Universidade do Estado do Rio de

Janeiro
FACULDADE DE TECNOLOGIA
ENGENHARIA DE PRODUÇÃO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E AMBIENTAL
PROCESSOS BIOQUÍMICOS

MANUAL DE PRÁTICAS DE

PROCESSOS BIOQUÍMICOS

APOSTILA DAS AULAS PRÁTICAS

Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues

Telma Temóteo dos Santos

Setembro de 2011
 Índice
1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRÃO .............................................................4
2. QUANTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS ................................................................8
2.1 Roteiro da Prática 1 – Quantificação de Micro-organismos ................................................. 10
2.1.1. Preparo da Suspensão de Células................................................................................ 10
2.1.2 Determinação do peso seco de células (%p/v).............................................................. 10
2.1.3. Turbidimetria ............................................................................................................. 10
2.1.4. Contagem de células em câmara de NEUBAUER ...................................................... 11
2.1.5. Determinação do volume do centrifugado (% v/v) ...................................................... 11
2.1.6. Estudo Dirigido.......................................................................................................... 12
2.1.7. Relatório da Prática 1 .................................................................................................13
3. DOSAGEM DE AÇÚCARES ..................................................................................................14
3.1 Método do DNS (3,5 dinitro salicilato) ............................................................................... 14
3.2 Roteiro da Prática 2 - Curva Padrão do Método DNS ......................................................... 16
3.2.1. Preparo da Solução Padrão de Glicose: 5 µmols/mL .................................................. 16
3.2.2. Construção da Curva Padrão ...................................................................................... 16
3.2.3. Estudo Dirigido.......................................................................................................... 17
3.2.4. Relatório da Prática 2 .................................................................................................18
4. ACÚCARES REDUTORES (AR) E AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS (ART) .................. 19
4.1 Roteiro da Prática 3 - Determinação de Açúcares Redutores (AR) e Açúcares Redutores
Totais (ART) ........................................................................................................................... 22
4.1.1. Determinação de Açúcares Redutores (AR) ................................................................ 22
4.1.2. Determinação de Açúcares Redutores Totais (ART) ................................................... 22
4.1.3. Dosagem de açúcares pelo método do DNS ................................................................ 23
4.1.4 Relatório da Prática 3 ..................................................................................................24
5. Grau Brix .................................................................................................................................25
5.1 Roteiro da Prática 4 - Determinação do BRIX ....................................................................26
5.1.1. Procedimento ............................................................................................................. 26
5.1.2. Relatório da Prática 4 .................................................................................................27
5. Cinética do Crescimento Microbiano ........................................................................................ 28
5.1 Roteiro da Prática 5 - Cinética do Crescimento de Células de Leveduras ............................ 31
5.1.1. Preparo da solução de YED 2% e inoculação das células ............................................ 31
5.1.2. Determinação da concentração de biomassa (X) ......................................................... 31
5.1.3. Relatório da Prática 5 .................................................................................................32
6. Produção de Etanol .................................................................................................................. 33
6.1 Roteiro da Prática 6 - Produção de Etanol em caldo de cana-de-açúcar ............................... 34
6.1.1. Fermentação .............................................................................................................. 34
6.1.2. Inibição da fermentação por NaF (inibidor da enolase) ............................................... 34
6.1.3. Relatório da Prática 6 .................................................................................................35
6.2 Roteiro da Prática 7 - Produção de Etanol em YED a 2% ................................................... 36
6.2.1. Preparo da solução de YED 2% .................................................................................. 36
6.2.2. Produção de células e de etanol e consumo de glicose ................................................ 36
6.2.3. Determinação do álcool pelo método do dicromato..................................................... 37
6.3.4. Relatório da Prática 7 .................................................................................................38
7. Acidez de vinhos ...................................................................................................................... 39
7.1. Roteiro da Prática 8 - Determinação da acidez total de vinhos ........................................... 40
7.1.1. Procedimento ............................................................................................................. 40
7.1.2.Relatório da Prática 8 ..................................................................................................41
8. Preparo de Soluções e Indicadores ............................................................................................ 42
 Apresentação

A disciplina de Processos Bioquímicos faz parte do currículo do curso de

Engenharia de Produção, ênfase Qualidade Química, da Faculdade de Tecnologia da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Pensando-se em fixar melhor o conteúdo da
disciplina desenvolveu-se um manual de aulas práticas.
A elaboração do Manual de Práticas de Processos Bioquímicos faz parte do Projeto
Elaboração de Material Didático para as Disciplinas de Microbiologia Industrial e
Processos Bioquímicos, modalidade Estágio Interno Complementar (EIC). Este produto
foi elaborado pela docente da disciplina, com o auxílio da aluna Telma Temóteo dos
Santos, estagiária do projeto.
O manual foi idealizado como apoio às aulas teóricas, da seguinte forma: breve
introdução teórica sobre as práticas, seguida dos roteiros da prática a ser realizada e do
relatório.
A primeira prática mostra as técnicas mais empregadas na quantificação dos micro-
organismos, importante no entendimento da Cinética Microbiana, vista nas aulas teóricas.
Nesta prática o aluno aprende o que é uma curva-padrão e como usar a espectrofotometria
para obter uma curva-padrão de absorbância em função do peso-seco de células.
Na segunda prática é construída uma curva-padrão para dosagem de açúcares, que é
utilizada na terceira prática para dosagem de açúcares redutores e redutores totais.
A quarta prática mostra como usar o sacarímetro de Brix e dosar o Grau Brix do
caldo de cana-de-açúcar, parâmetro importante no controle de qualidade da cana-de-açúcar
que chega às usinas de produção de etanol.
Na quinta prática o aluno acompanha o crescimento celular e faz os cálculos
relativos à cinética microbiana. Para isso, usa a curva-padrão construída na primeira
prática.
A sexta e sétima aulas práticas abordam a fermentação alcoólica. Na sexta
quantifica-se o etanol produzido em caldo de cana-de-açúcar a partir do CO2 formado. Esta
prática permite observar as fases da fermentação alcoólica vistas na teoria.
Na sétima prática quantifica-se o etanol obtido em meio sintético por titulometria e
realizam-se cálculos de rendimento, utilizando-se as curvas-padrão das práticas um e dois.
Finalmente, na oitava prática mede-se a acidez de vinhos comerciais.
 Como mostrado, os roteiros elaborados permitem abordar diversos aspectos
abordados nas aulas teóricas e práticas utilizadas na rotina industrial. Espera-se que o uso
desse manual possa auxiliar o melhor entendimento da disciplina.
 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos

1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRÃO

O termo espectro foi utilizado inicialmente por Newton, quando este descobriu que a luz
branca, ao atravessar um prisma, é dividida em várias cores. Atualmente, sabe-se que o espectro
visível é apenas uma pequena parte do espectro eletromagnético. A luz é, portanto, definida
como uma forma de energia eletromagnética, formada por ondas que apresentam comprimentos
diferentes. O comprimento de onda é medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10 -9m. A tabela 1.1
mostra as regiões do espectro em relação ao comprimento de onda.

Tabela 1. 1: Regiões do espectro em função do comprimento de onda

Região Comprimento de onda (nm)
Raios X 0,1 a 100
Ultravioleta 100 a 400
Visível 400 a 800
Infravermelho 800 a 5.000
Mico-onda 5.000 a 30.000

A capacidade que as diversas substâncias químicas têm de absorverem luz em

determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinação quantitativa e
qualitativa, uma vez que o espectro de absorção é característico para uma determinada substância
e a quantidade de absorção (intensidade) é dependente da concentração do composto.

Os métodos instrumentais estão sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as

mais diversas análises nas inúmeras áreas de atuação na industria química destacando-se os
métodos espectrofotométricos.

A espectrofotometria — medida de absorção ou transmissão de luz — é uma das mais

valiosas técnicas analíticas amplamente utilizadas em laboratórios de área básica, bem como em
análises clínicas e biológicas. Alguns exemplos de aplicação incluem: determinação de atividade
enzimática ou nas dosagens de compostos orgânicos em fluidos biológicos, como glicose, uréia,
proteínas, etc, em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de uma reação química, ou
um produto incolor que absorva na região do UV ou do IV.

A técnica baseia-se no fato de que quando um feixe de luz monocromática atravessa uma
solução com moléculas absorventes, parte da luz é absorvida pela solução e o restante é
transmitido. A absorção de luz depende basicamente da concentração das moléculas absorventes

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 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
e da espessura da solução – caminho óptico (Figura 1.1). Deve-se utilizar um feixe de luz
monocromática de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado.

Beer em 1852 observou a relação existente entre a transmissão e a concentração do meio

onde passa o feixe de luz. Uma determinada solução absorve a luz proporcionalmente à
concentração molecular do soluto, isto é, "A intensidade de um feixe de luz monocromático
decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta
aritmeticamente”.

Figura 1. 1: Esquema de Absorção da Luz

Fonte: http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html

A análise quantitativa em espectrofotometria é realizada através da medida da

absorbância, a qual se relaciona linearmente com a concentração dentro de uma faixa de
concentração, seguindo a lei de Lambert- beer. Para medidas de absorção de luz visível e
ultravioleta na pesquisa bioquímica a indústria especializada fabrica vários tipos de aparelhos,
comumente chamados de espectrofotômetros (Figura 1.2).

Nos espectrofotômetros a luz, fornecida por uma lâmpada, é fracionada pelo prisma ou
rede de difração (monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes
monocromáticas). O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida em um
recipiente transparente (cubeta). Parte da luz é absorvida e parte é transmitida. A redução da
intensidade luminosa é medida pelo detector (célula fotoelétrica) porque o sinal elétrico de saída
do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal elétrico amplificado e
visualizado no galvanômetro em números é lido como uma absorbância e é proporcional à
concentração da substância absorvente existente na cubeta.

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 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos

Figura 1. 2: Esquema óptico dos principais componentes do espectrofotômetro. As letras representam: (a)
fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de
amostras com cubeta contendo solução, (f) célula fotelétrica, (g) amplificador.

Se houver proporcionalidade entre a absorbância e a concentração da substância, pode-se

determinar a concentração da substância em amostras de concentração não conhecida com base
numa curva de calibração, que relaciona absorbância e concentração. Na Figura 1.3 á
apresentada uma curva de calibração, que corresponde à relação gráfica entre os valores de
absorbância e os de concentração.

Figura 1. 3: Curva de Calibração: Absorbância em função da Concentração

Para se plotar uma curva padrão é necessária a leitura de pelo menos quatro pontos, se
esta estiver na faixa de linearidade ou de dez pontos, caso não esteja. Além disso, é preciso
trabalhar, ao menos em triplicata para cada ponto. A curva é obtida a partir da inserção de uma
linha de tendência que passe pelos pontos experimentais. No exemplo da Figura 1.3 observa-se
que o ajuste dos pontos experimentais foi feito com uma reta. A qualidade do ajuste é avaliada
pelo valor do R2, não mostrado neste exemplo.

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 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
Com base na análise gráfica da Figura 1.3 é possível verificar a linearidade da reação e
calcular um fator de conversão de valores de absorbância em concentração.

FC = Média (Cp/Ap)

C = A.FC

Onde:
FC - fator de conversão ou fator da curva
Ap - absorbância do padrão
Cp - concentração do padrão

C - concentração da amostra
A - absorbância da amostra

Observação:

Pode-se trabalhar com a Absorbância (A), ou com a Transmitância (T), que é medida em
uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco na passagem da luz). A transmitância é
pouco utilizada, pois é substituída pelo valor de densidade óptica (D.O.) ou absorvância, termo
mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitância:

A = log 1/T

Referências:

 BRACHT, A; ISHII-IWAMOTO, E. L. Métodos de Laboratório em Bioquímica. São

Paulo: Manole, 2003.

 http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html

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 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos

2. QUANTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS
Os micro-organismos possuem a capacidade de ocupar e modificar um determinado
ambiente de forma rápida. A partir da proliferação, os micro-organismos também excretam
enzimas que modificam reagentes para a formação de novos produtos. Diante disso, a
quantificação microbiana é um importante acompanhamento em processos industriais que
envolvam micro-organismos diretamente, exemplo da fermentação alcoólica, ou para se verificar
a minimização dos mesmos quando estes não são desejáveis, como é o caso das salas de preparo
de injetáveis nas indústrias farmacêuticas.

Como exemplo de quantificação microbiana na industria tém-se a Portaria nº 518/04, que

estabelece que a quantidade de bactérias heterotróficas presentes na água não pode ultrapassar
500 UFC/ml senão há a necessidade de reteste,inspeção da fonte ou outras providências cabíveis.
Uma situação oposta, ao se considerar alimentos com atividade próbiótica, a contagem mínima
deve ser de 108 a 10 9 UFC na dose diária recomendada ou a empresa deve comprovar a eficácia
do produto como probiótico.

O crescimento dos micro-organismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais
como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células, por exemplo. A escolha
do método é função do Micro-organismo e das características do meio de fermentação (cor,
sólidos presentes, etc.).
Não existe um método absoluto para a quantificação microbiana ou determinação da
viabilidade celular de uma população de células. Para estimar a proporção de células viáveis em
uma cultura ou processo fermentativo, métodos baseados no plaqueamento ou observação
microscópica têm sido utilizados. Os métodos de contagem direta são rápidos e simples,
exigindo um mínimo de equipamento, permitindo que seja observada, simultaneamente, a
morfologia celular.

Outros métodos amplamente empregados são densidade ótica (ou absorbância), peso seco
de células, volume de centrifugado, número mais provável, dentre outros. Alguns destes métodos
serão vistos na prática 1.

Referências:
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 8
 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
 Brasil, Portaria nº 518, de 25 de março de 2004. Estabelece os procedimentos e
responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo
humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências. D.O.U. - Diário Oficial da
União; Poder Executivo, de 26 de março de 2004. Disponível online em: <http://e-
legis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=22322&word=>. Acesso em: 31/07/2008.
 FDA, Bacteriological Analytical Methods, 2001. Disponível online em:
<http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html>. Ultimo acesso em: 29/07/2008.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 9

 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
2.1 Roteiro da Prática 1 – Quantificação de Micro-organismos

Material Equipamentos Reagentes

 1 balão volumétrico de 100 mL  estufa  Fermento
 6 balões volumétricos de 250 mL  espectrofotômetro UV-Visível Biológico
 2 balões volumétricos de 1000 mL  centrífuga  Água
 1 Becher de 100 mL  balança
 1 Bastão de vidro  dessecador
 1 tubo de centrífuga  câmara de Neubauer
 pipetas volumétricas de 2, 3, 5, 10 e 15 mL  microscópio
 1 pesa-filtro

Objetivo: Determinar a concentração de células de levedura em uma suspensão, usando 4

diferentes técnicas de quantificação.

2.1.1. Preparo da Suspensão de Células

 Pesar cerca de 1 g de fermento biológico em um becher de 100 mL

 Dissolver em água destilada e diluir em balão volumétrico de 100 mL

2.1.2 Determinação do peso seco de células (%p/v)

 Pipetar 5 mL da suspensão de células recém preparada, previamente agitada e transferir

para pesa-filtro de tara conhecida.
 Secar em estufa entre 100 e 120ºC até peso constante.
 Determinar, por diferença de massa, o peso seco de células e expressar o resultado em
termos de massa seca de células (g) / 100 mL de suspensão.

2.1.3. Turbidimetria

 Diluir alíquotas de 2, 3 e 5 mL da suspensão de células em balões volumétricos de 250

mL e alíquota de 15 mL em balão volumétrico de 1.000 mL (fazer em duplicata).
 Ler a absorbância das suspensões diluídas em espectrofotômetro (=570 nm), usando
água destilada como branco.

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2.1.4. Contagem de células em câmara de NEUBAUER

 Diluir a suspensão 50 vezes.

 Gotejar a suspensão diluída em câmara de NEUBAUER e cobrir com a lamínula.
 Efetuar a contagem de 5 dos 25 quadrados da câmara (Figura 2.1). Expressar o
resultado em termos do número de células / mL da suspensão original, com base no
seguinte cálculo:
( 5 quadrados) x (5x10 4) x diluição

Figura 2. 1: Câmara de Neubauer. A. O círculo indica a área aproximada coberta pelo aumento de 100 vezes
ao microscópio (10X ocular e 10X objetiva) de uma câmara de contagem padrão. B. Aspecto de um quadrado
integrante do quadrado médio, mostrando que devem ser contadas as células que tocam as linhas do topo e
da esquerda do quadrado, desprezando aquelas que tocam a linha de baixo e da direita do quadrado.

2.1.5. Determinação do volume do centrifugado (% v/v)

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 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
 Pipetar 10 mL da suspensão de células recém preparada, previamente agitada e
transferir para tubo de centrífuga graduado.
 Centrifugar por 15 minutos. Anotar o volume de células.
 Expressar o resultado em termos de volume de células / 100 mL da suspensão.

2.1.6. Estudo Dirigido

1) Pesquisar outras metodologias para quantificação de micro-organismos e para controle de

qualidade.
2) Quais as possíveis fontes de erro das técnicas utilizadas nesta prática?
3) Discutir a aplicabilidade de cada técnica utilizada nesta prática.

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2.1.7. Relatório da Prática 1

Componentes do Grupo:

1) Preencher os espaços abaixo, efetuando os cálculos necessários:

- Determinação do volume do - Determinação do peso seco de células (%p/v)

centrifugado (% v/v) volume da suspensão: __________
volume da suspensão: __________ tara do pesa-filtro: __________
volume de células: __________ pesa-filtro + células secas: __________
% v/v: __________ peso das células secas: __________
Peso seco (g/100 mL): __________

- Contagem de células em câmara de NEUBAUER

Contagem quadrados: A = _____ , B = _____, C = _____, D = _____, E = _____
 5 quadrados (A+B+C+D+E) = _______
[células] da suspensão diluída 50 vezes = ( 5 quadrados) x (5x104) x (diluição)
[células] da suspensão original = _______ (nº células / mL)
- Turbidimetria
Diluição Vol. Susp. Vol. balão ABS ABS média Nº células Peso seco
(mL) (mL) 570nm células/mL (g/100 mL)

2) Construir os seguintes gráficos, determinando a reta de calibração e o fator da curva:

 Absorbância 570 nm x peso seco das suspensões diluídas
 Absorbância 570 nm x nº células/mL das suspensões diluídas

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3. DOSAGEM DE AÇÚCARES
Os carboidratos, ou açúcares, com fórmula empírica (CH2O)n são um dos maiores grupos
de compostos orgânicos conhecidos na natureza, e juntamente com as proteínas formam os
principais constituintes dos organismos vivos. Os carboidratos simples mais abundantes são as
pentoses e hexoses. Os açúcares possuem um ou mais átomos assimétricos de carbono, portanto
podem existir na forma de estereoisômeros.

Os carboidratos têm diversas classificações, de acordo com seu tamanho, com o grupo
funcional que é derivado, entre outras. As classificações podem ser: monossacarídeos,
oligossacarídeos e polissacarídeos.

Os monossacarídios são carboidratos simples que não podem ser hidrolisados a açúcares
de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdeídos) e cetoses
(poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o
número de carbonos na cadeia.

Os oligossacarídios são polímeros compostos de resíduos de monossacrídios unidos por

ligações hemiacetálicas, neste caso denominadas ligações glicosídicas, em número que variam de
duas, até, aproximadamente, dez unidades. São compostos importantes na determinação de
estruturas de polissacarídios.

Na indústria existem diversas reações tanto de degradação como de formação de açucares

que são determinantes no controle de qualidade dos produtos produzidos.

Um açúcar redutor é um açúcar no qual o carbono da carbonila não está envolvido em

uma ligação glicosídica e, portanto, pode sofrer oxidação.

Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais
como os íons férrico e cúprico. O carbono do grupo carbonila é oxidado a ácido carboxílico.
Todos os monossacarídeos são potencialmente redutores, devido a presença da carbonila. Outros
carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores.

3.1 Método do DNS (3,5 dinitro salicilato)

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 14

 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
Um dos métodos empregados na quantificação de açúcares redutores é o método do DNS.
É um método rápido e prático na determinação de açúcares redutores, e tem grande
aplicabilidade industrial. Como exemplo de aplicação temos: controle de qualidade na
caracterização das matérias primas para fins de processamento, e verificação se determinado
produto está dentro dos parâmetros e padrões exigidos pela legislação; indústria açucareira, no
acompanhamento do processo de fermentação, que permite verificar as taxas de consumo de
açúcar pelo micro-organismo.

A determinação de açúcares redutores pelo método do DNS baseia-se na redução, em

meio alcalino, do 3.5-dinitrosalicilato (coloração amarela). O produto formado é estável, com
coloração laranja-avermelhado (3-amino 5-nitro salicilato) na proporção estequiométrica e
máxima absorção da luz visível no comprimento de onda de 535 nm. Neste método ocorre a
seguinte reação de oxidação (Figura 3.1):

Figura 3. 1: Reação de oxidação da carbonila pelo reagente DNS.

Para se aplicar o método é necessário se fazer inicialmente uma curva-padrão do açúcar

que se deseja quantificar, como será realizado na prática 2 deste manual.

Referências:

 MILLER, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar,
Anal. Chem., n. 31, p.426, 1959.

WANG, Nam Sun. Glucose assay by dinitrosalicylic colorimetric method. Disponível em:
http://terpconnect.umd.edu/~nsw/ench485/lab4a.htm. Acesso em: 10 ago 2011.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 15

 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
3.2 Roteiro da Prática 2 - Curva Padrão do Método DNS

Material Equipamentos Reagentes

 1 balão volumétrico de 100 mL  espectrofotômetro UV-Vis  Glicose
 2 Becher de 50 ou de 100 mL  balança  Reagente DNS
 1 Bastão de vidro  termômetro
 1 Bureta de 10  banho-maria
 1 Bureta de 25 ou 50 mL
 11 tubos de ensaio com tampa de rosca
 Pipeta volumétrica de 1 mL

Objetivo: Construir uma curva padrão para determinação de açúcares redutores pelo método do
DNS, empregando a glicose como padrão.

Sensibilidade do método: 1-20 µmols glicose

3.2.1. Preparo da Solução Padrão de Glicose: 5 µmols/mL

 Pesar, em um becher de 100 mL, 90 mg glicose. Anotar a massa para realizar os

cálculos.
 Solubilizar com água destilada e transferir para balão volumétrico de 100 mL.
Avolumar o balão.

3.2.2. Construção da Curva Padrão

 Em tubos de ensaio com tampa, e com auxílio da bureta de 10 mL, preparar os

seguintes pontos da curva, em duplicata com exceção do branco:
Água destilada Solução Padrão
(mL) (mL)
branco 1,0 -
1 0,8 0,2 mL
2 0,6 0,4 mL
3 0,4 0,6 mL
4 0,2 0,8 mL
5 - 1,0 mL

 Adicionar 1 mL de DNS em cada tubo. Agitar e aquecer à 100°C em banho-Maria

durante 5 min.
 Resfriar e acrescentar 13 mL de água destilada em cada tubo, com auxílio da bureta de
50 mL. Tampar os tubos e homogeneizar (volume final = 15 mL).

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 16

 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
 Proceder a leitura da absorbância em espectrofotômetro em:  = 540 nm.

3.2.3. Estudo Dirigido

1) Pesquisar outras metodologias para quantificação de açúcares.

2) Ler o artigo Comparação de Métodos para Determinação de Açúcares Redutores e
Totais em Mel, disponível na pasta da Disciplina de Processos Bioquímicos ou no link
http://www.scielo.br/pdf/cta/v23n3/18834.pdf
3) Quais as possíveis fontes de erro na prática em questão?

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 17

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3.2.4. Relatório da Prática 2

Componentes do Grupo:

1) Preencher os espaços abaixo, efetuando os cálculos necessários:

Tubo ABS (540 nm) ABS média [glicose] (µg/mL)

1

2) Construir a curva padrão de glicose: Abs x [glicose] µg/mL, determinando o coeficiente

angular e o fator da reta obtida.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 18

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4. ACÚCARES REDUTORES (AR) E AÇÚCARES REDUTORES

TOTAIS (ART)
A qualidade da cana-de-açúcar era determinada exclusivamente pela sacarose aparente
(POL). Atualmente, englobam-se características físico-químicas e microbiológicas dessa
matéria-prima, que podem afetar, significativamente, a recuperação deste açúcar na fábrica e a
qualidade do produto final.

Dois tipos de fatores afetam a qualidade da matéria-prima destinada à indústria:

 fatores intrínsecos: relacionados à composição da cana (teores de sacarose, açúcares

redutores, fibras, compostos fenólicos, amido, ácido aconítico e minerais), sendo estes
afetados de acordo com a variedade da cana, variações de clima (temperatura, umidade
relativa do ar, chuva), solo e tratos culturais;

 fatores extrínsecos: relacionados a materiais estranhos ao colmo (terra, pedra, restos de

cultura, plantas invasoras) ou compostos produzidos por micro-organismos devido à sua
ação sobre os açúcares do colmo.

‘ Desta forma, existem indicadores que permitem avaliar tanto a riqueza da cana como a
qualidade da mesma para a recuperação dos açúcares. A Figura 4.1 ilustra a coleta de amostras
de cana para avaliação da sua qualidade. A Tabela 4.1 apresenta os principais indicadores da
qualidade da cana.

Figura 4. 1: Coleta de amostras de cana no caminhão na entrada da empresa.

Fonte: http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-de-cucar/arvore/
CONTAG01_138_22122006154842.html

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 19

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Tabela 4. 1: Indicadores da qualidade e valores recomendados para a cana-de-açúcar.

Fonte: Ripoli e Ripoli (2004).

Abaixo, seguem as definições de alguns destes indicadores:

POL: teor de sacarose aparente na cana. Para a indústria canavieira, quanto mais elevados os
teores de sacarose, melhor.

Pureza: é determinada pela relação POL/Brix x 100. Quanto maior a pureza da cana, melhor a
qualidade da matéria-prima para se recuperar açúcar. Todas as substâncias que apresentam
atividade óptica podem interferir na POL, como açúcares redutores (glicose e frutose),
polissacarídeos e algumas proteínas.

ATR ou ART (Açúcares Redutores Totais): indicador que representa a quantidade total de
açúcares da cana (sacarose, glicose e frutose). O ART é determinado pela relação POL/0,95 mais
o teor de açúcares redutores. A concentração de açúcares na cana varia, em geral, dentro da faixa
de 13 a 17,5%. Entretanto, é importante lembrar que canas muito ricas e com baixa percentagem
de fibras estão mais sujeitas a danos físicos e ataque de pragas e micro-organismos. Os estudos
mostram que nas primeiras 14 horas de deterioração da cana, 93% das perdas de sacarose foram

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 20

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devidas à ação de micro-organismos, 5,7% por reações enzimáticas e 1,3% por reações químicas,
resultantes da acidez.

Açúcares redutores: é a quantidade de glicose e de frutose presentes na cana, que afetam

diretamente a sua pureza, já que refletem em uma menor eficiência na recuperação da sacarose
pela fábrica.

A determinação de açúcares redutores pode ser realizada pelo método de DNS,

utilizando-se como padrão a glicose. Na determinação de açúcares redutores totais, promove-se
preliminarmente a hidrólise da sacarose com ácido clorídrico à quente, como será realizado na
prática 3.

Referências:
 RIPOLI, T. C. C.; RIPOLI, M. L. C. Biomassa de cana-de-açúcar: colheita, energia e
ambiente. Piracicaba: Barros & Marques Ed. Eletrônica, 2004. 302 p.

VIAN, Carlos Eduardo Freitas. Qualidade de matéria-prima. Disponível em:

http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-de-
acucar/arvore/CONTAG01_138_22122006154842.html. Acesso em: 10 Jul 2011.

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4.1 Roteiro da Prática 3 - Determinação de Açúcares Redutores (AR) e
Açúcares Redutores Totais (ART)
Material Equipamentos Reagentes
 1 balão volumétrico de 500 mL  espectrofotômetro UV-  100 mL de Caldo de cana
 6 balões volumétricos de 100 mL Vis  HCl 1:1
 pipetas volumétricas de 1, 2, 5, 10, 25 e  banho-maria  NaOH 0,1 mol/L
50 mL  termômetro  Reagente DNS
 provetas de 25 e 100 mL  Padrão de glicose (aula
 8 tubos de ensaio com tampa de rosca anterior)
 1 Bureta de 10
 1 Bureta de 25 ou 50 mL
 1 Becher de 100 mL

Objetivo: Determinar a concentração de sacarose, glicose e frutose presentes no caldo de cana.

4.1.1. Determinação de Açúcares Redutores (AR)

 Diluir 1, 5 e 10 mL de caldo de cana in natura, ou melaço, em balões volumétricos de

100 mL.
 Pipetar 1 mL do caldo de cana, ou melaço, diluído e transferir para tubo de ensaio com
tampa, devidamente identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.

4.1.2. Determinação de Açúcares Redutores Totais (ART)

 Colocar 50,00 mL de caldo de cana in natura, ou melaço, em balão volumétrico de 500

mL.
 Adicionar a seguir 70 mL de água destilada. Inserir um termômetro no balão e levar o
conjunto para banho-maria (~70°C)
 Quando a temperatura da solução atingir 65°C, retirar o balão do banho-maria e
adicionar imediatamente 25 mL de HCl 1:1. Homogenizar e deixar em repouso, à
temperatura ambiente, por 30 minutos.
 Após este tempo, avolumar o balão até volume final.
 Transferir 2, 10 e 25 mL do hidrolisado diluído para balões volumétricos de 100 mL.
 Adicionar NaOH 0,1 mol/L até completar o volume do balão.
 Pipetar 1 mL de cada solução acima para tubo de ensaio com tampa, devidamente
identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.

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4.1.3. Dosagem de açúcares pelo método do DNS

 Preparar um padrão de glicose, como na prática anterior, para ler a absorbância junto
com as amostras.
 Proceder a dosagem de açúcares redutores (amostras do item 4.1) e redutores totais
(amostras do item 4.2) pelo método do DNS: adicionar 1 mL de DNS às amostras já
colocadas nos tubos e levar ao banho-maria por 5 min. Deixar esfriar e completar com
13 mL de água destilada.
 Preparar amostra em branco (1 mL de água + 1 mL de DNS).
 Proceder a leitura da absorbância em espectrofotômetro em:  = 540 nm.
 Se a absorbância da amostra estiver fora da curva de calibração, repetir o procedimento
variando a diluição do hidrolisado.

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4.1.4 Relatório da Prática 3

Componentes do Grupo:

1) Dados obtidos na Prática:

Diluição (AR) ABS (AR) Diliução (ART) ABS (ART)

Concentração do Padrão de Glicose (µg/mL) = _____

ABS do padrão de glicose = _____

2) Calcular o teor de sacarose e de açúcares redutores no caldo de cana (g/100mL) usando

as seguintes equações:
% AR = (C x B x F x 10-4) / P ________ (g/100 mL)
-4
% ART = (A x B x F x 10 ) / P ________ (g/100 mL)
% sacarose = [%ART - %AR] x 0,95 ________ (g/100 mL)

onde:
A = absorbância da amostra processada conforme item 2.
B = concentração do padrão de glicose em µg/mL (ponto da curva de calibração)
C = absorbância da amostra processada conforme item 1.
P = absorbância do padrão de glicose (ponto da curva de calibração)
F = fator de diluição

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5. Grau Brix

Uma das variáveis agroindustriais mais facilmente determinadas em laboratório ou

mesmo em campo, é o Brix. Quando se trata de cana madura existe estreita relação entre essa
porcentagem e o conteúdo de sacarose na solução. A cana é considerada madura com Brix mínimo
de 18° entre outros fatores. Por consenso, admite-se o Brix como sendo a porcentagem de sólidos

solúveis contidos em uma solução açucarada, ou seja:

1° BRIX corresponde a 1 g de sólidos dissolvidos em 100 g de solução à 20°C

Sendo a sacarose um dos sólidos do caldo (80-90%), o aumento do seu conteúdo acaba
por resultar em aumento do Brix do caldo. Portanto, em soluções com alto teor de açúcares,
como por exemplo o melaço, o valor do °Brix é uma medida aproximada do teor de açúcares
presentes no meio.

A medida do Brix pode ser feita através de refratômetro ou pelo Sacarímetro de Brix, que
que será utilizado na prática 4. A escala do Sacarímetro de Brix varia de 0 a 90º Brix com
divisões de 0,1 / 0,2 / 0,5 e 1º Brix.

Referências:

 DOUMER, M. E.; MARTINS, G. A.; MOREIRA, A. da S.; SILVA, S. D. dos A..

Avaliação de graus brix de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) da parte inferior e
superior de colmos. Disponível em:
http://www.ucpel.tche.br/cic/cdcic2009/pdfs/1464.pdf Acessado em: mai 2011.

 INCOTERM. Instruções de Uso do sacarímetro de Brix. Disponível em:

http://www.incoterm.com.br/download_anexo/5733_MANUAL.pdf. Acesso em mai
2011.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 25

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5.1 Roteiro da Prática 4 - Determinação do BRIX

Material Equipamentos Reagentes
 proveta de 500 mL  sacarímetro de Brix  500 mL de Caldo de cana
 termômetro

Objetivo: Determinar o teor de sólidos dissolvidos em uma solução, através da medida da

densidade utilizando o sacarímetro de BRIX.

5.1.1. Procedimento

 Transferir o caldo de cana ou melaço para a proveta de 500 mL

 Mergulhar o sacarímetro de BRIX cuidadosamente, de modo a não umedecer a haste
acima do líquido. Deixar o instrumento flutuar livremente e não deixar tocar nas
paredes ou no fundo da proveta. Aguardar 5 minutos.
 Proceder a leitura olhando em nível com a superfície da solução, anotando o valor do
BRIX.
 Verificar a temperatura da solução.
 Efetuar as correções, utilizando a tabela 5.1. A correção é aditiva quando a temperatura
da solução for maior do que a temperatura padrão (20°C) e subtrativa quando a
temperatura da solução for menor do que a temperatura padrão.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 26

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5.1.2. Relatório da Prática 4

Componentes do Grupo:

Leitura no sacarímetro (°BRIX): _____ ° B – temperatura padrão 20°C

Temperatura da solução: _____°C
Fator de correção: ______
° BRIX = leitura no sacarímetro +/- fator de correção: ______ ° B

Tabela 5. 1: Tabela de Correção para Grau Brix

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5. Cinética do Crescimento Microbiano

Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e
não ao aumento das dimensões celulares. Quando se estuda a cinética de crescimento a escolha
da técnica de quantificação microbiana é um parâmetro importante, pois dela depende os
cálculos que serão realizados. É importante também se determinar a taxa de crescimento
microbiano e o tempo de geração do micro-organismo em estudo, nas condições de processo
utilizadas.
A Taxa de crescimento (velocidade específica de crescimento) é a variação no número
ou massa de micro-organismos por unidade de tempo.
Define-se Tempo de geração como o intervalo de tempo necessário para que uma célula
se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a
20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas.
O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de
fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura.
O conhecimento da cinética de um processo ou da cinética de crescimento microbiano é
importante industrialmente, pois permite a análise de perigos e pontos críticos do processo
(APPCC); previsão de eventos fora do processo; determinação de vida-de-prateleira; análise de
Risco.
Na Figura 5.1 é mostrada uma curva típica de crescimento microbiano. O crescimento
microbiano pode apresentar quatro fases distintas, a saber:
 Fase Lag ou de Adaptação - fase de adaptação metabólica ao novo ambiente, onde
ocorre rearranjo do sistema enzimático (síntese de enzimas), traumas físicos (choque
térmico, radiação, entre outros) e traumas químicos (produtos tóxicos, meio de cultura).
O número de indivíduos não aumenta nesta fase, podendo até mesmo decrescer. A
duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam
anteriormente.
 Fase Log ou Exponencial - Nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas,
absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Fase
na qual o número de células da população dobra a cada geração. A taxa de
crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 28

 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
questão. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Esta taxa de
crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Após um
determinado período de crescimento exponencial, as condições ambientais tornam-se
desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais, acúmulo de metabólitos tóxicos e
limitação de espaço. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase
estacionária.
 Fase Estacionária - Fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente
devido às condições limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se
dividindo, mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito
próxima da taxa de morte celular, o que mantém constante o número de células viáveis
na população. A curva de crescimento atinge um platô. A duração da fase estacionária
depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se
tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições
ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. É na fase estacionária que são
sintetizados vários metabólitos secundários, que incluem antibióticos e algumas enzimas.
Nesta etapa ocorre também a esporulação das bactérias.
 Fase de Declínio ou de Morte - Fase de declínio exponencial do número de células
viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. O número de células
viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população.

Figura 5. 1: Curva característica do crescimento celular de um micro-organismo

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 29

 Manual de Práticas de Processos Bioquímicos
Leitura Complementar:
 STREMEL, D. S., VIDAURRE, T.C., SILVA, F.S., KELLER, L.E. Estudo da cinética
de crescimento microbiano do Bacillus subtilis em meio alternativo na produção de
Biocontrolador de fungos fitopatogênicos. XVIII Congresso Regional de Iniciação
Científica e Tecnológica.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 30

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5.1 Roteiro da Prática 5 - Cinética do Crescimento de Células de

Leveduras
Material Equipamentos Reagentes
 pipeta volumétrica de 1 mL  espectrofotômetro UV-Vis  fermento biológico
 pipetas graduadas de 5, 10 e 25 mL  agitador tipo shaker  extrato de lêvedo
 proveta de 100 mL  balança  glicose
 5 Becher de 50 ou 100 mL  KH2PO 4
 8 tubos com tampa de rosca  (NH4)2SO4
 1 Erlenmeyer de 250 mL
 Bastão de vidro
 Bureta de 25ml

Objetivo: Determinar a taxa específica de crescimento de células de levedura em meio sintético

(YED 2%).
5.1.1. Preparo da solução de YED 2% e inoculação das células

 Preparar a solução de YED em erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lêvedo, 2 g de

glicose, 0,2 g de KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de água destilada
e solubilizar todos os reagentes.
 Pesar entre 90 e 100 mg de fermento biológico. Anotar a massa.
 Inocular o meio sintético transferindo o fermento para a solução de YED 2%, com o
auxílio da própria solução.
 Colocar o erlenmeyer no shaker e iniciar agitação contínua.

5.1.2. Determinação da concentração de biomassa (X)

 Após inocular as células, retirar uma alíquota de 3 mL.

 Transferir um pouco da amostra para a cubeta e proceder a determinação de biomassa
em 570 nm, utilizando a curva de “quantificação de micro-organismos”.
 Se a absorbância for maior do que o último ponto da curva, proceder à diluição da
mesma.
 Repetir o procedimento, retirando alíquotas a intervalos de 30 min, aumentando a
diluição, se necessário.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 31

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5.1.3. Relatório da Prática 5

Componentes do Grupo:

1) Determinação da concentração de biomassa (X)

Tempo Absorbância diluição [biomassa]
(min) (570 nm) (g/ mL)
0
30
60
90
120
180

2) Construir a curva de crescimento: (i) [biomassa] x tempo, (ii) Ln [biomassa] x tempo.

3) Determinar a taxa específica de crescimento (µX) das células de levedura em meio YED.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 32

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6. Produção de Etanol
O álcool (etanol) pode ser obtido de diversas formas de biomassa, sendo a canade-açúcar
a realidade econômica atual. Investimentos portentosos estão sendo efetuados para viabilizar a
produção de álcool a partir de celulose, sendo estimado que, em 2020, cerca de 30 bilhões de
litros de álcool poderiam ser obtidos desta fonte, apenas nos EUA. O benefício ambiental
associado ao uso de álcool é enorme, pois cerca de 2,3 t de CO2 deixam de ser emitidas para cada
tonelada de álcool combustível utilizado, sem considerar outras emissões, como o SO2.
A cana-de-açúcar é a segunda maior fonte de energia renovável do Brasil com 12,6% de
participação na matriz energética atual, considerando-se o álcool combustível e a co-geração de
eletricidade, a partir do bagaço. Dos 6 milhões de hectares, cerca de 85% da cana-de-açúcar
produzida no Brasil está na Região Centro-Sul (concentrada em São Paulo, com 60% da
produção) e os 15% restantes na região Norte-Nordeste.
Na safra 2004, das cerca de 380 milhões de toneladas moídas, aproximadamente 48%
foram destinadas à produção de etanol. O bagaço remanescente da moagem é queimado nas
caldeiras das usinas, tornando-as auto-suficientes em energia e, em muitos casos, superavitárias
em energia elétrica que pode ser comercializada. No total foram produzidos 15,2 bilhões de litros
de etanol e uma geração de energia elétrica superior a 4 GWh durante a safra, o que representa
aproximadamente 3% da nossa geração anual.
O etanol é um produto da fermentação do açúcar, mais freqüente entre os micro-
organismos. As principais produtoras de álcool são as leveduras principalmente linhagens de
Saccharomyces cerevisae. As leveduras são, como na maioria dos fungos, organismos aeróbicos.
No entanto, sob condições de anaerobiose fermentam carboidratos à etano e gás carbônico.
C6H12O6  2 C2H5OH + 2 CO2
A fermentação da glicose à etanol e gás carbônico pela levedura Saccharomyces
cerevisae segue o caminho da frutose bifosfato. A transformação de piruvato à etanol resume-se
em duas etapas. Primeiro, o piruvato é descarboxilado a acetaldeído sob ação da piruvato-
descarboxilase (e cooperação da tiaminopirofosfato). O acetaldeído é, em seguida, reduzido a
etanol pela álcool-desidrogenase com NADH2.

Referências:
 http://www.biodieselbr.com/energia/alcool/etanol.htm
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 33
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6.1 Roteiro da Prática 6 - Produção de Etanol em caldo de cana-de-açúcar

Material Equipamentos Reagentes
 2 Erlenmeyer de 500 mL  balança  350 mL de Caldo de cana
 Proveta de 200 mL  60 g de fermento biológico
 2 Becher de 50 mL  NaF
 1 Becher de 100 mL
 Bastão de vidro
 Fermentômetro

Objetivo: Produzir etanol utilizando caldo de cana como matéria prima e observar as fases da
fermentação alcoólica.

6.1.1. Fermentação

 Pesar cerca de 25 g de fermento biológico em becher.

 Transferir 150 mL de caldo de cana para o erlenmeyer de 500 mL.
 Acrescentar o fermento biológico previamente pesado e adaptar o fermentômetro.
Anotar a massa total do conjunto (m).
 Deixar que a fermentação se processe, pesando e anotando a massa do conjunto a cada
30 min.

6.1.2. Inibição da fermentação por NaF (inibidor da enolase)

 Repetir o procedimento do item 6.1, acrescentando-se ao caldo de cana 0,315 g de NaF.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 34

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6.1.3. Relatório da Prática 6

Componentes do Grupo:

1) Para os procedimentos 6.1 e 6.2, responda:

a) Qual a quantidade de gás carbônico produzido?
b) Qual a quantidade de etanol produzido?
c) Qual a quantidade de glicose consumida?
2) Calcule o grau de inibição provocado pelo NaF.
3) Calcule o rendimento e a eficiência da fermentação. Dado: rendimento teórico = 0,511
4) Construa o gráfico SCO2 x t, Setanol x t.
5) Pesquise a função da enzima enolase.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 35

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6.2 Roteiro da Prática 7 - Produção de Etanol em YED a 2%

Material Equipamentos Reagentes
Parte 1: Parte 1: Parte 1:
 1 Erlenmeyer de 250 mL  Balança  60 g de fermento
 Provetas de 50 e 100 mL  Espectrofotômetro biológico
 Pipeta volumétrica de 1 mL  Destilador  Glicose
 2 Becher de 50 e 100 mL  centrífuga  Padrão de glicose de
 10 tubos com tampa de rosca 10 mol/mL
 3 tubos de centrífuga  DNS
 4 balões volumétricos de 250 mL  Extrato de lêvedo
 2 balões volumétricos de 100 mL  KH2PO4
 Bastão de vidro  (NH4)2SO4
 Pipeta graduada de 5 mL  NaOH 0,1 N
 Bureta de 25 mL
Parte 2:
Parte 2:  Padrão de dicromato de
 Pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL potássio
 3 Erlenmeyer com tampa de borracha  H2SO4 concentrado
 Proveta de 200 ou 250 mL  H3PO4 85 %
 Proveta de 25 mL ou pipeta graduada de  Indicador
20 mL  Sulfato ferroso amoniacal
 Bureta de 25 mL

Objetivo: Calcular a eficiência de uma fermentação de glicose por células de leveduras através
da medida da produção de etanol e do consumo de glicose.

6.2.1. Preparo da solução de YED 2%

 Colocar em um erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lêvedo, 2 g de glicose, 0,2 g de

KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de água destilada e solubilizar todos
os reagentes.
 Retirar uma alíquota de 3 mL para a dosagem de açúcar pelo método do DNS.

6.2.2. Produção de células e de etanol e consumo de glicose

 Inocular o erlenmeyer de 250 ml, contendo YED com 20 % (pu/v) de células. Agitar e
imediatamente retirar uma alíquota de 1,0 ml (tempo 0) e verter para balão volumétrico
de 250 mL, completando com água destilada. Fazer a leitura da ABS a 570 nm (dosagem
de células).
 Manter o mosto inoculado agitando periodicamente por 1 h.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 36

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 Após 1 h de fermentação, retirar alíquota de 3 ml para determinação da concentração
celular. Diluir a amostra 1:250 e ler a ABS a 570 nm.
 Centrifugar cerca de 30 ml do meio fermentado. Recolher o sobrenadante (tempo 1 h).
 Do sobrenadante, guardar 5 ml para determinação do teor de açúcar e colocar 10 ml no
compartimento do destilador.
 No destilador, adicionar em seguida 10 ml de H2O e 0,5 ml de NaOH 0,1 N. Fechar o
sistema e recolher os 8 ml iniciais do destilado. Completar este volume a 10 ml com
exatidão. Congelar a amostra para posterior determinação do teor de etanol pelo método
do dicromato.
 Diluir 100 vezes uma alíquota dos sobrenadantes (tempos 0 e 1 h) e determinar a
quantidade de glicose pelo método do DNS.

6.2.3. Determinação do álcool pelo método do dicromato

 Colocar 10 ml de solução de dicromato em 3 frascos cônicos e adicionar, em seguida,

5 ml de H2SO4 concentrado, resfriando-se em água da torneira.
 Colocar em cada frasco 5,0, 2,5 e 1,0 ml do destilado e completar o volume a 5,0 ml de
água, quando for o caso.
 Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 min para o etanol ser quantitativamente levado
a ácido acético.
 Após 15 min, adicionar 165 ml de água destilada, 18 ml de ácido fosfórico e 0,5 ml de
indicador.
 Titular com sulfato ferroso amoniacal até a cor da solução mudar de púrpura para verde e
anotar o volume consumido (n).
 Para o ensaio em branco adicionar 5 ml de água destilada no lugar da amostra e repetir o
procedimento. Anotar o volume consumido (N).

Cálculos:

Alíquota de 5 ml do destilado A = 2 (1 – n/N)

Alíquota de 2,5 ml do destilado A = 4 (1 – n/N)
Alíquota de 5 ml do destilado A = 10 (1 – n/N)

Onde A = concentração de etanol na amostra original (%)

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 37

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6.3.4. Relatório da Prática 7

Componentes do Grupo:

1) Calcular as concentrações de glicose e de células para os tempos 0 e 1 h.

2) Calcular a massa de etanol formado.

3) Calcular o rendimento e a eficiência da fermentação a partir dos resultados.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 38

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7. Acidez de vinhos

Sabe-se que a acidez dos vinhos se deve a presença de ácidos como o tartárico, málico e
cítrico, entre os mais importantes. Estes ácidos garantem a conservação do vinho bem como
outras características de suma importância. O grau de acidez está também relacionado com a
acidez total titulável, o pH, a quantidade de ácidos dissociados e não dissociados, e a quantidade
relativa de cada um dos ácidos presentes.

Dentro dos padrões comerciais, a acidez do sumo fica no intervalo de 0,6 a 0,9 %
(expresso como a quantidade de ácido tartárico por 100ml de sumo ou vinho). Os vinhos doces
têm acidez no intervalo de 0,4 a 0,65%. Na fabricação do vinho é importante saber a acidez
titulável do mostro para poder determinar a quantidade correta de dióxido de enxofre que será
adicionada e também decidir se é ou não necessária uma correção da acidez.

A acidez titulável do vinho é normalmente expressa em ácido tartárico % (m/v); massa

molar do C2H4O2(COOH)2 = 150,09g/mol. Lembrar que o ácido tartárico tem dois hidrogênios
tituláveis ate a viragem da fenolftaleína.

Ácido tartárico ( g/100mL) = (Vb).(C NaOH).( 150,09).(100)

(1000).2.(Vam)

onde:
Vb é o volume, em mL, da solução de NaOH usada na titulação.
C NaOH é a concentração da solução de NaOH, em mol/L.
Vam é o volume, em mL, da amostra titulada.

Esta determinação está sujeita à interferência do CO2 dissolvido. Este erro pode ser
minimizado diluindo o vinho com água quente, próximo da fervura, e depois deixando esfriar até
a temperatura ambiente antes de titular. Geralmente esse erro é pequeno.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 39

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7.1. Roteiro da Prática 8 - Determinação da acidez total de vinhos
Material Reagentes

 2 Erlenmeyers de 250 mL  Vinhos branco e tinto secos

 1 Becher de 100 mL  Água destilada
 Pipeta volumétrica de 25 mL  Solução alcoólica de fenolftaleína a 1%
 NaOH 0,1 M

Objetivo: Determinar a acidez titulável do vinho branco e tinto. O ácido tartárico expressa a
acidez titulável do vinho. Esta expressão pode ser obtida por meio de uma equação que
determina a concentração do ácido tartárico em g/mL.

7.1.1. Procedimento

 Transferir 25 mL de vinho branco seco para um erlenmeyer de 250 mL.

 Adicionar 100 mL de água deionizada e 5 gotas de solução alcoólica de fenolftaleína a
1%.
 Titular com uma solução padrão de NaOH 0,1M.
 O ponto final é indicado pela permanência de uma leve cor rósea por mais de 30
segundos.
 Repetir o procedimento acima para o vinho tinto, com o cuidado de que o ponto final é
evidenciado pelo aparecimento de uma cor cinza-esverdeada.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 40

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7.1.2.Relatório da Prática 8

Componentes do Grupo:

1) Calcule a acidez do vinho analisado.

2) Determine o erro da análise, comparando o valor obtido com o contido no rótulo.

3) Compare com os valores comerciais.

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8. Preparo de Soluções e Indicadores

 Reagente DNS
Preparar separadamente, por dissolução à quente e a agitação, as soluções abaixo:
- 10g ácido 3,5-dinitro salicílico em 200 mL NaOH 2 mol/L (fica uma massa pastosa)
- 300 g tartarato duplo de sódio e potássio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL água destilada
Misturar as duas soluções e completar o volume a 1000 mL com água destilada aquecida.

 Meio sintético YED 2%

Solubilizar em água destilada o extrato de lêvedo (1%), glicose (2%), KH2PO4 (0,2%) e
(NH4)2SO4 (0,2%)

 Indicador: 0,25 g de sal de bário do ácido 4-difenilalanina-sulfônico dissolvido, com

leve aquecimento, em 50 ml de água. Filtrar em papel de filtro faixa azul. Líquido
sobrenadante é usado.

 Solução padrão de dicromato de potássio: 8,454 g K2Cr2O7 dissolvidos em água,

completado a 250 mL.

 Solução de sulfato ferroso amoniacal: 67,55 de FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, dissolvido em

300 mL de água e 10 mL de H2SO4 concentrado. Filtrar em papel faixa azul para balão de
500 mL e completar o volume com água destilada.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 42