Agrobacterium:

Um sistema natural de transferência de genes para plantas

Ana Cristina Miranda Brasileiro, Ph.D., Cristiano Lacorte, M.Sc.,
PESQUISA Biologia Molecular e Celular Vegetal Genética - Laboratório de Transferência de Genes
[email protected] Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Parque Estação Biológica,
Brasília - DF
Da galha-da-coroa para as plantas transgênicas
Fotos cedidas pelos autores

ntre as doenças bacterianas etiológico da galha-da-coroa, A. rhizo-

de plantas, a galha-da-co- almente um sistema modelo para estu- genes causa a raiz em cabeleira (do
roa (do inglês crown-gall) dos das interações patógeno-hospe- inglês hairy root), A. rubi induz galhas
tem-se destacado nos últi- deiro em plantas. especificamente em Rubus spp., A. vitis
mos anos, não pela impor- O agente etiológico causal da ga- induz galhas especificamente em videi-
tância econômica dos pre- lha-da-coroa é Agrobacterium tume- ras e A. radiobacter é saprófita (não-
juízos causados por ela, mas patogênica). As agrobactérias perten-
pelo impacto que o estudo dessa doen- cem à família Rhizobiaceae, que agru-
ça trouxe para a ciência moderna. Ape- pa, entre outros, os gêneros Rhizo-
sar de ser conhecida desde a Antigüida- bium, Bradyrhizobium e Phyllobacte-
de, somente em 1907, após a primeira rium, que são bactérias fixadoras de
descrição do seu agente etiológico, nitrogênio.
essa doença despertou o interesse de
cientistas que trabalham nos mais dife- Biologia do processo infeccioso
rentes campos da pesquisa. O interesse
particular nessa doença deveu-se ao No início do processo de infecção
fato de que as galhas vegetais são de uma planta por Agrobacterium, ocor-
normalmente causadas por microrga- re o reconhecimento e a ligação da
nismos ou por insetos, sendo que a Figura 1: Mapa funcional de um bactéria à célula vegetal. As bactérias
proliferação do tecido vegetal é induzi- plasmídio Ti do tipo nopalina: T- são atraídas em direção ao tecido vege-
da por um estímulo externo, de nature- DNA - corresponde ao segmento tal por quimiotactismo em relação às
za química ou mecânica. No caso da de DNA que é transferido para a moléculas-sinal (compostos fenólicos,
galha-da-coroa, as células vegetais in- célula vegetal; região vir – genes açúcares e aminoácidos), que são exsu-
fectadas pela bactéria adquirem a pro- responsáveis pelo corte e transfe- dadas por células lesadas em decorrên-
priedade de se multiplicarem de ma- rência do T-DNA; região de cia de ferimentos superficiais causados
neira autônoma, sem a necessidade de transferência conjugativa - genes por insetos, geadas ou tratos culturais.
estímulos externos. Essa doença se responsáveis pela transferência Uma vez em contato com as células
traduz assim, pela formação de uma do plasmídio Ti entre linhagens vegetais, as bactérias sintetizam micro-
galha na coroa (junção entre o tronco de Agrobacterium; região de fibrilas de celulose para favorecer a
e a raiz) ou diretamente nas raízes da replicação - funções ligadas a formação de agregados de células bac-
planta infectada. Inicialmente, os pes- replicação, manutenção e estabi- terianas em volta do tecido vegetal
quisadores associaram o desenvolvi- lidade do plasmídio Ti dentro da ferido. A capacidade de infectar células
mento dessas galhas ao câncer animal, bactéria; região noc - genes vegetais está associada à presença, nas
o que estimulou numerosas pesquisas responsáveis pelo catabolismo agrobactérias, de um plasmídio de alto
visando à elucidação das causas da das opinas peso molecular (150 a 250 kb), conhe-
galha-da-coroa. Esses estudos concluí- cido como plasmídio Ti (do inglês tu-
ram que o surgimento da galha é, na mor-inducing) (Figura 1).
realidade, o resultado de um processo faciens, uma bactéria tipicamente do As moléculas-sinal liberadas pela
natural de transferência de genes da solo, do tipo bacilo aeróbico e Gram- planta irão também ativar genes que
bactéria para a célula vegetal, que negativa. Além de A. tumefaciens, o estão localizados em uma região do
passam a sintetizar substâncias que gênero Agrobacterium possui outras 4 plasmídio Ti, chamada de região de
estimulam a divisão celular no sítio de espécies que diferem entre si pela virulência (região vir), que é um regu-
infecção. Os conhecimentos gerados patogenicidade e modo de infecção lon composto de seis a oito operons,
desde então culminaram com um en- em diferentes plantas, principalmente contendo, aproximadamente, 25 genes
tendimento bastante aprofundado des- em Angiospermas dicotiledôneas. Des- no total. As diversas proteínas codifica-
se parasitismo, sendo considerado atu- sa forma, A. tumefaciens é o agente das pelos genes da região vir vão pro-
12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
mover a transferência de uma outra gração do T-DNA na célula vegetal e a
região do plasmídio Ti da bactéria para capacidade dessas células transforma-
o núcleo da célula vegetal. Essa região, das se diferenciarem em uma planta. A
denominada T-DNA (do inglês trans- capacidade de diferenciação, chamada
ferred DNA), é delimitada por duas totipotência, permite a regeneração de
seqüências repetidas de 25 pb, conhe- plantas por meio de técnicas de cultura
cidas como extremidades direita e es- de tecidos in vitro.
querda (Figura 1). Uma vez no núcleo O avanço nos conhecimentos de
da célula, o T-DNA é integrado ao biologia molecular foi fundamental, tan-
genoma vegetal e aí expresso de forma to para elucidar de forma aprofundada
estável. Apesar de sua origem procario- as bases moleculares do processo de
ta, a expressão dos genes presentes no interação Agrobacterium-hospedeiro,
T-DNA só é possível por serem os sinais como para a construção de vetores de
de regulação desses genes reconheci- transformação baseados no plasmídio
dos pelo sistema de transcrição eucari- Ti. Assim, as técnicas de biologia mole-
ota vegetal. cular em associação com as técnicas de
O T-DNA de A. tumefaciens contém cultura de tecidos vegetais in vitro
uma série de genes conhecidos como constituem a base para a obtenção de
oncogenes que codificam enzimas en- uma planta transgênica.
volvidas na via de biossíntese de hor- Figura 2: Sintomas típicos de A construção de vetores derivados
mônios vegetais (citocininas e auxinas), galha-da-coroa (A) e de raiz em do plasmídio Ti para introduzir genes
causando um desbalanço hormonal nas cabeleira (B) em plantas de exógenos em plantas só foi possível
células transformadas. Em A. tumefaci- Kalanchoe sp., induzidas pela graças a uma particularidade do meca-
ens, essa proliferação desordenada das inoculação de linhagens patogê- nismo de transferência do T-DNA: ne-
células transformadas leva à formação nicas de Agrobacterium tumefa- nhum gene presente no T-DNA, exceto
da galha, enquanto que em A. rhizoge- ciens e A. rhizogenes, respectiva- os 25 pb de suas extremidades, é neces-
nes, a expressão dos oncogenes induz a mente, sob condições controla- sário ao processo de transferência e
produção de raízes no local do ferimen- das em casa de vegetação integração do T-DNA. Assim sendo,
to (Figura 2). pode-se eliminar partes ou todo o T-
O T-DNA também possui genes que DNA, incluindo os oncogenes, sem que
codificam enzimas responsáveis pela isso afete o processo de transferência.
síntese de opinas, que são aminoácidos muito importante na disseminação do A síntese de auxina e citocinina dentro
ou carboidratos modificados. O tipo de plasmídio Ti na natureza. A teoria que das células vegetais transformadas com
opina produzido (nopalina, octopina, propõe a atuação das opinas como o T-DNA interfere no balanço endóge-
agropina, manopina etc.) é utilizado intermediárias químicas do parasitis- no de reguladores de crescimento, tor-
como um dos critérios para a classifica- mo, é conhecida como o “conceito de nando-se incompatível com o cultivo
ção de linhagens e espécies de Agro- opinas” (Dessaux et al., 1993). de plantas in vitro. Assim, a remoção
bacterium. O sistema de infecção de plantas dos oncogenes do T-DNA é necessária
Como resultado do processo infec- pelas agrobactérias representa, assim, para a diferenciação e regeneração de
cioso, a linhagem de Agrobacterium uma situação única na natureza: a plantas a partir das células transforma-
indutora da galha faz com que a célula transferência de um elemento genéti- das. Uma linhagem de Agrobacterium
vegetal parasitada produza um tipo es- co, o T-DNA, de um organismo proca- cujos oncogenes foram eliminados do
pecífico de opina. Somente a linhagem riota para um organismo eucariota T-DNA é denominada “desarmada”, pois
indutora é capaz de catabolizar essa superior, com sua subseqüente inte- ela não é mais capaz de induzir galhas
opina como fonte de energia, carbono gração e expressão no genoma hospe- ou raízes em plantas.
e nitrogênio. Desta forma, as células deiro. A demonstração de que a causa A região vir também é essencial
transformadas pelo T-DNA continuam da proliferação celular da galha é a para a transferência do T-DNA, pois
dividindo-se incontroladamente devido transferência de informação genética contém genes cujos produtos vão pro-
à produção de citocininas e auxinas e, da bactéria para a célula vegetal (Chil- mover a excisão e o transporte do T-
quanto mais elas se dividem, mais elas ton et al., 1977) foi o ponto de partida DNA para a célula vegetal. Concluiu-se,
produzem opinas que vão sendo utili- para pesquisas intensivas visando a então, que o desenvolvimento de veto-
zadas pela bactéria, formando um nicho utilização desse sistema natural de res baseados no sistema Agrobacte-
extremamente favorável a ela. transferência de genes para a obten- rium requer que as extremidades direi-
Essa pressão seletiva favorece a ção de plantas transgências (Zambryski, ta e esquerda do T-DNA sejam conser-
multiplicação da linhagem indutora da 1992). vadas, mantendo também intacta a re-
galha que, por sua vez, irá reinfectar as gião vir, e que os oncogenes sejam
células vegetais que ainda não foram Agrobacterium como vetor de removidos. Dessa maneira, qualquer
transformadas. A síntese de opinas pe- transformação de plantas outra nova seqüência de DNA, inserida
las células vegetais infectadas e seu entre as extremidades do T-DNA, pode
catabolismo pela bactéria indutora da A obtenção de uma planta transgê- ser transferida e integrada ao genoma
galha tiveram provavelmente um papel nica envolve e a transferência e inte- vegetal sem afetar a regeneração da
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 13
célula transformada em uma planta. formação deve combinar, ao mesmo bacterium como vetor já foram descri-
A preparação de uma linhagem de tempo, a descontaminação do tecido tos, sendo que a maioria deles é, essen-
Agrobacterium para ser utilizada como infectado pela bactéria, a seleção das cialmente, uma adaptação do método
vetor na transformação de plantas in- células que foram transformadas e que de co-cultura de discos foliares de fumo
clui três etapas distintas. Em uma pri- expressam o gene marcador de sele- (N. tabacum), descrito em 1985 por
meira etapa, é necessário obter as li- ção, e a regeneração destas células em Horsch e colaboradores (Horsch et al.,
nhagens desarmadas por meio de um plantas. 1985). O protocolo básico de co-cultura
processo de dupla recombinação. Numa Ao se estabelecer um protocolo de consiste no cultivo de um explante
segunda etapa, é preciso construir um transformação, diferentes fatores de- vegetal em um meio de cultura líquido
vetor contendo no seu T-DNA os genes vem ser levados em consideração. As ou sólido, juntamente com uma linha-
de interesse. Por causa do seu tama- etapas de reconhecimento da planta gem desarmada de Agrobacterium con-
nho, o plasmídio Ti não pode ser mani- hospedeira, de ligação célula bacteria- tendo um vetor binário com o gene a
pulado diretamente. Desta forma, plas- na-célula vegetal e de indução da re- ser introduzido na planta (Figura 4). O
mídios menores, mais fáceis de tempo de co-cultura pode variar
manipular, foram desenvolvidos. de algumas horas a vários dias. O
Estes plasmídios, chamados de explante a ser utilizado poderá ter
vetores binários, contêm as ex- diversas origens (discos ou frag-
tremidades do T-DNA, entre as mentos foliares, segmentos de cau-
quais os genes de interesse são les ou de raízes, tubérculos, pecí-
clonados. Em uma última etapa, olos, cotilédones, protoplastos, em-
o vetor binário deverá ser trans- briões somáticos etc.), mas o im-
ferido para a linhagem desarma- portante é que tenha um alto po-
da de Agrobacterium, o que pode Figura 3: Sistema binário: o tencial de regeneração in vitro.
ser feito por métodos de conjugação vetor binário, contendo o gene Deve-se sempre procurar otimizar as
triparental, eletroporação ou choque de interesse entre as extremida- condições de cultura de tecido, visando
térmico (Figura 3). des do T-DNA, se mantém em as altas taxas de regeneração de plan-
uma linhagem desarmada de tas.
Sistema de transformação Agrobacterium de forma inde- Durante a co-cultura, ocorrerá a
via Agrobacterium pendente do plasmídio Ti ligação entre a bactéria e a célula vege-
desarmado, cujos oncogenes tal, no local de ferimento do explante,
A partir do desenvolvimento de foram eliminados e a região vir e a indução dos genes da região vir,
vetores binários e sua introdução em mantida com subseqüente transferência do T-
linhagens desarmadas de Agrobacte- DNA para o genoma vegetal. Posterior-
rium, foi possível a transferência de mente, o explante deverá ser transferi-
genes exógenos para plantas, utilizan- gião vir pelas moléculas-sinal são inte- do para um meio de regeneração apro-
do esta bactéria como vetor natural de rações complexas e específicas entre o priado, contendo antibióticos (geral-
transformação. Os primeiros estudos hospedeiro e o patógeno. Na planta, a mente cefotaxima, ampicilina ou carbe-
de transformação genética de plantas transferência do T-DNA é influenciada nicilina) para eliminar as células de
envolveram a inoculação de tecidos de tanto pela fisiologia (idade, tipo de Agrobacterium que são, a partir desse
fumo (Nicotiana tabacum) com linha- tecido, condições de cultura etc.) quanto momento, indesejáveis no meio de cul-
gens engenheiradas de Agrobacterium pelo genótipo. A determinação da com- tura. Esse meio deverá conter também
(Herrera-Estrella et al., 1983; Zambryski patibilidade Agrobacterium-hospedei- um agente de seleção que será respon-
et al., 1983). A partir de então, o sistema ro faz-se também necessária antes do sável pela inibição do crescimento das
de transformação via Agrobacterium estabelecimento de um protocolo de células não-transformadas. O efeito no-
vem sendo utilizado para transformar transformação via Agrobacterium para civo do agente de seleção será anulado
um grande número de plantas. A alta qualquer espécie vegetal. Para a indu- pelo produto da expressão do gene
eficiência de transformação, o baixo ção dos genes vir é também importante marcador de seleção (geralmente uma
custo operacional, assim como a sim- levar em consideração três condições enzima) nas células transformadas. As-
plicidade dos protocolos de transfor- básicas: pH entre 5 e 6, temperatura sim, somente estas células serão capa-
mação e de seleção são as principais entre 27 e 300C e fonte de carbono (em zes de regenerar em meio seletivo. Os
razões para a universalidade do uso do geral, sacarose) (Godwin et al., 1992). processos de seleção e regeneração
sistema Agrobacterium. Outro requerimento importante é a das células transformadas são de gran-
O princípio da transformação com presença de compostos que são natu- de importância para que se obtenha um
uma linhagem desarmada de Agrobac- ralmente produzidos pela planta em protocolo eficiente. A dose do agente
terium está baseado na seleção de uma resposta à infecção pela bactéria, prin- de seleção (geralmente antibiótico ou
ou mais células transformadas e na sua cipalmente compostos fenólicos, tais herbicida), assim como o tempo de
posterior regeneração em uma planta como acetossiringona e hidroxiacetos- exposição dos explantes aos mesmos,
transgênica, isto é, as células compe- siringona, entre outros (Stachel et al., são essenciais para inibir a divisão das
tentes a transformar deverão ser as 1985). células não-transformadas, sem, no en-
mesmas células competentes a regene- Vários métodos de transformação tanto, prejudicar o desenvolvimento
rar. Assim, a metodologia ideal de trans- genética de plantas utilizando Agro- das transformadas.
14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
 gração e expressão de transgenes, con-
sulte o “Manual de Transformação Ge-
nética de Plantas” (Brasileiro e Carneiro,
1998). Nele estão descritas as diferentes
técnicas utilizadas na transformação de
plantas, assim como metodologias para
a detecção de genes repórteres e marca-
dores de seleção, e a análise molecular
e bioquímica da integração e expressão
de genes em plantas. Para adquirir o
Manual, acessar via Internet a home page
da Embrapa no endereço: http://
www.spi.embrapa.br

Referências Bibliográficas
Figura 4: Esquema das principais etapas para obtenção de plantas
transgênicas por meio da técnica de co-cultura Brasileiro ACM, Carneiro VTC (eds)
(1998) Manual de Transformação Gené-
Durante as semanas seguintes, as cé- transformação por biobalística (ou tica de Plantas. Brasília, Embrapa-SPI/
lulas transformadas (resistentes ao agente aceleração de partículas) tem-se des- Embrapa-Cenargen, 309 p.
de seleção) crescem e diferenciam-se em tacado pela sua alta eficiência. Chilton MD, Drummond MH, Merlo
brotos que são então isolados e transferi- Atualmente diferentes característi- DJ, Sciaky D, Montoya AL, Gordon MP,
dos para um meio de indução de raiz. cas de interesse sócio-econômico já Nester EW (1977) Stable incorporation
Durante todos os estágios posteriores à foram introduzidas em diferentes es- of plasmid DNA into higher plant cells:
co-cultura, uma pressão de seleção deve pécies vegetais por transformação ge- the molecular basis of crown gall tumo-
ser mantida pela adição do agente seleti- nética, principalmente por intermé- rigenesis. Cell 11: 263-271.
vo ao meio de cultura, garantindo somen- dio do sistema Agrobacterium e do Dessaux Y, Petit A, Tempé J (1993)
te a regeneração de plantas transgênicas. método biobalístico. Essas caracterís- Chemistry and biochemistry of opines,
Ainda assim, os sistemas de seleção não ticas visam principalmente o melhora- chemical mediators of parasitism. Phyto-
são totalmente eficientes e alguns “esca- mento do desempenho em campo das chem. 34: 31-38.
pes” (plantas não-transformadas toleran- plantas cultivadas, por meio da resis- Godwin ID, Ford-Lloyd BV, New-
tes ao agente de seleção) podem ocorrer. tência a estresses bióticos e abióticos. bury HJ (1992) In vitro approaches to
Uma vez enraizadas, as plantas trans- Características relacionadas com o de- extending the host-range of Agrobacte-
formadas são aclimatadas e transferidas senvolvimento da planta e com a rium for plant transformation. Aust. J.
para casa de vegetação para análises qualidade do produto também po- Botany 40: 751-763.
posteriores. Essas plantas transformadas dem ser modificadas em plantas trans- Herrera-Estrella L, De Block M, Mes-
são, em geral, morfologicamente idênti- gênicas. A tendência é que cada vez sens E, Hernalsteens JP, van Montagu M,
cas às plantas não-transformadas, embora um maior número de características Schell J (1983) Chimeric genes as domi-
alterações fenotípicas possam ser, algu- possam ser manipuladas por meio da nant selectable markers in plant cells.
mas vezes, observadas devido às varia- engenharia genética, aumentando a EMBO J. 2: 987-995.
ções somaclonais decorrentes do proces- gama de produtos a serem disponibi- Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL,
so de cultura de tecidos, ou pela expres- lizados para o agricultor e para o Eichholtz D, Rogers SG, Fraley RT (1985)
são do próprio transgene. Uma análise consumidor. Em um futuro próximo, A simple and general method for trans-
molecular e bioquímica detalhada dessas as plantas transgênicas desempenha- ferring genes into plants. Science 227:
plantas é necessária para comprovar a rão também o papel de biofábricas, 1229-1231.
integração do DNA exógeno no genoma desenvolvidas para a produção de Stachel SE, Messens E, van Montagu
da planta e a sua expressão. A análise da produtos de interesse para as indústri- M, Zambryski P (1985) Identification of
progênie e o estudo da segregação tam- as de medicamentos, de alimentos e the signal molecules produced by woun-
bém são fundamentais para demonstrar a de rações. ded plant cells that activate T-DNA trans-
estabilidade da expressão dos genes in- Além de todas as implicações com fer in Agrobacterium tumefaciens. Natu-
troduzidos. a agricultura e com outros setores da re 318: 624-629.
Conclusão economia, as plantas transgênicas Zambryski PC (1992) Chronicles from
A insensibilidade de certas espécies constituem também um excelente sis- the Agrobacterium-plant cell DNA trans-
vegetais, especialmente Angiospermas tema para estudos básicos em diferen- fer story. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant
monotiledôneas, à infecção por Agrobac- tes campos da biologia, como fisiolo- Mol. Biol. 43: 465-490.
terium limita a utilização dessa bactéria gia, genética, botânica, biologia mole- Zambryski P, Joos H, Genetello C,
como vetor de transformação genética. cular e celular. Leemans J, van Montagu M, Schell JS
Assim, sistemas de transformação direta, (1983) Ti plasmid vector for introduction
baseados em métodos químicos ou físi- Para maiores informações sobre of DNA into plant cells without alteration
cos, foram desenvolvidos paralelamente técnicas de transformação genética de of their normal regeneration capacity.
ao sistema Agrobacterium. Entre elas, a plantas e análises moleculares da inte- EMBO J. 2: 2143-2150.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 15