Ed - CANCER DE PÊNIS Apresentação PAULINHA 2

Rede de
Biodiversidade e
Biotecnologia da
Amazônia Legal –
BIONORTE
❖ Washington Lima
❖ Paula Lauande
GENÉTICA DO
CÂNCER
Rede de Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal – BIONORTE
2
CASUÍSTICA
Incidência do
Câncer de pênis – Falta de higiene, Mecanismos
aumenta em todo o moleculares X
mundo. fimose e a não
circuncisão. progressão dos
Taxas mais altas- tumores: Não
países estão claros!
subdesenvolvidos.
3
OBJETIVOS
Fatores clínicos e
CNAs EXPRESSÃO histopatológicos
no PeCa GÊNICA associados ao
PeCa.
4
ALTERAÇÕES NO
GENOTIPAGEM NÚMERO DE
DO HPV CÓPIAS EM TODO
O GENOMA
DESENHO
GERAL
ANÁLISE DO ANÁLISE
NÚMERO DE CÓPIAS IMUNO-
DO TAQMAN
HISTOQUÍMICA
5
MATERIAIS E
MÉTODOS
ACRÉSCIMO DE PACIENTES E DADOS
SOCIAIS CLÍNICOS E PATOLÓGICOS
PACIENTES COM PeCa – n=55 Faixa etária-61 18
CONEP-BRASIL
HOSPITAL ALDENORA BELLO- (23 a 103). Maioria Casado-
e COMITÊ DE ÉTICA EM
2013 a 2016 71%
PESQUISA EM HUMANOS DA
Baixo nível de escolaridade
UFMA
50% bebiam álcool Amostras: Tecidos tumorais Tumores CARCINOMA

regularmente. Principal frescos e FFPE ESPINOCELULAR (36,4%
ocupação agriculturista- (antes de qualquer tratamento glande).
pescador 60,4% de câncer) Tamanho 4,07+-2,38cm
Achados histopatológicos mais

comuns: Maioria dos pacientes Penectomia parcial e total
Usuais 47,3%, condilomatosos apresentou fimose – 69% foram realizadas 70,9% e
29,1% e tumores grau II 24% menores de 40 anos. 23,6%, respectivamente.
62,3%. 7
GENOTIPAGEM DO HPV
DNA genômico- método NESTED-PCR (BIOGENETICS
MOLECULAR TECHNOLOGIES)
fenol-clorofórmio
1ª rodada-primer de consenso • Gene da β-globina(BGS1 e

MY09 e 9 primers modificados BGA2) controle +
MY09/11
2ª amplificação PCR- 40 primers
específicos e marcados com
fluoróforos
Produto foi detectado por eletroforese capilar.

Genotipagem do HPV –realizada por sequenciamento
de DNA
Análise de dados (Mega 6,0 /GEnBank/NCBI/Blast)8
ALTERAÇÕES NO NÚMERO DE CÓPIAS EM
TODO O GENOMA
❑ ACGH (HIDRIDIZAÇÃO GENÔMICA
COMPARATIVA ARRAY) –
❑ ENZIMAS ALU I E RSA E MARCADAS

DIRETAMENTE USANDO CYANINA 5 E 3,
RESPECTIVAMENTE.
Fonte: https://genetica.hupes.ufba.br/hibridizacao-
genomica-comparativa-em-array-acgh
9
ANÁLISE DO NÚMERO DE CÓPIAS DO TaqMan
A análise do O número de O Dna foi

número de pacientes variou isolado de Triplicata
cópias dos de acordo com o amostras de
ensaio genético: tecido FFPE não
genes Gene de
envolvidos na • AKT1 n=33 coradas, referência-
• AKT2 n=33 desparafinizadas
via de RNASE
• EGFR n=32 e desidratadas
sinalização (kit Dneasy
PI3K/AKT • ERBB4 n=34 Análise da dados-
• PIK3CA n=32 QIAGEN)
foi realizada software Copy
por TaqMan. • PTEN n=33 O qPCR foi Caller
realizado em
uma placa de 96
poços (ABI 7500
Fast). 10
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA
• O RNA foi isolado das seções do tecido FFPE não coradas,
desparafinadas e desidratadas , utilizando o kit Ambion.
• DNA complementar cDNA foi obtido usando o KIT DE

TRANSCRIÇÃO REVERSA cDNA de alta capacidade
Thermofisher.
• A análise da expressão gênica foi realizada pela Taqman

Universal PCR Mix II e as reações de amplificação foram
realizadas no termociclador ABI 7500 Fast com 100ng de
cDNA e 0,5 µL de primer e sonda para genes alvo (EGFR,
COX2,TP53 e RB1)
Triplicata e controle https://www.thermofisher.com/order/catalog/produc
negativo sem
modelo de DNA
t/4374966
11
ANÁLISE IMUNO HISTOQUÍMICA
TMA- a partir de blocos tumorais
Núcleos medindo 4mm retirados da área central do tumor.
Nove núcleos colocados em um novo bloco receptor.
Total= 42 amostras de tumores.
Igualmente para tecidos usados em controle negativo e positivo= foram colocados em um novo
bloco
ANTI-EGFR ANTI-COX2 ANTI-PGE2 ANTI-P53

(CLONE SPM341) (CLONE SP21) (POLICLONAL) (PAb240)
As proteínas foram avaliadas na membrana, citoplasma e núcleo.

Controle positivo: placenta (EGFR), adenocarcinoma de pulmão (COX2), intestino (PGE2) e
linfoma (p53).
Controle negativo: mesmo tecidos sem anticorpos. 12
ANÁLISE ESTATÍSTICA
• Análise da associação entre cada

parâmetro histopatológico e dados
moleculares foi realizada utilizando:
• Testes bivariados X2 Pearson ou teste

exato de Fisher (quando aplicável) Fonte da imagem: http://www.dicas-spss.com/?p=375
• Nível de significância P ˂ 0,05
• Testes estatísticos – STATA versão 12 e

Graphpad Prism v.7
Fonte da imagem:
Imagem:
https://www.statanordic.com/product.html?product_id=6646
https://www.utep.edu/technologysupport/ServiceCat
alog/SOFTWARE_PAGES/soft_graphpadprism.html.
RESULTADOS/DISCUSSÃO
1. Alta frequência de hrHPV em PeCa
2. Alto nível de CNA em locais de integração de HPV em hrHPV
PeCa
3. CNAs estão associados a sítios de HPV integração e PeCa
avançado
14
RESULTADOS/DISCUSSÃO
1. ERBB3 e EGFR apresentam altos níveis de amplificação em
hrHPV PeCa
2. Os genes associados à inflamação são super-expressos, enquanto
os genes relacionados ao HPV são sub-expressos no hrHPV PeCa
15
ALTA FREQUÊNCIA de hr(HPV) em
PeCa
ACHADOS PeCa (%)
rh(HPV) 88,6
HPV (positivo) 81,8
HPV -16 61,4

HPV (+infecções) 36,4
16
Alto nível de CNA em locais de
integração de HPV em hrHPV PeCa
A análise de aCGH (n = 20) revelou 1395 CNAs,
com média de 69,8 ± 39,0 por caso (variando
de 27 a 166)
dos quais 955 foram ganhos (68,5%),
338 perdas (24,2%)
67 amplificações (4,8%)
e 35 deleções (2,5%). 17
CNAs estão associados a sítios de
HPV integração e PeCa avançado
A Tabela 2 apresenta as citobandas afetadas e sua

associação com aspectos clínicos e histopatológicos
18
ERBB3 e EGFR apresentam altos níveis
de amplificação em hr(HPV) PeCa
Os genes com maior número de CNA foram

o ERBB3 e EGFR (amplificado em 97% e
65,6% dos casos, respectivamente) seguido
por AKT2, PIK3CA e PTEN
VEJA GRÁFICOS ABAIXO:

19
Expressão gênica para os genes inflamatórios (EGFR e COX2)
Associados à infecção por HPV (RB1 e TP53) (B) no câncer de pênis

20
OS GENES ASSOCIADOS À INFLAMAÇÃO SÃO SUPER-
EXPRESSOS, ENQUANTO OS GENES RELACIONADOS AO
HPV SÃO SUB-EXPRESSOS no hr(HPV) PeCa
97,3% e 94,3% dos tumores apresentaram

aumento expressão de EGFR e COX2.
Por outro lado, TP53 e RB1 apresentaram

downregulation em 83,3% e 62,8% das
amostras, respectivamente.
21
CONCLUSÕES
1. Foi observada maior frequência de HPV (96,4%),
principalmente de alto risco subtipos (88,6%) e de
múltiplos infecciosos (36,4%).
2. Genótipo O HPV16 foi apresentado na maioria dos
pacientes (61%), seguido pelos subtipos 59, 74 e 35
22
CONCLUSÕES
3. As alterações no cromossomo 14 encontradas neste estudo abrangem
amplificações para três longos RNAs não codificantes (lncRNAs),
LINC00226, LINC00221 e KIAA0125, gene ADAM6 e miR7641-2.
4. Esses dados sugerem que o HPV também pode controlar a expressão
de p53 e oncoproteínas RB através de outros mecanismos além do
HPV/ Via de sinalização TP53/RB1 que impulsiona a tumorigênese
23
CONCLUSÕES
5. De fato, estudos descreveram mecanismos epigenéticos aberrantes nas células
hospedeiras mediadas pelo HPV como metilação do DNA, modificações de histonas,
proteínas de remodelação da cromatina e ncRNAs;
6. Essas modificações levam à expressão gênica anormal em tecido carcinomas

associados a HPV pela ativação de oncogenes e elementos, que, por sua vez, levam à
perda do imprinting ou à inativação de genes supressores de tumor.
24
CONCLUSÕES
7. Outros autores que sugeriram que infecções podem atuar
promovendo o estabelecimento de PeCa por diferentes mecanismos.
8. O eixo COX2/PGE2/EP aparece como uma chave NÃO apenas na

iniciação e progressão do tumor, mas também no desenvolvimento de
resistência terapêutica;
25
CONCLUSÕES
9 . Além disso o gene EGFR (localizado em 7p11.2) foi encontrado em
associação com COX2/PGE2 e EGFR, a expressão da COX2 foi associada à
regulação positiva de EGFR na progressão do carcinoma colorretal.
10. Tendo em conta a alta frequência de amplificação de EGFR e
considerando o papel da família EGFR na sinalização de várias vias, como o
aumento das cópias do gene ERBB3 em 100% dos tumores
26
CONCLUSÕES
11 . O estudo revelou que a amplificação dos genes EGFR e ERBB3 é um dos
mecanismos genéticos que podem estar envolvidos no estabelecimento e/ou
progressão do hr(HPV) no PeCa.
12. É digno de nota que os pacientes com PeCa que apresentam Super-expressão
de EGFR apresentam prognóstico ruim e maior taxa de mortalidade por câncer.
27
REFERÊNCIAS
28
OBRIGADO
29

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50% bebiam álcool Amostras: Tecidos tumorais Tumores CARCINOMA

Achados histopatológicos mais

1ª rodada-primer de consenso • Gene da β-globina(BGS1 e

Produto foi detectado por eletroforese capilar.

❑ ENZIMAS ALU I E RSA E MARCADAS

A análise do O número de O Dna foi

• DNA complementar cDNA foi obtido usando o KIT DE

• A análise da expressão gênica foi realizada pela Taqman

ANTI-EGFR ANTI-COX2 ANTI-PGE2 ANTI-P53

As proteínas foram avaliadas na membrana, citoplasma e núcleo.

• Análise da associação entre cada

• Testes bivariados X2 Pearson ou teste

• Nível de significância P ˂ 0,05

• Testes estatísticos – STATA versão 12 e

HPV (positivo) 81,8

HPV -16 61,4

A Tabela 2 apresenta as citobandas afetadas e sua

Os genes com maior número de CNA foram

VEJA GRÁFICOS ABAIXO:

Associados à infecção por HPV (RB1 e TP53) (B) no câncer de pênis

97,3% e 94,3% dos tumores apresentaram

Por outro lado, TP53 e RB1 apresentaram

6. Essas modificações levam à expressão gênica anormal em tecido carcinomas

8. O eixo COX2/PGE2/EP aparece como uma chave NÃO apenas na

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