas. Foi utilizado um reator de tanque agitado
de 125 mL e obtido um rendimento de 77,5 % em conversão de ésteres.
 59

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Materiais

4.1.1. Enzima

Neste trabalho todos os experimentos foram realizados utilizando a lipase microbiana

comercial de Burkholderia cepacia (Lipase PS) manufaturada pela Amano Enzyme Inc
(Nagoya, Japão) e adquirida da Sigma-Aldrich.

4.1.2. Suportes de imobilização

Na síntese dos suportes híbridos foram utilizados como compostos orgânicos: álcool
polivinílico (PVA, MM 78.000 e 88 mol % hidrolisado, Polysciences adquirido da Sinapse
Biotecnologia Ltda. São Paulo), β-ciclodextrina (βCD, 97%) e carboximetilcelulose (CMC)
ambos adquiridos da Sigma-Aldrich, hidroxietilcelulose (HEC) (Fluka, Alemanha),
empregando como precursor tetraetilortossilicato (TEOS) adquirido da Aldrich (98%,
Sigma-Aldrich Chemical, St. Louis, MO, EUA). Álcool etílico (95%, Cromoline) e ácido
clorídrico (mín. 36%, Isofar).

4.1.3. Materiais de partida

Butanol (mín 99,5%, Merck) e ácido butírico (mín 99,0%, Vetec) foram utilizados
nas reações de esterificação. Como materiais de partida da reação de transesterificação foram
utilizados: etanol anidro (99%, Cromoline) e óleo de palmiste adquirido da Agropalma
(Belém-PA), tendo uma composição aproximada em ácidos graxos de: 4,3% Caprílico, 3,8%
Cáprico, 48,0% Láurico, 16,0% Mirístico, 8,25% Palmítico, 2,15% Esteárico, 15,50%
Oleico e 2,0% Linoleico e viscosidade (32,27 mm2/s). Propriedades adicionais do óleo de
palmiste são fornecidas no Apêndice A.

4.1.4. Outros reagentes

Os outros reagentes utilizados foram: hexano (Cromoline), heptano (Cromoline)

polietilenoglicol (MM 1500, Synth), goma arábica em pó pura (Synth), epicloridrina (99%,
Sigma-Aldrich), fosfato de sódio bibásico (mín. 99%, Montedison Farm), fosfato de sódio
monobásico anidro (mín. 99%, Synth), hidróxido de sódio (mín. 97%, Isofar), hidróxido de
potássio (mín. 85%, Cromoline), acetona (mín. 99,5%, Cinética) e iso-octano (99,0%,
 60

Synth), glicerol (85%, Merck). Azeite de oliva com baixa acidez (Carbonell, adquirido em
mercado local). Os demais materiais e reagentes foram adquiridos comercialmente em grau
analítico.

4.2. Equipamentos

Os principais equipamentos utilizados neste trabalho estão listados na Tabela 4.1.

Tabela 4.1. – Principais equipamentos utilizados durante a realização do trabalho

Tipo de análise e/ou Equipamento Modelo/ fabricante
ensaio
Dosagem de Cromatógrafo a gás Modelo GC-3800,Varian (Varian
ésteres Inc. Corporate Headequarters)

Viscosidade Viscosímetro Modelo LVDVIIICP-CP 520,

Brookfield

Centrifugação Centrífuga Modelo 206-BL, Excelsa II

(Fanem)

Dosagem de mono e Cromatógrafo de Modelo 1260 Infinity ELSD

diacilgliceróis alta eficiência (Agilent Technologies)

Densidade Densímetro Modelo DMA 35N EX

(Anton Paar)

Análises texturais BET BELSORP-mini II

Raios-X Raios-X Shimadzu

Espectrofotometria na região do Espectrômetro no Spectrum GX, Perkin

infravermelho infravermelho Elmer

Dosagem de glicerol Espectrofotometria do Modelo Cary 50 Conc (Varian)

UV-Visível

4.3. Metodologia Experimental

4.3.1. Síntese dos suportes híbridos

Os compostos híbridos constituídos de polissiloxano (SiO2) e polivinílico álcool

(PVA), β-ciclodextrina (βCD), carboximetilcelulose (CMC) ou hidroxietilcelulose (HEC)
foram sintetizados, pela mistura de 50 mL tetraetilortossilicato (TEOS), 50 mL etanol 95%
e 60 mL de solução do composto orgânico (PVA, βCD, CMC ou HEC) 2% (m/v). As
misturas foram aquecidas a 60ºC, sob agitação, com adição de 1,0 mL de ácido clorídrico
 61

(HCl) concentrado (PAULA et al., 2008). Após um período de incubação de 40 min, a

preparação foi vertida em moldes de acetato e mantida a 25 ºC por 48h até a completa
solidificação. Os compostos híbridos foram triturados e classificados, utilizando-se peneiras
de análises granulométricas (Bronzinox) com 42 e 60 mesh, sendo utilizado na etapa de
ativação, as partículas retidas na peneira com malha de 60 mesh.

4.3.2. Ativação dos suportes híbridos

Os suportes foram ativados com solução de epicloridrina 2,5% (v/v) em tampão

fosfato de sódio (0,1 M e pH 7,5), na proporção 1g de suporte para 10 mL de solução. Após
a homogeneização, as misturas foram mantidas sob agitação por 1h à temperatura ambiente,
sendo em seguida submetidas à filtração a vácuo em um funil de Buchner, contendo um
papel de filtro (diâmetro 28 μm) no seu interior, para retirar o excesso de umidade. Durante
a filtração os suportes foram lavados exaustivamente com água destilada e solução tampão
de fosfato, e em seguida levados à estufa (60º C) por 24 h.

4.3.3. Imobilização da lipase de Burkholderia cepacia em diferentes tipos de suporte

Os suportes ativados (SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC ou SiO2-PVA) foram

embebidos em hexano numa relação sólido: líquido de 1:10 e mantidos sob agitação branda
por 2 h. Após este período, para cada grama de suporte ativado (matéria seca), foram
adicionados 250 mg de lipase na sua forma livre, empregando como agente estabilizante da
enzima 100 µL de solução aquosa contendo 5 mg/mL de polietilenoglicol (massa molecular
1500). As suspensões contendo enzima e suportes foram mantidas sob agitação a 30°C por
2h, seguido de contato estático por um período adicional de 18h a 4 ºC. A recuperação dos
derivados imobilizados foi efetuada por filtração a vácuo, com lavagens sucessivas com
hexano até a redução da umidade dos derivados imobilizados a valores não superiores a 15%
(CARVALHO, 2011). O esquema geral do procedimento é ilustrado na Figura 4.1.
 62

Figura 4.1. – Esquema de síntese, ativação dos suportes híbridos e imobilização da lipase
B. cepacia.

Fonte: Próprio autor

4.3.4. Síntese dos ésteres de alquila

As reações foram efetuadas em reatores de vidro cilíndrico encamisados com

capacidade para 70 mL, acoplados com condensador de refluxo e nas seguintes condições
fixas: 20 gramas de meio reacional na razão molar óleo/ etanol de 1:8. Foi utilizada uma
quantidade de biocatalisador para satisfazer a relação previamente estabelecida de 600
unidades de atividade por cada grama de matéria-prima lipídica (DA RÓS et al, 2011). As
sínteses catalisadas pelas lipases imobilizadas foram efetuadas a 45ºC por um período total
de 72 h e agitação magnética de 150 rpm, conforme ilustrado na Figura 4.2. As concentrações
de ésteres de etila foram quantificadas por cromatografia em fase gasosa. O rendimento de
transesterificação foi calculado de acordo com metodologia descrita por URIOSTE et al
(2008).
 63

4.3.5. Separação do biocatalisador e purificação do biodiesel

A separação do biocatalisador foi efetuada por filtração, seguido de lavagem com

terc-butanol. O volume do filtrado recolhido foi medido e em seguida adicionado o mesmo
volume de água destilada. A mistura foi transferida para um funil de decantação, efetuando-
se agitação e deixando a mistura em repouso por 30 minutos para a separação das fases
(Figura 4.3). A fase inferior composta por glicerol e água de lavagem foi descartada e a fase
superior composta pelos ésteres de etila (biodiesel) foi submetida à centrifugação (1570 g
por 15 min) e em seguida à evaporação em rota-evaporador para a retirada de etanol e água
remanescentes. Posteriormente, foram adicionadas pequenas quantidades de sulfato de sódio
anidro para finalizar a etapa de secagem. A amostra de biodiesel purificada foi submetida à
análise dos parâmetros de interesse do projeto.

Figura 4.2. – Ilustração do aparato Figura 4.3. – Fases separadas do

experimental utilizado nas reações de biodiesel purificado no funil
etanólise do óleo de palmiste

Fonte: próprio autor

4.4. Métodos de análise

4.4.1. Caracterização dos suportes híbridos

4.4.1.1. Área superficial

A medida de área superficial das amostras dos suportes foi realizada em um

equipamento da marca BEL, modelo BELSORP-mini II, empregando-se a técnica de
adsorção-dessorção física de nitrogênio a -196ºC. As amostras foram previamente tratadas
in situ sob aquecimento à 100 ºC por 3 horas para retirada da água e os gases adsorvidos na
 64

superfície e nos poros do sólido. A massa empregada de cada amostra foi entre 0,17 e 0,21g.
Os resultados apresentaram erro máximo de ±5% do valor de área especifica. A área
superficial especifica dos suportes foi calculada pelo método BET (BRUNAUER;
EMMETT; TELLER, 1938) de multicamadas do gás nitrogênio adsorvido fisicamente a -
196ºC na amostra. A equação resultante do método de BET é expressa conforme a equação
4.1.

# ( (* () #
= + + ,. (4.1)
$.(#& #) $) .* $) .* #&

4.4.1.2 Difração de Raios-X (DRX)

A identificação estrutural das amostras foi realizada por medidas de difração de raios
X. As análises de raios-X foram realizadas colocando as amostras sobre o suporte de
alumínio e as análises foram efetuadas em intervalos angulares de 8 a 70 graus e tempo de
contagem de 1 segundo, utilizando o difratômetro da marca Shimadzu, modelo XRD 6000.
A técnica utilizada foi a difratometria de pó, a uma tensão de 40kV e uma corrente de 30
mA. A radiação utilizada foi de CuKα com monocromador de grafite e comprimento de onda
de 1.5418 Å.

4.4.1.3. Espectroscopia na região do Infravermelho (IV)

A espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)

foi conduzida na faixa de número de onda de 400 a 4000 cm-1 usando cristais de KBr. O
espectrômetro utilizado foi o modelo Spectrum GX, Perkin Elmer. As amostras foram
analisadas pelo método de Transmissão, sendo medidos os valores de absorbância no
intervalo de 400-4000 cm-1. Foram feitas 32 varreduras com resolução de 4 cm-1. As
amostras foram preparadas na forma de pastilhas de KBr, pesou-se cerca de 2 mg da amostra
seca e moída e adicionou-se a 200 mg de KBr grau espectroscópico, seco a 105 ºC por 2 h.
Essa mistura foi macerada até que fossem eliminados visivelmente todos os cristais, por
cerca de 1 min. A amostra macerada foi então transferida para um molde pastilhador e
prensada (1,5 kgf cm-2) sob vácuo por 5 min, formando então a pastilha para análise.
 65

4.4.1.4. Testes de adsorção do glicerol dos suportes híbridos

Os testes de adsorção do glicerol foram realizados utilizando 10 mL de solução

alcóolica de glicerol a 5% (v/v) e diferentes suportes (5% massa seca), seguida da incubação
em banho de lavadora ultrassônica a 30 °C por 2 horas. O parâmetro avaliado foi a
capacidade de adsorção do glicerol e a recuperação mássica. Após o procedimento, as
misturas compostas por solução alcoólica de glicerol e os suportes foram centrifugadas a
1570g durante 30 minutos. O sobrenadante foi recuperado e pesado para determinar a
recuperação mássica da solução (equação 4.2) e em seguida o teor residual de glicerol
quantificado (metodologia descrita no item 4.4.1.6), determinando a porcentagem de glicerol
adsorvido (equação 4.3).

:;
-./0-12çã5 62778.2 (%) = . 100% (4.2)
:<

Em que:
mf: massa da solução recuperada ao final do teste (gramas)
mi : massa da solução inicial (gramas).

: DE<*FGHE < <*<IE : DE<*FGHE ;< IE

[email protected]@ AB751C8B5 (%) = :DE<*FGHE < <*<IE
.100% (4.3)

Sendo a massa de glicerol inicial presente na solução teste igual a 0,50 g e a massa
final de glicerol calculada conforme a equação 4.4.

N
J2772 B- [email protected]@ L8 2@(K) = ML. C. (4.4)
(OO

Em que: Cf é a concentração final de glicerol na amostra (g/mL), C o volume de solução

(igual a 10 mL) e R a porcentagem de recuperação mássica.

4.4.1.5. Quantificação de glicerina em meio sintético

Para a determinação do teor de glicerina foi utilizado o método de Espectrofotometria

do UV-Visível desenvolvido por BONDIOLI; BELLA (2005). O princípio do método é a
reação do formaldeído, originado da oxidação da glicerina com o ácido periódico, com a
acetilacetona. O composto formado é 3,5-diacetil-1,4-di-hidrolutidina, um produto de cor
esverdeada detectado na leitura no espectrofotômetro UV/Vis no comprimento de onda de
 66

410 nm. Para o estabelecimento do método foram preparados os reagentes descritos na

Tabela 4.2.

Tabela 4.2. – Concentrações dos reagentes utilizados na etapa de dosagem do glicerol

Reagente Concentração

Ácido acético (stock) 1,6 M

Acetato de amônio (stock) 4,0 M

Acetilacetona 0,2 M

Metaperiodato de sódio 10 mM

Solvente de trabalho Etanol 96%

Glicerol 0,5M

Na construção da curva de calibração (Figura 4.3) utilizou-se solução padrão de

glicerol (0,03 mg/mL) preparada em solvente de trabalho (etanol: água, 1:1), a qual foi
diluída entre 2 e 20 vezes para se obter soluções de concentração conhecida entre 0,002 e
0,014 mg/mL.

Figura 4.3. – Curva padrão do glicerol

0,7

0,6 y = 51,94x - 0,016

R² = 0,9986
Absorbância (410nm)

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014

Glicerol(mg/mL)

Fonte: próprio autor

 67

Uma alíquota de 2 mL de cada diluição foi transferida para um tudo de vidro e os

demais reagentes foram adicionados: 1,2 mL de solução 10mM de metaperiodato de sódio e
1,2 mL de solução 0,2M de acetilacetona. Posteriormente as amostras foram colocadas em
banho de água termostatizado (70°C) por 1 min para favorecer a reação de oxidação da
glicerina e em seguida os tubos foram resfriados por imersão em água a 20°C por 2 min. A
leitura da absorvância foi realizada a 410nm em espectrofotômetro UV-Visível e os valores
de absorbância obtidos foram plotados em função da concentração de glicerol (mg/mL).
A curva de calibração (Figura 4.3) apresentou uma ótima correlação linear (0,9986)
e por meio da equação da reta y= 51,94x – 0,016 foi possível quantificar o teor de glicerol
nas amostras obtidas durante o desenvolvimento do trabalho.

4.4.2. Propriedades dos derivados imobilizados

4.4.2.1 Dosagem de atividade hidrolítica da lipase livre e imobilizada

A atividade enzimática da lipase na forma livre e imobilizada foi determinada pelo

método de hidrólise do azeite de oliva, conforme metodologia modificada por Soares et al.
(1999). Foram misturados 5 mL de uma emulsão de azeite de oliva (50% azeite: água) e 4
mL de tampão fosfato (pH 7,0; 0,1 M). A fim de garantir a homogeneização do meio, o
sistema reacional foi mantido sob agitação prévia, à 37 ºC por 10 min. Em seguida, foi
adicionado a massa conhecida da preparação de lipase (cerca de 5 mg da lipase livre ou
500 mg do derivado imobilizado), mantendo-se o sistema reacional sob agitação a 37 ºC, por
5 min. Após o período de incubação, foram adicionados 15 mL de uma mistura de etanol e
acetona (1: 1) para interromper a reação. Os ácidos graxos liberados foram titulados com
uma solução de KOH previamente padronizada (0,02mol/L) utilizando fenolftaleína como
indicador. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima que libera
1µmol de ácido graxo por minuto de reação, nas condições do ensaio. As atividades foram
calculadas segundo a equação 4.5 e expressas em μmol/g.min (Ug-1).

]65@ ($` $a ).b.(O³

Atividade hidrolítica \ ^K. 68 _ = (4.5)
d.:

Em que: VA= volume de KOH gasto na titulação da amostra, VB = volume do KOH gasto na
titulação do branco, M = molaridade da solução de KOH, t = tempo de reação em min, m =
massa em gramas.
 68

4.4.2.2. Dosagem da umidade dos derivados imobilizados

A determinação do teor de umidade dos derivados imobilizados foi feita medindo-se

a perda de massa do material após secagem de uma quantidade conhecida (cerca de 0,1g)
em balança analítica com infravermelho durante 15 min a 100oC.

4.4.2.3 Estabilidade térmica da lipase livre e dos derivados imobilizados

As lipases livre e imobilizada foram incubadas a 50 °C em tampão fosfato (100 mM,

pH 7,0) por 180 minutos. Em intervalos pré-determinados, as amostras foram retiradas,
resfriadas em banho de gelo para interromper o processo de inativação e em seguida as
atividades hidrolíticas residuais foram determinadas empregando o método de hidrólise do
azeite de oliva, conforme a metodologia descrita no item 4.4.1.

4.4.2.4. Determinação dos parâmetros cinéticos da lipase livre e imobilizada

No cálculo da constante de Michaelis-Mentem (Km), foram preparados sistemas

reacionais contendo ácidos graxos totais em concentrações variando entre 372 – 1860 mM,
obtidos a partir de emulsões preparadas com diferentes proporções de azeite de oliva (10 –
50 %) e solução aquosa de goma arábica (7% mv-1). As velocidades iniciais das reações de
hidrólise catalisadas pela lipase na forma livre e imobilizada foram determinadas de acordo
com a metodologia de hidrólise do azeite de oliva descrita anteriormente no item 4.4.1. As
constantes cinéticas (Km e Vmax) foram determinadas pelo software Origin 8.

4.4.2.5. Determinação da atividade de esterificação dos derivados imobilizados

As atividades de esterificação das amostras de lipase imobilizada foram

determinadas pela formação do butirato de butila na reação de n-butanol (0,10 M) com ácido
butírico (0,14 M) em heptano a 40 ºC empregando 0,5 g de preparação experimental de lipase
imobilizada. A reação foi iniciada pela adição da lipase imobilizada ao meio reacional (20
mL), em frasco fechado de 100 mL, em shaker rotatório com agitação de 180 rpm, durante
24 horas. Alíquotas de 1 mL foram retiradas do meio reacional no tempo zero e após
intervalos pré-determinados. O teor de ácido butírico foi determinado por titulação de
alíquotas diluídas em etanol, empregando solução alcoólica de KOH 0,02M e fenolftaleína
como indicador. A concentração do ácido butírico foi calculado pela equação 4.6:
 69

V×M×m (4.6)
Ácido graxo (g/L) =
W

Em que: m = massa molecular do ácido graxo titulado (g/mol); M = molaridade da solução

de KOH (mol/ L); V = volume gasto de KOH (mL); W = massa da alíquota titulada (g).

As concentrações do butanol residual e butirato de butila formado foram

quantificadas por cromatografia de fase gasosa (Varian, Modelo CG 3800), utilizando uma
coluna empacotada (6ft S# DEGS WHP 80/100 mesh, HP) e nitrogênio com gás de arraste
(30 mL/min). As condições operacionais adotadas são descritas na Tabela 4.3. Uma unidade
de atividade (esterificação) foi definida como a quantidade de enzima que conduz à formação
de 1 µmol de butirato de butila por minuto nas condições do ensaio.

Tabela 4.3. – Condições operacionais para quantificação da concentração de butanol e

butirato de butila por cromatografia de fase gasosa.

Padrão Interno (PI): Hexanol em heptano

Temperatura da coluna 75°C
Temperatura do ionizador 190°C
Temperatura do vaporizador 190°C
Vazão dos gases Nitrogênio (30 mL/min)
Hidrogênio (27 mL/mim)
Ar sintético (300 mL/min)
Preparo da amostra Misturar 1:1 com PI

Minutos Concentração
Tempos de retenção PI 10,3 22,17 g/L
Butanol 3,6 12,71 g/L
Butirato de butila 5,7 8,30 g/L

4.4.3. Caracterização do biodiesel

4.4.3.1. Determinação dos ésteres de etila

Os ésteres de etila formados foram quantificados nas amostras antes da purificação,

empregando cromatógrafo à gás (Modelo Varian CG 3800, Inc. Corporate Headquarters,
Palo Alto, CA, USA), equipado com detector ionizante de chama e coluna empacotada de
aço inoxidável do tipo 5% DEGS CHR-WHP 80/100 mesh 6ft 2.0mm ID e 1/8”OD (Restek,
Frankel Commerce of Analytic Instruments Ltda, SP, Brasil). Nitrogênio foi usado como
 70

gás de arraste com fluxo de 25 mL/min. A coluna foi submetida a uma rampa de temperatura
de 90° C (3 min), 120 ºC (10 min) e 170º C (15 min), numa taxa de aquecimento de
25°C/min. A coleta de dados foi realizada utilizando o programa Galaxie Chomatography
Data System version 1.9. O volume de injeção da amostra foi de 1 µL em hexano e padrão
interno (hexanol) e a quantificação foi realizada pela calibração interna apresentada na
Tabela 4.4, conforme estabelecido por Urioste et al. (2008).

Tabela 4.4. – Condições de operação para a determinação dos ésteres de etila

Padrão Interno (PI): Hexanol em hexano

Programa de Temperatura 90°C/ 3 min, 120 ºC/ 10 min e 170 ºC/ 15 min
Taxa de aquecimento 25°C/ min
Gás de arraste Nitrogênio
Atenuação do cromatógrafo A, B, C = 16
Preparo da amostra 0,1g de amostra em 0,6g de hexano
Amostra para injeção 1:1 (amostra: padrão interno)
Minutos
C8 EtOH 3,28
C10 EtOH 5,26
Tempos de retenção dos C12 EtOH 8,56
monoésteres de etila C14 EtOH 12,06
C16 EtOH 13,96
C18 EtOH 17,10
C18:1 EtOH 17,81
C18:2 EtOH 19,26

4.4.3.2. Determinação dos teores residuais monoacilgliceróis e diacilgliceróis.

As amostras purificadas de biodiesel foram submetidas a análise de cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE) para determinar os teores residuais de monoacilgliceróis e
diacilgliceróis. O equipamento utilizado foi um cromatógrafo Agilent modelo 1260 Infinity
ELSD, com detector evaporativo de espalhamento de luz e coluna de aço inoxidável
Phenomenex Gemini 5 µm C18 11HPLC (JT Baker, Avantor Performance Materials). A
fase móvel constituiu de acetonitrila (A) e metanol (B), com uma proporção de solventes de
80% de A e 20% de B, por 35 minutos. Uma taxa de fluxo de 1,0mL/min foi mantida por 6
minutos, seguida de 1,5 mL/min por 30 minutos e 3,0 mL/min por 35 minutos.
As amostras de biodiesel foram dissolvidas em acetato de etila/hexano (1:1, v/v),
sendo injetadas em volumes de 10 µL. Os padrões utilizados de Monoacilgliceróis e
diacilgliceróis foram: monolaurina (C12:0), monomiristina (C14:0), monopalmitina
 71

(C16:0), monoestearina (C18:0), monooleina (C18:1), dilaurina (C12:0), dimiristina

(C14:0), dipalmitina (C16:0), diestearina (C18:0) e dioleina (C18:1).

4.4.3.3. Viscosidade

Os valores da viscosidade absoluta em função da taxa de deformação foram medidos

em viscosímetro Brookfield Modelo LVDVII (Brookfield Viscometers Ltd, Inglaterra)
empregando o cone CP 42. As medidas foram feitas a 40 °C, empregando aproximadamente
0,5 mL de amostra.

4.4.3.4. Densidade

Os valores de densidade foram determinados utilizando um densímetro digital

Modelo DMA 35N EX (Anton Paar). As medidas foram feitas a 20 °C, empregando-se 2,0
mL de amostra.

4.4.3.5. Rendimento de transesterificação

O rendimento (R) das reações de síntese de biodiesel por via enzimática foi definido
como o valor que expressa a massa total obtida de ésteres de etila (Mt) em relação à massa
total teórica esperada de ésteres de etila (ΣMe). Me foi determinada a partir da massa de ácidos
graxos presente na massa inicial do óleo de palmiste (M0), da massa molecular
correspondente a cada ácido (MMa) e do éster correspondente (MMe). Este cálculo é
representado pela equação 4.7 (a), em que M0 corresponde ao produto da concentração
mássica de cada ácido graxo (Ca), com a massa inicial de óleo utilizada (Mi) equação 4.7
(b). O rendimento foi calculado dividindo a massa total de ésteres determinada pela análise
de cromatografia gasosa (Mt) pela massa total teórica de ésteres de etila (Me), conforme
mostrado na equação 4.7 (c).

(bH.bbF) bd
(a) J- = (b) J5 = M2. J8 (c) = . 100 (4.7)
bbI ebF
 73

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com o objetivo de substituir a matriz híbrida de SiO2-PVA, selecionou-se três

compostos orgânicos: β-ciclodextrina (βCD), carboximetilcelulose (CMC) e
hidroxietilcelulose (HEC) para obtenção de compósitos híbridos obtidos pela técnica sol-
gel, tendo como motivação do estudo a elevada afinidade do suporte híbrido SiO2-PVA pelo
glicerol.
Os experimentos consistiram no preparo de diferentes tipos de suportes híbridos e a
caracterização de suas propriedades texturais e morfológicas. Testes foram também
realizados para avaliar a afinidade dos suportes na retenção do glicerol.
Os suportes híbridos obtidos SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC foram utilizados para
imobilizar a lipase de Burkholderia cepacia, tendo a matriz SiO2-PVA como base de
comparação. Nesta etapa foram avaliados diversos parâmetros como: o rendimento de
imobilização, a atividade hidrolítica dos derivados imobilizados, propriedades texturais e
morfológicas, os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) e a estabilidade térmica.
Para todos os biocatalisadores, foi verificada a potencial catalítico para mediar
reações em meio orgânico analisando os desempenhos dos derivados imobilizados na reação
de esterificação do n-butanol e ácido butírico para a produção de butirato de butila e na
reação de transesterificação do óleo de palmiste com etanol. As amostras de biodiesel obtidas
foram caracterizadas com relação a alguns parâmetros de qualidade: teor de éster;
viscosidade cinemática a 40 °C; e teores residuais de mono e diacilglicerol.
Os resultados obtidos ao longo do desenvolvimento dos ensaios realizados são
descritos e discutidos neste capítulo.

5.1. Preparo dos suportes híbridos

O preparo dos diferentes tipos de suportes híbridos ocorreu, conforme a metodologia

descrita no item 4.3.1. Ao final da etapa de solidificação, a massa obtida em forma de
pastilha, em cada batelada foi pesada. Os compostos híbridos foram triturados, pesados e
classificados, utilizando-se peneiras de análises granulométricas (Bronzinox) com 42 e 60
mesh. Ao final desta etapa, pesaram-se as massas obtidas nas granulometrias de 42, 60 e
maior do que 60 mesh. Os valores obtidos em todas essas etapas são mostrados na Tabela
5.1.
 74

Tabela 5.1. – Rendimentos de sólidos obtidos em todas as etapas envolvidas no preparo

dos suportes híbridos
Suporte Massa (g) da Massa (g) Massa (g) Massa(g) Massa(g) >
pastilha do moído Mesh 42 Mesh 60 Mesh 60
SiO2-βCD 20,75±0,17 19,03±0,24 4,20±0,78 4,68±0,21 10,16±0,72

SiO2-CMC 20,50±0,26 18,88±0,62 5,66±0,69 4,79±0,17 8,43±0,13

SiO2-HEC 20,90±0,36 18,49±0,44 1,31±0,40 4,87±0,18 12,31±0,19

SiO2-PVA 22,76±0,05 20,70±0,07 4,14±1,31 5,44±0,22 11,12±1,30

Conforme mostrado na Tabela 5.1, todos os suportes híbridos forneceram massas

semelhantes ao final de cada batelada, tanto na forma de pastilha, quanto após a etapa de
moagem. A diferença mais marcante foi verificada com relação ao suporte SiO2-HEC que
forneceu menor massa na granulometria de 42 mesh e maior massa na granulometria superior
a 60 mesh quando comparado aos outros 3 suportes, sugerindo maior fragilidade desse
compósito em relação aos outros suportes.
Apesar desta diferença, todos os suportes apresentaram proporções similares no valor
granulométrico de interesse, que é a porção retida na granulometria de 60 mesh, sugerindo
que a substituição do PVA pelos outros compostos orgânicos não interferiu no rendimento
em massa do preparo dos suportes híbridos.

5.2. Caracterização dos suportes híbridos preparados

5.2.1. Análise morfológica dos suportes

As características texturais derivadas dos experimentos de adsorção/dessorção dos

suportes de SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-PVA pelo método BET estão
apresentadas na Tabela 5.2.
Observa-se que os valores de área superficial específica, volumes específicos dos
poros e diâmetro médio dos poros para todos os suportes híbridos apresentaram valores
próximos. Desta forma, em termos de propriedades texturais, conclui-se que os suportes de
SiO2-βCD, SiO2-CMC e SiO2-HEC podem ser uma alternativa promissora para imobilização
de enzimas em substituição ao SiO2-PVA, com regular sucesso.
 75

Tabela 5.2. – Área superficial específica, volume de poros e diâmetro médio de poro para
os suportes de SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-PVA.

Área superficial Volume específico Diâmetro médio dos

Suporte
específica (m2 g-1) dos poros (cm3 g-1) poros (Å)
SiO2-βCD 450,5 0,3614 32,087
SiO2-CMC 361,6 0,2492 27,568
SiO2-HEC 490,5 0,3522 28,718
SiO2-PVA 529,7 0,4391 33,161

5.2.2. Análise na região do infravermelho dos suportes

Informações sobre a orientação das moléculas dos suportes foram obtidas por
espectroscopia na região do infravermelho, e são demonstradas na Figura 5.1.
Os espectros apresentaram uma banda larga na região de 3400 cm-1 com um ombro
em 3250 cm-1, assim como um pico em 1640 cm-1, que foram atribuídas ao grupamento O-
H de hidroxilas ligadas às cadeias poliméricas dos suportes. O grupamento O-H é
proveniente da água de hidratação e de cristalização. Outros picos intensos em 450 cm-1,
assim como em 1090 cm-1 estão associadas com as vibrações de estiramento simétricas e
assimétricas da sílica, respectivamente. A presença das ligações características de Si-O-Si
mostraram a formação bem sucedida do material híbrido a base de sílica. A existência de
grupos livres de Si-OH associados com o pico 950 cm-1 são devidos à reação incompleta de
condensação das unidades disponíveis de silanol. Esses grupos de hidroxila livres atuam de
maneira efetiva na funcionalidade do material híbrido preparado a base de sílica. As
deformações simétricas dos grupos –CH3 e –CH2 são mostradas no pico de 2980 cm-1. A
presença de grupos livres reativos (N-H e –OH) estão associadas a região de 3400 cm-1.
Ligações específicas de C = C estão associados ao pico de 1640 cm-1 (TODOROVA;
CHERNEV; DJAMBAZOV, 2014; NYQUIST; KAGEL, 1997).
 76

Figura 5.1. – Espectros na região do infravermelho das matrizes híbridas

Absorbância (unidades arbritárias) SiO2-CMC

SiO2-HEC

SiO2-βCD

SiO2-PVA

4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
-1
Comprimento de onda (cm )
Fonte: próprio autor

5.2.3. Difração de raios-X dos suportes

A caracterização estrutural foi realizada a partir da difração de raios-X, nesta técnica

uma frente de ondas passa através de fendas cuja separação é comparável ao comprimento
de onda λ da radiação. A técnica de medida difração de raios-X é baseada na interação da
radiação eletromagnética de comprimento de onda λ (≈0,1 nm) com planos de átomos do
sólido cristalino.
Os materiais com arranjo cristalino e repetitivo apresentam difratogramas contendo
picos e reflexões bem definidas. Por outro lado, os materiais amorfos não possuem um
arranjo cristalino regular e, portanto não apresentam difratogramas com reflexões definidas
(CULLITY, 2001).
Os difratogramas ilustrados na Figura 5.2 são referentes aos suportes híbridos de
SiO2-CMC, SiO2-HEC, SiO2-βCD e SiO2-PVA. Os difratogramas obtidos a partir dos
suportes híbridos apresentam uma expressiva largura em 23° (2θ), indicando formação de
estruturas predominantemente amorfas pela presença da sílica (KIM et al., 2003). A
formação de um microambiente amorfo mostra que os suportes são formados por uma rede
não uniforme e com um número considerável de interstícios, ideal para o processo de
imobilização de enzimas (FAN et al., 2006). Uma distribuição homogênea do componente
 77

orgânico na matriz inorgânica evita a formação de agregados de enzima, conforme

constatado por Abbehausen et al., 2011.
De forma generalizada, os difratogramas mostraram o mesmo perfil e as resoluções
das linhas espectrais apresentaram pouco ruído. A forma e largura dos picos indicaram que
há fase amorfa em todas as matrizes híbridas.

Figura 5.2. – Difratometria de Raios X das matrizes híbridas

Intensidade (unidades arbritarias)

SiO2-CMC

SiO2-HEC

SiO2-βCD

SiO2-PVA

10 20 30 40 50 60 70

2 Θ (graus)

Fonte: próprio autor

5.2.4. Testes de afinidade do suporte pelo glicerol

Os suportes foram avaliados quanto à capacidade de adsorção do glicerol e a

recuperação mássica. Os ensaios de adsorção foram realizados em banho ultrassônico a 30
°C por 2 horas, utilizando uma solução alcoólica de glicerol 5% (m/v) e uma proporção fixa
de adsorventes de 5% em massa seca. A Tabela 5.3 apresenta os valores gerados pela atuação
dos suportes na remoção do glicerol e na recuperação mássica.
 78

Tabela 5.3. – Adsorção de glicerol e porcentagens de recuperação mássica de solução

empregando diferentes matrizes híbridas
Suporte Glicerol adsorvido Recuperação mássica
(%) (%)
SiO2-βCD 4,13±0,31 91,41
SiO2-CMC 14,45±0,80 91,86
SiO2-HEC 8,98±1,16 92,32
SiO2-PVA 10,92±0,19 92,66

Como demonstrado na Tabela 5.3 todos os suportes testados apresentaram elevado

percentual de recuperação mássica, variando entre 91,41 a 92,66 %, tendo este parâmetro
menor importância na escolha de uma determinada matriz híbrida. Entretanto, os valores de
glicerol adsorvido variaram numa ampla faixa, apresentando valores de 4,13 a 14,45 %.
De acordo com a literatura (COSTA-SILVA, 2013), o glicerol forma uma camada na
superfície da lipase imobilizada. Os resultados obtidos mostraram que a matriz híbrida de
SiO2-CMC apresentou comparativamente maior afinidade pelo glicerol, em razão das
propriedades hidrofílicas do composto de carboximetilcelulose. Por ouro lado, a matriz
híbrida de SiO2-βCD demonstrou a menor afinidade, sugerindo que a β-ciclodextrina
aumentou o caráter hidrofóbico da matriz híbrida, em função de possíveis grupos apolares
presentes neste composto.
Verifica-se, portanto, que a substituição do polivinilálcool por β-ciclodextrina
reduziu em até 50% a habilidade do suporte hibrido em absorver glicerol. Os componentes
derivados de celulose apresentaram resultados similares aos obtidos com o polivinilálcool.
Em termos de afinidade pelo glicerol os resultados obtidos permitiram a classificação dos
suportes híbridos na seguinte ordem crescente: SiO2-CMC > SiO2-PVA > SiO2-HEC > SiO2-
βCD.

5.3. Caracterização dos derivados imobilizados preparados

5.3.1. Imobilização da lipase de Burkholderia cepacia em diferentes suportes híbridos

Adotando o procedimento descrito no item 4.3.3, os suportes híbridos previamente

ativados com epicloridrina, foram utilizados para imobilizar a lipase de B. cepacia. Especial
atenção foi dada ao procedimento experimental de imobilização para se obter derivados
imobilizados com teores de umidade inferiores a 10%, tendo em vista que elevados teores
 79

de água podem favorecer a reação de hidrólise, reduzindo assim a eficiência das reações de
síntese.
A Tabela 5.4 apresenta os resultados de atividade hidrolítica dos derivados
imobilizados obtidos, bem como os valores de rendimento de imobilização.

Tabela 5.4. – Parâmetros obtidos da imobilização da lipase B. cepacia em diferentes

suportes híbridos.
Suporte Umidade Atividade hidrolítica Rendimento de
(%) (Ug-1) imobilização (%)
SiO2-βCD 9,78 1636,8 ± 106,3 63,4± 6,9
SiO2-CMC 8,73 1457,4 ± 129,7 56,2± 0,2
SiO2-HEC 8,33 1451,0 ± 132,7 56,0± 4,6
SiO2-PVA 9,09 1661,26±120,2 67,9± 0,7
Atividade da lipase livre 10296±255 Ug-1

Nas condições adotadas verifica-se uma pequena variação entre a interação da

enzima de Burkholderia cepacia e os suportes testados, devido provavelmente à diferença
da conformação estrutural de cada suporte. Os valores de atividade hidrolítica variaram
entre 1451 a 1661,26 Ug-1, correspondendo a rendimentos de imobilização entre 56,0 a
67,9%. Os rendimentos mais elevados foram obtidos para os sistemas imobilizados nos
suportes SiO2-βCD (63,4± 6,9 %) e SiO2-PVA (67,9± 0,7%).

5.3.2. Análise morfológica dos derivados imobilizados

As características texturais derivadas dos experimentos de adsorção/dessorção dos

derivados imobilizados em SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-PVA pelo método
BET estão apresentadas na Tabela 5.5.
Observa-se que para os derivados imobilizados os valores obtidos de área superficial
específica, volumes específicos dos poros e diâmetro médio dos poros apresentaram valores
próximos. Verifica-se ainda que a lipase imobilizada na matriz SiO2-βCD apresentou os
resultados mais próximos em termos de área superficial específica e volume específico dos
poros com relação a lipase imobilizada matriz SiO2-PVA, e um valor maior de diâmetro
médio dos poros.
O diâmetro médio dos poros dos derivados imobilizados é considerado um dos
parâmetros mais importantes, podendo afetar a eficiência catalítica, isto é, quanto maior for
 80

o diâmetro médio dos poros maior será o acesso do substrato ao sítio ativo da enzima
imobilizada no suporte, minimizando assim defeitos difusionais e impedimentos estéricos
do biocatalisador.

Tabela 5.5. – Área superficial específica, volume de poros e diâmetro médio de poro para
a lipase de B. cepacia imobilizada nos suportes híbridos SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC
e SiO2-PVA.

Área superficial Volume específico Diâmetro médio

Biocatalisador
específica (m2 g-1) dos poros (cm3 g-1) dos poros (Å)
Lipase-SiO2-βCD 312,3 0,2780 35,617
Lipase-SiO2-CMC 209,5 0,1326 25,319
Lipase-SiO2-HEC 206,1 0,1573 30,516
Lipase-SiO2-PVA 309,4 0,2010 25,987

Dessa forma, em termos de propriedades texturais, conclui-se que as matrizes de

SiO2-βCD, SiO2-CMC e SiO2-HEC podem ser uma alternativa promissora a matriz de SiO2-
PVA para a imobilização de lipases.

5.3.3. Análise de infravermelho dos derivados imobilizados

A espectroscopia no infravermelho foi utilizada para verificar a eficiência do método

de imobilização da lipase B. cepacia nos diferentes tipos de suportes testados. Os espectros
no infravermelho obtidos para a lipase B. cepacia livre e os derivados imobilizados são
mostrados na Figura 5.3.
O pico característico da lipase B. cepacia livre, que envolve a banda de 1640 cm-1
(grupamento aminos primários), esta exibido na Figura 5.3, e de acordo com as bandas
descritas na literatura (BOSLEY; PELLOW, 1997). Estes picos também se encontram
presentes nos espectros dos derivados imobilizados, apresentando um comportamento
semelhante para todos os suportes utilizados. Pode-se ainda observar a presença de bandas
que indicam a deformação axial Si-O-Si (810 cm-1 e 950 cm-1).
Verifica-se nas curvas um comportamento semelhante para todos os derivados
imobilizados. Observa-se, porém, que ocorre um decaimento nos picos de 480 cm-1 e
1090 cm-1 da lipase B. cepacia para todos os derivados imobilizados mostrando uma
conformação estrutural um pouco diferente na orientação das moléculas após a imobilização.
 81

Figura 5.3. – Espectros na região do infravermelho da lipase de B.cepacia na forma livre e

imobilizada nos suportes híbridos

Absorbância (unidades arbritarias)

Lipase livre

Lipase SiO2-CMC

Lipase SiO2-HEC

Lipase SiO2-β CD

Lipase SiO2-PVA

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

-1
Comprimento de onda (cm )
Fonte: próprio autor

5.3.4. Difração de raios-X dos derivados imobilizados

A caracterização estrutural a partir da difração de raios-X também foi utilizada para

verificar a eficiência do método de imobilização da lipase B. cepacia nos diferentes tipos de
suportes testados. Os espectros no infravermelho obtidos para a lipase B. cepacia para os
derivados imobilizados são mostrados na Figura 5.4.
Os difratogramas obtidos a partir dos derivados imobilizados apresentaram os
mesmos perfis que os difratogramas obtidos para os suportes híbridos, indicando que não
ocorreu alteração no arranjo estrutural após a etapa de imobilização. De forma generalizada,
os difratogramas mostraram o mesmo perfil e as resoluções das linhas espectrais
apresentaram pouco ruído. A forma e largura dos picos indicaram que há fase amorfa em
todos os derivados imobilizados.
 82

Figura 5.4. – Difratometria de Raios X da lipase de B.cepacia imobilizada nos suportes

híbridos

Intensidade (unidades arbritarias)

Lipase SiO2-CMC

Lipase SiO2-HEC

Lipase SiO2-β CD

Lipase SiO2-PVA

10 20 30 40 50 60 70
2 Θ (graus)

Fonte: próprio autor

5.3.5. Parâmetros cinéticos dos derivados imobilizados

O efeito da concentração do substrato sobre a atividade das preparações de lipase

imobilizada foi investigado e comparado com o da lipase livre, sob as mesmas condições de
reação, empregando emulsões de azeite de oliva em diferentes proporções (10-50% m/v),
correspondendo a concentrações em ácidos graxos variando entre 372 a 1860 mM/L. Os
ensaios foram realizados em pH 7,0 e temperatura de 37 ºC, e os valores obtidos são
fornecidos no Apêndice B. Os perfis das curvas de velocidade de reação das preparações de
lipase livre e imobilizada em função da concentração de ácido graxo são apresentados na
Figura 5.5.
Verifica-se que o aumento na concentração do substrato de 372 para 1116 mM
resultou em um incremento significativo nas velocidades de reação para todas as
preparações de lipase ensaiadas. Para concentrações de substrato superiores a 1488 mM, a
atividade enzimática da lipase tornou-se essencialmente independente da concentração do
substrato, seguindo uma cinética do tipo Michaelis-Menten. Os valores de Km e Vmax
aparentes foram calculados com o auxílio do programa Origin 8, conforme apresentados na
Tabela 5.6.
 83

Figura 5.5. – Perfis das curvas de velocidade de reação da lipase B. cepacia livre (a) e dos
derivados imobilizados em (b) SiO2-βCD, (c) SiO2-CMC, (d) SiO2-HEC e (e) SiO2-PVA
Lipase livre (a) Lipase imobilizada em SiO2-βCD (b)
12500 2000
-1 1
-1
Vmax=12391 µM. g min-
1 Vmax= 2589,48 µM. g min-

-1
Velocidade de reação/ µM g min
-1
-1 KM = 1204,13 mMol L
-1

KM = 400 mMol L
Velocidade de reação/ µM g min

10000

-1
1500
-1

7500
1000

5000

500

2500

0
0 0 372 744 1116 1488 1860
0 372 744 1116 1488 1860 -1
Ácidos Graxos / mmol L
-1
Ácidos Graxos / mmol L
Lipase imobilizada em SiO2-CMC (c) Lipase imobilizada em SiO2-HEC (d)

2000 2000
-1 1 -1 1
V max= 2270,86 µ M. g min- Vmax= 2243,72 µM. g min-
-1
-1

-1 -1
Velocidade de reação/ µM g min

KM = 1037,25 mMol L
Velocidade de reação/ µM g min

K M = 1061,02 mMol L
-1
-1

1500 1500

1000
1000

500
500

0
0 0 372 744 1116 1488 1860
0 372 744 1116 1488 1860 -1
Ácidos Graxos / mmol L
-1
Ácidos Graxos / mmol L
Lipase imobilizada em SiO2-PVA (e)
2000 -1 1
V max= 2621,83 µ M. g min-
-1
Velocidade de reação/ mM g min

-1
K M = 1153,62 mMol L
-1

1600

1200

800

400

0
0 372 744 1116 1488 1860
-1
Ácidos Graxos / mmol L
Fonte: próprio autor
 84

Os valores de Km das preparações de lipase imobilizada foram entre 2,5 a 3 vezes

superior ao obtido pela lipase livre, indicando mudança da afinidade da lipase pelo substrato,
na forma imobilizada, independentemente do tipo de suporte testado.
O aumento dos valores de Km e a diminuição dos valores de Vmax dos derivados
imobilizados quando comparados aos da enzima livre pode ser explicado pelo fato de que
enzimas imobilizadas normalmente dificultam a transferência de massa dos reagentes para a
superfície (difusão externa) e para os poros (difusão interna) provocando assim a perda de
afinidade com o substrato quando comparados à enzima livre (VILLEUNEVE et al., 2000).
Esse comportamento é geralmente observado para enzimas imobilizadas em função
dos efeitos de interação enzima e suporte e dependem do processo de imobilização. Segundo
Georgio; Hubbell (1993), três formas de interação podem ser distinguidas: (1) a ligação da
proteína na matriz pode resultar em mudanças conformacionais que afetam a função
catalítica; (2) o acesso do substrato ao sítio ativo da enzima pode ser afetado por
impedimento estérico do suporte e; (3) as propriedades do suporte, como sua natureza
hidrofílica ou hidrofóbica, ou a presença de cargas fixas que afetam o modo de ação da
enzima.

Tabela 5.6. – Parâmetros cinéticos da lipase B. cepacia livre e imobilizada nos diferentes
suportes híbridos
Biocatalisador Km Vmax
(mmol.L-1 ) U/g
Lipase livre 400 12391
Lipase-SiO2-βCD 1204 2590
Lipase-SiO2-CMC 1061 2271
Lipase-SiO2-HEC 1037 2244
Lipase-SiO2-PVA 1153 2622

Entre todos os derivados imobilizados testados, a lipase imobilizada na matriz SiO2-

HEC foi que forneceu o menor valor de Km de 1037,25 mmol L-1 apresentando assim maior
afinidade da enzima pelo substrato, quando comparado as outras matrizes.
 85

5.3.6. Estabilidade térmica da lipase de B. cepacia livre e imobilizada nos diferentes

tipos de suporte

Experimentos foram ainda efetuados para estimar a constante de inativação térmica

(kd) e o tempo de meia-vida da B. cepacia livre e imobilizada nos diversos suportes híbridos.
Os testes de estabilidade térmica foram efetuados conforme a metodologia descrita no item
4.4.3 e os valores obtidos são fornecidos no Apêndice C. Os perfis das curvas de estabilidade
térmica das preparações de lipase livre e imobilizada estão ilustrados na Figura 5.6.

Figura 5.6. – Estabilidade térmica da lipase B. cepacia livre e dos derivados imobilizados
nos suportes híbridos SiO2- βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-PVA

1 00

95
Atividade residual (%)

L ip a s e liv re
L ip a s e -S iO 2 - B C D
75
L ip a s e - S iO 2 -C M C
L ip a s e - S iO 2 -H E C
L Ip a s e - S iO 2 -P V A
70

65

60
0 30 60 90 12 0 15 0 18 0

T e m p o (m in )

Fonte: próprio autor

Verifica-se pelo perfil das curvas, que a atividade residual da lipase na forma solúvel
foi reduzida bruscamente em 60 min de incubação, resultando numa perda total de 35 % da
sua atividade inicial ao final de 180 min. Por outro lado, os valores de atividade residual dos
derivados imobilizados permaneceram praticamente constantes, apresentando perdas
mínimas de aproximadamente 2-3% das atividades iniciais, pelo mesmo período de tempo.
Esses dados indicam que o procedimento de imobilização atuou no sentido de aumentar a
estabilidade térmica da lipase B. cepacia.
 86

A partir desses resultados, calculou-se a constante de inativação térmica (kd) e o

tempo de meia-vida (t1/2). O tempo de meia-vida é definido como o tempo necessário para
que ocorra uma redução de 50% da atividade inicial da enzima (Tabela 5.7).

Tabela 5.7. – Estabilidade térmica dos derivados de B. cepacia imobilizados em diferentes

tipos de suporte
Biocatalisador Atividade Kd Tempo de Aumento da
relativa (h-1) meia-vida estabilidade
(%) (h) térmica
Lipase-SiO2-βCD 97,90 0,007 97,6 21
Lipase-SiO2-CMC 97,07 0,01 70,0 15
Lipase-SiO2-HEC 98,01 0,007 103,5 22
Lipase-SiO2-PVA 98,33 0,006 123,8 26
Lipase livre: Kd = 0,15 h-1 e t1/2 = 4,67 h

Esses parâmetros confirmam a influência positiva do método de imobilização na

estabilização térmica da lipase, revelando aumentos da estabilidade térmica entre 15 a 26
das preparações de lipase imobilizada nos suportes híbridos em relação a lipase na forma
livre. A estabilidade térmica mais elevada foi constatada para a lipase imobilizada em SiO2-
PVA (t1/2 = 123,8 h) e a menor para o derivado imobilizado em SiO2-CMC (t1/2 = 70,0 h).
Entretanto, verifica-se que a lipase imobilizada nas matrizes híbridas SiO2-HEC e SiO2-βCD
também apresentaram elevada estabilidade térmica.

5.4. Aplicação das preparações de lipases imobilizadas em meio orgânico

Para testar a atividade catalítica dos derivados imobilizados em meio orgânico,

utilizou-se a síntese do butirato de butila a partir do n-butanol e ácido butírico, avaliando a
cinética de conversão dos materiais de partida em éster. As sínteses foram realizadas
conforme metodologia descrita no item 4.4.2.5. O perfil de formação do butirato de butila e
consumo dos materiais de partida estão apresentados na Figura 5.7 (a-d), tomando por base
os dados descritos no Apêndice D.
 87

Figura 5.7. – Perfil do consumo do butanol ( ) e ácido butírico ( ) e formação do

butirato de butila ( ) na reação de esterificação mediada pela lipase de B. cepacia
imobilizada nos suportes híbridos: (a) SiO2-βCD, (b) SiO2-CMC, (c) SiO2- HEC, (d) SiO2-
PVA (40 °C, 180 rpm).

(a) (b)
150 150
atividade = 114 µΜ//g.min Atividade= 95 µM/g.min

125 125
Concentraçao (mmol/L)

Concentraçao (mmol/L)
100 100

75
75

50
50

25
25

0
0 0 3 6 9 12 15 18 21 24
0 4 8 12 16 20 24
Tempo (h)
Tempo (h)

(c) (d)
150 150
Atividade = 118 µM/g.min
atividade = 111 µΜ//g.min
125 125
Concentraçao (mmol/L)
Concentraçao (mmol/L)

100 100

75 75

50 50

25 25

0
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tempo (h) Tempo (h)

Fonte: próprio autor

 88

As reações apresentaram conversões satisfatórias, e em 24h de reação o álcool

(reagente limitante) foi consumido parcialmente, sendo o éster formado na mesma proporção
molar, como esperado pela estequiometria da reação. A menor concentração de butirato de
butila foi alcançada na reação catalisada pelo derivado imobilizado em SiO2-CMC (9,8 g.L-
1
). Nas reações catalisadas pelos derivados imobilizados em SiO2-βCD, SiO2-HEC e SiO2-
PVA [Figuras 5.4 (b), (c) e (d)] o teor de éster formado foi incrementado para valores
superiores a 11,5 g.L-1.
A Tabela 5.8 apresenta os valores de atividades de esterificação, conversão molar de
butanol e produtividade obtidos nas reações catalisadas pelos quatro derivados imobilizados
testados.

Tabela 5.8. – Atividade de esterificação, conversão molar de butanol e produtividade na

síntese do butirato de butila mediada por diferentes derivados imobilizados.
Biocatalisador Atividade de Conversão molar Produtividade
esterificação butanol (géster. L-1.h-1)
(µM.g-1min.-1) (%)
Lipase-SiO2-βCD 114 73,3 0,5
Lipase-SiO2-CMC 95 63,1 0,4
Lipase-SiO2-HEC 111 71,5 0,5
Lipase-SiO2-PVA 118 75,2 0,5

Como demonstrado na Tabela 5.8, todos os derivados imobilizados tem potencial

para catalisar a reação de esterificação, porém com diferentes velocidades de reação. A lipase
de B. cepacia imobilizada no suporte de SiO2-PVA apresentou o melhor resultado, obtendo
uma atividade de esterificação de 118 µM.g-1min-1 enquanto que a mesma enzima quando
imobilizada em SiO2-CMC forneceu uma atividade de esterificação de 95 µM.g-1min-1,
indicando diferente afinidade da lipase pelo substrato, na forma imobilizada para os
diferentes tipos de suportes utilizados.

5.5. Síntese de ésteres de etila por transesterificação

Os ensaios de transesterificação foram efetuados de acordo com as condições

descritas no item 4.3.3 empregando-se as preparações de B. cepacia imobilizada nos
diferentes tipos de suporte hibrido e os valores obtidos são fornecidos no Apêndice E. Nesta
série de ensaios, as reações foram monitoradas em termos de ésteres de etila formados em
função do tempo de reação, conforme mostrado na Figura 5.8 (a-d) e Tabela 5.9.
 89

Figura 5.8. – Perfil de formação dos ésteres de etila a partir da reação de transesterificação
do óleo de palmiste com etanol, catalisada pela lipase B. cepacia imobilizada em
diferentes suportes híbridos: (a) SiO2- βCD, (b) SiO2-CMC, (c) SiO2-HEC, (d) SiO2-PVA

(a) (b)
80 80
C8
C8
75 C10
C10
C12
C12
70 70 C14
C14
C16
C16

Èsteres de etila (m/m %)

65
Ésteres de etila (m/m %)

C18
C18
C18:1
60 C18:1 60
C18:2 C18:2
55 Total Total

50 50
10 10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0 24 48 72
0
0 24 48 72
Tempo (h)
Tempo (h)

(c) (d)
80 C8 80
C10 C8
C12 C10
C14 C12
70
C16
70 C14
Esteres de etila (m/m %)
Esteres de etila (m/m %)

C18 C16
C18:1 C18
60 C18:2 60 C18:1
Total
C18:2
Total
50 50

10
8
8
6
6
4
4

2 2

0 0
0 24 48 72 0 24 48 72
Tempo (h) Tempo (h)

Fonte: próprio autor

 90

Os rendimentos de transesterificação foram calculados com base nos dados obtidos

por cromatografia de fase gasosa e confirmados por cromatografia líquida de alta eficiência
(tomando por base os teores de mono, diacilgliceróis). Os valores de viscosidade e a
densidade das amostras purificadas foram também determinados (Tabela 5.10).
Com base nos resultados obtidos, verifica-se que independente do derivado
imobilizado as reações apresentaram perfil cinético semelhante com relação à formação dos
principais ésteres de ácidos graxos presentes no óleo de palmiste, com destaque para os
ésteres de laurato e miristato de etila, que são os ácidos graxos presentes em maior proporção
nessa matéria-prima lipídica (Tabela 5.9). Entretanto, a velocidade de reação sofreu
interferência do tipo de suporte hibrido empregado na imobilização da lipase de B. cepacia.

Tabela 5.9. – Perfil dos ésteres de etila nas amostras de biodiesel obtidas por catálise
Biocatalisador %g éster/g amostra m/m
éster
C8 C10 C12 C14 C16 C18 C18:1 C18:2 (%)

Lipase-SiO2-βCD 3,3 3,2 35,7 9,7 6,3 1,6 9,0 4,8 73,56
Lipase-SiO2CMC 3,5 3,5 35,3 9,8 6,8 1,6 9,1 4,8 73,87
Lipase-SiO2-HEC 3,3 3,4 35,7 10,3 6,8 1,7 7,1 4,3 73,80
Lipase-SiO2-PVA 3,5 3,4 35,9 9,6 6,3 1,5 8,3 4,3 73,90

As velocidades de reação mais elevadas foram observadas para lipase imobilizada

no suporte hibrido composto de sílica e derivados de celulose, alcançando em ambos os
casos conversões máximas do óleo de palmiste em ésteres de etila em 48 horas, enquanto os
derivados imobilizados nos suportes SiO2-βCD e SiO2-PVA requereram 72 horas para atingir
o mesmo grau de conversão.
Tomando por base os resultados alcançados na transesterificação etanólica do óleo
de palmiste, foi possível realizar uma avaliação comparativa da atuação dos biocatalisadores
tomando como parâmetros: conversão em ésteres (CE%), teores residuais de MAG e DAG,
bem como os valores de viscosidade e densidade do biodiesel. Essas propriedades das
amostras de biodiesel purificadas são apresentadas na Tabela 5.10. A concentração de ésteres
(CE) e os níveis de mono, diacilgliceróis (MAG, DAG) foram quantificados pela técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
 91

Com relação à viscosidade cinemática obtida no produto final de cada reação

(Apêndice F), verifica-se que quanto maior o rendimento de transesterificação maior a
redução da viscosidade da matéria-prima lipídica precursora.

Tabela 5.10. – Propriedades das amostras de biodiesel purificadas

Biocatalisador Densidade Viscosidade MAG DAG CE

(kg/m3) (mm2/s) (%) (%) (%)
Lipase-SiO2-βCD 870 4,01 2,7 0 97,29
Lipase-SiO2-CMC 870 4,01 2,8 0 97,15
Lipase-SiO2-HEC 869 3,92 2,1 0 97,93
Lipase-SiO2-PVA 870 3,84 1,7 0 98,30

Os valores de viscosidade cinemática das amostras geradas nas reações catalisadas

pelas lipases imobilizadas em SiO2-PVA, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-βCD encontram-se
dentro da faixa limite especificada pela legislação da ANP (3,0-6,0 mm2/s), com valores que
variaram de 3,84 a 4,01 mm2/s. Os valores de densidade das amostras geradas também se
encontram dentro da faixa limite especificada pela legislação da ANP (850-900 kg/m³), com
valores muito próximos de 869 a 870 kg/m³.
Entretanto, os níveis obtidos de MAG gerados nas reações catalisadas pela lipase
imobilizadas em SiO2-PVA, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-βCD são superiores ao limite
especificada pela legislação da ANP (max 0,8%), tendo apresentado valores entre 1,7 e
2,85%.
È provável que a maior habilidade do sistema imobilizado em SiO2-PVA em adsorver
o glicerol tenha auxiliado na redução do teor de MAG no produto purificado.
 93

6. CONCLUSÕES

Em decorrência da elevada afinidade do suporte hibrido SiO2-PVA pelo glicerol, o

presente trabalho teve como objetivo selecionar componentes orgânicos para obtenção de
compósitos híbridos pela técnica sol-gel visando avaliar o efeito do agente orgânico na
evolução do sol para gel e nas propriedades finais dos suportes para imobilizar a lipase
microbiana de Burkholderia cepacia. Foram testados três compostos orgânicos β-
ciclodextrina (βCD), carboximetilcelulose (CMC) e hidroxietilcelulose (HEC) e os
resultados obtidos foram comparados com o comportamento já estabelecido para o
polivinilálcool (PVA). Os resultados obtidos foram promissores e permitiram concluir que:

Todos os compostos orgânicos testados em presença do precursor (TEOS) formaram

géis em meio ácido, resultando em géis poliméricos, que após a secagem deram
origem a uma matriz compacta (SiO2-βCD, SiO2-CMC e SiO2-HEC) com
propriedades morfológicas (FTIR, BET e Raio-X) similares as caraterísticas do
híbrido de SiO2-PVA.

A afinidade das matrizes hibridas pelo glicerol variou numa ampla faixa e foi
diretamente dependente do tipo de composto orgânico empregado, permitindo a
classificação dos suportes híbridos na seguinte ordem crescente: SiO2-CMC > SiO2-
PVA > SiO2-HEC > SiO2-βCD.

O desempenho dos híbridos de SiO2-βCD, SiO2-CMC e SiO2-HEC como matrizes

de imobilização da lipase B. cepacia foi altamente satisfatório e forneceu derivados
imobilizados ativos tanto em meio aquoso quanto meio não aquoso, e similar ao
derivado imobilizado em SiO2-PVA.

O conjunto de dados obtidos permitiram selecionar o composto orgânico βCD para

substituir com vantagens o polivinilálcool no preparo de matrizes hibridas para
imobilização da enzima lipase. O menor poder hidrofílico desta matriz em relação às
outras matrizes testadas pode ser creditado a estrutura cíclica da βCD que reduziu a
capacidade do suporte SiO2-βCD em adsorver glicerol, principal subproduto da
reação de transesterificação.

Testes em processos conduzidos em fluxo contínuo são sugeridos como trabalho

futuro para comprovação da eficiência dessa matriz.
 95

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 107

APÊNDICES

APÊNDICE A - Propriedades do óleo de palmiste

Algumas propriedades físico-químicas do óleo de palmiste foram determinadas, como:

índice de acidez e viscosidade, as demais características foram adotadas tomando por base o
laudo técnico fornecido pela Agropalma, conforme apresentados na Tabela A1.

Tabela A.1. – Propriedades do óleo de palmiste

Índice de Índice de Índice de iodo Índice de Viscosidade

acidez peróxido (g I2/100g) saponificação cinemática
(mg KOH/g) (mEq/ kg) (mgKOH/g) (mm2/s)

0,09±0,01 1,00 16-21 230-254 32,27

A viscosidade foi determinada adotando metodologia descrita no item 4.4.3.3.

O índice de acidez da matéria-prima foi determinado de acordo com as normas do
Instituto Adolfo Lutz (1985). Para esta determinação, uma massa conhecida das amostras
(cerca de 2,0 g da amostra) foi pesada em frascos Erlenmeyers. Em seguida, foram
adicionados 25mL de uma mistura de éter etílico e álcool etílico (95%) preparada na
proporção 2:1 em volume. Os ácidos livres foram titulados com solução de hidróxido de
potássio (KOH) de concentração 0,01M previamente padronizada, utilizando-se
fenolftaleína como indicador. O índice de acidez foi calculado pela relação entre a massa em
miligramas de hidróxido de potássio consumidos por grama de amostra analisada, conforme
a equação.

($`)ijkl` $al`mni ).bbopq.[opq]

Índice de acidez =
bI:HrdGI

Em que: Vamostra = Volume de solução de KOH gasto na titulação da amostra (mL), Vbranco =
Volume de solução de KOH gasto na titulação do branco (mL), MMKOH = Massa Molar do
KOH (56,1g/mol), [KOH] = Concentração molar da solução de KOH (mol/L), Mamostra =
massa de amostra (g).
O índice de acidez influencia diretamente na síntese de biodiesel por
transesterificação, sendo considerada como matéria-prima ideal óleos e gorduras com índice
de acidez inferior a 2 mg KOH/g óleo (SUAREZ et al., 2009). Sendo assim, a matéria-prima
 108

lipídica está adequada para síntese de biodiesel.

O índice de Iodo de 16-21 g I2/100g do óleo de palmiste também atendeu os
requisitos para ser utilizado na fabricação de biocombustíveis. Estudos efetuados por
KNOTHE (2002) mostraram que valores superiores a 115g I2/100g, indicam menor
estabilidade oxidativa dos óleos, que prejudica sua aplicação industrial.
O índice de peróxido de 1,0 mEq/kg também encontra-se dentro da faixa estabelecida
pela legislação, no qual o máximo permitido é da ordem de 10 mEq/kg (em reações
enzimáticas o valor máximo recomendado é da ordem de 5 mEq/kg) (CARVALHO, 2011).
 109

APÊNDICE B – Atividade hidrolítica da lipase B. cepacia livre e dos derivados

imobilizados em SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-PVA, utilizando diferentes
concentrações de azeite de oliva para determinação dos parâmetros cinéticos.

Porcentagem de azeite na Porcentagem de água na Concentração em ácidos

emulsão (%) emulsão (%) graxos (mM)
10 90 372
20 80 744
30 70 1116
40 60 1488
50 50 1860

AGL Lipase livre Lipase-SiO2- Lipase-SiO2- Lipase-SiO2- Lipase-SiO2-

(mM) (Ug-1) βCD (Ug-1) CMC (Ug-1) HEC (Ug-1) PVA (Ug-1)
372 6289±242 721±37 640±35 650±22 788±15
744 7596 ±97 979±30 867±86 874±38 1077±10
1116 8860±48 1113±11 1161±38 1194±42 1245±15
1488 9483±97 1406±75 1314±55 1332±46 1539±93
1860 10644±187 1637±56 1457±130 1451±133 1661±20
 110

APÊNDICE C – Estabilidade térmica da lipase B. cepacia livre e dos derivados

imobilizados em SiO2-βCD, SiO2-CMC, SiO2-HEC e SiO2-PVA.

Atividade residual da lipase PS livre e dos derivados imobilizados: Lipase-SiO2-βCD,

Lipase-SiO2-CMC, Lipase-SiO2-HEC e Lipase-SiO2-PVA submetidos a tratamento térmico
(50ºC), mediada em meio aquoso (tampão fosfato 0,1M, pH 7,0).

Atividade hidrolítica determinada a 37ºC, tempo de 5 min.

Lipase PS livre
Tempo (h) Atividade hidrolítica % de atividade referente
(Ug-1) à atividade inicial (t=0)
0 10296,1 100
30 7929,9 77,02
60 6744,9 65,51
120 6647,9 64,57
180 6598,4 64,09

Lipase-SiO2-βCD
Tempo (h) Atividade hidrolítica % de atividade referente
(Ug-1) à atividade inicial (t=0)
0 951,14 100
30 947,15 99,58
60 940,49 98,88
120 936,68 98,48
180 931,17 97,90

Lipase-SiO2-CMC
Tempo (h) Atividade hidrolítica % de atividade referente
(Ug-1) à atividade inicial (t=0)
0 890,03 100
30 881,66 99,06
60 874,37 98,24
120 865,20 97,21
180 863,95 97,07
 111

Lipase-SiO2-HEC
Tempo (h) Atividade hidrolítica % de atividade referente
(Ug-1) à atividade inicial (t=0)
0 968,5 100
30 958,91 99,01
60 955,90 98,70
120 951,16 98,21
180 949,23 98,01

Lipase-SiO2-PVA
Tempo (h) Atividade hidrolítica % de atividade referente
(Ug-1) à atividade inicial (t=0)
0 888,25 100
30 884,79 99,61
60 881,86 99,28
120 876,08 98,63
180 873,42 98,33

Tempo Enzima Lipase-SiO2- Lipase-SiO2- Lipase- Lipase-SiO2-

(min) livre βCD CMC SiO2-HEC PVA
% de atividade referente à atividade inicial (t=0)
0 100 100 100 100 100
30 77,02 99,58 99,06 99,01 99,61
60 65,51 98,88 98,24 98,70 99,28
120 64,57 98,48 97,21 98,21 98,63
180 64,09 97,90 97,07 98,01 98,33
 112

APÊNDICE D – Dados referentes aos testes de esterificação do butanol com ácido butírico
para a produção de butirato de butila utilizando diferentes derivados imobilizados.

Perfil da reação de esterificação do butanol com ácido butírico para a produção de butirato
de butila utilizando o derivado imobilizado de Lipase-SiO2-βCD

Lipase-SiO2-βCD
Tempo Concentração de Concentração de Concentração de
(h) butanol butirato de butila ácido butírico
mmol/L g/L mmol/L g/L mmol/L g/L
0 100,32 7,42 0 0 139,79 12,30
3 63,51 4,70 24,45 3,52 109,67 9,65
6 61,28 4,53 33,62 4,84 104,08 9,16
15 38,49 2,84 58,04 8,36 69,00 6,07
18 35,11 2,59 71,17 10,25 63,53 5,59
21 30,35 2,25 76,44 11,01 57,96 5,10
24 27,16 2,01 82,32 11,85 53,07 4,67

Perfil da reação de esterificação do butanol com ácido butírico para a produção de butirato
de butila utilizando o derivado imobilizado de Lipase-SiO2-CMC

Lipase-SiO2-CMC
Tempo Concentração de Concentração de Concentração de
(h) butanol butirato de butila ácido butírico
mmol/L g/L mmol/L g/L mmol/L g/L
0 100,58 7,44 0 0 139,20 12,25
3 88,40 6,54 5,81 0,84 131,94 11,61
6 79,66 5,89 11,35 1,63 124,14 10,92
15 60,12 4,45 29,75 4,28 101,26 8,91
18 54,83 4,06 38,40 5,53 90,74 7,99
21 47,83 3,54 50,37 7,25 77,63 6,86
24 37,12 2,75 68,43 9,85 59,29 5,22

Perfil da reação de esterificação do butanol com ácido butírico para a produção de butirato
de butila utilizando o derivado imobilizado em Lipase-SiO2-HEC

Lipase-SiO2-HEC
Tempo Concentração de Concentração de Concentração de
(h) butanol butirato de butila ácido butírico
mmol/L g/L mmol/L g/L mmol/L g/L
0 100,10 7,41 0 0 139,14 12,24
3 92,34 6,83 5,12 0,74 133,65 11,76
6 80,52 5,96 12,57 1,81 125,11 11,01
15 49,26 3,64 44,08 6,35 96,74 8,51
18 43,60 3,23 55,13 7,94 82,67 7,27
21 37,38 2,77 66,90 9,63 67,45 5,94
24 28,48 2,11 80,01 11,52 54,92 4,83
 113

Perfil da reação de esterificação do butanol com ácido butírico para a produção de butirato
de butila utilizando o derivado imobilizado de Lipase-SiO2-PVA

Lipase-SiO2-PVA
Tempo Concentração de Concentração de Concentração de
(h) butanol butirato de butila ácido butírico
mmol/L g/L mmol/L g/L mmol/L g/L
0 100,40 7,43 0 0 139,58 12,21
3 46,49 3,44 49,58 7,14 89,59 11,63
6 39,46 2,92 59,10 8,51 77,06 11,02
15 33,38 2,47 73,40 10,57 61,85 9,22
18 30,81 2,28 76,67 11,04 58,13 8,89
21 28,51 2,11 80,00 11,52 54,95 8,40
24 25,81 1,91 84,65 12,19 51,14 7,83
 114

APÊNDICE E – Dados referentes aos testes de etanólise do óleo de palmiste, na razão molar
de 1:8, empregando diferentes tipos de derivado imobilizado, 600 unidades de atividade/ g
de óleo, sob agitação magnética a 45ºC.

Massa de enzima=5,57 g
Lipase-SiO2-βCD
Ésteres Concentração de ésteres etílicos (% m/m)
24h 48h 72h
Octanoato de etila (C8:0) 3,28 3,46 3,35
Decanoato de etila (C10:0) 2,76 3,27 3,19
Laurato de etila (C12:0) 27,80 32,41 35,69
Miristato de etila (C14:0) 8,49 9,18 9,68
Palmitato de etila (C16:0) 6,30 6,10 6,30
Estearato de etila (C18:0) 1,40 1,63 1,56
Oleato de etila (C18:1) 6,65 8,51 9,01
Linoleato de etila (C18:2) 2,92 3,01 4,78
Total 59,61 68,58 73,56
Rendimento (%) 79,73 92,43 99,13

Massa de enzima= 6,1g

Lipase-SiO2-CMC
Ésteres Concentração de ésteres etílicos (% m/m)
24h 48h 72h
Octanoato de etila (C8:0) 3,36 3,43 3,55
Decanoato de etila (C10:0) 3,18 3,49 3,49
Laurato de etila (C12:0) 33,62 34,29 35,29
Miristato de etila (C14:0) 9,63 9,79 9,81
Palmitato de etila (C16:0) 6,38 6,48 6,78
Estearato de etila (C18:0) 1,54 1,59 1,61
Oleato de etila (C18:1) 8,61 9,09 9,13
Linoleato de etila (C18:2) 4,16 4,78 4,81
Total 71,29 73,44 73,87
Rendimento (%) 96,08 98,97 99,56
 115

Massa de enzima = 6,0 g

Lipase-SiO2-HEC
Ésteres Concentração de ésteres etílicos (% m/m)
24h 48h 72h
Octanoato de etila (C8:0) 3,21 3,25 3,26
Decanoato de etila (C10:0) 3,49 3,40 3,40
Laurato de etila (C12:0) 32,55 35,69 35,70
Miristato de etila (C14:0) 9,79 10,31 10,32
Palmitato de etila (C16:0) 6,75 6,77 6,77
Estearato de etila (C18:0) 1,50 1,65 1,66
Oleato de etila (C18:1) 6,71 7,06 7,09
Linoleato de etila (C18:2) 3,94 4,25 4,27
Total 67,95 73,40 73,80
Rendimento (%) 91,58 98,92 99,46

Massa de enzima= 5,56 g

Lipase-SiO2-PVA
Ácidos graxos Concentração de ésteres etílicos (% m/m)
24h 48h 72h
Octanoato de etila (C8:0) 2,54 3,09 3,54
Decanoato de etila (C10:0) 2,93 3,29 3,45
Laurato de etila (C12:0) 29,00 33,56 35,86
Miristato de etila (C14:0) 8,40 9,13 9,62
Palmitato de etila (C16:0) 5,86 6,16 6,28
Estearato de etila (C18:0) 1,19 1,35 1,51
Oleato de etila (C18:1) 7,13 8,08 8,29
Linoleato de etila (C18:2) 4,04 4,12 4,32
Total 61,19 69,95 73,90
Rendimento (%) 82,47 94,27 99,60
 116

APÊNDICE F – Viscosidade do biodiesel catalisado pelos derivados imobilizados Lipase-

SiO2-βCD, Lipase-SiO2-CMC, Lipase-SiO2-HEC e Lipase-SiO2-PVA, utilizando óleo de
palmiste e etanol, na razão molar de 1:8, sob agitação magnética a 45ºC.

Biocatalisador Viscosidade Densidade Viscosidade

utilizado dinâmica (cP) (kg m-3) cinemática (mm2/s)
Lipase-SiO2-βCD 3,49 870 4,01
Lipase-SiO2-CMC 3,49 870 4,01
Lipase-SiO2-HEC 3,41 869 3,92
Lipase-SiO2-PVA 3,34 870 3,84