Avaliação do desempenho dos ensaios Abbott m2000 e Roche COBAS

Ampliprep/COBAS Taqman para determinação da carga viral do HIV-1 utilizando

manchas de sangue seco e manchas de plasma secas no Quénia

Clement Zeh1*, Kenneth Ndiege2, Seth Inzaule2, Rebecca Achieng2, John

Williamson1, Joy Chih-Wei Chang3, Dennis Ellenberger3, John Nkengasong3
1 Division of HIV/AIDS Prevention, U.S. Centers for Disease Control and Prevention,
Kisumu, Kenya,
2 Centre for Global Health Research, Kenya Medical Research Institute, Kisumu,
Kenya,
3 International Laboratory Branch, Division of Global HIV/AIDS, Center for Global
Health, U.S. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, United
States of America

*[email protected]

Resumo
O teste de rotina da carga viral do HIV não é amplamente acessível na maioria dos
locais com recursos limitados, incluindo o Quénia. Para aumentar o acesso ao teste de
carga viral, tipos alternativos de amostras, como manchas de sangue seco (DBS), que
superam as barreiras logísticas associadas à separação do plasma e ao transporte da
cadeia de frio, precisam ser considerados e avaliados. O presente estudo avaliou
manchas combinadas de sangue seco (DBS) e manchas de plasma seco (DPS) contra
plasma usando os ensaios quantitativos de carga viral Abbott M 2000 (Abbott) e Roche
Cobas Ampliprep/Cobas TaqMan (CAP / CTM) no oeste do Quénia.

Métodos
DBS e DPS plasmáticos correspondentes foram obtidos de 200 pacientes experientes
em tratamento antirretroviral (TAR) infectados com HIV-1 que frequentam centros de
apoio a pacientes no oeste do Quénia. Os parâmetros de desempenho quantitativos do
ensaio quantitativo com intervalos de confiança (IC) de 95% foram avaliados no limite
inferior de detecção dos ensaios (400cps/ml para CAP/CTM e 550cps / ml para Abbott)
usando SAS versão 9.2. As curvas de operação do receptor (ROC) foram ainda
utilizadas para avaliar os limiares de carga viral com o melhor desempenho do ensaio
(ensaio de referência plasma CAP / CTM).
Resultados
Usando o teste de Abbott, a sensibilidade e especificidade, respectivamente, para DPS
foram (97,3%, [95% IC: 93,2-99,2] e 98,1% [95% IC: 89,7-100]) e aquelas para DBS
(93,9% [95 % IC: 88,8–97,2] e 88,0% [IC95%: 82,2–92,4]). A correlação e concordância
usando plasma pareado e DPS/DBS foram fortes, com r2 = 90,5 e rc = 68,1. A
alteração percentual relativa de Bland-Altman foi de 95,3 para DPS, (95% CI: 90,4–
97,7) e 73,6 (95% IC: 51,6–86,5) para DBS. Usando o ensaio CAP / CTM, a
sensibilidade para DBS foi significativamente maior em comparação com DPS (100,0%
[95% CI: 97,6-100,0] vs 94,7% [95% CI: 89,8-97,7]), enquanto a especificidade para
DBS foi menor: 4%, [IC 95%: 0,4–13,7] em comparação com DPS: 94,0%, [IC 95%:
83,5–98,7]
Quando comparados em diferentes limiares clínicos relevantes, a acurácia do ensaio
Abbott foi de 95% no ponto de corte de 1000 cps/ml, com sensibilidade e especificidade
de 96,6% [IC 95% 91,8–98,7] e 90,4% [IC95% 78,2– 96,4] respectivamente. O limiar
óptimo foi de 3000 cps/ml com uma precisão de 95,5%, sensibilidade e especificidade
de 94,6% [IC 95% 89,3-97,5] e 98,1% [IC 95% 88,4–99,9]), respectivamente. O melhor
limiar para CAP/CTM foi de 4000 cópias/mL, com 92,5% de precisão (sensibilidade de
96,0% [IC 95% 91,0–98,3] e especificidade de 82,7% [IC 95% 69,2–91,3]).

Conclusões
Houve desempenho semelhante entre DBS, DPS e plasma pareados usando o teste de
Abbott, e boa correlação para DPS e plasma pareados usando o teste CAPCTM. Os
achados sugerem que o DBS e o DPS podem ser usados de forma confiável como
amostras alternativas ao plasma para medir a VL do HIV-1 usando o Abbott, e o DPS
pode ser usado com segurança com o CAP / CTM em ambientes limitados.

Introdução
Mais de 60% dos indivíduos infectados pelo HIV-1 residem na África [1]. O HIV é a
pry4rincipal causa de morte na África Subsaariana e uma das principais causas de
mortalidade global [1]. Entre as várias intervenções para prevenir a disseminação do
HIV, o uso consistente de terapia anti-retroviral (TARV) tem sido demonstrado como o
mais eficaz, com uma redução de 96% na taxa de transmissão interligada entre casais
discordantes em um estudo [2] . Dados de estudos anteriores sugeriram que a VL da
pessoa infectada precisa ser reduzida abaixo de 1000-1500 cópias/mL para que a
probabilidade de transmissão se aproxime de zero [3]. Aproximadamente 9,1 milhões
de pessoas infectadas estão em terapia anti-retroviral na África Subsaariana, e o
sucesso do tratamento depende do monitoramento de rotina [4]. Devido aos recursos
limitados, as directrizes anteriores de tratamento recomendavam o uso de marcadores
imunológicos e clínicos para o monitoramento do tratamento [5]. No entanto, estes
marcadores demonstraram ser substitutos pobres, levando à classificação errada da
falha do tratamento, acumulação de estirpes resistentes ao fármaco HIV-1, limitando
subsequentemente futuros opções de tratamento, ou resultantes de uma mudança
injustificada para um regime caro [6-8]. O uso alternativo de VL para monitorar
pacientes em TARV tem várias vantagens, incluindo detecção atempada e precisa da
falha do tratamento virológico e ajustes apropriados no tratamento, que podem prevenir
a resistência antirretroviral e garantir futuras opções de tratamento. Isso também pode
contribuir para uma redução no custo total dos cuidados [9]. Consequentemente, as
directrizes da OMS recomendam fortemente o uso de testes de rotina de VL para o
monitoramento de falhas do tratamento ART, quando disponíveis, incluindo
configurações limitadas por recursos (RLS) [3]. O Ministério da Saúde do Quénia
adoptou esta recomendação, que resultou na ampliação programática dos testes de VL
[10].
No entanto, ainda existem desafios que limitam o acesso ao teste de LV pela maioria
dos indivíduos infectados pelo HIV-1 em TARV no Quénia. Entre os obstáculos estão
os custos rigorosos associados à infra-estrutura de laboratório, o envio de amostras
para os poucos laboratórios de referência com capacidade para testes de LV e
frequentes atrasos no recebimento de resultados de tais laboratórios. O uso de plasma,
actualmente usado para testes de VL em RLS, é dificultado pela necessidade de
preparação de amostras de sangue total, requisitos de armazenamento e transporte de
cadeia fria de áreas geralmente remotas para as instalações de testes centralizadas.
Portanto, há necessidade de uma abordagem mais viável, como o uso de tipos de
amostras alternativos, para ajudar a reduzir custos e aumentar o acesso aos testes de
VL.
Amostras de fluido seco (DFS), incluindo amostras de sangue seco (DBS) e amostras
de plasma seco (DPS), podem fornecer várias vantagens logísticas e práticas ao
plasma, incluindo transporte e armazenamento fáceis de colectar (especificamente
DBS). A DFS também pode superar a necessidade de envio a frio e mostrou-se estável
à temperatura ambiente sem degradação dos ácidos nucléicos virais [11]. Em crianças,
entre as quais a colecta de amostra preferida é por meio de picada no dedo ou no
calcanhar, o DBS oferece a vantagem do requisito de pequeno volume em comparação
com a punção venosa [12]. Além disso, descobertas anteriores mostraram resultados
promissores para testes de carga viral com DFS, com resultados comparáveis àqueles
derivados do plasma no teste de VL [13-18]. Apesar dessas vantagens, o DFS ainda
não foi amplamente adoptado nos testes de rotina de VL, sugerindo a necessidade de
mais dados para orientar a implementação. O objectivo deste estudo foi avaliar o
desempenho do teste de VL em DBS e DPS, em comparação com o teste de plasma,
usando dois ensaios VL comuns, os testes em tempo real Roche Cobas
Ampliprep/Cobas TaqMan CAP/CTM e Abbott M 2000. O objectivo secundário foi
avaliar ainda mais o limite de detecção para DBS usando o ensaio Abbott.
Métodos
Descrição do participante do estudo
Os participantes eram pacientes HIV positivos em TARV que procuravam atendimento
e tratamento de tratamento em centros de atendimento clínico em Western, no Quénia.

Aprovações éticas e consentimento informado

A aprovação ética para o estudo foi obtida dos Comités de Ética e Orientação Científica
do Instituto de Pesquisa Médica do Quénia (KEMRI) em Nairobi, Quénia e do Conselho
de Revisão Institucional dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA
(CDC) em Atlanta, Geórgia. Todos os participantes do estudo forneceram
consentimento informado por escrito para participação no estudo.

Colheita, preparação e armazenamento de amostras

Amostras de pacientes experientes em TARV que compareceram para monitoramento
de VL alvo foram colectadas de clínicas na região do Quénia Ocidental de Novembro
de 2012 a Fevereiro de 2013.
Amostras de sangue total por via intravenosa foram colectadas em tubos
anticoagulantes de ácido etilenodiamino tetra acético (EDTA). A separação por plasma
e a localização de DBS e DPS foram realizadas no laboratório clínico de pesquisa de
HIV do KEMRI / CDC. O plasma foi separado das amostras de sangue total no prazo
de 6 horas a partir do momento da colecta e 1 mL foi aliquotado em criotubos estéreis e
armazenado a -70˚C até o teste ser realizado. Para cada amostra de sangue total e
plasma, duas placas Whatman 903 foram preparadas, uma para DBS e outra para
DPS, observando 75μL de sangue total e plasma, respectivamente, em cada um dos 5
pontos, seguindo as recomendações dos fabricantes. O DBS e o DPS foram secos ao
ar à temperatura ambiente em fluxo laminar durante a noite e depois embalados com
cartões indicadores dessecantes e de humidade. As amostras DFS foram então
enviadas à temperatura ambiente para o laboratório de testes KEMRI/CDC HIV-
Research. Nos quatro meses de colecta de amostras, o teste de VL foi feito no plasma
para monitoramento de rotina do paciente, enquanto o DFS foi armazenado a -30˚C
para processamento posterior. Os espécimes de plasma, DBS e DPS correspondentes
foram colocados em quatro categorias de 50 espécimes cada, com base nos resultados
de VL de plasma CAP/CTM em cópias/mL (<400, 400- <10.000, 10.000- <100.000 e
100.000). Resultados <550 cópias/mL foram considerados indetectáveis ao usar DBS e
DPS para determinação de VL com Abbott M2000. Embora os resultados <400
cópias/mL tenham sido considerados indetectáveis quando se utiliza o DBS e o DPS
para determinação de VL com o CAP/CTM da Roche. Os valores detectáveis de VL no
plasma para cada plataforma de ensaio foram utilizados como grupo de referência para
comparação com os valores correspondentes de DBS e DPS VL na avaliação da
correlação e concordância. Para avaliar a reprodutibilidade dos resultados dos testes
DBS e DPS VL usando o teste de Abbott, 80 DBS e 80 DPS (40 com indetectável e 40
com cópias de VL detectáveis) seleccionados aleatoriamente foram reprocessados em
duplicatas. Para avaliar ainda mais o limite de detecção (LOD) do teste Abbott, foram
utilizados painéis DBS obtidos do CDC International Laboratory Branch. Os painéis
DBS LOD foram produzidos a partir de sangue humano VIH-negativo com painéis de
VIH-1 disponíveis comercialmente com concentrações de VL conhecidas (Acrometrix
por Life Technology, Benicia, CA, EUA). O sangue enriquecido em 5.000, 2.500, 1.000,
500 e 250 cópias/mL foi então usado para preparar DBS e processado em vinte
repetições para cada concentração para avaliar o teste de Abbott LOD. Devido a falhas
de execução, havia um número limitado de pontos para avaliar LOD para o teste CAP/
CTM.
Processamento e detecção de ácidos nucléicos
Processamento e detecção com o Roche COBAS Ampliprep/COBAS Taqman. O
ensaio CAP / CTM (Roche Diagnostics Ltd, Rotkruez, Suíça) foi utilizado para extração,
amplificação e quantificação automatizadas no plasma e no DFS seguindo as
instruções do fabricante da Roche. Resumidamente, 1000 μL de amostras de plasma
foram divididas em alíquotas nos respectivos tubos de espécimes, após um breve
vórtice obter uma mistura uniforme. Os espécimes foram transferidos para o CAP /
CTM para processamento usando o método HI2CAP96 [19]. Para DFS, foi utilizado o
procedimento de teste de mancha de fluido seco CAP / CTM HIV-1 (HI2DFS96 versão
2.0). A extração, amplificação e quantificação do DFS foram idênticas àquelas dos
espécimes de plasma, com as seguintes modificações do fabricante; Um círculo
completo DBS de cada espécime foi colocado em um tubo de amostra de 1,8 mL. Para
este tubo, 1000 μl de reagente pré-extração de amostra foram adicionados para
eluição, o eluente foi transferido para um termomisturador (Eppendorf AG, Hamburgo,
Alemanha) a 1000 rpm por 10 minutos a 56˚C [19]. Posteriormente, os espécimes
foram transferidos para o CAP / CTM para processamento.

Processamento e detecção com o Abbott M2000. O teste de amostras de plasma e

DFS usando o preparador de amostras Abbott m2000 (sp) / analisador em tempo real
(rt) Abbott m2000 (Promega, Madison, WI, EUA) envolveu extração, amplificação e
quantificação automatizadas. O teste de plasma foi feito seguindo as directrizes padrão
do fabricante de 0,6 mL no protocolo de plasma m2000 [20]. Para DFS, a extração de
RNA foi feita seguindo o procedimento do fabricante, descrito resumidamente como
segue; para cada espécime, dois discos de meia polegada (dois pontos) foram obtidos
de cada cartão e colocados em tubos de propileno de 15 mL, respectivamente
rotulados. Em seguida, 1,7 mL de reagente de m-lise em volume, fornecido com o
ensaio de preparação de amostras Abbott, foi adicionado a cada tubo e incubado
durante 15 minutos, com mistura intermitente à temperatura ambiente, para lisar. Os
lisados foram transferidos para os respectivos vasos de reacção m2000sp. O
processamento foi realizado utilizando o protocolo 1mL do DFS versão 4.0 em
m2000sp, seguindo as directrizes do fabricante [20]. A amplificação e quantificação em
tempo real foram realizadas em m2000rt, utilizando também o protocolo de 1mL
DBS/DPS da manufactura.
Análises estatísticas
Os níveis de RNA do HIV-1 em amostras de plasma e DBS foram transformados em
valores de log10. Os valores utilizados já haviam sido ajustados para hematócrito e
volume da amostra, utilizando-se factores de correcção incorporados tanto no software
CAP / CTM quanto no de ensaios Abbott. Usando a plasma VL para cada ensaio como
referência, a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor
preditivo negativo (VPN) (e 95% intervalos binários de confiança exactos [IC]) foram
calculados em torno do limite inferior de detecção do ensaio (400 cps/ml para
CAP/CTM e 550 cps/ml para Abbott). Correlação de concordância e análises de Bland
Altman foram realizadas para determinar a precisão e concordância das medidas de VL
entre plasma e DBS e plasma e DPS espécimes, com o ensaio CAP/CTM e Abbott,
usando amostras de plasma como o grupo de referência. Para analisar a
reprodutibilidade do ensaio Abbott utilizando DBS e DPS, utilizou-se o coeficiente de
concordância e Bland-Altman. Utilizamos a análise probit para determinar o limite de
detecção do ensaio Abbott usando o DBS, e a curva de operação do receptor e as
razões de verossimilhança foram usadas para estimar os vários pontos de corte
clínicos relevantes para a falha do tratamento.
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o SAS, versão 9.2 (SAS Inc.,
Cary, Carolina do Norte, EUA).
Resultados
Taxas de detecção em DBS e DPS em níveis correspondentes de VL
A proporção de amostras de DBS e DPS com LV detectável aumentou com um
aumento no nível de LV no plasma. Entre os espécimes com plasma indetectável VL,
96% com CAP / CTM e 14% com Abbott tiveram LV detectável usando DBS (Tabela 1).
Além disso, 6% com CAP / CTM e 2% com Abbott tiveram LV detectável usando DPS
(Tabela 2).
Desempenho do DBS para determinação de VL usando testes de testes da Roche
e Abbott
A sensibilidade da detecção de VL para DBS usando o ensaio CAP / CTM foi
significativamente maior (100,0%, 95% CI: 97,6-100,0) em comparação com o ensaio
Abbott (93,9%, 95% CI: 88,8-97,2). A especificidade foi no entanto significativamente
maior para o ensaio Abbott (88,0%, 95% CI: 82,2-92,4) do que CAP / CTM (4,0%, IC
95%: 0,5-13,7). O VPP do Abbott também foi significativamente maior (100,0%, IC95%:
97,4–100,0) do que o CAP / CTM (75,8%, IC95%: 69,2-81,6), mas não houve muita
diferença no VPN para os dois testes; CAP / CTM (100,0%, IC 95%: 15,8-100,0) e
Abbott (85,5%, IC 95%: 73,8-93,0) (Tabela 3). Para o CAP / CTM, a correlação entre os
valores de plasma pareado e VD DBS foi forte, com um coeficiente de correlação de
89,7, P <0,001 e coeficiente de correlação de concordância de 85,2, IC95%: 80,6-88,8
(Fig. 1a). A análise de Bland-Altman mostrou diferença média (bias) de -0,23 e limites
de concordâncknjjjjjnjjjjj5% de -0,96 a 0,51 log10 (Fig. 2a), com 6% dos resultados
(9/150) caindo do desvio-padrão ± 1,96 (SD).,,
Usando Abbott, houve uma forte correlação entre os valores de LV de amostras de
plasma-DBS emparelhados com um coeficiente de correlação de 90,5, P <0,001 e rc
68,1 IC95%: 61,2-74,0 (Fig. 1b).
A análise de Bland-Altman mostrou diferença média (viés) de -0,59 e 95% dos limites
de concordância de -1,25 a 0,06 log10 (Fig. 2b), com 6,7% (10/150) caindo do desvio
padrão ± 1,96 (DP).
Desempenho do DPS para determinação de LV usando ensaios de testes da
Roche e Abbott
As medidas de desempenho para os testes Abbott e CAP / CTM foram 97,3% (95% CI:
93,2-99,2) e 94,7% (89,8–99,7) para sensibilidade, especificidade 98,1% (89,7–100)
versus 94,0% (83,5–98,8) PPV 99,3% (96,2–100,0) vs. 97,9% (94,1–99,6) e NPV
92,7% (82,4–98,0) vs. 85,5% (73,3–93,5), respectivamente (Tabela 3).
Correlação forte foi observada entre os valores pareados de plasma e DPS VL usando
o ensaio CAP / CTM, com um coeficiente de correlação (r2) de 75,1, P <0,001 e rc de
73,0, IC 95%: 64,5-79,7 (Fig 3a). A análise de Bland-Altman mostrou diferença média
(bias) de 0,19 e 95% dos limites de concordância de -0,97 a 1,34 log10 (Fig. 4a), com
3,3% (5/150) caindo do desvio-padrão ± 1,96 (DP). Com o teste Abbott, houve uma
forte correlação nos resultados da LV entre o par de amostras de plasma e DPS (r2 =
91,4, P <0,001 e rc = 57,9, IC 95%: 50,9-64,2) (Fig. 3b). A análise de Bland-Altman
mostrou diferença média (viés) de -0,83 e 95% dos limites de concordância de -1,48 a
0,17 log10 (Fig. 4b), com 6,7% dos resultados (10/150) caindo do desvio padrão de ±
1,96 SD).
Comparando os valores de CV pareados com o CAP / CTM como referência e Abbott
como o grupo de comparação, observamos uma forte correlação (r2 = 91,8, P <0,001 e
rc = 87,1, 95% CI: 83,0-90,3). A análise de Bland-Altman mostrou diferença média
(viés) de -0,30 e 95% dos limites de concordância de -0,44 a 1,03 log10, com 4,7%
(7/150) caindo do desvio-padrão ± 1,96 (DP).
Reprodutibilidade de medições de DBS e DPS no Abbott em tempo real ensaio
Avaliamos ainda a reprodutibilidade de DBS e DPS no sistema Abbott usando 80
amostras DBS e 80 DPS. Os resultados mostraram um forte rc de 73,6, 95% CI: 51,6-
86,5, com todos os valores de VL caindo dentro de ± 2 desvios-padrão para DBS. Para
os 40 espécimes detectáveis de DPS, observamos um forte rc de 95,3 (95% CI: 90,4-
97,7). A análise de Bland-Altman mostrou diferença média (viés) de 0,05 e 95% limites
de concordância de -0,31 a 0,42 log10 para DPS e um viés de 0,15, 95% limites de
concordância de -0,63 a 0,93 log10 para DBS (Fig. 5).

Limite de detecção para DBS no sistema Abbott

Usando análise probit para o painel DBS replica, um limite de detecção de 1.222
cópias/mL (95% CI: 978, 1874) foi observado (Fig 6). O desempenho do ensaio nas
categorias de LV seleccionadas foi de 100% a 2500 e 5000 cópias/mL, 85% a 1000
cópias/mL, 45% a 500 cópias/mL e 17,6% a 250 cópias/mL

Determinação do limiar clínico óptimo para determinação de falha do LV usando

o DBS
Avaliações adicionais para determinar o limiar DBS VL em que os ensaios tiveram
desempenho óptimo, quando se usou plasma CAP/CTM como referência, mostraram o
melhor ponto de corte para CAP/CTM a 4000 cópias/mL, com 92,5% de precisão
(sensibilidade de 96,0% [IC 95% 91,0–98,3] e especificidade de 82,7% [IC95% 69,2–
91,3]). Da mesma forma, o melhor limiar para o ensaio em tempo real da Abbott foi de
3.000 cópias/mL com 95,5% de precisão (sensibilidade 94,6% [IC 95% 89,3–97,5],
especificidade 98,1% [IC 95% 88,4–99,9]) (Tabela 4) . No entanto, isto não diferiu
substancialmente de 1000 cópias/ml com detecções 95% precisas (sensibilidade 96,6
[IC 95% 91,8-98,7], especificidade 90,4 [IC 95% 78,2–96,4]), nem qualquer um dos
outros pontos de corte do Sistema Abbott (Razão de Verossimilhança positiva [LR +]>
10%) em qualquer ponto de corte em comparação com CAP/CTM (LR + com <3% em
3000). A AUC do ROC para DBS VL usando CAP / CTM e Abbott, respectivamente, foi
de 0,90 (IC 95%: 0,85 a 0,96) e 0,97 (IC 95%: 0,95 a 1,0).
Discussão
As restrições logísticas apresentadas pelo plasma como o tipo de amostra para o teste
de VL em configurações com recursos limitados podem criar acesso restrito ao teste de
VL. Seguindo as recentes directrizes da OMS, os países da África Subsaariana
adoptaram o monitoramento de rotina da VL. No entanto, a implementação é
dificultada, entre outros, pelo tipo de amostra adequado para pacientes de áreas
remotas. O desempenho do DFS é uma alternativa que poderia superar as restrições
logísticas associados à colecta e remessa de plasma precisam ser avaliados. O
presente estudo avaliou o desempenho de DBS e DPS para testes de LV usando
ensaios CAP / CTM e Abbott.
Tanto o CAP / CTM quanto o Abbott mostraram boa sensibilidade para o DBS VL, o
que é apoiado por resultados de estudos similares [14,21,22], mas a especificidade foi
comparativamente maior para o ensaio Abbott. O uso de DBS para testes de LV tem
sido geralmente relatado como resultando em baixa especificidade, especialmente para
o ensaio CAP / CTM [23-26]. Uma possível explicação poderia ser a contribuição do
DNA pró-viral do HIV-1 e do RNA viral a partir de células mononucleares do sangue
periférico em RT-PCR [27]. A diferença observada na especificidade entre os ensaios
Abbott e CAP / CTM poderia ser atribuído à capacidade do primeiro para excluir a
contaminação do DNA pró-viral. A tecnologia de extracção CAP / CTM usando esferas
de sílica não discrimina entre DNA e RNA do HIV-1 [19], enquanto o ensaio Abbott
discrimina o DNA intracelular do HIV-1, extraindo principalmente o RNA, usando contas
de óxido de ferro [20]. Hipoteticamente, a contribuição do DNA e RNA associados às
células do HIV pode ser a fonte de LV detectável falsa na DBS em amostras com LV
plasmática indetectável [11,28]. Este poderia ser ainda o motivo para a especificidade
ligeiramente inferior para o ensaio Abbott, uma vez que ainda não consegue discriminar
o RNA celular do RNA cellfree. A amplificação baseada na sequência de ácido nucléico
NucliSense (NASBA), que amplifica especificamente ARN de cadeia simples através da
utilização de ARN polimerase de T7 [29], demonstrou resultar numa especificidade
mais elevada do que o ensaio Abbot [30]. Essas descobertas continuam a destacar a
necessidade de recomendações específicas do ensaio para orientar o teste de VL do
DBS. Alternativamente, mais estudos devem ser realizados para optimizar o uso de
DBS em testes de carga viral, especialmente aqueles que visam métodos de extracção
que discriminam o RNA livre de células de RNA ou DNA associado a células. Estudos
limitados que avaliam esses métodos são promissores, incluindo o protocolo de
fraccionamento viral livre por Roche [31] e o método de depleção de leucócitos
incorporado no sangue total baseado em SAMBA point-of-care test [32].
O desempenho do DPS foi comparável ao plasma, suportando sua utilidade como um
tipo de amostra alternativo ao plasma para o teste de VL. No entanto, devido aos
requisitos de centrifugação para separar o plasma e o processamento da cadeia de frio
para manter a integridade da amostra, o uso de DPS pode não servir ao propósito de
aumentar o acesso ao teste de VL na RLS. Apesar dessa limitação, foram
desenvolvidas tecnologias para minimizar as complexidades associadas à colecta de
DPS, incluindo separadores de plasma de baixo custo, rápidos e simples de usar, que
exigem baixo volume de sangue total [33], o que poderia proporcionar uma
oportunidade de expandir a utilização de DPS. para o teste de VL. O DBS e o DPS
apresentaram resultados reprodutíveis usando a plataforma Abbott tanto em níveis
baixos quanto altos de VL. Esse achado é consistente com os achados de outros
estudos [18,22]. As directrizes da OMS recomendam um limite de 1.000 cópias/mL
para falha do tratamento para amostras de plasma e DBS [3]. No entanto, observamos
um trade-off em especificidade e sensibilidade, enquanto usamos o limite actual da
OMS para DBS (1000cps/ml) e o limite recomendado para 2013 de 3000-5000 cps / ml.
Com 1.000 cópias/ml, quase 10% dos pacientes seriam erroneamente classificados
pelo ensaio Abbott como tratamento falsa e cerca de 4% como resposta falsa à TARV.
O ensaio CAP/CTM, com uma sensibilidade perfeita, mas com uma especificidade
muito mais baixa, levaria a que quase 83% dos doentes fossem erroneamente
classificados erroneamente como falha do tratamento. Aumentar o corte melhora a
especificidade do CAP/CTM até um máximo de 83% em 4000 cópias / mL. Para o
ensaio Abbott, a especificidade aumenta para o seu máximo melhor a 3000 cps / ml,
reduzindo a taxa de erro de classificação falsa para falha do tratamento de 10% para
2%. No entanto, o risco de falta de pacientes que falham no tratamento aumenta de 3,4
para 6,4%. Achados semelhantes foram observados em outros estudos e sugerem a
necessidade de um trade-off no uso de ensaios baseados em DBS [26,34]. Reduzir o
cut-off minimiza a contaminação do ácido nucleico viral celular, mas aumenta o risco de
falta de pacientes que falham no tratamento com baixos níveis de viremia [26,34]. No
entanto, é importante notar que as decisões clínicas dependem de um algoritmo que
requer um teste confirmatório 3 meses após o aconselhamento intensivo de adesão.
Em tal algoritmo, um ponto de corte inferior para falha virológica (1000cps/ml) poderia
resultar em aumento de custos para testes repetidos, mas mais pessoas que falham no
tratamento podem ser detectadas muito cedo. Por outro lado, um corte mais alto, como
3000cps/ml, pode reduzir os custos de repetir o teste ao usar o ensaio Abbott, mas,
potencialmente, falha em 3% dos casos que falham no tratamento. Como não está
claro como esses testes funcionariam no algoritmo actual, mais estudos são
necessários para determinar as melhores características de desempenho do ensaio
que maximizariam o uso do DBS.
Até onde sabemos, este é o primeiro estudo no Quénia a avaliar e comparar o uso de
DBS e DPS em amostras de plasma para o teste de LV usando os ensaios Abbott e
CAP/CTM. Uma vez que ambos os ensaios são comumente usados no Quénia, os
resultados deste estudo fornecerão orientação ao Ministério da Saúde do Quénia na
implementação do uso de DBS para testes de VL para atender à demanda crescente
de testes de rotina de VL. No entanto, mais estudos são necessários para avaliar o
desempenho do teste VL de DBS colectado, enviado e armazenado em temperatura
ambiente em condições de campo. Um desses estudos foi realizado no Quénia,
avaliando não só o DBS venoso, mas também o finger stick e o micro capilar DBS para
o teste de LV, com resultados comparáveis ao plasma [13].
(Schmitz, 2014), este estudo teve algumas limitações. Primeiro, devido a um número
limitado de amostras de DBS e DPS, a análise de LOD foi feita apenas no ensaio
Abbott; adicionalmente, espécimes eram de pacientes experientes em TAR com
informações faltantes sobre o histórico de tratamento. Estudos futuros devem avaliar se
a duração do uso de TARV pode influenciar o desempenho do DBS para o teste de LV.
Em conclusão, boa correlação e concordância foram observadas entre DBS, DPS e
plasma combinados para Abbott, enquanto boa correlação foi observada para DPS e
plasma usando CAP/CTM. Nossos resultados mostram que DBS e DPS podem ser
usados de forma confiável como amostras alternativas ao plasma para medir a VL do
HIV-1 usando Abbott, enquanto a DPS pode ser usada com segurança com CAP/CTM
em configurações com recursos limitados.

Agradecimentos
Agradecemos aos centros de apoio ao paciente HISS e à equipe do Laboratório de
Pesquisa em HIV / KEMRI / CDC.
O CDC financiou este estudo. Os papéis de todos os coautores eram os seguintes; CZ,
DE, JCWC, JN participaram do desenho do estudo, supervisão do estudo, testes
laboratoriais e análise de dados. KN participou da supervisão do estudo, testes
laboratoriais e análise de dados. RA, SI e J.W participaram da análise de dados; Todos
os autores participaram da redacção do manuscrito e aprovaram o conteúdo final.
Este artigo foi publicado com a permissão do director, KEMRI

Contribuições dos autores

Conceituação: CZ DE JCWC JN.
Análise formal: KN JW SI RA.
Aquisição de financiamento: CZ DE JCWC JN.
Investigação: KN.
Metodologia: CZ DE JCWC JN.
Administração do projecto: CZ DE JCWC JN.
Supervisão: CZ DE JCWC JN KN.
Escrita - rascunho original: CZ JCWC DE JN KN RA SI JW.
Escrita - revisão e edição: CZ JCWC DE JN KN RA SI JW

Referências
1. UNAIDS. AIDS by the numbers-AIDS is not over but it can be [Internet]. 2016.
http://www.unaids.org/en/resources/documents/2016/AIDS-by-the-numbers
(accessed December 06, 2016)
2. Baggaley RF, White RG, Hollingsworth TD, Boily M-C. Heterosexual HIV-1
infectiousness and antiretroviral use: systematic review of prospective studies of
discordant couples. Epidemiology. 2013; 24: 110–21
https://doi.org/10.1097/EDE.0b013e318276cad7 PMID: 23222513
3. World Health Organization. Consolidated guidelines on the use of antiretroviral
drugs for treating and preventing HIV infection Recommendations for a public
health approach— Second edition. 2016. http://www.who.int/hiv/pub/arv/arv-
2016/en/ (accessed February 16, 2017)
4. UNAIDS. On the fast-track to an AIDS-free generation [Internet]. 2016.
http://www.unaids.org/sites/default/files/media_asset/GlobalPlan2016_en.pdf
(accessed November 04, 2016)
5. WHO. Antiretroviral Therapy for HIV Infection in Infants and Children: Towards
Universal Access Recommendations for a public health approach: 2010 revision
(accessed March 18, 2017).
6. Rawizza HE, Chaplin B, Meloni ST, Eisen G, Rao T, Sankale ´ JL, et al.
Immunologic criteria are poor predictors of virologic outcome: Implications for
HIV treatment monitoring in resource-limited settings. Clin Infect Dis. 2011; 53:
1283–1290 https://doi.org/10.1093/cid/cir729 PMID: 22080121
7. Sigaloff KC, Hamers RL, Wallis CL, Kityo C, Siwale M, Ive P, et al. Unnecessary
antiretroviral treatment switches and accumulation of HIV resistance mutations;
two arguments for viral load monitoring in Africa. J Acquir Immune Defic Syndr.
2011; 58: 23–31 https://doi.org/10.1097/QAI.0b013e318227fc34 PMID:
21694603
8. Van Oosterhout JJG, Brown L, Weigel R, Kumwenda JJ, Mzinganjira D, Saukila
N, et al. Diagnosis of antiretroviral therapy failure in Malawi: Poor performance of
clinical and immunological WHO criteria. Trop Med Int Heal. 2009; 14: 856–861
9. Barth RE, van der Loeff MF, Schuurman R, Hoepelman AI, Wensing AM.
Virological follow-up of adult patients in antiretroviral treatment programmes in
sub-Saharan Africa: a systematic review. Lancet Infect Dis. 2010; 10: 155–166
https://doi.org/10.1016/S1473-3099(09)70328-7 PMID: 20185094
10. Ministry of Health National AIDS and STI Control Program (NASCOP).
Guidelines on use of antiretroviral drugs for treating and preventing HIV infection:
A rapid advice, 2014
http://healthservices.uonbi.ac.ke/sites/default/files/centraladmin/healthservices/R
apid Advice Booklet 2014 24 June 12 noon_0.pdf (accessed February 16, 2017)
11. Monleau M, Butel C, Delaporte E, Boillot F, Peeters M. Effect of storage
conditions of dried plasma and blood spots on HIV-1 RNA quantification and
PCR amplification for drug resistance genotyping. J Antimicrob Chemother.
2010; 65: 1562–1566 https://doi.org/10.1093/jac/dkq205 PMID: 20542904
12. Stevens WS, Marshall TM. Challenges in implementing HIV load testing in South
Africa. J Infect Dis. 2010; 201 Suppl: S78–84
13. Schmitz ME, Agolory S, Junghae M, Broyles LN, Kimeu M, Ombayo J, et al. Field
Evaluation of Dried Blood Spots for HIV-1 Viral Load Monitoring in Adults and
Children Receiving Antiretroviral Treatment in Kenya: Implications for Scale-up in
Resource-Limited Settings. J Acquir Immune Defic Syndr. United States; 2017;
74: 399–406
14. Ouma KN, Basavaraju S V, Okonji JA, Williamson J, Thomas TK, Mills LA, et al.
Evaluation of quantification of HIV-1 RNA viral load in plasma and dried blood
spots by use of the semiautomated Cobas Amplicor assay and the fully
automated Cobas Ampliprep/TaqMan assay, version 2.0, in Kisumu,
Kenya. J Clin Microbiol. United States; 2013; 51: 1208–1218
15. Taieb F, Tram TH, Ho HT, Pham VA, Nguyen L, Pham BH, et al. Evaluation of
Two Techniques for Viral Load Monitoring Using Dried Blood Spot in Routine
Practice in Vietnam (French National Agency for AIDS and Hepatitis Research
12338). Open forum Infect Dis. United States; 2016; 3: ofw142
16. Rutstein SE, Kamwendo D, Lugali L, Thengolose I, Tegha G, Fiscus SA, et al.
Measures of viral load using Abbott RealTime HIV-1 Assay on venous and
fingerstick dried blood spots from provider-collected specimens in Malawian
District Hospitals. J Clin Virol. 2014; 60: 392–398 https://doi.org/10.1016/j.jcv.
2014.05.005 PMID: 24906641
17. Fajardo E, Metcalf CA, Chaillet P, Aleixo L, Pannus P, Panunzi I, et al.
Prospective evaluation of diagnostic accuracy of dried blood spots from finger
prick samples for determination of HIV-1 load with the NucliSENS Easy-Q HIV-1
version 2.0 assay in Malawi. J Clin Microbiol. 2014; 52: 1343–1351 https://
doi.org/10.1128/JCM.03519-13 PMID: 24501032
18. Andreotti M, Pirillo M, Guidotti G, Ceffa S, Paturzo G, Germano P, et al.
Correlation between HIV-1 viral load quantification in plasma, dried blood spots,
and dried plasma spots using the Roche COBAS Taqman assay. J Clin Virol.
2010; 47: 4–7 https://doi.org/10.1016/j.jcv.2009.11.006 PMID: 19962936
19. Roche. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 test package insert, rev. 2.0;
Roche Molecular Systems, Inc.,2008. www.roche-diagnostics.ch/. .
 ./roche../04710932990_DE_EA_COBAS-COBASAmpliPrep_COBAS-TaqMan
HIV-1-Test-v2.0.pdf (accessed Mar 18, 2017). 2008;
20. Abbott. Abbott RealTime HIV-1 Test package insert; Abbott Molecular Inc.
https://www.abbottmolecular.com/. . .pcr/realtime-hiv1-qualitative.htmL.
(Accessed Feb 6, 2015) 2007.
21. Arredondo M, Garrido C, Parkin N, Zahonero N, Bertagnolio S, Soriano V, et al.
Comparison of HIV-1 RNA measurements obtained by using plasma and dried
blood spots in the automated abbott real-time viral load assay. J Clin Microbiol.
2012; 50: 569–572 https://doi.org/10.1128/JCM.00418-11 PMID: 22170904
22. Mbida AD, Sosso S, Flori P, Saoudin H, Lawrence P, Monny-Lobe ´ M, et al.
Measure of viral load by using the Abbott Real-Time HIV-1 assay on dried blood
and plasma spot specimens collected in 2 rural dispensaries in Cameroon. J
Acquir Immune Defic Syndr. 2009; 52: 9–16 https://doi.org/10.1097/QAI.
0b013e3181aeccbc PMID: 19620878
23. Lofgren SM, Morrissey AB, Chevallier CC, Malabeja AI, Edmonds S, Amos B,
et al. Evaluation of a dried blood spot HIV-1 RNA program for early infant
diagnosis and viral load monitoring at rural and remote healthcare facilities.
AIDS. 2009; 23: 2459–2466 https://doi.org/10.1097/QAD. 0b013e328331f702
PMID: 19741481
24. Marconi A, Balestrieri M, Comastri G, Pulvirenti FR, Gennari W, Tagliazucchi S,
et al. Evaluation of the Abbott Real-Time HIV-1 quantitative assay with dried
blood spot specimens. Clin Microbiol Infect. 2009; 15: 93–97
25. Waters L, Kambugu A, Tibenderana H, Meya D, John L, Mandalia S, et al.
Evaluation of filter paper transfer of whole-blood and plasma samples for
quantifying HIV RNA in subjects on antiretroviral therapy in Uganda. J Acquir
Immune Defic Syndr. 2007; 46: 590–593 PMID: 18193501
26. Parkin NT. Measurement of HIV-1 viral load for drug resistance surveillance
using dried blood spots: literature review and modeling of contribution of DNA
and RNA. AIDS Rev. Spain; 2014; 16: 160–171
27. Johannessen A. Dried blood spots in HIV monitoring: applications in resource-
limited settings. Bioanalysis. 2010; 2: 1893–1908
https://doi.org/10.4155/bio.10.120 PMID: 21083497
28. Fiscus SA, Brambilla D, Grosso L, Schock J, Cronin M. Quantitation of human
immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma by using blood dried on filter
paper. J Clin Microbiol. 1998; 36: 258–260 PMID: 9431960
29. van Gemen B, v d Wiel P, van Beuningen R, Sillekens P, Jurriaans S, Dries C, et
al. The one-tube quantitative HIV-1 RNA NASBA: precision, accuracy, and
application. PCR Methods Appl. United States; 1995; 4: S177–84.
30. Garrido C, Zahonero N, Corral A, Arredondo M, Soriano V, de Mendoza C.
Correlation between Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) RNA
Measurements Obtained with Dried Blood Spots and Those Obtained with
Plasma by Use of Nuclisens EasyQ HIV-1 and Abbott RealTime HIV Load Tests.
Journal of Clinical Microbiology. 2009. pp. 1031–1036
https://doi.org/10.1128/JCM.02099-08 PMID: 19193847
31. Wu X, Crask M, Ramirez H, Landas T, Do TD, Honisch C, et al. A simple method
to elute cell-free HIV from dried blood spots improves their usefulness for
monitoring therapy. J Clin Virol. Netherlands; 2015; 65: 38–40
32. Titchmarsh L, Zeh C, Verpoort T, Allain JP, Lee H. Leukodepletion as a point-of-
care method for monitoring HIV-1 viral load in whole blood. J Clin Microbiol.
2015; 53: 1080–1086 https://doi.org/10.1128/JCM.02853-14 PMID: 25428162
33. Homsy A, van der Wal PD, Doll W, Schaller R, Korsatko S, Ratzer M, et al.
Development and validation of a low cost blood filtration element separating
plasma from undiluted whole blood. Biomicrofluidics. 2012; 6
34. Inzaule SC, Hamers RL, Zeh CE, Rinke de Wit TF. Stringent HIV Viral Load
Threshold for Virological Failure Using Dried Blood Spots: Is the Perfect the
Enemy of the Good? Journal of acquired immune deficiency syndromes (1999).
United States; 2016. pp. e30–3