Cap4 Esterilizaà à o
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Disciplina
QUI034 Engenharia Bioquímica
CAPÍTULO 4.
ESTERILIZAÇÃO
Francisco Beltrão
ESTERILIZAÇÃO
SUMÁRIO
1. Introdução
2. Esterilização do Equipamento
a) Agentes Físicos
b) Agentes Químicos
3. Esterilização de Meios por Calor Úmido
a) Tipos de processos em escala industrial
b) Cinética da destruição térmica de microrganismos
c) Cálculo do tempo de esterilização
4. Esterilização de Ar
a) Filtração
Leitura Obrigatória
1. INTRODUÇÃO
I. Penalidade econômica.
1. INTRODUÇÃO
✓ Concepção do Biorreator:
• Contato eficiente entre as fases.
• Boa transf. de O2 para a célula. 2
• Boa transf. de calor do meio
para a célula e vice-versa. 1
• Proteger o MO de contaminações.
4
3
Esquema geral de um processo fermentativo.
(SchmidellW. et al., 2001)
1. INTRODUÇÃO
✓ O sistema pode ser:
• Não asséptico: não é estritamente necessário operar com culturas puras.
• Asséptico: condições de assepsia são pré-requisitos para formação do produto.
Questões:
✓ Como efetuar a assepsia de
grandes volumes de meios e de ar?
✓ Qual o método usado para
eliminar os MOs? Ex. filtração ou
aquecimento.
✓ Se aquecimento (batelada ou
contínuo)... em qual regime de t e
Antibióticos T?
Vacinas
Vitaminas...
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
Significado absoluto:
➢ Um material estéril é
totalmente isento de
qualquer organismo ativo e essa
condição se mantém.
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
Eliminação direcionada
aos MO prejudiciais.
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
✓ Técnicas de assepsia - aplicação de métodos físicos ou químicos:
• Métodos físicos: calor seco, calor úmido, radiação UV, radiação ionizante e
ultrassom.
• Métodos químicos: líq. ou gases que matam/danificam a capacidade reprodutiva
dos MO (hipoclorito, óxido de etileno, O3).
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes físicos
CALOR SECO
✓ Destrói os MO pela oxidação de seus constituintes químicos.
✓ Mais lenta e menos eficaz do calor úmido.
✓ TC lenta e nível de hidratação das células tende a diminuir, conferindo certa “proteção” às
proteínas.
Calor seco
Vidrarias, metais e sólidos resistentes ao calor
(recheios do filtro de ar)
Fornos ou estufas (t≈2h e T>150°C)
TC mais lenta
t de 3-4h para garantir a eficiência
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes físicos
CALOR ÚMIDO
✓ Ambiente: vapor d’água saturado.
✓ T elevada + alto grau de umidade: método efetivo para destruir MO!
✓ Vantagens: fácil obtenção, manuseio, eficácia e baixo custo.
✓ Na indústria → obtido em caldeiras e distribuído em tubulações de inox isoladas
termicamente.
✓ Aplicações: reatores (vazios ou carregados) e tubulações.
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes físicos
CALOR ÚMIDO
✓ Modo de ação: desnaturação irreversível das proteínas (enzimas e membranas
celulares).
✓ A resistência das proteínas ao calor é uma função da hidratação da célula:
• ↑ água: facilita a entrada nas moléculas de proteína, promovendo mudanças
irreversíveis.
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes físicos
CALOR ÚMIDO
✓ Reatores vazios:
1. Injeção direta no interior e expulsão do ar.
2. Fechar reator e pressurizar (até 1,5 atm e 121oC): novas injeções para manter P e T.
3. Final - injeção de ar esterilizado para resfriamento e estabilização da P interna.
4. Introdução do meio de cultura esterilizado (externamente).
5. Início do bioprocesso.
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes físicos
CALOR ÚMIDO
✓ Reatores com meio (processo descontínuo): 3 etapas
✓ t de esterilização: 20-40min, 121oC.
✓ Reator multipropósito: limpeza química prévia + esterilização
num t=60min.
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes físicos
Operação:
1. Completar o nível de água indicado;
2. Adicionar o material dentro da autoclave e fechar a porta;
AUTOCLAVE 3. Aquecer, com vapor gerado ocupando todo o espaço
interno, devendo fluir para fora pela válvula de descarga (10-
✓ Esterilização de reatores 20min, expulsando o ar).
pequenos (30 L) e vidrarias. 4. Fechar a válvula de descarga, esperar T e P estabilizarem
(1.5atm e 121oC).
✓ ≠ dimensões, os verticais
apresentam a porta de
acesso na parte superior;
✓ Aquecimento elétrico
(laboratório).
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes físicos
AUTOCLAVE
Vapor sob pressão
tem 2 funções:
1. TC, favorecida pela
condensação no
material, ↑ rapidamente
a T (difusão de calor).
2. Manutenção do ↑ do
nível de hidratação no
interior das células.
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes físicos
RADIAÇÃO UV
✓ Absorvida por muitas células (baixa capacidade de penetração).
✓ Efeito letal é proporcional à dose de radiação e morte celular
depende do tempo de exposição.
✓ Região do espectro com ação esterilizante é 220-300 nm.
RADIAÇÃO IONIZANTE
✓ Radiações ionizantes eletromagnéticas α, β, γ, raios-X, etc.
✓ Causa grande variedade de efeitos físicos e bioquímicos nos MO.
✓ O principal alvo que leva à perda de viabilidade é a molécula de
DNA.
Esterilização de sólidos: vidraria, metais, embalagens.
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ESTERILIZAÇÃO
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
b) Agentes químicos
GERMICIDAS
QUÍMICOS
C5H8O2
H2O2
CH2O
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
b) Agentes químicos
GERMICIDAS QUÍMICOS
✓ Protocolo para o ciclo de desinfecção/esterilização química de um equipamento:
1. Desmontagem do equipamento;
2. Limpeza com o uso de detergentes;
3. Lavagem com água de baixa dureza para remover os detergentes;
4. Montagem do equipamento, introdução do germicida, propiciando t necessário de
exposição;
5. Drenagem da solução germicida do sistema;
6. Remoção dos resíduos de germicida pela circulação de água.
2. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS
b) Agentes químicos
AGENTES GASOSOS
✓ Salas e laboratórios (vapores de formaldeído).
✓ Agentes mais importantes:
• Óxido de etileno: itens hospitalares e plásticos de laboratório (câmaras semelhantes
à autoclave).
• Óxido de propileno: alimentos.
• Vapores de formaldeído: câmaras, salas e ambientes onde assepsia é desejável.
✓ Tempo de esterilização depende:
• Agente e sua concentração.
• Umidade relativa do ambiente.
• T do processo.
Descontínuo (batelada)
Contínuo
✓ Processo descontínuo
• Vapor direto: esterilização in situ, meio é colocado no fermentador, ocorre o
borbulhamento de vapor aquecido (diluindo o meio).
• Vapor indireto: vapor passa pela serpentina/camisa.
✓ Agitação mecânica assegurando T homogênea.
✓ Ocorre em três fases:
2. Esterilização:
1. Aquecimento com vapor 3. Resfriamento
Manutenção da Te
(direto ou indireto): com água:
por um dado de
T0 até Te≈l20°C Até T de fermentação
tempo θ
✓ Processo descontínuo
• Destruição térmica ocorre Variação de T durante
nas três fases! a esterilização em
• Quando T > Tm (mínima batelada
letal, 80-100°C) há
destruição de MO!
T de fermentação
N = no de MO vivos
T3>T2>T1 Função decrescente do t!
t ln(N)
0 N0
... ...
lnN
200 200 5.3 6
250 40 3.7 4
100000 y = -0,0341x + 12,1626
2
R² = 0,9998
80000 0
60000 0 100 200 300
t (min)
N
40000
𝑘105 = 0.0341𝑚𝑖𝑛−1 𝑙𝑛𝑁0 = 12.1626
20000
0
Linear
0 100 200 300
t (min)
𝑁0 = 191.000
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ESTERILIZAÇÃO
Importante!!
Taxa de decréscimo da população é
inicialmente baixa e depois ↑.
Quanto ↑T → ↓t de taxa mínima.
Para T>l20 °C, se considera
pequeno o desvio da curva em
relação à Eq. 4.2!
𝑘105 = 0.0341𝑚𝑖𝑛−1
𝑘120 = 3.0𝑚𝑖𝑛−1
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ESTERILIZAÇÃO
𝑙𝑛𝑁 = 𝑙𝑛𝑁0 − 𝑘 ∙ 𝑡
ln(0,1 ∙ 𝑁0 ) = 𝑙𝑛𝑁0 − 𝑘 ∙ 𝐷𝑟
2,303
𝐷𝑟 =
𝑘
B. stearothermophilus
E. coli
𝑑𝑁 𝑁0
= −𝑘 ∙ 𝑁 𝑙𝑛𝑁 = 𝑙𝑛𝑁0 − 𝑘 ∙ 𝑡 𝑙𝑛 =𝑘∙𝑡
𝑑𝑡 𝑁
✓ Ex. 2: Considerando um problema com P=0,03 (3%). A cada 100 partidas de meio
tratadas nas mesmas condições:
• 97 partidas esterilizadas 𝐸𝑓 3
P= = 0,03 =
𝐸𝑡 100
• 3 partidas não esterilizadas
1 𝑁0 1 100𝑁0 1 𝑁0
t= 𝑙𝑛 = 𝑙𝑛 = 𝑙𝑛
𝑘 𝑁 𝑘 3 𝑘 0,03
1 𝑁0
t = 𝑙𝑛
𝑘 𝑃
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ESTERILIZAÇÃO
1 𝑁0 1 2,5∙1010
t = 𝑙𝑛 t= 𝑙𝑛 =7,7min
3,4𝑚𝑖𝑛−1 0,1
𝑘 𝑃 ↓P
1 2,5∙1010
t= 𝑙𝑛 =8,4min
3,4𝑚𝑖𝑛−1 0,01
↑t
1 2,5∙1010
t= 𝑙𝑛 =9,1min
3,4𝑚𝑖𝑛−1 0,001
✓ Processo descontínuo:
Variação de T
durante a
CÁLCULO DE θ ENVOLVE esterilização
N1 no inicial de MO vivos no meio em batelada
P probabilidade de falha
Curvas de aquecimento e resfriamento
Tm temperatura mínima letal
Te temperatura de esterilização
Variação de k com T
N2
N3
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ESTERILIZAÇÃO
✓ Processo descontínuo:
• No aquecimento e no resfriamento k varia devido à
variação da T. Logo:
𝑑𝑁
= −𝑘 ∙ 𝑁
𝑑𝑡
𝑁0
𝑙𝑛 =𝑘∙𝑡
𝑁
1. Escolher diversos valores de t;
2. Para cada t encontrarT;
3. Para cada T calcular k;
4. → k = f(t).
Aquecimento Resfriamento
t (min) T' (oC) k (min-1) t (min) T' (oC) k (min-1)
24 80 0.0002 0 120 1.5999
30 87 0.0022 2 114 0.4819
40 97 0.0161 4 109 0.1773
50 105 0.0797 6 105 0.0797
60 112 0.3230 8 101 0.0358
70 116 0.7189 10 97 0.0161
80 120 1.5999 15 88 0.0027
20 80 0.0005
Variação de T
durante a
esterilização
contínua
Ex. 4.
4. ESTERILIZAÇÃO DE AR
a) Filtração
4. ESTERILIZAÇÃO DE AR
a) Filtração
• Filtros de membranas:
Leitura Obrigatória!
Obrigada!