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    Determinacao de Proteina Bruta - Prof Nathan

    Enviado por

    LourivalMartins
    O documento descreve métodos para determinar o teor de proteína bruta em grãos, incluindo o método de Kjeldahl, que converte nitrogênio em amônia. Vários métodos são baseados na interação entre proteínas e reagentes que formam compostos coloridos mensuráveis, como os métodos de Biureto, Ácido Bicinconínico e Lowry. O documento também discute as principais proteínas encontradas em diferentes cereais como trigo, cevada e arroz.

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    Determinacao de Proteina Bruta - Prof Nathan

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    O documento descreve métodos para determinar o teor de proteína bruta em grãos, incluindo o método de Kjeldahl, que converte nitrogênio em amônia. Vários métodos são baseados na interação entre proteínas e reagentes que formam compostos coloridos mensuráveis, como os métodos de Biureto, Ácido Bicinconínico e Lowry. O documento também discute as principais proteínas encontradas em diferentes cereais como trigo, cevada e arroz.

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    Determinacao de Proteina Bruta - Prof Nathan

    Enviado por

    LourivalMartins
    O documento descreve métodos para determinar o teor de proteína bruta em grãos, incluindo o método de Kjeldahl, que converte nitrogênio em amônia. Vários métodos são baseados na interação entre proteínas e reagentes que formam compostos coloridos mensuráveis, como os métodos de Biureto, Ácido Bicinconínico e Lowry. O documento também discute as principais proteínas encontradas em diferentes cereais como trigo, cevada e arroz.

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    Determinação de proteína bruta

    em grãos
    Prof. Nathan Levien Vanier
    Eng. Agrônomo, Dr.

    Faculdade de Agronomia
    “Eliseu Maciel”
    Proteínas são polímeros de aminoácidos

    Grupamento carboxila
    COO-

    H3N+ C H
    Grupamento amino
    R Radical
    Grupos R apolares, alifáticos
    Grupos R polares, não carregados

    Grupos R Grupos R
    Grupos R aromáticos
    carregados
    carregados
    positivamente
    negativamente
    Estrutura de proteínas

    Fonte: Delcour e Hoseney, Principles of Cereal Sci. and Tech. 3ª Ed., 2010.
    Aminoácidos essenciais
    ➢ Histidina
    ➢ Isoleucina
    ➢ Leucina
    ➢ Lisina
    ➢ Metionina
    ➢ Fenilalanina
    ➢ Treonina
    ➢ Triptofano
    ➢ Valina

    Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.


    Proteínas em cereais

    Espécie Teor de Principal proteína de reserva


    proteína dos
    grãos (% bs)
    1. Trigo ~11 Prolaminas (gliadinas) e Glutelinas
    (gluteninas)
    2. Cevada ~11 Prolaminas (Hordeína)
    3. Centeio ~9 Prolaminas (Secalina)
    4. Aveia ~10 Globulinas
    5. Milho ~ 10 Prolaminas (Zeína)
    6. Sorgo ~8,5 Prolaminas (Kafirina)
    7. Arroz ~7,5 Glutelinas (Oryzenína)

    Fonte: FAO – Food and Agriculture Organization, 1991, disponível em


    http://www.fao.org/docrep/x2184e/x2184e04.htm
    Proteínas em trigo

    Prolaminas (gliadinas)

    Globulinas (triticina)
    Globulinas (triticina)

    Trigo 11 dias após o florescimento, apresentando inclusões de triticina (I)


    em uma matriz de prolamina (M).

    Fonte: Shewry e Halford, J. of Exp. Botany, v. 53, p. 947-958, 2002.


    Proteínas em trigo

    Trigo duro Trigo mole


    Proteínas em trigo
    Composição de AAs do glúten e de suas frações após hidrólise
    ácida com HCl 6 M a 110°C por 24 h, seguido de evaporação,
    filtração, diluição e separação por HPAEC-IPAD.

    Fonte: Rombouts et al., J. of Chromat. A., v. 1216, p. 5557-5562, 2009.


    Proteínas em arroz

    Fonte: Paiva, F. F., Tese de Doutorado, PPGCTA-UFPEL, 2014.


    Principais aminoácidos das proteínas do arroz
    Perfil de aminoácidos em diferentes cultivares de arroz.

    Os grupamentos amida promovem agregação de proteínas,


    reduzindo sua flexibilidade e solubilidade.

    Fonte: Houston et al., AACC Anual Meeting, 1968.


    Isolados proteicos de soja

    Isolado proteico de soja

    Isolado proteico de soja Isolado proteico de soja Isolado proteico de soja


    tratada a 40°C por 16 h tratada a 60°C por 16 h

    Fonte: Wally-Vallim et al., J. Food Sci., v. 79, p. E1351-E1358, 2014.


    Métodos de determinação do teor de
    proteína bruta
    1. Kjeldahl/Micro-Kjeldahl
    2. Biureto
    3. Ácido bicinconínico (BCA)
    4. Lowry
    5. Bradford
    6. Ninidrina
    7. Medição de turbidez
    8. Dumas
    9. Ultravioleta
    10. Ouro coloidal (colloidal gold)
    11. Infravermelho
    12. Fluorescência
    Método Princípio Vantagens Limitações Referências

    Kjeldahl/ N é convertido em Método N não proteico AOAC


    Micro- NH3, o qual é oficial que deve ser (1995)
    Kjeldahl coletado em excesso determina determinado
    de ácido para diretamente separadamente,
    determinação de N o teor de N. caro, demorado,
    por titulação. N x Universal. requer
    fator = % proteína treinamento.
    Biureto Íons cúpricos, sob Rápido, Interferentes: Robinson e
    condições alcalinas, barato. agentes de Hodgen
    interagem com ligações precipitação (1940)
    peptídicas para proteica, agentes
    produzir compostos redutores, fibras,
    arroxeados, aditivos, pigmentos
    mensurados a 540 nm. e minerais.
    Ácido Redução do cobre a íons Rápido, Agentes redutores Smith et al.
    bicinconínico cúpricos (Cu1+) por relativamente podem interferir na (1985)
    (BCA) proteínas em condições barato, reação. Coloração
    alcalinas, produzindo reagentes não formada é instável.
    compostos arroxeados, interferem na
    mensurados a 560 nm. quantificação
    BCA age como reagente (sais,
    capturador de Cu1+ em guanidina-
    vez de Folin-Ciocalteau. HCl, ureia).

    Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.


    Método Princípio Vantagens Limitações Referências

    Lowry Cobre alcalino reage Rápido, Proteína deve ser Lowry et al.
    com ligações peptídicas barato, menos solúvel em pH 10. (1951)
    + redução com Folin- interferentes Agentes redutores Seevaratnam
    Ciocalteau por por causa de interferem. Requer et al. (2009)
    aminoácidos turbidez. mistura rápida
    aromáticos (Tryp e (<10s) com Folin
    Tyr). O complexo de para ser
    coloração azulada é reprodutível. Cor
    avaliada a 750 nm. não é proporcional
    ao teor de proteína.
    Bradford Para uma solução ácida Rápido, Tampões alcalinos Bradford
    de Comassie Blue G- preciso, sais e fortes e SDS (1976)
    250, a absorbância reagentes que (>0,1%)
    áxima varia de 465 a interferem em interferem.
    595 nm quando o Lowry não
    corante se liga a interferem
    proteína. neste método.
    Ninidrina Aminoácidos, amônia e Mais simples Aminas primárias, Spackman et
    grupamentos amino do que amônia, e al. (1958)
    primários reagem com Kjeldahl. Pode aminoácidos livre
    ninidrina em pH 5,5. ser usado para podem interferir. A
    quantificar cor varia.
    AA.

    Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.


    Método Princípio Vantagens Limitações Referências

    Medição de Baixas concentrações de Simples e Ácidos nucléicos Layne


    turbidez TCA, SSA e rápido. interferem. Utiliza (1957)
    Ferrocianeto de reagentes corrosivos. Wieser
    Potássio são utilizados (2000)
    para precipitar as
    proteínas, formando
    uma suspensão túrbida.
    A turbidez é mensurada
    como redução de
    absorbância a 540 nm.
    Dumas Amostra é queimada Não utiliza Necessita bastante Simonne
    a altas temperaturas químicos. amostra para et al.
    (700-800°C) e o Método análise e (1997) e
    nitrogênio liberado rápido. instrumento caro. Miller et
    é quantificado Resultados Determina al. (2007)
    (cromatografia comparáveis nitrogênio total
    gasosa) ao Kjeldahl. (proteico e não
    proteico)
    Ultravioleta Alta absorção a 280 nm Rápido, Coeficiente de extinção Stoschek
    (UV) de triptofano e tirosina barato, não molar a 280 nm do (1990) e
    presentes nas proteínas. destrutivo, Trip. e da Tir. deveria Sanchez-
    Lei de Beer é utilizada livre da ser calculado para cada Martínez et
    para quantificação. interferência proteína. Interferência al. (2009)
    de sais de fenóis, ácidos
    nucléicos e outros.
    Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.
    Método Princípio Vantagens Limitações Referências

    Infravermelho Absorção da energia Rápido. Alto custo do Wesley et


    de radiação das equipamento. al. (2001),
    proteínas nas Kim et al.
    regiões próximas (2007),
    (3300-3500 nm, Prieto et
    2080-2220 nm, al. (2009)
    1560-1670 nm) ou
    pertencentes (6,47
    µm) ao IV.
    Fluorescência Reagentes específicos Rápido, Equipamento com Benson e
    (OPA, ANS...) sensível, custo elevado. Hare (1975),
    produzem derivados estável. Substâncias não Petersen
    fluorescentes. Como proteicas que (1983),
    exemplo, OPA reage apresentam Nielsen et al.
    com NH2 terminal dos fluorescência (2001), Held
    aminoácidos e grupos ε- interferem. (2006)
    amino dos resíduos de Estabilidade dos
    lisina. A leitura da produtos
    fluorescência é fluorescentes é
    geralmente feita a 450 maior nos
    nm. hidrolisados do que
    nas proteínas
    nativas.

    Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.


    Métodos de determinação do
    Método de Kjeldahl
    teor de proteína bruta

    Etapas do método:

    1. Preparo e pesagem de amostra


    2. Adição de reagentes
    3. Digestão
    4. Destilação da amônia
    5. Titulação

    Fonte: Ötleş, Methods of Analysis of Food Comp. And Additives, 2012.


    Métodos de determinação do
    Método de Kjeldahl
    teor de proteína bruta
    ~0,2 g de amostra
    5 mL H2SO4
    2 g de mistura catalítica

    - Digestão por 4 h a 350ºC


    - Repouso 1 h
    Métodos de determinação do
    Método de Kjeldahl
    teor de proteína bruta

    Função dos reagentes na etapa de digestão:

    H2SO4 → promove a oxidação de compostos orgânicos à CO2 e água, e


    induz a quebra e transformação de compostos nitrogenados em amônia
    livre, a qual é complexada na forma de sulfeto de amônio.

    Sais (K2SO4, Na2SO4) → necessário para elevar a temperatura de digestão.

    Catalisadores → aceleram a oxidação. Incluem: metais (Hg, Cu, Se);


    óxidos (CuO, HgO, P2O5, TiO2); peróxidos (H2O2); sais (CuSO4, Hg2SO4).

    Fonte: Ötleş, Methods of Analysis of Food Comp. And Additives, 2012.


    Métodos de determinação do
    Método de Kjeldahl
    teor de proteína bruta
    Reações:
    25 mL NaOH
    (NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+2H2O+Na2SO4

    NH3+H3BO3→NH4H2BO3

    10 mL H3BO3
    Indicador misto
    Métodos de determinação do
    Método de Kjeldahl
    teor de proteína bruta

    Titulação com HCl 0,1 N


    (verde → rosa)

    NH4H2BO3+HCl→H3BO3+NH4Cl

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