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Nanoscopia com Luz Focada

Palestra Nobel, 8 de dezembro de 2014
por Stefan W. Hell
Instituto Max Planck de Química Biofísica, Departamento de NanoBiofotônica, Am

Fassberg 11, 37077 Göttingen, Alemanha e Centro Alemão de Pesquisa do Câncer
(DKFZ), Divisão de Nanoscopia Óptica, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Alemanha.
Todos conhecemos o ditado

e “ver para crer”. Não“uma
só seimagem
aplicamvale mais que
às nossas mildiárias,
vidas palavras”
mas certamente
também às ciências naturais. Portanto, provavelmente não é por acaso que o início
histórico das ciências naturais modernas coincide muito com a invenção da
microscopia de luz. Com o microscópio de luz, a humanidade pôde ver pela primeira
vez que todo ser vivo consiste em células como unidades básicas de estrutura e
função; bactérias foram descobertas com o microscópio de luz, e também mitocôndrias
como exemplos de organelas subcelulares.
No entanto, aprendemos no ensino médio que a resolução de um microscópio
de luz é limitada a cerca de metade do comprimento de onda da luz em uso [1–4],
que normalmente equivale a cerca de 200–350 nanômetros (Fig. 1). Se queremos
ver detalhes de coisas menores, como vírus, temos que recorrer à microscopia eletrônica.
A microscopia eletrônica alcançou uma resolução espacial muito maior — dez vezes,
cem vezes ou mesmo mil vezes maior; na verdade, até o tamanho de uma única
molécula. Então surge a pergunta: por que nos incomodamos com o microscópio de
luz e sua resolução espacial, agora que temos o microscópio eletrônico?
A resposta a esta pergunta é dada na Fig. 2, onde conduzi um pequeno
“experimento”. Eu contei o número de artigos publicados nesta edição da Nature
Medicine onde um microscópio de luz foi usado e onde um microscópio eletrônico foi
usado. O vencedor claro foi a microscopia de luz, que continua sendo a técnica de
microscopia mais popular nas ciências da vida. Isto é por duas razões fortes.
159
160 Os prêmios Nobel
FIGURA 1. Escalas de comprimento e limites de resolução espacial de inspeção visual (olho

humano), microscopia óptica (ótica) e microscopia eletrônica. A nanoscopia óptica de campo distante
estende a resolução muito além do limite de Abbe de metade do comprimento de onda da luz usada
(~ 200 nanômetros).
A primeira razão é que a microscopia de luz é a única maneira pela qual podemos olhar
dentro de uma célula viva, ou mesmo de tecidos vivos, em três dimensões; é minimamente
invasivo. Mas, há outra razão. Quando olhamos para uma célula, geralmente estamos
interessados em uma certa espécie de proteínas ou outras biomoléculas, e temos que
diferenciar essa espécie das demais – temos que “destacar” essas proteínas [5]. Isso ocorre
porque, à luz ou aos elétrons, todas as proteínas parecem iguais.
Na microscopia de luz, esse “destaque” é facilmente viável anexando uma molécula
fuo rescent à biomolécula de interesse [6]. É importante ressaltar que uma molécula
fuorescente (Fig. 2, [7]) tem, entre outros, dois estados fundamentais: um estado fundamental
e um estado fuorescente excitado com maior energia. Se lançarmos luz de um comprimento
de onda adequado sobre ela, por exemplo, luz verde, ela pode absorver um fóton verde para
que a molécula seja elevada de seu estado fundamental para o estado excitado. Logo
depois, os átomos da molécula se mexem um pouco – é por isso que as moléculas têm
subestados vibracionais – mas dentro de alguns nanossegundos, a molécula relaxa de volta
ao estado fundamental emitindo um fóton de fuorescência.

Como parte da energia do fóton absorvido (verde) é perdida no movimento dos átomos,
o fóton de fuorescência é desviado para o vermelho no comprimento de onda, mostrado
como laranja na Fig. 2. Isso é realmente muito conveniente, porque agora podemos
Nanoscopia com Luz Focada 161
FIGURA 2. A microscopia de luz continua sendo o método de microscopia mais popular nas
ciências da vida, devido a uma série de vantagens distintas, como imagem de células vivas e
especificidade biomolecular. Este último é fornecido pela marcação das biomoléculas de interesse
com marcadores fluorescentes, permitindo sua detecção específica da espécie no microscópio.
separar facilmente a fuorescência da luz de excitação, a luz com a qual a célula é

iluminada. Essa mudança no comprimento de onda torna a microscopia de fuorescência
extremamente sensível. Na verdade, pode ser tão sensível que se pode detectar uma
única molécula, como foi descoberto através dos trabalhos do meu co-laureado WE
Moerner [8], de Michel Orrit [9] e seus colaboradores.
No entanto, se uma segunda molécula, uma terceira molécula, uma quarta molécula,
uma molécula ffh e assim por diante estiverem posicionadas mais próximas do que cerca
de 200 a 350 nanômetros, não podemos distingui-las, porque elas aparecem no
microscópio como um único borrão. Portanto, é importante ter em mente que a resolução
consiste em diferenciar os recursos; trata-se de distingui-los. A resolução não deve ser
confundida com a sensibilidade de detecção, pois trata-se de ver características
diferentes como entidades separadas.
Agora é fácil perceber que muita informação é perdida se olharmos para uma célula
com um microscópio de fuorescência: qualquer coisa que esteja abaixo da escala de
200 nanômetros parece borrada. Conseqüentemente, se alguém conseguir criar um
microscópio de fuorescência de foco (campo distante) que tenha uma resolução espacial
muito maior, isso teria um tremendo impacto nas ciências da vida e além.
Em um primeiro passo, temos que entender por que a resolução de um microscópio
convencional de focagem de luz é limitada. Em termos simples, pode ser explicado como
FIGURA 3. A focalização da luz pela lente do microscópio (objetiva) não pode ocorrer com mais precisão
do que o limite de Abbe. Como resultado, todas as moléculas dentro dessa região limitada por difração
são iluminadas juntas, emitem virtualmente juntas e não podem ser distinguidas.
segue. O elemento mais importante de um microscópio de luz é a lente objetiva (Fig. 3). O
papel dessa lente objetiva é simplesmente concentrar a luz no espaço, focalizar a luz até um
ponto. No entanto, como a luz se propaga como uma onda, não é possível que a lente
concentre a luz em um único ponto. Em vez disso, a luz será difratada, “manchada” na região
focal, formando um ponto de luz que tem – no mínimo – cerca de 200 nanômetros de largura
e cerca de 500 nanômetros ao longo do eixo óptico [10]. Isso tem uma consequência
importante: se várias feições estiverem nessa região, todas serão alimentadas com essa luz
ao mesmo tempo e, portanto, produzirão sinais simultaneamente. No caso de cópia de
micros de fuorescência, esta é a luz de excitação. À medida que tentamos detectar o sinal
de fuorescência com uma lente e retransmiti-lo para um detector, os sinais produzidos pelas
moléculas dentro desse ponto >200 nanômetros ficarão confusos. Isso ocorre porque no
detector, cada molécula também produzirá um ponto de luz focalizada (fuorescência) e os
pontos dessas moléculas simultaneamente iluminadas se sobreporão (Fig. 3). Nenhum
detector será capaz de diferenciar o sinal dessas moléculas, não importa se é o olho, um
fotomultiplicador ou mesmo uma câmera pixelizada.
A pessoa que avaliou plenamente que a difração representa um sério limite na resolução
foi Ernst Abbe (Fig. 4), que viveu no final do século XIX e
FIGURA 4. Limite de resolução de difração esculpido em pedra (em cima: Memorial em

homenagem a Ernst Abbe em Jena, Alemanha), e aumento de resolução em nanoscopia
STED (meio) sobre imagem confocal (abaixo).
que cunhou essa “barreira de difração” em uma equação que recebeu seu nome [1]. Ele diz
que, para serem separáveis, duas características do mesmo tipo devem estar mais distantes
do que o comprimento de onda dividido pelo dobro da abertura numérica da lente objetiva.
Pode-se encontrar essa equação na maioria dos livros didáticos de física ou óptica, e também
em livros didáticos de bioquímica e biologia molecular, devido à enorme relevância da
microscopia de luz nesses campos. A equação de Abbe também é encontrada em um
memorial que foi erguido em Jena, Alemanha, onde Ernst Abbe viveu e trabalhou, e lá está
escrito em pedra. Isto é o que os cientistas acreditavam ao longo do século 20. No entanto,
não só eles acreditavam, como também era um fato. Por exemplo, se alguém quisesse olhar
para as características do citoesqueleto celular no século 20 [5], este era o tipo de resolução
obtida (Fig. 4, “Confo cal”). Mas agora, hoje, temos a resolução mostrada na Fig. 4, (“STED”)
e essa resolução se tornou um novo padrão. Então, o que eu descrevo nesta palestra é como
essa transição foi feita, da resolução anterior limitada por difração para uma resolução muito
além da barreira de difração.
Começou no final da década de 1980. Eu era estudante em Heidelberg naquela época e

trabalhava na área de pesquisa de microscopia de luz, então, é claro, eu estava familiarizado
com a equação de Abbe. Comecei a me perguntar: essa equação foi cunhada em 1873, mas
agora estamos em 1990. Tanta física nova surgiu durante o século 20 e tantos fenômenos
novos foram descobertos - na verdade, tive que aprender muito para meus exames ! Deveria
haver fenômenos – pelo menos um – que poderiam ser utilizados para superar a barreira de
difração em um microscópio de luz operando com feixes de luz propagados e lentes
regulares. Bem, eu entendi que não vai funcionar apenas mudando a forma como a luz se
propaga, a forma como a luz é focada. [Na verdade, eu tinha investigado isso; isso me levou
à invenção do microscópio 4Pi [11, 12], que melhorou a resolução axial, mas não superou a
barreira de Abbe.] Eu estava convencido de que uma solução potencial deve ter algo a ver
com as grandes descobertas do século XX : mecânica quântica, moléculas, estados
moleculares e assim por diante.
Por isso, comecei a verificar meus livros novamente para encontrar algo que pudesse
ser usado para superar a barreira de difração em um microscópio de foco de luz. Um dia
coloquei minhas idéias sobre como resolver o problema por escrito (Fig. 5). Em termos
simples, a ideia era verificar as propriedades espectroscópicas dos fuoróforos, suas
transições de estado e assim por diante, especificamente para resolver o problema de
resolução. Até então, eles eram usados apenas para sinal de fuorescência
FIGURA 5. Percepção no início da década de 1990 de que a chave para ultrapassar o limite
de resolução de difração está nas propriedades do fuoróforo (citação de um manuscrito
submetido em 1993, no topo). A fotografia (abaixo) mostra a página 20 do livro Te Quantum Theory of Light
por Rodney Loudon (Oxford Science Publications), onde encontrei um lembrete do fenômeno
da emissão estimulada, que eu obviamente conhecia de meus estudos de física, na manhã de
sábado, 6 de novembro de 1993. Minha cópia do livro está agora em exposição no Museu Nobel,
Estocolmo.
geração ou para medir pH ou concentração de cálcio, etc. Mas talvez houvesse uma propriedade que
pudesse ser usada com o propósito de tornar obsoleta a barreira de Abbe. Alternativamente, poderia haver
um efeito quântico-óptico cujo potencial não foi realizado, simplesmente porque ninguém pensou em
superar a barreira de difração [13].
Com essas idéias em mente, um dia quando eu não estava muito longe daqui em Åbo/Turku, do outro
lado do Golfo de Bótnia, em uma manhã de sábado, eu folheei um livro sobre óptica quântica [14] e tropecei
na página mostrada em Fig. 5.
Tratava-se de emissão estimulada. De repente, fiquei eletrificado. Por quê?
Para reiterar, o problema é que a lente focaliza a luz no espaço, mas não com mais de 200 nanômetros.
Todos os recursos dentro da região de 200 nanômetros são alimentados simultaneamente com luz de
excitação. Isso não pode ser alterado, pelo menos não ao usar lentes ópticas convencionais. Mas talvez
possamos mudar o fato de que todos os recursos que são alimentados com luz (de excitação) são, no final,
capazes de enviar luz (de volta) ao detector. Se conseguirmos manter algumas das moléculas escuras -
para ser mais preciso, em um estado em que não são capazes de enviar luz ao detector - veremos apenas
as moléculas que podem, ou seja, aquelas no estado claro. Assim, ao registrar moléculas de estado claro
em oposição a moléculas de estado escuro, podemos distinguir as moléculas. Assim, a ideia era manter
uma fração das moléculas residentes na mesma área de difração em estado escuro, pelo período de tempo
em que as moléculas residentes nessa área fossem detectadas. De qualquer forma, lembre-se: o estado
(transição) é a chave para diferenciar os recursos. E a resolução é sobre recursos exigentes.
Por isso, surge a pergunta: existem estados escuros em uma molécula fuorescente? A resposta na
verdade foi dada no diagrama de energia mostrado na Fig. 2, reiterado na Fig. 6b. O estado fundamental
do fuoróforo é um estado escuro!

Para a molécula emitir fuorescência, a molécula tem que estar em seu estado excitado.
Assim, o estado excitado é o estado brilhante, mas o estado fundamental é, obviamente, um estado escuro.
Estado.
Qual é agora o papel da emissão estimulada? Na verdade, a resposta é tão simples quanto profunda:
faz moléculas escuras, ou seja, moléculas que não são vistas pelo detector! Essa era a razão pela qual eu
estava tão animado. Eu havia encontrado uma maneira de fazer com que os fuoróforos normais não
fervessem, apenas fuoróforos normais que eram comumente usados na microscopia de fuorescência. E
agora você pode facilmente visualizar como o microscópio funciona: depleção de emissão estimulada – ou:
STED – microscopia [15-23]. A Fig. 7a esboça a lente, o componente crítico de um microscópio óptico de
campo distante, bem como uma amostra e um detector. Usamos um feixe de luz para excitar moléculas do
estado fundamental para o estado excitado, para torná-las brilhantes ('ON'), ou seja, levá-las ao estado
excitado. Inevitavelmente, a luz de excitação

FIGURA 6. A comutação de moléculas dentro da região limitada de difração “de ” permite a detecção
separada de moléculas vizinhas que residem na mesma região de difração. (a) Na microscopia de
fuorescência operando com lentes convencionais (por exemplo, microscopia confocal), todas as
moléculas dentro da região coberta pelo máximo de difração principal da luz de excitação são
alimentadas com luz de excitação simultaneamente e emitem fumaças juntas. Isso ocorre porque
eles podem assumir simultaneamente o estado fluorescente (sinalização). (b) Manter a maioria das
moléculas – exceto aquela(s) que se pretende registrar –
em um estado escuro resolve o problema. O estado escuro é um estado a partir do qual nenhum
sinal é produzido no detector. Tal transição para o estado escuro “de” é mais pela
realizada simplesmente
indução de
emissão estimulada, que força instantaneamente as moléculas ao seu estado fundamental escuro
(“de”).
FIGURA 7. Microscopia STED. (a) Esquema de instalação. (b) Região onde a molécula
pode ocupar o estado “on” (verde) e onde deve ocupar o estado “of” (vermelho).
Transições(c)
moleculares. (d) Para intensidades da luz STED (vermelho) iguais ou superiores à
intensidade de limiar Is, as moléculas são efetivamente desligadas. Isso ocorre porque a
luz STED sempre fornecerá um fóton que estimulará a molécula a assumir instantaneamente
o estado fundamental, mesmo na presença de luz de excitação (verde). Assim, a presença
de luz STED com intensidade maior que Is altera a capacidade das moléculas de fluorescência.
será difratado e obtém-se um ponto de luz de pelo menos 200 nanômetros. O sinal
aí produzido, de todas as moléculas, poderá chegar ao detector. Mas agora,
usamos um segundo feixe de luz que induz a emissão estimulada e, assim, produz
moléculas no estado escuro. A idéia é “empurrar” instantaneamente as moléculas
que foram excitadas de volta ao estado fundamental para que a molécula não seja
capaz de emitir luz, pois assumiu o estado fundamental escuro ('OFF').
A condição física para conseguir isso é que o comprimento de onda do feixe

de estimulação seja maior (Fig. 7c). Os fótons do feixe de estimulação têm uma
energia mais baixa, para não excitar as moléculas, mas para estimular as moléculas
que vão do estado excitado de volta ao estado fundamental. Há outra condição, no
entanto: temos que garantir que haja de fato um fóton vermelho na molécula que
empurra a molécula para baixo. Estou dizendo isso porque a maioria dos fótons
passa pelas moléculas, pois há uma probabilidade finita de interação do fóton com
uma molécula, ou seja, uma seção transversal finita de interação. Mas se aplicarmos luz
estimulante em uma intensidade acima de um certo limiar, podemos ter certeza de que há
pelo menos um fóton que “chuta” a molécula para o estado fundamental, fazendo com que
ela assuma instantaneamente o estado escuro.
A Fig. 7d mostra a probabilidade da molécula assumir o estado claro, o S1, na
presença do feixe STED transferindo a molécula para o estado fundamental escuro. Além
de uma certa intensidade de limiar, Is, a molécula é claramente “desligada”. Pode-se
aplicar basicamente qualquer intensidade de luz verde. No entanto, a molécula não será
capaz de ocupar o estado brilhante e, portanto, não sinalizar. Agora a abordagem é clara:
simplesmente modificamos esse feixe vermelho para ter uma forma de anel no plano focal
[19, 24], de modo que não carregue nenhuma intensidade no centro. Assim, podemos
desligar a capacidade de fluorescência das moléculas em todos os lugares, menos no
centro. O anel ou “rosquinha” torna-se cada vez mais fraco em direção ao centro, onde é
idealmente de intensidade zero. Lá, no centro, não poderemos desviar as moléculas,
porque não há luz STED, ou é muito fraca.
Agora vamos dar uma olhada na amostra (Fig. 7b) e vamos supor que queremos ver
apenas a fibra no meio. Portanto, temos que virar a fibra para a esquerda e a para a direita.
O que nós fazemos? Não podemos diminuir o anel, pois também é limitado pela difração.
Abbe diria: “Fazer anéis de luz mais estreitos não é possível devido à difração”. Mas não
temos que fazer isso. Em vez disso, simplesmente temos que “fechar” as moléculas das
fibras que não queremos ver, ou seja, fazemos com que suas moléculas permaneçam em
estado escuro, até que tenhamos registrado o sinal daquela área. Obviamente, a chave
está na preparação dos estados. Então, o que fazemos? Nós tornamos o feixe forte o
suficiente para que as moléculas mesmo muito próximas do centro do anel sejam viradas
“de ” porque elas estão efetivamente confinadas ao estado fundamental o tempo todo. Isso
porque, mesmo próximo ao centro do anel, a intensidade está além do limiar Is em termos
absolutos.
Agora temos sucesso na separação: somente na posição do centro da rosquinha as
moléculas podem emitir, e podemos, portanto, separar esse sinal do sinal das fibras
vizinhas. E agora podemos adquirir imagens com resolução de subdifração: podemos
mover os feixes pela amostra e separar cada fibra da outra, pois suas moléculas são
forçadas a emitir em diferentes pontos no tempo. Jogamos um jogo “on/of”. Dentro da
região de excitação muito mais ampla, apenas um subconjunto de moléculas que estão no
centro do anel donut pode emitir em qualquer ponto no tempo. Todos os outros ao seu
redor são efetivamente mantidos no estado fundamental escuro. Sempre que alguém
verifica em que estado elas estão, quase sempre encontra essas moléculas no estado
fundamental.
Esse conceito acabou funcionando muito bem [17, 19, 23, 25]. A Fig. 8a contém uma
gravação confocal padrão de alta qualidade de algo que não se pode fazer
FIGURA 8. Arquitetura complexa de poros nucleares em um núcleo de célula intacto fotografado

por (a) microscopia con focal (limitada por difração) e (b) nanoscopia STED.
fora o que é. A Fig. 8b mostra a mesma região fotografada usando microscopia STED.
A resolução é aumentada em cerca de uma ordem de magnitude (no canal vermelho), e
pode-se discernir claramente o que está realmente sendo fotografado aqui: complexos de
poros nucleares. Como resultado da alta resolução, você pode ver que esse complexo de
poros nucleares apresenta oito subunidades moleculares. A simetria óctupla fica muito clara
[25]. Não há quase nenhuma comparação com a gravação confocal padrão.
Escusado será dizer que, se for permitido este aumento na resolução espacial, obtém-
se novas informações. Em outras palavras, novos insights são obtidos com este microscópio.
Descrevo brevemente pesquisas feitas em colaboração com virologistas interessados no
vírus da imunodeficiência humana (HIV). Geralmente, os vírus têm cerca de 30 a 150
nanômetros de diâmetro [5]. Então, se alguém quiser fotografá-los com um microscópio de
luz. . . não há chance de que isso dê certo - não se verá nenhum detalhe das distribuições
de proteínas nas partículas do vírus. Um microscópio de fuorescência limitado por difração
produziria apenas um borrão de fuorescência do tamanho de 250 a 350 nanômetros. Te
FIGURA 9. Nanoscopia STED da proteína Env do envelope do HIV em viriões únicos. A

microscopia confocal não é capaz de revelar a distribuição espacial em nanoescala das
proteínas Env; as imagens das proteínas Env nas partículas do vírus parecem manchas borradas
de 250 a 350 nm (laranja, coluna esquerda). A microscopia STED revela que as proteínas Env
formam padrões espaciais (coluna central, laranja), com partículas maduras tendo seu Env
fortemente concentrado no espaço (painel na linha superior da coluna central, laranja).
vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem cerca de 140 nm de tamanho. Os cientistas que
colaboraram conosco estavam interessados em descobrir como uma proteína chamada Env
é distribuída na partícula do HIV [26], Fig. 9. No registro normal, nada de específico é visto.
Em contraste, a gravação STED de alta resolução revelou que a proteína Env forma padrões
nas partículas do HIV. O que realmente foi descoberto neste estudo é que as partículas
maduras do HIV – aquelas que estão prontas para infectar a próxima célula – têm o Env
concentrado basicamente em um único local do vírus. Parece ser um requisito para que o
HIV seja muito eficaz. Este é um exemplo de como uma nova visão mecanicista foi obtida
como resultado da imagem de resolução de subdifração.
Claro, um ponto forte da microscopia de luz é que podemos visualizar células vivas. A
Figura 10 mostra uma gravação de taxa de vídeo com microscopia STED. Essas são
vesículas sinápticas no axônio de um neurônio vivo [20]. Pode-se ver diretamente como eles
se movem e podemos estudar sua dinâmica e seu destino ao longo do tempo. É claramente
importante ser capaz de criar imagens de células vivas.
FIGURA 10. Imagem STED de taxa de vídeo do movimento da vesícula sináptica no axônio do neurônio
pocampal do quadril vivo. (A palestra contém vídeo).
Imagens de células vivas “no extremo” são mostradas na Fig. 11. Aqui, abrimos o
crânio de um camundongo anestesiado e examinamos o cérebro do camundongo na
camada superior, chamada de camada molecular do córtex visual [21] . Este era um
camundongo transgênico, o que significa que alguns de seus neurônios expressavam
uma proteína fuorescente, especificamente a proteína fuorescente amarela YFP, e é por
isso que esse neurônio é destacado do cérebro circundante. O tecido cerebral circundante é escuro.
Em seguida, fizemos gravações sequenciais e pudemos ver as extremidades sinápticas
receptoras do neurônio - as chamadas espinhas dendríticas. Eles se movem um pouco,
e vale a pena dar zoom neles. Distingue-se o colo da espinha e, em particular, os detalhes
da extremidade em forma de taça das espinhas dendríticas. A microscopia STED permite
que essas pequenas morfologias sejam visualizadas, de modo que possamos observar
suas sutis mudanças temporais. Estou muito confiante de que em um futuro não muito
distante seremos capazes de visualizar as proteínas aqui na sinapse [27]. Também posso
imaginar que seremos capazes de dar uma dica visual ao camundongo e observar como
isso realmente altera a distribuição de proteínas diretamente na sinapse. Assim, no final,
devemos aprender como funciona a comunicação neuronal ou a formação da memória
no nível molecular.
Como a microscopia STED depende da propagação livre da luz, pode-se realizar

imagens tridimensionais (3D). É possível focar no tecido cerebral, por exemplo, e gravar
um conjunto de dados 3D. A Fig. 12 mostra um registro de super-resolução 3D de actina
em um neurônio vivo em uma fatia chamada de hipocampo organotípica.
FIGURA 11. Nanoscopia STED em cérebro de camundongo vivo.
Voltando ao básico, à resolução espacial, alguns de vocês perguntarão: Qual é a

resolução que podemos obter? Qual é o limite? Na verdade, existe um novo limite? Então,
voltemos ao princípio. O “nome do jogo” é que giramos moléculas em todos os lugares, mas
no mínimo de intensidade, no zero central, do feixe STED [28-31]. Se pudermos fazer a
região na qual as moléculas estão
FIGURA 12. Representação de dados tridimensionais de nanoscopia STED mostrando a actina dendrítica de
um neurônio de uma fatia de cérebro de hipocampo organotípica viva (rato).
FIGURA 13. Escala de resolução nos conceitos STED/RESOLFT: uma extensão da

equação de Abbe. A resolução escala inversamente com a raiz quadrada da razão
entre a intensidade máxima na crista do donut e a intensidade de limiar característica
do fuoróforo Is.
ainda permitido emitir menores, a resolução é melhorada; isso é claro. A extensão

(ou diâmetro) da região em que as moléculas ainda estão “ligadas” agora determina
a resolução espacial. Claramente, não pode mais ser descrito pela equação de Abbe.
De fato, esse diâmetro deve depender da intensidade I que se encontra na crista do
donut (Fig. 13b,d) e da intensidade limiar Is, que é uma característica da interação
fóton-molécula. Quanto maior for sua razão, menor será d. Agora é fácil perceber
que essa razão deve ser encontrada no denominador, se descrevermos a resolução
com uma nova equação que agora é obviamente necessária [23, 28, 29]. Na verdade,
d escala inversamente com a raiz quadrada de I/Is. Assim, quanto maior I/Is, menor
é d. Como resultado, d tende a 0 para valores cada vez maiores de I/Is (Fig. 13b,d).
Na situação representada na Fig. 13b, não podemos separar duas das moléculas
próximas porque ambas podem emitir ao mesmo tempo. Mas vamos tornar o feixe
um pouco mais forte, de modo que apenas uma molécula “entre” na região em que
as moléculas podem estar “ligadas”. Agora o limite de resolução é aparente: é o
tamanho de uma molécula, porque uma molécula é a menor entidade que se pode separar.
Isso não é surpreendente! Afinal, separamos as feições preparando suas moléculas

em dois estados diferentes, e assim deve ser a molécula que é o limite da resolução
espacial. Quando duas moléculas se aproximam muito, podemos separá-las porque
no momento em que uma delas está emitindo, a outra é “de” e vice-versa [28, 30-32].
Vale a pena notar que se todas as moléculas “de” ou escuras são inteiramente
escuras, detectar um único fóton de uma molécula é absolutamente suficiente para
saber que há uma molécula presente (no mínimo do feixe STED). A posição dessa
molécula é inteiramente determinada pela presença dos fótons do feixe STED.
Esses fótons determinam exatamente onde a molécula está “ON” e onde está
“OFF” (escuro). Os fótons de fuorescência detectados indicam apenas a presença de
uma molécula, ou muitas delas [30-32].
Normalmente se obtém resolução espacial molecular, e em uma célula? Para
microscopia STED agora, o padrão de resolução está entre 20 e 40 nanômetros
dependendo do fuoróforo, e dependendo do ambiente químico do fuoróforo [25]. Mas
isso é algo que está progredindo; está em desenvolvimento contínuo. Com fuoróforos
que têm propriedades próximas do ideal e podem ser “ligados” e “desligados” quantas
vezes desejar, podemos fazer muito melhor, é claro.
Na verdade, existem tais fuoróforos - não orgânicos, inorgânicos -

que já atendem a esse requisito. Essas são as chamadas lacunas de nitrogênio
carregado em diamantes (Fig. 14), defeitos fluorescentes em cristais de diamante
que podem ser ativados e de um número quase ilimitado de vezes [33]. Com essas
imagens, conseguimos reduzir a região de emissão para 2,4 nanômetros [34]. Vale
lembrar que o comprimento de onda responsável por esse resultado é de 775
nanômetros. Assim, a região de emissão é menor que um por cento, uma fração
muito pequena do comprimento de onda.
Isso pode parecer um experimento de prova de princípio, e até certo ponto é.
Mas não é só isso, há outra razão para realizar esses experimentos [33, 35, 36]. As
chamadas vacâncias de nitrogênio carregado são atualmente consideradas como
candidatas atraentes para computação quântica: como qubits operando à temperatura
ambiente [37, 38]. Possuem um estado de spin com um tempo de coerência muito
longo mesmo à temperatura ambiente, que pode ser preparado e lido opticamente.
Sendo menos de um nanômetro de tamanho, eles podem detectar campos magnéticos
em nanoescala [39, 40]. Nós inerentemente temos nanosensores aqui, e STED é
talvez a melhor maneira de ler o estado e os campos magnéticos em nanoescala. No
final, isso poderia tornar o STED um candidato interessante, talvez para ler qubits em
um computador quântico, ou quem sabe . . . O desenvolvimento continua!
FIGURA 14. Fuoróforos quase-ideais, em particular repetições virtualmente ilimitadas das transições
de estado de ativação de resolução, fornecem os atuais registros de resolução em imagens ópticas
de campo distante usando STED, no regime de nanômetro de um dígito. Centros de cor (centros de
vacância de nitrogênio carregado) em diamantes possuem grande potencial para várias outras
aplicações, notadamente em sensoriamento magnético e informação quântica, que podem ser
combinados com leitura óptica baseada em lentes de difração ilimitada (campo distante).
Voltando aos fundamentos, enfatizei que o nome do jogo é “ligar/desligar”, ou

manter uma fração das moléculas escuras para separação [30-32]. É assim que
separamos as moléculas, com um estado claro e um estado escuro. Uma vez que fica
claro que este é um princípio geral, é óbvio que a emissão estimulada não é a única
maneira pela qual podemos jogar esse “jogo on/of”. Deve haver também outros
estados “on”
Come “of”
issoem
emum corante
mente, que se em
naveguei pode usar livros
outros para oe mesmo
descobriefeito [22, 28-30].
que existem
estados tripletos, estados escuros de longa duração e, é claro, em livros de química,
você descobrirá que há isomerização cis-trans fotoinduzida (Fig. 15). Pode-se perguntar
por que usar essas transições especiais que, ao contrário da emissão estimulada, não
são encontradas em absolutamente nenhum fuoróforo, pois são necessários fuoróforos
especiais para isso? Afinal, as transições usadas no STED são realmente básicas:
excitação óptica e desexcitação.
E os dois estados entre os quais essas transições são induzidas são os estados mais
básicos imagináveis, ou seja, o fundamental e o primeiro estado excitado.

FIGURA 15. Estados e transições de estado utilizados em (a) STED, (b) GSD e (c) nanoscopia
RESOLFT. (d) A expressão modificada para a resolução descreve a região espacial, na qual as
moléculas ainda podem residir no estado “ligado”. (e) A intensidade Is para garantir a transição é
inversamente relacionada ao tempo de vida do estado. Quanto maior o tempo de vida dos estados
envolvidos, menos fótons por segundo são necessários para estabelecer a diferença de estado on-
of que é necessária para separar as características que residem dentro da barreira de difração.
De fato, verifica-se que há uma forte razão para examinar outros tipos de estados e
transições de estado. Considere os tempos de vida do estado (Fig. 15). Para a transição
STED básica, o tempo de vida do estado, o estado excitado, é de nanossegundos (Fig. 15a).
Para estados escuros metaestáveis usados em métodos denominados microscopia de
depleção do estado fundamental (GSD) [41-43] (Fig. 15b) o tempo de vida do estado é de
microssegundos, e para isomerização é da ordem de milissegundos (Fig. 15c). Por que
esses grandes aumentos no tempo de vida do estado utilizado são relevantes?
Bem, lembre-se de que separamos características adjacentes transferindo suas
moléculas fluorescentes para dois estados diferentes. Mas se o estado - um dos estados -
desaparece depois de um nanossegundo, então a diferença nos estados criados desaparece

depois de um nanossegundo. Consequentemente, é preciso se apressar em colocar os
fótons, criar essa diferença de estados, bem como lê-la, antes que ela desapareça. Mas se
tivermos mais tempo - microssegundos, milissegundos - podemos desligar as moléculas, ler
as restantes, ligar, desligar. . . ; eles ficam lá, porque seus estados são longevos. Não é
preciso se apressar em colocar o
luz, e isso torna essa “separação por estados” operacional em níveis de luz muito mais
baixos [28, 41].
Para ser mais formal, o limiar de intensidade Is mencionado acima é proporcional
ao tempo de vida dos estados envolvidos (Fig. 15e): quanto maior o tempo de vida,
menor é o Is, e a barreira de difração pode ser quebrada usando esse tipo de transição
em níveis de luz muito mais baixos. Is diminui de megawatts (STED), kilowatts (GSD)
para watts por centímetro quadrado para tempos de comutação de milissegundos –
uma faixa de seis ordens de magnitude [28]. Isso torna as transições entre estados de
longa duração muito interessantes, é claro. Aqui na equação (Fig. 15d), é
desce e com isso, claro, eu também desço porque não são necessários tantos fótons
por segundo para obter a mesma resolução d.
A isomerização cis-trans é particularmente interessante porque é encontrada em
proteínas fuorescentes comutáveis. Nós analisamos isso muito cedo a partir de 2003,
para verificar se podemos usá-lo para uma gravação do tipo STED. Eventualmente, eu
o chamei de RESOLFT, para “Reversible Saturable/Switchable Opticamente Linear
FIGURA 16. A paralelização do conceito STED/RESOLFT é a chave para imagens mais rápidas.
O problema de difração deve ser resolvido apenas para moléculas que residem dentro de uma
região limitada por difração. Assim, muitos mínimos de intensidade ('rosquinhas') são produzidos,
em distâncias mútuas maiores que o limite de difração, para escaneamento altamente eficiente de
grandes áreas de amostra. O uso de esquemas altamente paralelizados é muito facilitado pelo
aproveitamento de transições entre estados moleculares on-of de vida longa, como cis/trans.
(Fluorescence) Transitions” [28, 44–46], simplesmente porque eu não poderia mais chamá-
lo de STED. Não há emissão estimulada ali, por isso tive que dar um nome diferente. A força
não é apenas que se pode obter alta resolução em baixos níveis de luz. Notavelmente, pode-
se usar lasers baratos, lasers de onda contínua (CW) e/ou espalhar a luz sobre um grande
campo de visão, porque não é necessária uma luz tão intensa para alternar as moléculas.
Desta forma, pode-se paralelizar as gravações, o que significa que se pode fazer uma série
de muitos furos (mínimos de intensidade, zeros) ao mesmo tempo e ler rapidamente um
grande campo de visão (Fig. 16). Não importa que se tenha muitos desses mínimos de
intensidade ao mesmo tempo. Contanto que estejam cada um mais distantes do que a
barreira de difração de Abbe, eles podem ser lidos simultaneamente pela projeção do sinal
gerado nessa matriz de mínimos em uma câmera. Apenas alguns passos de varredura em
uma direção e na direção ortogonal, e uma imagem de super-resolução de um grande campo
de visão é obtida. Na Fig. 17 [47], uma célula viva foi gravada em dois segundos com mais
de 100.000 “rosquinhas”, por assim dizer, em paralelo.
Apesar do arranjo óptico um pouco diferente, a chave é a transição molecular. A seleção

da transição molecular correta determina os parâmetros da imagem. O desempenho de
imagem, incluindo a resolução e
FIGURA 17. Nanoscopia RESOLFT massivamente paralelizada. Aqui, uma matriz de ~114.000 em mínimos
de tensão (zeros) foi usada para criar imagens de uma célula viva em dois segundos.
o nível de contraste, assim como outros fatores, é realmente determinado pela transição
molecular escolhida [32].
Colocando a próxima pergunta, o que é preciso para alcançar a melhor resolução?
Agora vamos supor que alguém tenha feito essa pergunta no século 20. Qual teria sido a
resposta? Bem, a resposta foi inquestionavelmente: boas lentes [10]. Claro, boas lentes.
Por quê? Porque a separação de feições vizinhas foi realizada pela focagem da luz. E
então, é claro, é preciso boas lentes para produzir o ponto focal de luz mais nítido na
amostra aqui, ali e em todos os lugares, e/ou o ponto focal de luz mais nítido em qualquer
lugar do detector.
No entanto, uma vez que não é possível produzir um ponto focal de luz ainda menor, essa
estratégia chegou ao fim (Fig. 18, acima). Portanto, se uma pessoa tem várias
características dentro de um ponto de luz limitado por difração, simplesmente não pode fazer melhor.
A resolução é definitivamente limitada pela difração se separarmos as características pelo
foco da luz - não há como distinguir as características, as moléculas, porque tudo se
sobrepõe no detector (Fig. 18, acima). Então, qual foi a solução para este problema?
Não separe apenas focando. Separados por estados moleculares, no caso mais fácil
por estados “on/of” [28-31].
distinguir
Se separando
as características,
por estadospode-se
moleculares,
distinguir
pode-se
as moléculas,
de fato
mesmo que residam dentro da região ditada pela difração. Podemos distinguir, por
exemplo, uma molécula de suas vizinhas e discerni-la (Fig. 18, abaixo). Para este propósito,
temos nossa escolha de estados que já apresentei (Fig. 15) que podemos usar para
distinguir características dentro da região de difração.
Nos métodos que descrevi, STED, RESOLFT e assim por diante, a posição do estado
- onde a molécula está "on", onde a molécula está "of" - é determinada por um padrão de
luz com um ou mais zeros de intensidade , por exemplo, um donut. Esse padrão de luz
determina claramente onde a molécula deve estar “ligada” e onde deve estar “fora”. As
coordenadas X, Y, Z são rigidamente controladas pelo padrão de luz incidente e a(s)
posição(ões) de seu(s) zero(s). Movendo o padrão para a próxima posição X, Y, Z - já se
conhece a posição da ocorrência dos estados “on” e “of”. Um não requer necessariamente
muitos detectados
fótons das moléculas do estado “ligado”, porque os fótons detectados são meramente
indicadores da presença de uma característica. A ocorrência do estado e sua localização
é totalmente determinada pelo padrão de luz incidente.
Agora surge a pergunta: como isso se compara com a invenção seminal relatada pela
primeira vez por Eric Betzig [48], baseada na descoberta de WE Moerner [8, 49], de que
você pode detectar moléculas únicas? No conceito PALM (“Photo-Activated Localization
Microscopy”) [48] (também chamado de STORM ou FPALM [50, 51]), existem duas
diferenças fundamentais para abordagens do tipo STED (Fig. 19).
FIGURA 18. Mudança de paradigma no uso do fenômeno físico pelo qual as características são
discernidas em um microscópio de fuorescência de campo distante: do foco da luz ao uso de uma
transição de estado molecular, como uma transição entre um "ligado" e um "de " Estado.
FIGURA 19. Tanto em métodos de nanoscopia coordenada-alvo quanto em coordenadas

estocásticas, muitos fótons são necessários para definir ou estabelecer coordenadas
moleculares em escalas de frações subdif. No modo coordenado-alvo (STED, RESOLFT, etc.),
as coordenadas de (por exemplo) o estado “ligado” são estabelecidas iluminando a amostra
com um padrão de luz com intensidade zero; a localização do zero define as coordenadas com
precisão da fração subdif. No modo de coordenadas estocásticas (PALM, STORM etc.), as
coordenadas das moléculas em estado “ligado” que emergem aleatoriamente são estabelecidas
analisando o padrão de luz emitido pelas moléculas (localização). A precisão da coordenada
espacial é alcançada em ambos os casos por um número suficiente de fótons. Em ambas as
famílias, as moléculas vizinhas são discernidas criando transitoriamente diferentes estados moleculares na amostra.
Em primeiro lugar, baseia-se criticamente na detecção de moléculas únicas. Em

segundo lugar, ao contrário do caso STED, no caso PALM a posição espacial do
estado ligado é descontrolada, totalmente estocástica. Uma molécula “aparece” em
algum lugar aleatoriamente no espaço, uma única molécula por região de tamanho
de difração, e énão
desta
seforma
sabe onde
que auma
diferença
molécula
de estado
se voltou
“on”/”of”
para oé estado
criada. ligado,
Mas como
deve-
se usar um padrão de luz com o qual se possa medir a posição. Esse padrão de luz
é a luz fuorescente que é emitida pela molécula e fotografada em um detector de
matriz, geralmente uma câmera.
Os pixels da câmera fornecem a referência de coordenadas. Sem entrar em
os detalhes, este padrão de luz de fuorescência emitida permite determinar a posição da

molécula com um cálculo do centróide.
Uma percepção interessante aqui é que é necessário um padrão brilhante de luz emitida
para descobrir a posição de emissão, assim como é necessário um padrão brilhante de luz
incidente em STED/RESOLFT para determinar a posição de emissão. Não
surpreendentemente, sempre precisamos de padrões brilhantes de luz quando se trata de
posições, porque se tivermos apenas um único fóton, ele se perderá. O fóton pode ir a
qualquer lugar dentro do domínio da difração, não há como controlar para onde ele vai
dentro da zona de difração. Em outras palavras, quando se trata de posições, são necessários
muitos fótons por definição, pois isso é inerente à difração. Muitos fótons são necessários
para definir posições de moléculas em estado “ligado” e “de” na microscopia STED/
RESOLFT, assim como muitos fótons são necessários para descobrir a posição de moléculas
em estado “ligado” no método estocástico PALM.
No entanto, em ambos os casos, a separação de características é, obviamente, feita
por uma transição “on/of” De
diferenciamos. [28-31].
fato, É assim
todos os que diferenciamos
métodos os recursos,
de super-resolução quecomo osem vigor
estão
agora e úteis, conseguem a separação colocando transientemente as moléculas em dois
estados diferentes para o período de tempo em que as moléculas que residem na mesma
zona de difração são detectadas. “Fluorescente” e “não-fluorescente” é o par de estados
mais fácil de se brincar, e foi isso que funcionou até agora.
Pode-se considerar que no século XX foram as lentes que foram decisivas. E os

fabricantes de lentes eram os “reis”. Era preciso ir até eles e pedir as melhores lentes para
obter a melhor resolução. Mas como é hoje? Não, não são os fabricantes de lentes. Esse
jogo de resolução não é mais sobre lentes. Trata-se de estados moleculares, e estados
moleculares são, obviamente, sobre moléculas. As moléculas determinam agora quão bem
podemos imaginar; eles determinam a resolução espacial. E isso não é tecnologia óptica —
é química (Fig. 20). Pode-se dizer que agora são os químicos que podem tirar as melhores
imagens. De certa forma, isso era inicialmente um problema de física – a barreira de difração
certamente era, sem dúvida – que agora evoluiu para um tópico de química.
Tis Prêmio Nobel foi concedido para imagens de fuorescência de super-resolução.

Sendo o elemento de habilitação uma transição entre dois estados, os dois estados não
precisam ser fuorescência “on”/”of”: eles também podem ser um par de estados “A” e “B”
(Fig. 21), como "absorção/não absorção", "dispersão/não dispersão", "giro para cima/para
baixo", "ligado"/"não ligado" (como no método chamado PAINT [52]), etc.
Talvez também se possa imaginar um microscópio de absorção de super-resolução ou um
microscópio de espalhamento de super-resolução, se identificarmos os estados corretos. A
história continua, e estou esperando mais dela por vir. Está apenas começando!
FIGURA 20. Das lentes aos interruptores moleculares. Se no século 20, a qualidade do foco das lentes
era decisiva para obter uma resolução espacial muito alta, agora são as moléculas e suas transições de
estado que se tornam centrais para alcançar a melhor resolução. A otimização de moléculas para
fornecer transições de estado robustas e repetidamente executáveis (on/of) é principalmente um
problema de química.
FIGURA 21. O papel limitante da difração é superado pela utilização de pelo menos dois estados
moleculares para separar as características que residem mais próximas do que a barreira de difração.
Embora as moléculas fluorescentes tenham sido o primeiro tipo de moléculas que proporcionaram tais
estados, são concebíveis outras moléculas e estados que não são necessariamente do tipo fluorescente.
É por isso que se poderia imaginar quebrar a barreira de difração também em um microscópio óptico de
campo distante não-fuorescência, desde que estados adequados e transições de estado sejam identificados.
Olhando para a equação de Abbe (Fig. 4), ela foi escrita em pedra por tantos anos, mas
não pode explicar o fato de que agora temos uma resolução espacial muito maior.
Felizmente, podemos adaptar a equação de Abbe com muita facilidade. Nós simplesmente
adicionamos o fator de raiz quadrada, e agora a boa notícia é: a resolução cai para o tamanho
de uma molécula (Fig. 15d). Podemos alcançar a resolução da imagem na escala molecular.
RECONHECIMENTOS
Sou grato a Stefen J. Sahl por editar a versão inicial da palestra original transcrita, bem como
a Mark Bates por outras melhorias. Por último, mas não menos importante, gostaria de
mencionar que não poderia ter falado sobre esse desenvolvimento sem a ajuda de muitos
alunos e pós-doutorandos muito talentosos que contribuíram para isso. Agradeço-lhes do
fundo do coração por suas contribuições. Eu gostaria de acrescentar que muitos deles ainda
continuam neste campo porque é muito, muito emocionante.
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dos Estados Unidos da América, 2006, 103 (50), 18911-18916.
Foto do retrato de Stefan W. Hell pelo fotógrafo Alexander Mahmoud.

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Nanoscopia com Luz Focada

por Stefan W. Hell

Instituto Max Planck de Química Biofísica, Departamento de NanoBiofotônica, Am

Todos conhecemos o ditado

160 Os prêmios Nobel

FIGURA 1. Escalas de comprimento e limites de resolução espacial de inspeção visual (olho

ao estado fundamental emitindo um fóton de fuorescência.

Nanoscopia com Luz Focada 161

separar facilmente a fuorescência da luz de excitação, a luz com a qual a célula é

162 Os prêmios Nobel

Nanoscopia com Luz Focada 163

FIGURA 4. Limite de resolução de difração esculpido em pedra (em cima: Memorial em

além da barreira de difração.

Começou no final da década de 1980. Eu era estudante em Heidelberg naquela época e

164 Os prêmios Nobel

Nanoscopia com Luz Focada 165

superar a barreira de difração [13].

na página mostrada em Fig. 5.

Tratava-se de emissão estimulada. De repente, fiquei eletrificado. Por quê?

(transição) é a chave para diferenciar os recursos. E a resolução é sobre recursos exigentes.

do fuoróforo é um estado escuro!

excitado. Inevitavelmente, a luz de excitação

166 Os prêmios Nobel

Nanoscopia com Luz Focada 167

A condição física para conseguir isso é que o comprimento de onda do feixe

168 Os prêmios Nobel

Nanoscopia com Luz Focada 169

FIGURA 8. Arquitetura complexa de poros nucleares em um núcleo de célula intacto fotografado

170 Os prêmios Nobel

FIGURA 9. Nanoscopia STED da proteína Env do envelope do HIV em viriões únicos. A

Nanoscopia com Luz Focada 171

Como a microscopia STED depende da propagação livre da luz, pode-se realizar

172 Os prêmios Nobel

FIGURA 11. Nanoscopia STED em cérebro de camundongo vivo.

Voltando ao básico, à resolução espacial, alguns de vocês perguntarão: Qual é a

Nanoscopia com Luz Focada 173

FIGURA 13. Escala de resolução nos conceitos STED/RESOLFT: uma extensão da

ainda permitido emitir menores, a resolução é melhorada; isso é claro. A extensão

174 Os prêmios Nobel

Isso não é surpreendente! Afinal, separamos as feições preparando suas moléculas

Na verdade, existem tais fuoróforos - não orgânicos, inorgânicos -

Nanoscopia com Luz Focada 175

Voltando aos fundamentos, enfatizei que o nome do jogo é “ligar/desligar”, ou

básicos imagináveis, ou seja, o fundamental e o primeiro estado excitado.

176 Os prêmios Nobel

desaparece depois de um nanossegundo, então a diferença nos estados criados desaparece

Nanoscopia com Luz Focada 177

178 Os prêmios Nobel

Apesar do arranjo óptico um pouco diferente, a chave é a transição molecular. A seleção

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FIGURA 19. Tanto em métodos de nanoscopia coordenada-alvo quanto em coordenadas

Em primeiro lugar, baseia-se criticamente na detecção de moléculas únicas. Em

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os detalhes, este padrão de luz de fuorescência emitida permite determinar a posição da

Pode-se considerar que no século XX foram as lentes que foram decisivas. E os

Tis Prêmio Nobel foi concedido para imagens de fuorescência de super-resolução.