Quim. Nova, Vol. 30, No.

2, 382-387, 2007

BIOTRANSFORMAÇÃO DE LIMONENO: UMA REVISÃO DAS PRINCIPAIS ROTAS METABÓLICAS

Revisão

Mário Roberto Maróstica Júnior* e Gláucia Maria Pastore

Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, CP 6121,
13083-970 Campinas – SP, Brasil

Recebido em 11/8/05; aceito em 20/4/06; publicado na web em 24/10/06

BIOTRANSFORMATION OF LIMONENE: A REVIEW OF THE MAIN METABOLIC PATHWAYS. There is considerable progress
in the study of the biotransformation of limonene. Extensive research on the biotransformation of limonene has resulted in the
elucidation of new metabolic pathways. Natural flavors can be produced via biotransformation, satisfying consumer demand for
natural products. This review presents some elements concerning the biotransformation of limonene with emphasis on the metabolic
pathways. Some comments are also made on problems related to biocatalysis as well as on the application of some compounds
originating from the biotransformation of the inexpensive limonene.

Keywords: limonene; biotransformation; pathways.

INTRODUÇÃO se um subproduto industrial adequado para bioconversões a compos-

tos de alto valor comercial6. Além disso, existem diversas aplicações
Nos últimos anos, a produção biotecnológica de compostos de para o limoneno, como solvente para resinas, síntese de outros com-
aroma vem sendo estimulada pela crescente demanda do mercado postos químicos, aplicações em borracha, tintas, agente dispersante
consumidor por produtos rotulados como “naturais” e “saudáveis”1. para óleo, além da utilização na síntese química do mentol7.
As legislações norte-americana e européia referem-se aos com- A era entre 1945 e 1960 marcou o início da indústria de suco
postos de aroma naturais como aqueles preparados tanto por pro- de laranja na Flórida, o que levou a um aumento na porcentagem
cessos físicos (extração de suas fontes naturais) como por proces- de laranjas destinada ao suco concentrado de menos de 1 para 80%.
sos enzimáticos e microbianos que envolvem precursores isolados A conseqüente disponibilidade de grandes quantidades de R-(+)-
na natureza, sendo que o composto gerado deve ser idêntico ao já limoneno de baixo custo (US$ 1–2/kg) interessou a químicos e bió-
existente na natureza para que a substância seja legalmente rotula- logos. Isso se explica, principalmente, pelo fato de alguns compos-
da como ‘natural’2. Isso, aliado ao interesse por aromas naturais tos medicinais e de aroma possuírem fórmulas estruturais seme-
em vez de aromas sintéticos levou a um aumento de investigações lhantes ao limoneno, sugerindo grande potencial para a utilização
focadas em produção biotecnológica dos denominados ‘bioaromas’. industrial desse rejeito industrial8.
A maioria dos compostos de aroma usados no mundo (aproxima- Como exemplo, pode-se citar alguns de seus derivados mais
damente 80%) utiliza processos químicos para sua obtenção. En- notáveis como os compostos oxigenados α-terpineol, álcool perílico,
tretanto, observa-se uma nova tendência em países desenvolvidos, carveol, carvona e mentol. Mentol e carvona são compostos de aro-
como a Alemanha, onde 70% de todos os compostos de aroma utili- ma extensivamente utilizados, sendo que o álcool perílico vem ga-
zados em alimentos são ‘naturais’1. Diferentemente dos processos nhando destaque crescente devido às comprovações relacionadas a
químicos, que requerem temperaturas e pressões extremas, as con- seu poder de prevenção a doenças degenerativas. Portanto, a utili-
versões microbianas ocorrem sob condições brandas e, em alguns zação de R-(+)-limoneno para síntese de compostos de aroma e com-
exemplos, os produtos são formados estereosseletivamente3. postos funcionais pode ser considerada promissora do ponto de vis-
O limoneno, 4-isoprenil-1-metil-ciclo-hexeno, um monoterpeno ta econômico. Assim sendo, a biotransformação catalítica de R-(+)-
monocíclico faz parte da estrutura de mais de 300 vegetais4. Os limoneno em compostos de aroma, como carvona e álcool perílico,
dois enantiômeros do limoneno são os mais abundantes mono- foi considerada desde os anos 60 por duas vantagens principais:
terpenos na natureza. S-(-)-limoneno é principalmente encontrado grandes regioespecificidade e enantioespecificidade enzimáticas,
em uma variedade de plantas e ervas como Mentha spp, enquanto fazendo com que numerosos microrganismos e células de plantas
R-(+)-limoneno é o componente majoritário dos óleos das cascas fossem descritos como transformadores deste monoterpeno8.
de limão e laranja e do óleo essencial de alcarávia, sendo a preven- Entretanto, a grande maioria dos estudos de biotransformação de
ção da desidratação e a inibição de crescimento microbiano suas monoterpenos descritos até o momento são apenas acadêmicos, sendo
funções naturais nos vegetais1. inviáveis do ponto de vista industrial, pois sua aplicação direta em
No caso dos óleos essenciais dos cítricos em geral, o R-(+)- escalas maiores esbarra nos baixos rendimentos devido à volatilidade
limoneno é seu componente mais expressivo, atingindo concentra- do substrato e toxicidade do limoneno aos microrganismos em geral3.
ções de 90 a 96%5,6. Aproximadamente 50 mil t de R-(+)-limoneno
são recuperadas ao ano como subproduto da indústria cítrica mundi- Problemas da biocatálise
al5,6. O limoneno é geralmente separado do óleo essencial obtido no
suco de laranja pela sua baixa solubilidade em água, alta tendência à A toxicidade dos microrganismos ao precursor limoneno e a
autoxidação e polimerização, e formação de “off-flavors”, tornando- multiplicidade dos metabólitos originados da biotransformação do
monoterpeno resultam em baixas concentrações dos produtos finais
*e-mail: [email protected] e intermediários, elevando os custos da recuperação dos compos-
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tos gerados. Adicionalmente, um longo tempo de fermentação é

necessário para que os produtos se acumulem em grandes quanti-
dades, o que contrasta diretamente com a necessidade de um curto
tempo de fermentação, uma vez que o substrato monoterpênico
(limoneno) possui altas instabilidade e volatilidade9.

O baixo rendimento dos processos de biotransformação

Os compostos de aroma estão freqüentemente presentes em baixas Figura 1. Estrutura do limoneno

concentrações nos sistemas fermentativos, resultando em alto custo
para os processos de recuperação (isso pode ser compensado pelo alto
preço dos aromas naturais, de 10 a 100 vezes maiores que os sintéti- Dessa forma, o processo biotecnológico apresenta a vantagem
cos)10. Muitos estudos revelam o efeito inibidor do limoneno em vários de ser regido por reações enzimáticas, as quais se diferenciam da
microrganismos. Além disso, alguns autores relatam que o limoneno síntese química por serem enantio e regioespecíficas. Por essa ra-
diminui a velocidade do processo de fosforilação oxidativa nas célu- zão, a oxidação enzimática do limoneno foi primeiramente estuda-
las3. Log P é utilizado como medida estabelecida da toxicidade de mi- da nos anos 60 por Dhavalikar e Bhattacharyya13. Posteriormente a
crorganismos a solventes orgânicos imiscíveis em água. As toxicidades esse estudo, grande número de metabólitos foi isolado e identifica-
mais fortes foram observadas em valores de log P entre 1 e 5. Compos- do e vários microrganismos e células de plantas foram classificados
tos como o limoneno (com log P = 4,83) aumentam a fluidez das mem- como capazes de transformar o limoneno em compostos de interes-
branas dos fungos filamentosos, o que leva a permeabilidade não espe- se, demonstrando que o monoterpeno em questão é facilmente ata-
cífica, perda de integridade celular, decréscimo de matéria seca e cado pelo sistema enzimático de certos microrganismos. Entretan-
inativação da energia metabólica devido à dissipação da força próton to, pouco sucesso tem sido alcançado na tentativa de converter os
motiva (gradiente eletroquímico de H+ através da membrana)11. A alta dados laboratoriais em processos industriais.
fluidez da membrana pode prevenir a manutenção dos complexos en- Os últimos cinco anos têm visto significativos progressos no
tre enzima e membrana como, por ex., o complexo formado entre campo da biotransformação de limoneno, especialmente no que se
citocromo P450 monoxigenase e citocromo P-450 redutase dependente refere à regioespecificidade da biocatálise por microrganismos. Tra-
de NADPH, que está envolvido nas transformações oxidativas de balhos recentes descrevem a hidroxilação das posições 3 (resultan-
terpenos, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, esteróides e outros do em isopiperitenol), 6 (produzindo carveol e carvona) e 7 (álcool
compostos lipofílicos, promovidas por fungos11. perílico, aldeído perílico e ácido perílico como produtos). Progres-
sos consideráveis têm sido atingidos na caracterização de limoneno-
Problemas relacionados à recuperação dos produtos da hidroxilases de plantas e clonagem dos seus genes codificantes8.
biotransformação Seis rotas principais de conversão do limoneno podem ser
distinguidas (Figura 2): oxidação do substituinte metila a compostos
“Downstream processing” significa isolamento, concentração e perílicos; conversão da dupla ligação do anel ao diol corresponden-
purificação de um produto. O sistema de destilação ou extração em te; oxidação alílica a cis, trans carveóis e carvona; epoxidação da
batelada, padrão nas indústrias de biotecnologia, requer operações ligação dupla na unidade isoprenil a α-terpineol; oxidação alílica a
em grandes volumes. A volatilidade e baixa solubilidade em água isopiperitenol e epoxidação da ligação 8,9 a limoneno-8,9-epóxido.
de muitos compostos de aroma tornam sua recuperação difícil de
ser realizada. Por outro lado, existe um limite superior para a con- Oxidação do substituinte metila a compostos perílicos
centração do produto final no meio de fermentação por causar inibi-
ção e toxicidade aos microrganismos10. Pelo fato de os produtos Primordialmente, três substâncias de interesse industrial são
biotransformados encontrarem-se presentes em pequenas concen- resultantes do ataque da posição 7 do limoneno (1): álcool perílico
trações, esse processo torna-se custoso. Quatro razões sugerem a (2), aldeído perílico (3) e ácido perílico (4). O composto (2) é de
extração de bioaromas in situ utilizando avançadas técnicas de se- particular importância, uma vez que várias investigações têm rela-
paração12: perda de produtos por volatilização; instabilidade bio- tado que essa substância, extraída de lavanda (Lavandula
química do produto na presença das células; fenômeno de inibição angustifolia), possui propriedades preventivas contra câncer de fí-
e, concentração de produto não constante nas bateladas. gado, mama e pulmões3. Segundo ensaios in vivo, (1) e (4) têm
Há, portanto, a necessidade de desenvolvimento de técnicas mais demonstrado inibição da metástase em células de ratos16.
específicas aplicáveis in loco e em condições de esterilidade. Aro- Um vasto número de estudos tem estabelecido que alguns
mas muito voláteis são os que mais necessitam desse tipo de tecnologia. isoprenóides como (1), (2), além de γ-tocoferol, β-ionona e farnesol
apresentam propriedades de inibição da formação de tumores.
ROTAS METABÓLICAS ENVOLVIDAS NA Isoprenóides têm se mostrado capazes de diminuir o crescimento de
BIOTRANSFORMAÇÃO DO LIMONENO vasto número de tumores animais, incluindo células leucêmicas,
melanomas, tumores pancreáticos e hepatomas. Ratos alimentados com
A introdução regioespecífica de grupos carbonilas ou hidroxilas atra- 1% da dieta com (2) apresentaram uma taxa de regressão do tumor de
vés de reações químicas é difícil, devido às propriedades eletrônicas simi- 55%. Nesse estudo, conclui-se que o monoterpeno (2) é um candidato
lares dos grupos metilas presentes nos carbonos 3 e 6 e nos carbonos 7 e excelente para tratamento terapêutico de câncer humano17. Recente-
10 do limoneno11 (Figura 1). Conseqüentemente, a oxidação química clás- mente, foi evidenciado o uso de (2) e seus derivados monoterpênicos
sica gera mistura de produtos. Um exemplo representativo é a oxidação (utilizados isoladamente ou em combinação com agentes imuno-
alílica do limoneno utilizando dióxido de selênio que produz limonen-4- depressivos como ciclosporinaA e azatioprina) para tratamento de pa-
ol, trans-carveol, cis-carveol, álcool perílico e limonen-10-ol. Entretanto, cientes submetidos a transplante de órgãos18. Relata-se que esses com-
há uma exceção: limoneno pode ser convertido exclusivamente a carvona postos são capazes de promover uma redução no nível de rejeição.
através da reação com cloreto de nitrosila. Investigações relatam a biotransformação de (1) com obtenção
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do posterior, o mesmo grupo inseriu um fragmento de 3,6 kb da

mesma linhagem em E. coli, resultando na biotransformação do R-
(+)-(1) a (2) e (12), sendo (12) formada pela ação de uma
desidrogenase não específica da linhagem de E. coli22. A produção de
(4) em alta concentração (3 g/L) foi descrita por Speelmans et al.9.
Linhagens identificadas como Pseudomonas putida possuem a ca-
pacidade de adaptar sua membrana pela conversão de ácidos graxos
cis- para trans- na presença de solventes como tolueno e estireno.
Linhagens resistentes a solventes são excelentes candidatos para re-
alizar a conversão de (1), uma vez que se mostram mais resistentes
ao acúmulo de terpenóides tóxicos. Os autores revelam que glicerol
foi necessário como co-substrato para crescimento e produção de
(4), sendo ótima a combinação de 150 mM de (1) e 50 mM de glicerol.
O uso de amônia ou uréia como fonte de nitrogênio revelou-se como
fator de grande importância à bioconversão. As condições de 30 a
34 oC e pH=7, assim como a utilização de emulsificantes, foram
determinantes para o acúmulo do produto de interesse, o qual não
sofreu etapas de metabolização subseqüentes a outros compostos,
apresentando-se quimicamente estável, sendo, ainda, o (4) o único
composto resultante da conversão9.
Uma outra linhagem de Pseudomonas putida MTCC 1072 oxi-
dou (1) a (2) e p-ment-1-eno-6,8-diol com rendimentos de 36 e 44%,
respectivamente, sendo que não foram observadas degradações sub-
seqüentes. Os autores relatam que a linhagem é resistente a uma
concentração de (1) de 0,2% (v/v), sendo que na concentração de
0,5% (v/v) os rendimentos sofreram uma redução significativa.
Relatam também que o pH tem forte influência na conversão, sen-
do pH=5,0 o valor ótimo, observando-se ainda queda brusca na
atividade a valores de pH=3,0 e 7,03.
Trytek e Fiedurek26 relatam a biotransformação de (1) a (2) e (4)
a partir de uma linhagem de fungo filamentoso psicrotrófico,
Mortierella minutíssima 01, isolada de uma amostra de solos árticos.
Figura 2. Principais rotas envolvidas na biotransformação do limoneno
A linhagem foi selecionada por melhor se desenvolver em placas de
Petri contendo ágar em contato com vapor de (1). A produção de ou-
dos compostos perílicos por linhagens de leveduras 19, fungos tros compostos, como (11) e (12) além de óxido-de-limoneno, indi-
filamentosos (Penicillium digitatum) e, principalmente, por ca que a linhagem é capaz de atacar o monoterpeno em diferentes
bactérias3,9,13,20-22. posições. Os autores relatam que a hidroxilação da posição C-6, ge-
Uma estratégia comum para seleção de linhagens de bactérias rando (11), parece ser favorecida a 30 oC em comparação a 15 oC, a
com potencial biotransformador de (1) é a utilização de técnicas de qual se mostrou mais eficiente para a hidroxilação da posição C-7,
enriquecimento de cultura usando o substrato como única fonte de gerando (2). A linhagem mostrou resistência a concentrações de 0,8%
carbono9,13,20,21,23. (v/v) de (1), sendo que um aumento em sua concentração para 1,2%
O primeiro relato de biotransformação de (1) a compostos gerou inibição. Os autores defendem que biotransformação a baixas
perílicos foi realizado por Dhavalikar e Bhattacharyya. Os autores temperaturas com microrganismos psicrotróficos pode ser vantajosa
descreveram a biotransformação de R-(+)-(1) por meio de uma li- por um lado por evitar a evaporação do substrato, por outro, apresen-
nhagem de Pseudomonas isolada de uma amostra de solo. Relata- ta o empecilho do lento desenvolvimento da linhagem.
ram a formação de outros compostos de interesse industrial, como
carveol (11), carvona (12) e diidrocarvona (13)13. Cadwallader et Conversão da dupla ligação do anel ao diol correspondente
al.20 selecionaram uma linhagem de Pseudomonas gladioli capaz de
biotransformar (1) a (4) e α-terpineol (14). A concentração de (4) Recentemente van der Werf et al.14 confirmaram a rota de de-
atingiu 1861 ppm no quarto dia de contato com o substrato terpênico gradação de (1) ao seu diol correspondente, através de estudos
e posteriormente sofreu um rápido decréscimo, sendo que no sétimo bioquímicos com uma linhagem de Rhodococcus erythropolis sub-
dia não podia mais ser detectado19. Em 1992, Yoshiaki et al. relata- metida a (1) como única fonte de carbono. Observou-se que a li-
ram a biotransformação de R-(+) e S-(-)-(1), respectivamente, a R- nhagem inicia seu ataque com a epoxidação da ligação dupla 1,2
(+)- e S-(-)-(2) por uma linhagem de Aspergillus cellulosae24. do anel (através da limoneno-1,2-monoxigenase), sendo que a
Já uma linhagem de Bacillus stearothermaphilus BR388 isolada hidrólise de limoneno-1,2-epóxido (6) a limoneno-1,2-diol (7) foi
da casca de laranja foi capaz de metabolizar (1) como única fonte de catalisada por uma limoneno-1,2-epóxido-hidrolase muito ativa e
carbono (mostrando resistência ao substrato, suportando concentra- indutível [enzima indutível é aquela expressa apenas em presença
ção máxima de 0,15% do monoterpeno), mas degradou (1) mais efi- do seu substrato, no caso, o monoterpeno em estudo, (1)]. As de-
cazmente na presença de extrato de levedura. (2) foi o composto pro- gradações subseqüentes dão origem a 1-hidróxi-2-oxo-limoneno
duzido em maior quantidade, atingindo concentração máxima de (8), que se rearranja espontaneamente a 3-iso-propenil-6-
200 mg/L21. Um fragmento cromossomal de 9,6 kb da mesma linha- oxoeptanoato (9)15. Ambos os enantiômeros de (1) foram degrada-
gem foi inserido em E. coli, a qual foi capaz de metabolizar (1) nos dos analogamente, mas as configurações estereoquímicas dos in-
mesmos produtos obtidos com a linhagem bacilácea25. Em um estu- termediários de R-(+) e S-(-)-(1) são opostas, sendo que as ativida-
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des das mesmas enzimas foram detectadas na biotransformação de sença de (1). Depois de 2 dias de fermentação, 97% do substrato se
ambos os enantiômeros, o que sugere que as enzimas envolvidas acumulou no micélio e 3% ficaram no meio de cultura. Em
apresentaram enantio e estereoespecificidades14. Este foi o primei- contrapartida, os produtos se acumularam em concentrações três a
ro relato sobre microrganimos que metabolizam (1) por meio de quatro vezes maiores no meio aquoso em relação ao micélio. Após
uma rota iniciada pelo ataque de sua ligação dupla 1,2. Essa subs- 12 dias de cultivo, as concentrações de (11) e (12) atingiram valo-
tância não possui aroma impactante, mas pode ser utilizada para res ao redor de 70 e 30 mg/L, respectivamente quando o substrato
sínteses posteriores. terpênico foi adicionado na forma gasosa. Os autores relataram
Há relatos anteriores de ser (7) o produto de biotransformação que o pré-cultivo realizado em presença de (1) não aumentou a
majoritário em leveduras e fungos filamentosos e um produto capacidade de crescimento do microrganismo, mas a taxa de
minoritário obtido através de biotransformação com linhagens de biotransformação e as concentrações máximas dos produtos foram
bactérias14. Uma linhagem de Cladosporium sp também se mos- mais de duas vezes maiores para (11) e três a quatro vezes maiores
trou capaz de atacar a ligação 1,2 de (1) resultando em cis- e trans- para (12) comparando-se aos testes sem a pré-adaptação. A adap-
diol (7) como produtos principais, gerando concentrações finais de tação do microrganismo pode ser devida a dois fatores: adaptação
0,2 e 1,5 g/L, respectivamente, após 4 dias de fermentação. Abraham geral do metabolismo e/ou indução das enzimas envolvidas pela
et al.27 produziram o mesmo composto utilizando uma linhagem adição do substrato11. Entretanto, até o momento, as enzimas de
de fungo filamentoso, Corynespora cassiicola DSM 62475. Do plantas têm demonstrado a maior regioespecificidade. A enzima
ponto de vista da produtividade, esta foi uma das mais interessan- limoneno-6-hidroxilase isolada do microssomo de uma espécie de
tes aproximações práticas relatadas até então: em um fermentador Menta spp foi capaz de converter o S-(-)-(1) em (11)33-35. Outro
de 70 L, 1,3 kg de (1) foram transformados em 900 g de produto exemplo é a oxidação de R-(+)-(1) às misturas racêmicas de (11) e
em 96 h de fermentação27. Um outro estudo de seleção com mais (12) pelas espécies Solanum aviculare e Dioscorea deltoidea. Ob-
de 60 linhagens também resultou na formação de cis- e trans-diol servou-se que as células de S. aviculare foram capazes de transfor-
(7) a partir de R-(+)- e S-(-)-(1), por uma linhagem de Corynespora mar 34% do (1) adicionado em (12) (mistura racêmica). Apesar da
cassiicola, com rendimentos de 50% aproximadamente28. alta regioespecificidade, observa-se que a atividade das células ve-
getais em geral ainda é insuficiente para uma aplicação de um pro-
Oxidação alílica a cis, trans carveóis e carvona cesso em escala industrial36.
Uma linhagem de bactéria, Rhodococcus opacus PWD4, foi
A oxidação da posição 6 de (1) pode gerar substâncias de rele- capaz de hidroxilar (1) exclusivamente na sua posição 6, gerando
vada importância industrial como (11) e (12). (12) ocorre nas for- (+)-trans-(11) como único produto, com rendimento final de 94 a
mas R-(+) e S-(-) e seus isômeros diferem consideravelmente nas 97%. Os pesquisadores realizaram o cultivo das células em presen-
propriedades sensoriais. Eles ocorrem em altas porcentagens em ça de tolueno como única fonte de carbono e energia. A mesma
grande número de óleos essenciais. R-(+)-(12) é o componente prin- linhagem desenvolvida em glicose como única fonte de carbono
cipal do óleo de alcarávia (presente em concentrações de 60%, não foi capaz de biotransformar (1), sugerindo que uma das enzimas
aproximadamente), enquanto que S-(-)-(12) ocorre em óleo de hor- envolvidas na degradação do tolueno pode ser responsável pela
telã, em uma concentração de 70 a 80%29. Ambos os isômeros são biotransformação de (1). Os autores sugerem que uma possível
utilizados como compostos de aroma em alimentos e bebidas. S-(- candidata seja a tolueno-2,3-dioxigenase37.
)-(12) é produzida em maiores quantidades, sendo utilizada em
produtos de higiene bucal30. Epoxidação da ligação dupla na unidade isoprenil a α -
Monoterpenóides quirais são importantes para o balanceamento terpineol
do bouquet de muitos óleos essenciais e aroma de frutas. Por ex.,
uma mistura de (-)-linalol, (-)-citronelol, (-)-cis-óxido de rosa, (-)- O α-terpineol (14) é um importante produto comercial. Peque-
mentol e R-(+)-(12) é a base molecular para o aroma de óleo de nas quantidades do terpenóide são encontradas em muitos óleos
Rosa Bulgária, um composto com potencial utilização pela indús- essenciais (por ex., em coníferas e óleos de lavanda); enquanto que
tria de aromas e fragrâncias30. β-, γ- e δ-terpineol não ocorrem largamente na natureza.
Além disso, (11) e (12) parecem atuar no organismo humano S-(-)-(14) ocorre na espécie Pinus palustris Mill., apresentando-se
como antioxidantes e, segundo recentes investigações, encontram- em concentração menor que 60% em seu óleo essencial. (S)-(-)-
se em vários compostos que podem atuar como coadjuvantes para (14) possui um odor caracteristicamente conífero, enquanto (R)-
tratamento e prevenção do processo de envelhecimento31. O ataque (+)-(14) tem aroma floral intenso, com “treshold” de 350 ppb. Ape-
da posição C-6 de (1) foi relatado primeiramente em 1966 pelo sar do (14) ocorrer em muitos óleos essenciais, como de “grape
pioneiro grupo indiano, que obteve (11), (12) e (13)13. Foi estudada fruit”, bergamota e lima, apenas pequenas quantidades são isola-
a transformação de (1) por linhagens de Penicillium digitatum e das, por ex., por destilação fracionada de óleos de pinho. Esse com-
Penicillium italicum isolados de frutas cítricas. A biotransformação posto possui aplicações importantes, sendo utilizado, por ex., em
conduzida com a linhagem de P. italicum apresentou rendimento sabonetes e alguns cosméticos29.
de 80% na conversão de (1), quando sua concentração inicial foi Reconhecidamente, (14) é um interessante produto final da
0,5% (v/v). Concentrações maiores que essa foram inibitórias. A bioconversão de (1). Esse processo tem sido descrito utilizando-se
biotransformação de (1) por P. italicum resultou em cis- e trans- uma grande variedade de microrganismos como catalisadores. O pri-
(11), (12), cis e trans-p-menta-2,8-dien-1-ol, p-menta-1,8-dien-1- meiro relato da obtenção de R-(+)-(14) por meio da biotransformação
ol e p-menta-8-eno-1,2-diol32. Um estudo mais recente mostrou o de R-(+)-(1) foi feito por Kraidman et al. em 1969. A transformação
potencial de um basidiomiceto, Pleurotus sapidus, ao transformar foi catalisada por uma linhagem de Cladosporium sp38. Desde 1985,
regioespecificamente R-(+)-(1) em cis,trans-(11) e R-(+), S-(-)-(12) vários autores têm relatado o relevante potencial de linhagens de
como produtos principais. O substrato foi adicionado com 2,5 dias Penicillium sp ao converter R-(+)-(1) em R-(+)-(14)28,39-43. Tan et al.
de crescimento até o quarto dia, sendo a biotransformação estendi- relataram que a linhagem utilizada demonstrou enantiosseletividade
da até 12 dias pela adição do substrato em fase gasosa. Os rendi- e enantioespecificidade ao converter a mistura racêmica de (1) a R-
mentos foram aumentados com a realização do pré-cultivo em pre- (+)-(14). A atividade aumentou mais de 12 vezes após indução atra-
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vés da adição seqüencial do substrato, o que proporcionou um rendi- de reprodutibilidade a mutações morfológicas evidenciadas por meio
mento de 3,2 g/L de (14) após 96 h de reação em escala laboratorial42. de variações da aparência, ao microscópio, e cor da cultura, que
Levando-se em conta a indução enzimática, e outras características variava de preto a amarelo-esverdeado45.
como inibição pelo agente quelante de ferro fenantrolina, pode-se De forma geral, os microrganismos oxidam (1) não especifica-
concluir que o sistema enzimático citocromo P450-dependente en- mente, produzindo uma ampla variedade de metabólitos, levando a
volvido na bioconversão se assemelha ao das bactérias, como por um grande número de compostos indesejados, embora haja algu-
ex., da linhagem Pseudomonas sp., da qual diferentes monoxigenases mas exceções. Entretanto, a conversão é sempre catalisada por
citocromo P450-dependentes foram purificadas e caracterizadas6,44. enzimas catabólicas, que permitem que (1) seja utilizado como fon-
Tan e Day utilizaram o micélio imobilizado (da mesma linhagem) em te de energia. Em plantas, enzimas de algumas espécies mostraram
biorreator. Relataram que o leito se manteve ativo por pelo menos regioespecificidade ao atacar o S-(-)-(1) em sua posição C-3.
14 dias. A produção de R-(+)-(14) atingida foi de aproximadamente Em uma espécie de Mentha ssp (M.x piperita) a hidroxilação
13 mg/(g de leito)/dia, correspondendo a uma conversão molar do alílica na posição C-3 de S-(-)-(1) levou à formação de (-)-(15) e,
substrato maior que 45%, quando o nível de oxigênio dissolvido foi posteriormente, a (-)-mentol35. O mesmo grupo demonstrou que a
de 50 μmol/L. A avaliação econômica mostrou que a produtividade regioespecificidade das C-3 e C-6 limoneno-hidroxilases envolvi-
precisa ser aumentada para que o processo possa ser aplicável do das na transformação de S-(-)-(1) em mentol e (12), respectiva-
ponto de vista industrial41. Os mesmos autores ainda avaliaram o mente, é determinada pela substituição de um aminoácido, F363I,
efeito de 22 co-solventes orgânicos em células livres e imobiliza- a qual converte C-6 em C-3 hidroxilase. Esses estudos sugerem
das. Com as imobilizadas, um aumento de 2 vezes na produção de uma possibilidade futura de modificar geneticamente e clonar o
(14) foi observado em sistema de micela reversa (0,1%(v/v)) de citocromo P450 de plantas para alterar a especificidade das
Tween 80 ou Triton 100-X). O alginato de cálcio é hidrofílico, en- hidroxilases quanto ao substrato e/ou produtos8.
quanto que o substrato é hidrofóbico, promovendo, Além disso, relata-se que os genes de Mentha spp responsáveis
indubitavelmente, uma redução do contato com o substrato para as pela produção de limoneno-hidroxilases foram expressos com su-
células imobilizadas. Já para células livres, o aumento na atividade cesso em Saccharomyces cerevisiae e Escherichia coli33.
foi de 2,2 e 2,4 vezes com 1,5% (v/v) de decanoato de etila e
dioctilftalato, respectivamente42. Outros materiais utilizados para Epoxidação da ligação 8,9 a limoneno-8,9-epóxido
a imobilização de células, além do alginato de cálcio, são materi-
ais celulósicos (como DEAE-celulose) e porosos (como alginatos, O primeiro relato da obtenção de limoneno-8,9-epóxido (17)
ágar, quitosana e ácido poli-galacturônico)43. através da epoxidação de (1) nas posições 8 e 9 foi feito por van der
O potencial da microextração em fase sólida (MEFS) foi reco- Werf et al.46, que utilizaram uma linhagem de Xanthobacter sp.
nhecido para seleção de linhagens biotransformadoras de (1) por C20 isolada de uma amostra de sedimentos cujo crescimento ocor-
um grupo belga. Demyttenaere et al.28 investigaram mais de 60 reu em cicloexano como única fonte de carbono. Aparentemente,
linhagens de fungos filamentosos, realizando uma otimização dos uma monoxigenase indutível do citocromo P450 catalisa a
parâmetros de MEFS relevantes: tipo de fibra a ser utilizado, tem- hidroxilação do cicloexano (possivelmente uma enzima citocromo
po de extração e temperatura. Os autores concluíram que as me- P450 dependente) e não hidroxila o anel cicloexênico do R-(+)-(1),
lhores condições de análise foram adsorção em fibra de mas catalisa sua epoxidação, dando origem a (4R,8R)-(17) como
polidimetilsiloxano revestida com divinil-benzeno/carboxeno (50/ único produto da reação, sendo relatada uma taxa de conversão de
30 μm), à temperatura de 25 ºC por 30 min. Deste trabalho desta- aproximadamente 100%. S-(-)-(1) também foi convertido a uma
ca-se a nova e prática metodologia para seleção das linhagens, uti- mistura na proporção de 78:22 de (4S,8R)- e (4S,8S)-(17), com
lizando culturas de superfície desenvolvidas nos próprios frascos 100% de taxa de conversão. Relata-se a forte inibição pela forma-
específicos para MEFS. As linhagens selecionadas foram ção de produtos, a qual não pôde ser minimizada por meio da uti-
investigadas posteriormente quanto a biotransformação em cultura lização de co-solventes orgânicos46. (17) tem sido encontrado na
submersa. Uma linhagem de P. digitatum isolada de uma amostra fração volátil de muitos alimentos, incluindo poncã e gengibre47.
de poncã mostrou alta enantiosseletividade ao converter 93% de R-
(+)-(1) em R-(+)-(14) em presença de etanol como co-solvente. O CONCLUSÃO
mesmo microrganismo foi capaz de transformar o S-(-)-(1), entre-
tanto, apenas quantidades traço foram alcançadas44. Apresentaram nesta revisão alguns dos principais avanços ob-
servados nos últimos anos com relação à biotransformação de (1)
Oxidação alílica a isopiperitenol e isopiperitona em compostos de interesse industrial, assim como a elucidação de
algumas rotas metabólicas por meio de enzimas régio e estéreo
Os respectivos isômeros de isopiperitona (16) foram obtidos por específicas. A biotransformação com células inteiras apresenta re-
meio da hidroxilação alílica e desidrogenação da posição C-3 de R- ais vantagens econômicas se comparada aos processos com enzimas
(+)- e S-(-)-(1) com uma linhagem de Aspergillus celulosae com purificadas e, em alguns casos, as enzimas são mais estáveis den-
rendimentos de 19 e 3%, respectivamente, sendo que a (+)-piperitona tro das células, estendendo a “vida” da biocatálise, além da adição
foi apresentada como principal produto da biotransformação, que de co-fatores não ser requerida, uma vez que já estão contidos nas
gerou também outros produtos após 7 dias de incubação a 30 °C24. mesmas. Os processos de transformação microbiana de terpenóides
Em um trabalho posterior, uma linhagem de levedura identificada têm explorado a obtenção de produtos de interesse comercial3.
como Hormonema sp. foi capaz de transformar o R-(+)-(1) em trans- É evidente o progresso que a biotransformação de (1) sofreu na
isopiperitenol (15) em concentração de 0,5 g/L após 12 h de incuba- última década. Ratifica-se que a busca por novas biocatálises
ção. Este foi o primeiro relato da obtenção biotecnológica de trans- regioespecíficas teve sucesso por estabelecer rotas metabólicas di-
(15), o qual pode ser facilmente convertido a (-)-mentol por meio de ferentes das já conhecidas, o que acarretou na produção de novos
uma hidrogenação. Infelizmente, os autores relataram pouca compostos de aroma com aplicação industrial relevante, os quais
reprodutibilidade dos resultados, o que compromete a implantação podem ser considerados ‘naturais’, atendendo à exigência do mer-
de um processo industrial com o microrganismo. Atribui-se a falta cado consumidor.
Vol. 30, No. 2 Biotransformação de limoneno: uma revisão das principais rotas metabólicas 387

Compostos de aroma produzidos por biotransformação tende- 10. Janssens, L.; De Pooter, H. L.; Schamp, N. M.; Vandamme, E. J.; Process
rão a substituir os compostos de aroma obtidos sinteticamente em Biochem. 1992, 27, 195.
11. Onken, J.; Berger, R. G.; J. Biotechnol. 1999, 69, 163.
um futuro próximo. Em países europeus, essa transformação já 12. Berger, R. G.; Aroma biotechnology, Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag,
está em curso. Isso se deve principalmente às vantagens que o pro- 1995.
cesso de biotransformação oferece frente à síntese química, além 13. Dhavalikar, R. S.; Bhattacharyya, P. K.; Indian J. Biochem. 1966, 3,144.
da potencialidade das transformações microbianas em produzir 14. van der Werf, M. J.; Swarts, H. J.; de Bont, J. A. M.; Appl. Environ.
Microbiol. 1999, 65, 2092.
compostos de aroma novos e com aplicações diversas na indústria,
15. http://umbbd.ahc.umn.edu, acessada em Fevereiro 2006
como demonstrado ao longo desta revisão. 16. Raphael, T. J.; Kuttan, G.; J. Experimet. Clin. Cancer Research 2002, 22,
Entretanto, algumas dificuldades precisam ser vencidas. 419.
Metodologias em biologia molecular são necessárias para otimizar 17. Gould, M. N.; Crowell, P. L.; Elson, C. E.; Ren, Z.; US pat. WO9524895,
as propriedades da biocatálise, como conferir maior estereos- 1995.
18. Imagawa, D. K.; Ming-Sing, S.; US pat. 6,133,324, 2000.
seletividade ou termoestabilidade, até mesmo uma diferente capa- 19. van Rensburg, E.; Moleleki, N.; van der Walt, J. P.; Botes P. J.; van Dyk,
cidade de atacar substratos diferentes. M. S.; Biotechnol. Lett. 1997, 19, 779.
Apesar de alguns relevantes avanços, a aplicação direta da 20. Cadwallader, K. R.; Braddock, R. J.; Parish, M. E.; Higgins, D. P.; J. Food
biotransformação em escala industrial ainda esbarra em alguns Sci. 1989, 54, 1241.
21. Chang, H. C.; Oriel, P.; J. Food Sci. 1994, 59, 660.
empecilhos, como a expressão de enzimas régiosseletivas e
22. Cheong, T. K.; Oriel, P. J.; Appl. Biochem. Biotechnol. 2000, 84, 903.
estereosseletivas em altos níveis em linhagens hospedeiras seguras 23. Dhavalikar, R. S.; Rangachari, P. N.; Bhattacharyya, P. K.; Indian J.
(“food-grade”) e o desenvolvimento de técnicas de extração com- Biochem. 1966. 3,158.
patíveis com o apelo dos compostos de aroma originados do proces- 24. Noma, Y.; Yamasaki, S.; Asakawa, Y.; Phytochemistry 1992, 31, 2725.
so de biotransformação, considerados naturais. 25. Chang, H. C.; Cage, D. A.; Oriel. P.; J. Food Sci. 1995, 59, 660.
26. Trytek, M.; Fiedurek, J.; Biotechnol. Lett. 2005, 27,149.
Um dos desafios para o futuro é a expressão de oxigenases do 27. Abraham, W. R.; Stumpf, B.; Kieslich, K.; Appl. Microbiol. Biotechnol.
citocromo P450 de plantas responsáveis pela síntese de diferentes 1986, 24, 24.
enantiômeros e estereoisômeros de (2), (11) e (15) em linhagens 28. Demyttenaere, J. C. R.; van Belleghem, K.; De Kimpe, N.; Phytochemistry
hospedeiras, que permitam o aumento da escala, utilizando-se de 2001, 57, 199.
29. Bauer, K.; Garbe, D.; Surburg, H.; Common Fragrance and Flavor
produção em biorreatores.
Materials: Preparation, Properties and Uses, 2 nd ed., VCH
Espera-se que a disponibilidade de oxigenases específicas, o Verlagsgesellschft mbH: Weinheim, 1990.
rápido desenvolvimento de suas aplicações e o alto valor agregado 30. Ohloff, G.; Scent and Fragrances. The Fascination of Odors and their
dos produtos biotransformados a partir de (1) possibilitem Chemical Perspectives, Springer-Verlag: Berlin and Heidelberg, 1994
bioprocessos industriais de alta escala nos próximos anos, para que 31. Kawasaki, K.; Kokai T. K.; Jpn. JP2004018431, 2004 (CA 140:133439).
32. Bowen, E. R.; Florida State Horticultural Society, Florida, 1975, p. 304.
seja possível atender à crescente exigência do mercado consumidor 33. Haudenschild, C.; Schalk, M.; Croteau, R.; Arch. Biochem. Biophys. 2000,
por produtos ‘naturais’ e de qualidade. 379,127.
34. Carter, O. A.; Peters, R.J.; Croteau, R.; Phytochemistry 2003, 64, 425.
AGRADECIMENTOS 35. Lupien, S.; Karp, F.; Wildung, M.; Croteau, R.; Arch. Biochem. Biophys.
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36. Vanek, T.; Valterov, I. ; Vaisar, T.; Phytochemistry 1999, 50, 1347.
Ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico 37. Duetz, W. A.; Fjallman, A. H. M.; Beilen, J. B.; Witholt, B.; Appl. Environ.
e Tecnológico) pelo apoio financeiro (Número do Processo 141601/ Microbiol. 2001, 67, 2829.
2004-3). 38. Kraidman, G.; Mukherjee, B. B.; Hill, I. D.; Bacteriol. Proc. 1969, 69, 63.
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