Microarrays
Microarrays
Microarrays
ndice
Histria
Microarrays
Como funciona
Sondas
Design Experimental
Bioinformtica
Anlise de dados
Aplicaes
Histria
As ferramentas necessrias para estudar o RNA esto disponveis h anos, como Northern blots, RT-PCR , ESTs, e SAGE .
O primeiro microarray surgiu na dcada de 80 e evoluiu da tcnica de Southern blotting e Northern blotting.
1995
Traou-se o prefil de expressao gnica pela primera vez.
1997
Inseriu-se o genoma completo da Saccharomyces cerevisiae num microarray.
2004
Conseguiu inserir-se o genoma humano inteiro num microarray.
Uma quantificao rpida e rentvel do transcriptoma tornou-se possvel devido ao desenvolvimento de microarrays de expresso gnica.
Microarrays
Os microarrays baseiam-se na capacidade de cadeias complementares de DNA se hibridarem uma em torno da outra numa soluo com elevada especificidade.
Microarrays
Tipos de Microarrays
Microarrays de baixa densidade (spotted DNA microarrays)
-1.000 a 10.000 spots por cm2 - Estudo de parte do genoma - Sondas: cDNA, mRNA ou oligonucletidos 50-80pb
Microarrays
Suportes
Lminas de plstico Chips Lminas de vidro + resistente s elevadas temperaturas de hibridao + no-poroso + tem autofluorescncia baixa + boa geometria + passivo na fabricao de arrays de elevada densidade - superfcie planar tem uma capacidade de carga baixa - a ligao ao DNA no eficiente quimicamente.
Materiais porosos: Nitrocelulose, Nylon e Acrilamida + imobilizao de maiores quantidades de alvos + maior rea de superfcie -> mais sensvel
cDNA
Hibridza!
Maior fluorescncia
Menor fluorescncia
E se no se observa fluorescncia?
Gene Inactivo
Sondas
Sondas
cDNA
Oligonucletidos
Pr-sintetizada
In situ
Sondas
Sonda de cDNA
Sequncias conhecidas de cDNAs so depositados nos poos do microarray e utilizadas como sondas .
Sondas
Sonda de Oligonucletidos
Sequncias de oligonucletidos so concebidas para representar um gene ou um transcripto de interesse.
H dois tipos
Longos
(60 bases)
Longos To sensveis e quase to especficas como as sondas cDNA. Produzidos pela Agilent.
Curtos
(25 bases)
Sondas
Sonda de Oligonucletidos Curtos
O processo de manufactura da Affymetrix restringe o tamanho das sondas a 20-25 nucletidos. Para cada gene h 16 sondas com aproximadamente 25 nucletidos. As sondas complementares chamam-se Perfect Match (PM) e so emparelhadas com sondas MisMatch (MM). O resultado obtido para um dado gene a mdia entre os sinais PM e MM.
Vantagens e Desvantagens
cDNA No necessrio conhecer previamente a sequncia; Elevada especificidade;
Isolamento e purificao prvia; As sequncias mais longas podem ter hibridao cruzada com outros genes ;
Oligonucletidos
Vantagens
No necessrio isolar nem purificar o DNA; Menos reactivos com as sequncias das amostras a utilizar ;
Necessrio conhecer as sequncias previamente; Menor especificidade; Demora mais tempo;
Desvantagens
Desing Experimental
Comparao entre duas amostras
Hiptese
Escolha do Mircroarray
Marcadores
RESULTADOS
cDNA
Escolha do Microarray
Marcadores
directa: sondas
mais utilizados.
Marcao indirecta: O mRNA trancripto reversamente presena na de
aminoalil-dNTPS que
HIBRIDIZAO Temperaturas elevadas (42C- 60C) Concentrao salina e ph da soluo tampo adequado 12h-20h Agentes desnaturantes Formamida (diminuitemperatura de anealing)
LAVAGEM
Controlos
REFERNCIA Uma aliquiota de RNA de referncia hibridizada com cada array. A intensidade da amostra medida relativamente intensidade do RNA de referncia.
DESIGN DE BLOCOS A amostra hibridizada com marcadores diferentes de modo a eliminar interferncias provocadas por cada marcador
Recursos bioinformticos
Dificuldade na troca de data sobre microarrays
Analises estatsticas
Analise de Dados
Segmentao do spot
Verifica-se se o pixel pertence regio do sinal ou ao background
Analise de Dados
Quantificao da intensidade
Correco do background modo a remover erros. de
do
Analise de Dados
genes expressos nas clulas saudveis
Amarelo: genes expressos nas duas clulas. Preto: genes no expressos nos casos estudados.
Analise de Dados
Normalizao
Os erros sistemticos podem afectar a determinao dos nveis de expresso gnica.
Determinao da quantidade de genes do canal vermelho que esto sobre ou sub-expressos comparativamente ao canal verde.
Rjk ajustamento do background do sinal vermelho Gjk ajustamento do background do sinal verde Cjk factor de normalizao
Aplicaes
Transcritoma
O que ?
Conjunto de todos os genes que esto a ser expressos, num dado instante e numa dada clula. A sua caracterizao passa por identificar RNAs e determinar as suas abundancias relativas. Os genes mais expressos vo ter mais transcritos convertidos a cDNA marcado ; cDNA mais abundantes vo se ligar mais s sondas que aqueles de genes menos expressos; Os genes que so expressos ao mesmo nvel tero quantidades equivalentes de transcrito ligados s sondas.
Aplicaes
Deteco de mutaes e SNPs
Crucial sequenciar fragmentos (RT-PCR tem uma taxa de erro associada)
Polimorfismo de um nucletido Conservados ao longo da evoluo Podem ser usados como marcadores de gentipos
Caso particular: SNPs (Sondas so especificas) SNPs: sequncias de DNA que diferem apenas num nucletido entre pares de cromossomas ou diferentes espcies; Baaj Y. et al, 2008: sondas em hairloop maior especificidade
Podem ser detectadas determinadas doenas, ainda antes dos primeiros sintomas pela deteco de um marcador gentico ou de uma mutao.
Bibliografia
http://bib.oxfordjournals.org/content/4/4/361.full.pdf http://www.genome.gov/10000533 www.affymetrix.com http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15952881 http://discover.nci.nih.gov/microarrayAnalysis/Experimental.Design.jsp http://linus.nci.nih.gov/techreport/BiotechniquesSimon.pdf http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/