PUC-Rio

Departamento de Química

PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA

2018.2

Prof. FATIMA VENTURA PEREIRA MEIRELLES

0
 INFORMAÇÕES GERAIS
As aulas práticas serão ministradas da seguinte maneira (com exceção da primeira
onde serão dadas estas explicações):
1 – O roteiro da prática deverá ser lido pelo aluno com uma semana de antecedência.
2 – O professor fará a exposição dos objetivos e do desenvolvimento da prática ao final
da aula anterior.
3 – O aluno executará a prática sob a supervisão do professor. O uso do jaleco
comprido e de manga longa, calça comprida e sapato fechado cobrindo todo o
peito do pé é OBRIGATÓRIO durante as práticas. NÃO SERÁ PERMITIDA A
REALIZAÇÃO DA PRÁTICA caso qualquer uma das normas seja desobedecida.
Um técnico ou monitor estará sempre presente para auxiliar o professor e os alunos.
4 – Os alunos devem trazer para a realização da prática, além dos itens mencionados em
3, APOSTILA COMPLETA, ÓCULOS DE SEGURANÇA, CANETA (DE BOA
QUALIDADE) PARA ESCREVER EM VIDRO, CALCULADORA E RÉGUA.
5 - O aluno deverá construir os gráficos e tabelas referentes às medidas e/ou
observações feitas durante o desenvolvimento da prática, antes de sair do laboratório.
6 - O aluno que se ausentar do lab sem a autorização do professor, FICARÁ SEM NOTA
E SEM PRESENÇA. OS ALUNOS DEVERAO RUBRICAR A LISTA DE PRESENÇA
AO FINAL DA AULA, ANTES DE SAIR DO LAB
6 – Os resultados serão discutidos ao final da aula. Quando não for possível, serão
discutidos em outro momento acordado entre professor e alunos, oportuno conforme
cronograma.
7 - Os intervalos entre as medidas deverão ser utilizados para a resolução dos exercícios
propostos (ver ítem 9) ou releitura da prática seguinte.
8 - OS RELATÓRIOS deverão ser entregues na DATA e no HORÁRIO (INÍCIO OU
TÉRMINO DA AULA) marcada/o no cronograma enviado. Relatórios entregues fora
das datas e horarios previstos no cronograma somente serão corrigidos no final
do semestre, após os testes e perderão 0,5 pontos por DIA UTIL (e não aula) de
atraso.
OBS: Relatórios entregues fora deste horário atrasam a correção e a liberação das
notas de toda a turma.
9 – Estarão à disposição dos alunos, juntamente com os roteiros das práticas, as
equações das reaçoes realizadas, e outras informações necessárias a pratica, listas
de exercícios (estudos dirigidos, já mencionados anteriormente) que poderão ser
resolvidos no horário da disciplina (intervalos entre as medidas) para fixação da
matéria. As dúvidas também poderão ser sanadas nestes intervalos ou em horário
conveniente para os alunos e o professor. Os exercícios auxiliarão o aluno nos testes
sobre as práticas.
10 – As notas serão calculadas da seguinte forma (Conforme Categoria V):
G1 = prova prática (PP) (Valor: 10,0)
G2 = testes escritos sobre as práticas (T1 + T2) sendo a soma de T1 + T2 = 10,0*;
G3 = (C + MR) /2 onde C = conceito de desempenho no laboratório (assiduidade,
interesse, participação, eficiência, CALCULOS, etc), dado pelo professor com auxílio do
técnico/monitor), e MR = média dos relatórios. Ambos têm Valor 10,0
M = (G1 + G2 + G3)/3
11 – Condições de Aprovação:
M > 6,0 APROVADO SEM PROVA FINAL (PF) ou G1, G2 e G3 > 5,0
12 – A prova final podera ser prática (PP) e/ou escrita (PE) dependendo da notas dos
alunos, substituindo as notas mais baixas (G1 e G2 , respectivamente).
* a composição das notas G2 e da G3 pode ser invertida, de acordo com o cronograma

1
 ÍNDICE

A - PRÁTICAS E EXERCÍCIOS Página

1. Dosagem de proteínas pelo método do biureto....................................... 03

2. Dosagem de açúcares redutores pelo método do ácido 3,5

dinitrosalicilico.......................................................................................... 05

3. Curva de solubilidade da caseína

3.1 Em função da força iônica................................................ 07
3.2 Em função do pH.............................................................. 08

4. Lipídeos:
4.1 Purificação do azeite de oliva .......................................... 09
4.2 Determinação do teor de ácidos graxos livres no óleo de
oliva................................................................................... 10

5. Cinética enzimática: curva de progresso de reação (efeito da

concentração de substrato e determinação dos parâmetros cinéticos
km e vm)................................................................................................... 13

6. Cinética enzimática:
6.1 Efeito da temperatura...................................................... 16
6.2 Estabilidade à temperatura............................................... 17
6.3 Efeito do pH...................................................................... 18
6.4 Estabilidade ao pH........................................................... 19

7. Fermentação alcoólica............................................................................ 21

8. Reações químicas de glicídeos............................................................... 24

B - FORMULÁRIO RELATÓRIO.............................................. 27

C – REAÇÕES UTILIZADAS....................................................... 39

1 - MÉTODOS PARA ESTIMATIVA E QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

(EXEMPLOS) 39
2 - PROPRIEDADES QUÍMICAS DE GLICÍDEOS 41

D - BIBLIOGRAFIA........................................................................................ 44

2
 A - PRÁTICAS E EXERCÍCIOS
1 - DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
A - Material:
Solução de caseína – 10,0mg/mL Para otimizar o
Reagente do Biureto - sol. CuSO4 em meio alcalino tempo e garantir a
uniformidade das
Solução problema (solução caseína 10,0 a 100 mg/mL) condições
Espectrofotômetro experimentais
processe o padrão e
a amostra
B - Procedimento: desconhecida na
sequência indicada
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE PROTEÍNAS pelo professor.
Sensibilidade do método químico 1,0 - 10,0 mg de proteínas/mL
Sensibilidade da aparelhagem para este método químico: a determinar
1. Seguir o protocolo abaixo utilizando a solução padrão de caseína 10,0mg/mL.
Solução H2O Reagente Abs C
Tubo
Caseína (mL) (mL) Biureto (mL) 550nm (mg/mL)
B 0,00 2,00 8,00
1 0,40 1,60 8,00
2 0,80 1,20 8,00
3 1,20 0,80 8,00
4 1,60 0,40 8,00
5 2,00 0,00 8,00
2. Após a adição dos regentes, agitar e aguardar 30 minutos à temperatura ambiente.
3. Usando o tubo B como "Branco da reação" determinar as absorvâncias a 550nm.
4. Lançar em gráfico as leituras de absorvância x concentração de proteína.
Determinar o fator ( c/ A), para construção da melhor reta, como ensinado pelo
professor. Considere a precisão do espectrofotometro no calculo do fator
5. Construir a melhor reta de acordo com as instruções do professor.
6. Determinar os limites de sensibilidade da aparelhagem utilizada para o método do
biureto.

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DA CASEÍNA EM UMA SOLUÇÃO

PROBLEMA
Suponha que você recebeu uma amostra de uma indústria para determinar a
concentração de caseína em certo produto comercial, pelo método do biureto. Sabendo
que sua concentração está incluída na faixa de 10,0 a 100mg/mL, utilize a curva padrão
obtida, os mesmos reagentes e o mesmo espectrofotômetro. Para tal, siga os passos
abaixo:
1. Calcule as diluições que devem ser feitas para que, após a reação, as leituras das
soluções diluídas se encaixem na curva padrão construída. Escolha um número de
diluições suficientes para cobrir toda a faixa de concentração possível (10,0 a
100,0mg/mL) e que forneçam pelo menos dois resultados dentro da curva padrão.
2. Escreva como (exatamente) voce vai fazer as diluições (Ex: 1,00mL amostra + 2,00 mL
água = 1:3= diluição de 3X).
3. Prepare as soluções diluídas
4.Realize a dosagem, lembrando que o volume máximo de amostra para reagir com o
reagente do teste de biureto é de 2,00 mL.
5 – Calcule a concentração da amostra desconhecida utilizando o fator da curva padrão
estabelecido no ítem B4.
NÃO SE ESQUEÇA DE ANOTAR NO RELATÓRIO O NÚMERO DE SUA AMOSTRA.

3
 EXERCÍCIOS 1
DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO

1. Uma determinada solução contém uma mistura de glicose e proteína. Como

poderíamos dosar cada uma das substâncias?

2. Em 1,00mL de uma solução de proteína de concentração de 4,00g/L ensaiada com o

reagente de Biureto forneceu uma absorvância de 0,200. Qual será a concentração de
uma solução que apresente absorvância 0,80 utilizando-se para a dosagem 1,00mL
desta solução?

3. Deseja-se determinar o teor de proteínas num homogeneizado de células pelo

método do Biureto. Para isso tomou-se 2,00mL de homogeneizado e dilui-se a
10,00mL com água destilada. Desta solução diluída retirou-se 1,00mL para a
dosagem obtendo-se uma absorvância igual a 0,250. Qual a concentração da solução
original em mg/mL?
f = 22,0mg/mL amostra.

4. Para dosagem de uma proteina com o reagente do Biureto foi necessário

Proceder-se a diluições de modo a se ter leituras de absorvância dentro da faixa na
qual a lei de Lambert-Beer é obedecida. Assim:

a) 10,00mL da solução original foram diluidos a 50,00mL, obtendo-se a solução B.

b) 25,00mL da solução B foram diluídos a 50,00mL, fornecendo a solução C.
c) Uma aliquota de 0,500mL da solução C quando dosada pelo método do Biureto
forneceu Abs= 0,1

Sabendo-se que f=25,0mg/mL amostra, pergunta-se: qual a concentração da

solução original?

5. Podemos acompanhar o curso da hidrólise ácida (HCl 6,00M) de uma proteína por
meio de diferentes reações. Para cada tipo de reagente, teremos um tipo de curva
diferente. Trace as curvas Abs x tempo de hidrólise usando-se os seguintes métodos
de dosagem:

(1) Método do Biureto

(2) Método de Folin-Ciocalteau
(3) Método da ninidrina
(4) Absorção a 280nm
(5) Absorção a 220nm

4
 2 - DOSAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES PELO MÉTODO DO ÁCIDO ÁCIDO 3,5
DINITROSALICILICO
A - Material
Para otimizar o tempo e garantir
Solução padrão de glicose – 10,0 mol/mL. a uniformidade das condições
Solução problema - glicose 20,0-200 mM. experimentais processe o padrão
e a amostra desconhecida na
Ác. 3,5 dinitro salicílico em solução alcalina (DNS) sequência indicada pelo
Banho-maria 100,0 C professor.
Espectrofotômetro

B - Procedimento
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE GLICÍDEOS REDUTORES:
Sensibilidade do método químico 1,0 - 20,0 moles de glicose/mL
Sensibilidade da aparelhagem para este método químico: a determinar
1. Seguir o protocolo abaixo utilizando a solução de glicose 10,0 mol/mL
Solução H2O Reagente Abs C
Tubo
Glicose (mL) (mL) DNS (540nm) ( mol/mL)
B 0,00 1,00 1,00
1 0,20 0,80 1,00
2 0,40 0,60 1,00
3 0,60 0,40 1,00
4 0,80 0,20 1,00
5 1,00 0,00 1,00
2. Após a adição dos reagentes, agitar e aquecer a 100,0 C por EXATAMENTE 5
minutos, resfriar e completar o volume a 12,00 mL com água destilada.
3. Usando o tubo B como "Branco da reação" determinar as absorvâncias a 540nm
4. Lançar em gráfico as leituras de absorvância x concentração de proteína.
Determinar o fator ( c/ A), para construção da melhor reta, como ensinado pelo
professor. Considere a precisão do espectrofotometro no calculo do fator
5. Construir a melhor reta de acordo com as instruções do professor.
6. Determinar os limites de sensibilidade da aparelhagem utilizada para o método do
DNS.

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE EM UMA SOLUÇÃO

PROBLEMA
Suponha que você recebeu uma amostra de uma indústria para determinar a
concentração de glicose em certo produto comercial, pelo método do DNS. Sabendo que
sua concentração está incluída na faixa de 20,0 a 200 mol/mL utilize a curva padrão
obtida, os mesmos reagentes e o mesmo espectrofotômetro. Para tal, siga os passos
abaixo:
1 – Calcule as diluições que devem ser feitas para que, após a reação, as leituras das
soluções diluídas se encaixem na curva padrão construída. Escolha um número de
diluições suficientes para cobrir toda a faixa de concentração possível (20,0 a 200
mol/mL) e que forneçam pelo menos dois resultados dentro da curva padrão.
2 – Escreva como (exatamente) voce vai fazer as diluições (Ex: 1,00mL amostra + 2,00
mL água = 1:3= diluição de 3X)
3 – Prepare as soluções diluídas
4 – Realize a dosagem, lembrando que o volume máximo de amostra para reagir com o
reagente do teste do DNS é de 1,00 mL.
5 – Calcule a concentração da amostra desconhecida utilizando o fator da curva padrão
estabelecido no ítem B4.
NÃO SE ESQUEÇA DE ANOTAR NO RELATÓRIO O NÚMERO DE SUA AMOSTRA.

5
EXERCÍCIOS 2: DOSAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES PELO MÉTODO DO ÁCIDO
3,5 DINITROSALICILICO

1. De posse de uma solução de glicose de concentração 22,5 mg/mL, qual é a diluição

que se deve fazer para que 1,00 mL desta solução dê uma absorvância de 0,4
quando dosada pelo método do ácido 3,5 dinitro salicílico?
f = 12,5 moles/mL de amostra; PM glicose = 180,00g.
2. Com objetivo de determinar o grau de pureza de uma maltose comercial, 2,00 mL de
uma solução de concentração 150 mg/mL foram diluídos a 120,00 mL e desta
diluição, tomaram-se duas alíquotas de 1,00 mL, em duplicata, para a dosagem com
DNS.
Alíquota Volume Abs (540nm)
A 1,00mL 0,51
B 1,00mL 0,49
Com base nos resultados da tabela acima, calcule o grau de pureza desta maltose
comercial. f = 12,5 moles/mL de amostra; PM maltose = 342,00g.
3. Em 5,00 mL de uma solução A de glicídeo redutor foram diluídos a 20,00 mL com
água destilada, originando a solução B. 0,20mL desta solução B, após reação com
DNS apresentou uma absorvância igual a 0,300. Pede-se a concentração de A
em mol/mL, sabendo-se que 1,00 mL da solução do mesmo glicídio de concentração
4,00 oles/ mL forneceu uma absorvância igual a 0,500.
4. Alíquotas colhidas após 60 e 90 minutos de crescimento de células de levedura em
meio contendo glicose foram ensaiadas para verificação do consumo de glicídios. Ao
fazer a dosagem do sobrenadante com DNS, foi perdido o branco de reação. Se
não fosse possível fazer outro branco por falta de reagente, como verificar se houve
consumo de glicose no intervalo considerado?
5. A concentração de uma solução de glicose é de 1,0000 mol/100mL. Que diluição
deverá ser feita para que 1,00 mL da solução resultante contenha 1,00 mmol?
6. Para dosagem de uma solução de maltose de concentração desconhecida foi
necessário proceder-se a diluições de modo a se ter leituras de absorvância dentro
da faixa de obediência à lei de Lambert-Beer. Assim:
a) tomou-se 4,00 mL da solução e diluiu-se em balão aferido a 100,00 mL, obtendo-se
a solução B.
b) 10,00 mL da solução B foram diluídos a 25,00 mL obtendo-se a solução C.
c) da solução C retirou-se uma aliquota de 0,40 mL para dosagem de maltose com o
reagente de DNS; e obteve-se uma absorvância, em 540 m, igual a 0,3.
Qual será a concentração em mg/mL da solução original, sabendo-se que o PM da
maltose é 342,00g? Expresse o resultado também em molaridade. f=12,0 mol/mL de
amostra.
7. Uma solução de glicose foi preparada de modo que 45,000 mg do glicídio foram
solubilizados num volume final de 10,00 mL. A que volume devem ser diluídos estes
10,00 mL de modo que uma alíquota de 1,00 mL da solução diluída forneça Abs =
0,250 quando dosada pelo método do DNS? f = 10,0 moles/mL de amostra e PM
glicose = 180,00g.
8. Em 1,00 mL de uma solução A de glicose de concentração 150,0 mol/10mL foi
ensaiada pelo método apropriado fornecendo Abs de 0,900. Qual será a concentração
de uma solução B que apresenta uma abs de 0,300 utilizando-se para dosagem 1,00
mL de solução. Dê a resposta em mol/mL.

6
 3 - CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASEÍNA:
3.1- EM FUNÇÃO DA FORÇA IÔNICA

A - Material:
Solução de caseína 0,300g% em acetato de sódio 0,100M Lembre-se que a
Ácido acético 0,100M turbidez se relaciona de
forma inversa à
Sulfato de magnésio 1,25M solubilidade
Espectrofotômetro
Becher com água (para lavar)
Becher (para recolher)

B - Procedimento
1. Calcular a força iônica em cada tubo, como ensinado anteriormente, sabendo que
= ½ ci . zi2
2. Numerar os tubos de ensaio e proceder segundo o quadro abaixo:

Tubo B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MgSO4
--- --- 0,10 0,30 0,60 0,80 1,00 1,50 2,00 3,50 4,00
1,25M (mL)
Ác. Acético
--- 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
0,100M (mL)
H2O dest.
5,00 4,00 3,90 3,70 3,40 3,20 3,00 2,50 2,00 0,50 ---
(mL)
Força iônica,
(M)
Abs (570nm)
Log (1/Abs)
(570nm)

3. Adicionar 0,50mL da solução de caseina em acetato de sódio no tubo 1, agitar e ler a

turbidez em 570nm, IMEDIATAMENTE, conta o branco (tubo B).
4. Repetir o procedimento para os demais tubos.
5. Lançar em gráfico o logarítimo do inverso da turbidez (absorvância) contra a força
iônica.
6. Analisar o gráfico obtido indicando as regiões de "salting in" e "salting out".

EXERCÍCIOS 3.1: CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASEÍNA EM FUNÇÃO DA FORÇA

IÔNICA
1. Uma albumina apresentou as curvas de
solubilidade lançadas em gráfico para S C1
três concentrações iônicas.
C2
C1 C2 C3.
C3
Qual o fenômeno observado? Justifique.

pH
2. Defina “salting in” e “salting out”.

7
 3 - CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASEÍNA:
3.2 - EM FUNÇÃO DO pH

A - Material
Solução de caseína 0,300g% em acetato de sódio 0,100M
Ácido acético 0,100M
Ácido acético 1,00M
Espectrofotômetro
Becher com água (para lavar)
Becher (para recolher)
B - Procedimento
1. 1. Calcular o pH em cada tubo, como ensinado anteriormente, sabendo que o ácido
acético é um ácido fraco (pKa = 4,76), que no tubo ele estará diluido e que o ph pode
ser calculado pela equação de Henderson-Hasselbach: pH = pKa + log ([A-]/{HA])
2. Numerar tubos de ensaio e proceder segundo o quadro abaixo.
Tubo B 1 2 3 4 5 6 7
H2O dest. (mL) 5,00 4,40 4,30 4,00 3,50 2,50 0,50 3,90
Ác. Acético
--- 0,10 0,20 0,50 1,00 2,00 4,00 ---
0,100M (mL)
Ác. Acético
--- --- --- --- --- --- --- 0,60
1,00M (mL)
pH
Abs (570nm)

3. Adicionar 0,50mL da solução de caseína em acetato de sódio no tubo 1agitar e ler a

turbidez em 570nm, IMEDIATAMENTE, contra o branco (tubo B).
4. Repetir o procedimento para os demais tubos
5. Lançar em gráfico a absorvância contra o pH.
6. Analisar o gráfico obtido indicando a faixa onde se situa o pI da caseína.

EXERCÍCIOS 3.2
CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASEÍNA EM FUNÇÃO DO pH

1. Duas proteínas A e B apresentaram as curvas 2. A curva de solubilidade de uma

de solubilidade x pH representadas abaixo. proteína A em função do pH é a
Escolha um pH onde as proteínas A e B seguinte:
migrarão para polos opostos quando
S
submetidas a um campo elétrico.

S
A B
4 6 pH

Qual seria o comportamento da

mesma proteína quando
pH submetida a um campo
elétrico em tampão pH=7,0?

8
 4- LIPÍDEOS
4.1 PURIFICAÇÃO DO AZEITE DE OLIVA

A – Material

Coluna cromatográfica
Alumina neutra
Éter etílico
Éter de petróleo
Azeite de oliva
Agitador magnético

B – Procedimento

1. Pesar, aproximadamente, 10,000g de alumina neutra.

2. Preparar uma suspensão de alumina neutra em uma mistura de solventes (éter etílico /
éter de petróleo 1:10).

3. Verter esta suspensão na coluna cromatográfica, afim de que se tenha uma coluna
recheada sem bolhas e sem rachaduras e com aproximadamente 2,00 mL do líquido no
topo. Esta servirá como uma coluna de adsorção de ácidos graxos livres, presentes no
azeite de oliva.

4. Revestir a coluna com papel alumínio para protegê-la da luz. O azeite de oliva pode
sofrer fotooxiredução.

5. Preparar 50,00 mL de uma solução a 50,00% (p/v) de azeite de oliva em uma mistura
de éter etílico e éter de petróleo (1:10).

6. Aplicar com cuidado diretamente na coluna.

7. Coletar o azeite de oliva proveniente da coluna sob agitação, ao abrigo da luz, para
evaporação do solvente.

8. Deixar evaporar até desaparecer o odor do solvente.

9. Guardar o óleo purificado em frasco escuro e/ou revestido com papel alumínio e
protegido da luz, para a quantificação dos ácidos graxos.

9
 4- LIPÍDEOS
4.2- DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES NO ÓLEO DE OLIVA

A – Material

Solução de NaOH 0,0100 M

Fenolftaleína 0,100%
Biftalato de Potássio 0,0500 M
Etanol
Bureta 50,00 mL
Erlenmeyer
Chapa de aquecimento
Termômetro

B – Procedimento

PADRONIZAÇÃO DO NaOH
1. Em um erlenmeyer pequeno colocar 3,00 mL de biftalato de potássio (0,0500M). Fazer
em duplicata.
2. Adicionar 1 gota de fenolftaleína 0,100%, em cada um dos erlenmeyers.
3. Titular as duas amostras com NaOH 0,0100M e anotar os volumes.
4. Titular um branco da amostra (com água destilada).

OBS: A padronização deve ser feita sempre no dia da dosagem.

Erlenmeyer Vbiftalato (mL) M biftalato (M) VNaOH (mL) MNaOH (M)

2
Branco da
padronização

TITULAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS NO ÓLEO DE OLIVA (BRUTO E PURIFICADO)

1. Em um erlenmeyer pequeno colocar, medindo na balança, 10,000 g de óleo de oliva

(±11,00 mL) e dissolver em 10,00 mL de etanol.

2. Levar a mistura etanol-óleo ao aquecimento com manutenção da temperatura a 60,0-

65,0°C por 10 minutos.

3. Resfriar até a temperatura ambiente.

4. Adicionar 2-3 gotas de fenolftaleína 0,100%.

5. Titular contra NaOH 0,0100M, sob agitação vigorosa, duas amostras.

10
 PREPARO DO BRANCO DO ENSAIO

1. Em um erlenmeyer pequeno colocar 11,00 mL de água destilada e 10,00 mL de

etanol.

2. Levar a mistura ao aquecimento com manutenção da temperatura a 60,0-65,0°C por

10,00 minutos.

3. Resfriar até a temperatura ambiente.

4. Adicionar 2-3 gotas de fenolftaleína 0,100%.

5. Titular contra NaOH 0,0100M, sob agitação vigorosa, duas amostras.

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES (%)

Para o cálculo da % de ácidos graxos livres utilize os dados da tabela:

VNaOH (mL) VNaOH (mL)

Erlenmeyer V (mL)
Titulação da amostra Titulação do branco

1
2

Dados: m óleo= _____ g.

Mol médio dos AG = 276,00.

1. Calcular a % de ácidos graxos livres no óleo de oliva purificado e comparar com o

valor obtido para o bruto.

2. Discutir os resultados.

3. Utilizar os resultados de outro grupo para verificar o efeito (se é que há) do tamanho
da coluna.

11
 EXERCÍCIOS 4.1: PURIFICAÇÃO DO AZEITE DE OLIVA

1. Em que princípio(s) se baseia a cromatografia de adsorção?

2. Pesquise a composição do azeite de oliva.

3. Descreva o que acontece com os componentes do óleo de oliva durante sua passagem
na coluna de adsorção.

EXERCÍCIOS 4.2: DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES NO

ÓLEO DE OLIVA

1. Defina titulação.

2. O que se espera encontrar quando compararmos o teor de ácido graxo encontrado no

óleo purificado com o do óleo bruto?

3. Para que serve o branco?

4. Suponha que você dosou o teor de ácidos graxos em 5 produtos comerciais (brutos).
Considerando as informações abaixo e outras que você pesquisou, responda o que se
pede:

A B C D E
ÁCIDO
1,00 0,50 0,20 0,050 0,025
GRAXO (%)
a. Qual é a importância dos ácidos graxos no azeite de oliva?
b. Qual dos produtos (A – E) deve ser o mais agradável para o consumo?

12
 5- CINÉTICA ENZIMÁTICA: CURVA DE PROGRESSO DE REAÇÃO (EFEITO DO
TEMPO E DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO E DE ENZIMA)

A - Material:
Sacarose (DIFERENTES CONCENTRAÇÕES, variando de 0,0200 a 0,200M)
Invertase (DUAS CONCENTRAÇÕES DIFERENTES em mg% preparada em tampão
acetato de sódio 0,0500M pH 4,7)
Tampão acetato de sódio 0,0500M - pH 4,7
Ác. 3,5 dinitro salicílico em solução alcalina (DNS)
Banho-maria 100,0 C
Espectrofotômetro
Solução padrão de glicose 10,00 mol/mL

B - Procedimento

1. Calcular as concentrações de E e S reais (no meio reacional), antes da aula conforme

cronograma
2. Numerar 9 tubos de ensaio de 1 a 9. Adicionar a cada um deles, 1,00 mL de DNS.
3. Em um erlenmeyer, colocar 8,00 mL de tampão acetato de sódio 0,0500M pH 4,7 e
5,00mL de sacarose xM (o professor dará a cada grupo uma concentração diferente).
4. Adicionar ao erlenmeyer 2,00 mL de invertase na concentração de y 1mg% (E1).
Homogeneizar. Anotar IMEDIATAMENTE a hora.
5. Após 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 45 e 60 minutos retirar 1,00 mL da mistura reacional e
colocar estas aliquotas nos tubos de ensaios correspondentes (vide 1).
6. Fazer um branco de reação (entre os 45 e 60 minutos) para cada concentração de
enzima, na forma e na ordem indicada (Este branco servirá como tempo zero de
reação): 1,00mL DNS + 0,33 mL sacarose + 0,54mL tampão + 0,13 mL invertase.
7. Após ter sido retirada a aliquota correspondente ao tempo 60 minutos, proceder à
reação do DNS, incubando os tubos por 5 minutos a 100,0 C.
8. Resfriar e completar a 12,00 mL com água destilada. Homogeneizar. Ler as abs em
540nm.
9. Anotar os resultados e mostrar ao professor para completar a tabela de resultados
diretamente no computador
OBS: O cálculo do produto formado em mol/mL deve ser feito utilizando o fator
obtido para a curva padrão do DNS

10. Copiar no pendrive o resultado da turma para elaboração do relatório

11. Lançar em gráfico produto formado X tempo para uma mesma [E] e [S] distintas.
12. Lançar em gráfico produto formado X tempo para uma mesma [S] e [E] distintas
13. Selecionar no gráfico, [P] x t com diferentes [S] e [E] fixa, o intervalo de tempo em que
a velocidade se mantém constante em todos os casos, e calcular a velocidade inicial
da reação para cada [S].
14. Construir os gráficos de v x [S] e 1/v x 1/[S]
15. Determinar Vm e KM pelos dois graficos e discutir comparativamente os resultados.
16 Calcular as atividades da enzima para cada caso (E1 e E2, para uma [S] fixa).

U total U/mL meio reaconal U/mL enzima U/mg enzima

E1
E2

13
 EXERCÍCIOS 5: CINÉTICA ENZIMÁTICA

1. Um volume de 0,50mL de uma solução de sacarose 0,100M foi incubado com 0,40mL
de tampão acetato 0,0500M pH 4,7 e 0,10mL de uma solução de invertase. Após 30 e
45 minutos tomaram-se alíquotas de 0,20 mL para dosagem dos açúcares redutores
pelo método do DNS. As absorvâncias obtidas foram:
30 minutos = 0,200 45 minutos = 0,200
OBS: 0,50mL de uma solução padrão de glicose 20,0 mM forneceu uma absorvância de 0,3.
Pergunta-se:
a - Qual a porcentagem de sacarose hidrolisada?
b - Por que a curva de progresso de reação entrou em platô antes de toda a sacarose ser
hidrolisada?

2. Identifiquem no gráfico as curvas referentes ao: a – substrato, b – produto, c -

complexo ES.
[ ]

tempo
3. Como podemos acompanhar o progresso de uma reação enzimática?

4 - Num ensaio para determinação dos parâmetros cinéticos da reação entre uma enzima
E e um Substrato S, a seguinte sequência experimental foi seguida (o produto é um
glicídio redutor).

Reagentes Tubos (concentração de substrato em mol/L)

B 0,02 0,03 0,05 0,10 0,20
Água 1,00 --- --- --- --- ---
Tampão --- 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40
Substrato --- 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
Enzima --- 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10
AGUARDAR 5 MINUTOS À TEMPERATURA AMBIENTE
DNS 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Aquecer a 100,0 C por 5 minutos, resfriar, completar com água destilada a 12,00mL e ler
a Abs a 540nm
As Abs obtidas quando o experimento foi realizado em diferentes tempos encontram-se a
seguir:
[S]
0,02M 0,03M 0,05M 0,10M 0,20M
t(min)
1 0,105 0,025 0,040 0,045 0,050
2 0,035 0,050 0,075 0,105 0,105
3 0,050 0,075 0,105 0,165 0,170
4 0,070 0,105 0,150 0,215 0,215
5 0,090 0,130 0,190 0,280 0,270
8 0,190 0,210 0,300 0,435 0,435
f = 10,26 mol/mL

14
Estudos prévios mostraram que em 5 minutos de reação as condições iniciais eram
mantidas. A concentração de enzima usada foi de 0,05 mg% em todos os tubos. Pede-se:
a - Construir as curvas de progresso de reação para todas as [S] utilizadas.
b - Estimar VM e KM pela curva v x [S] considerando os valores obtidos em 5 min.
c - Calcular os parâmetros cinéticos pela curva 1/v x 1/[S] considerando os valores obtidos
em 5 minutos.
d - Verificar a impropriedade do uso dos valores obtidos no item b.
e - Qual é a importância do KM?
f - O que seria de se esperar para KM e VM se a concentração de enzima fosse dobrada?

15
 6– CINÉTICA ENZIMÁTICA:
6.1 - EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE DA ENZIMA

A - Material
Sacarose.............M
Invertase........ mg% em tampão acetato de sódio 0,0500 M pH 4,7.
Tampão acetato de sódio 0,0500M pH 4,7
Ác. 3,5 dinitro salicílico em solução alcalina (DNS)
Cuba de gelo
Banhos a 0,0, 55,0 e 100,0 C
Espectrofotômetro

B - Procedimento:

1. Seguir o protocolo abaixo

Água Sacarose Tampão

Tubo
(mL) _____ M (mL) (mL)
B 0,20 0,50 0,30
1 --- 0,50 0,30
2 --- 0,50 0,30
3 --- 0,50 0,30
4 --- 0,50 0,30

2. Colocar os tubos 1, 3 e 4 nos banhos a (0,00; 55,0 e 100,0 C respectivamente; colocar

o tubo 2 a temperatura ambiente (medindo esta temparatura também). Esperar o
sistema atingir a temperatura desejada (5 minutos)
3. Adicionar 0,20 mL de invertase aos tubos 1, 2, 3 e 4. Homogeneizar. Anotar
IMEDIATAMENTE a hora.
4. Após exatamente 5 minutos adicionar 1,00 mL de DNS, inclusive no branco.
5. Transferir todos os tubos para o banho a 100,0 C e marcar 5 minutos.
6. Resfriar e completar a 12,00 mL com água destilada. Homogeneizar. Ler as abs em
540 nm.
7. Anotar os resultados na tabela abaixo.

Temperatura Abs Produto Velocidade

Tubo
(°C) 540nm ( mol/mL) ( mol/mL.min)
1
2
3
4
OBS: O cálculo do produto formado em mol/mL deve ser feito utilizando o fator obtido
para a curva padrão do DNS.

8. Coletar os resultados dos demais grupos

9. Lançar em gráfico a velocidade de reação x temperatura e determinar a temperatura
ótima para esta reação.

16
 6 – CINÉTICA ENZIMÁTICA:
6.2 - ESTABILIDADE À TEMPERATURA

A - Material
Sacarose.............M
Invertase........ mg% em tampão acetato de sódio 0,0500 M pH 4,7.
Tampão acetato de sódio 0,0500M pH 4,7
Ác. 3,5 dinitro salicílico em solução alcalina (DNS)
Cuba de gelo
Banhos a diferentes temperaturas (geralmente 0,0, 55,0 e 100,0 C)
Espectrofotômetro

B - Procedimento:

1. Seguir o protocolo abaixo

Água Tampão
Tubo
(mL) (mL)
B --- 0,50
1 --- 0,50
2 --- 0,50
3 --- 0,50
4 --- 0,50
2. Homogeneizar. Colocar os tubos 1 a 4 no banho a Temperatura desejada ( _____ C).
3. Ligar o cronômetro, adicionar a invertase, a sacarose e o DNS nos tempos indicados
na Tabela abaixo.
Tempo de adição ~ (min)
Tubo
Invertase (0,20mL) Sacarose (0,30mL) DNS (1,00mL)*
1 1 16 21
2 2 12 17
3 3 8 13
4 5 6 11
* colocar o tubo a T ambiente

4. Ao término da cinética, adicionar 1,00mL DNS no tubo do branco, adicionar 0,30 mL de

sacarose e esperar exatamente 5 min para adicionar a invertase (0,20mL).
5. Transferir todos os tubos para o banho a 100,0 C e marcar 5 minutos.
6. Resfriar e completar a 12,00 mL com água destilada. Homogeneizar. Ler as abs em
540nm
7. Anotar os resultados na tabela abaixo.
Tempo de
Abs Produto Velocidade
Tubo incubação
540nm (_______) (__________)
(min)
1
2
3
4
OBS: O cálculo do produto formado em mol/mL deve ser feito utilizando o fator obtido
para a curva padrão do DNS.
8. Coletar os resultados dos demais grupos
9. Lançar em gráfico a velocidade de reação x tempo e determinar a temperatura onde a
enzima apresentou a maior estabilidade.

17
 6 – CINÉTICA ENZIMÁTICA:
6.3 - EFEITO DO pH NA ATIVIDADE DA ENZIMA

A - Material

Sacarose..........M
Invertase.......... mg%
Tampão citrato fosfato pH 2,6; 3,6 ; 4,6; 5,6; 7,0
Ác. 3,5 dinitro salicílico em solução alcalina (DNS)
Espectrofotômetro

B - Procedimento

1. Seguir o protocolo abaixo.

Invertase Tampão
Tubo pH
(mL) 2,6 3,6 4,6 5,6 7,0
1 0,20 0,30 --- --- --- ---
2 0,20 --- 0,30 --- --- ---
3 0,20 --- --- 0,30 --- ---
4 0,20 --- --- --- 0,30 ---
5 0,20 --- --- --- --- 0,30

2. Colocar 0,50 mL de sacarose em cada tubo e marcar a hora IMEDIATAMENTE.

Homogeneizar.
3. Após exatamente 5 minutos adicionar 1,00 mL de DNS em cada um dos tubos e
homogeneizar.
4. Transferir todos os tubos para o banho a 100,0 C e marcar 5 minutos.
5. Resfriar e completar a 12,00 mL com água destilada. Homogeneizar. Ler as abs em
540 nm.
OBS: Fazer um branco de reação obedecendo a seguinte ordem:
1,00mL DNS + 0,33mL sacarose + 0,54 mL tampão + 0,13 mL invertase
6. Anotar os resultados na tabela abaixo.

Abs Produto Velocidade

Tubo pH
(540nm) ( _______ ) ( _______ )
1
2
3
4
5
OBS: O cálculo do produto formado em mol/mL deve ser feito utilizando o fator obtido
para a curva padrão
.
7. Coletar os resultados dos demais grupos
8. Lançar em gráfico a velocidade x pH e determinar o pH ótimo para esta enzima.

18
 6 – CINÉTICA ENZIMÁTICA:
6.4 - ESTABILIDADE AO pH

A - Material

Sacarose..........M
Invertase.......... mg%
Tampão citrato fosfato pH 2,6; 3,6 ; 4,6; 5,6; 7,0
Ác. 3,5 dinitro salicílico em solução alcalina (DNS)
Espectrofotômetro

B - Procedimento

1. Adicionar 0,50 mL de tampão em 6 tubos (B, 1, 2, 3, 4, 5).

2. Adicionar a invertase, a sacarose e o DNS nos tempos indicados na Tabela abaixo.

Tempo de adição ~ (min)

Tubo
Invertase (0,20mL) Sacarose (0,30mL) DNS (1,00mL)*
1 1 21 26
2 2 17 22
3 3 13 18
4 4 9 14
5 5 6 11
* colocar o tubo a T ambiente

3. Ao término da cinética, adicionar ao tubo do branco (B) 1,00mL DNS, 0,30 mL de

sacarose e adicionar a invertase 0,20mL.
4. Transferir todos os tubos para o banho a 100,0 C e marcar 5 minutos.
5. Resfriar e completar a 12,00 mL com água destilada. Homogeneizar. Ler as abs em
540nm
6. Anotar os resultados na tabela abaixo.

Abs Produto Velocidade

Tubo pH
(540nm) ( _______ ) ( _______ )
1
2
3
4
5
OBS: O cálculo do produto formado em mol/mL deve ser feito utilizando o fator obtido
para a curva padrão do DNS.

7. Coletar os resultados dos demais grupos

8. Lançar em gráfico velocidade de reação x tempo e determinar o pH onde a enzima
apresentou a maior estabilidade.

19
 EXERCÍCIOS 6.1 - 6.2
CINÉTICA ENZIMÁTICA: EFEITO DA TEMPERATURA

1. Um técnico, a quem se pediu para determinar os parâmetros cinéticos de uma

enzima E atuando sobre o substrato S, fez todas as determinações das velocidades
dosando o produto formado em 20 minutos de reação. Ensaios prévios da enzima
forneceram os seguintes resultados:

Tempo de incubação (min) 0 5,00 10,0 20,0 30,0 45,0

mol produto formado 0 3,00 6,00 8,70 10,20 11,40

Pergunta-se:

a - Foi cometido algum erro pelo técnico ? Explique e sugira a correção.

b - Aproximadamente, até que tempo de reação a concentração de ES permanece
constante?
c - Determine a velocidade inicial para a concentração de substrato testada.
d - Trace o gráfico v x t e P x t

2. Uma enzima E teve sua atividade testada em diferentes temperaturas por diversos
pesquisadores. Todas as determinações foram feitas com uma mesma
concentração de substrato inicial e dentro da faixa de velocidade inicial, embora
cada pesquisador empregasse tempos diferentes.
Determinar, a partir dos dados abaixo, a temperatura ótima de ação da enzima.

T de incubação (°C) 5 15 25 35 45 55 65
Tempo de incubação (min) 2,0 4,0 10,0 3,0 5,0 4,0 10,0
mol produto formado 0,40 8,0 44,0 19,5 26,5 12,5 15,0

EXERCÍCIOS 6.3 – 6.4

CINÉTICA ENZIMÁTICA: EFEITO DO pH

1. Qual deve ser o perfil esperado para a velocidade de uma reação enzimática em
função do pH?

2. Explique o perfil acima, em todas as regiões de pH.

3. O que significa o termo pH ótimo de uma enzima?

4. Diferencie atividade enzimática e estabilidade enzimática.

20
 7 - FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

A - Material

Mosto utilizado: diferentes para cada grupo)

Agente fermentativo: Fermento – suspensão 67,00% (peso úmido/volume).
Ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS) em solução alcalina
Solução padrão de dicromato de potássi
H2SO4 concentrado
H3PO4 a 85,00%
Indicador de sal de Bário
Solução de Sulfato ferroso Amoniacal
Banho-maria
Balança
Centrífuga
Destilador
Espectrofotômetro

B - Procedimento

FERMENTAÇÃO

NÃO SE ESQUECER DE IDENTIFICAR AS AMOSTRAS COM O NOME DOS

COMPONENTES DO GRUPO. OS FRASCOS SERÃO GUARDADOS NO
CONGELADOR.

1 Pesar o erlenmeyer de 250,00mL contendo o meio de cultura. m1 = ____________

2 Retirar uma alíquota de 5,00mL para um frasco âmbar pequeno, identificar como (T0)
e congelar para posterior quantificação de glicose. Medir massa do sistema
m2 = ____________
3 Adicionar __________ mL de uma suspensao celular de _________% (m.u/v) de
células. Agitar e anotar o tempo. Pesar rapidamente o frasco. m3 = _______________
4 Enquanto isso, o mosto inoculado é deixado sob agitação ou não a ________°C,
(conforme indicação do professor).
5 Após 1,5 hora de fermentação agitar bem, abrir o frasco para total desprendimento do
CO2 e pesar o conjunto. m4 = _______________ .
6 Centrifugar cerca de 30,00mL do meio fermentado e separar o sobrenadante. Caso o
sobrenadante permaneça turvo, centrifugar novamente.
7 Calcular a quantidade de CO2: m = ____________ n = ______________
8 Do sobrenadante, separar 25,00mL em frasco pequeno âmbar com identificação para
destilação e cerca de 5,00mL em outro frasco pequeno âmbar com identificação (T60)
9 Congelar o frasco pequeno (T60) para posterior quantificação de glicose.
10 Calcular a concentração teórica de glicose (to = momento em que a celula encontra o
substrato)
11 Fazer os cálculos da diluição necessária para dosagem de glicose (t0 e t60) na aula
seguinte e entregar ao professor

DOSAGEM DA GLICOSE DOS MEIOS FERMENTADOS

1. Considerando a concentração inicial de glicose presente, diluir uma alíquota dos

sobrenadantes (T0 e T60), se necessário, e determinar a quantidade de glicose
21
 consumida pelo método do DNS, usando o fator da curva padrão previamente
construída. NÃO ESQUECER DE FAZER O BRANCO.
Experimento Tempo Abs Fator Diluição Vi:Vf [glicose] Média
(ex: M1I1V1)
T0

T60
glicose consumida = ___________________

DESTILAÇÃO DO ÁLCOOL

1 Transferir 10,00mL do sobrenadante (frasco separado para destilação na aula

passada) e colocar no compartimento para amostra do destilador.
2 Adicionar em seguida 10,00mL de água destilada e 0,50mL de NaOH 0,100M (o
hidróxido de sódio é colocado para evitar a destilação de álcoois superiores).
3 Fechar o sistema e recolher os 8,00mL iniciais do destilado que conterão todo o etanol
presente na amostra. Completar este volume a 10,00mL com exatidão.
4 Reservar e identificar o destilado em um frasco pequeno âmbar.
5 Armazenar no congelador.

DOSAGEM DO ETANOL PELO MÉTODO DO DICROMATO

1 Adicionar 10,00mL da solução de dicromato de potássio em dois erlenmeyer,

adicionando-se em seguida, 5,00mL de H2SO4 concentrado, resfriando-se em água de
bica corrente.
2 Colocar em cada frasco 2,50mL e 1,00mL do destilado (obtido na aula passada) e
completar o volume a 5,00mL de água.
3 Agitar e aguardar em repouso durante 15 minutos para o etanol ser quantitativamente
levado a ácido acético.
4 Após os 15 minutos, adicionar 165,00mL de água destilada, 18,00mL de ácido
fosfórico e 0,50mL da solução do Indicador.
5 Titular com sulfato ferroso amoniacal até a cor da solução mudar para verde e anotar o
volume consumido (Vensaio).
6 Para o ensaio em branco, adicionar 5,00mL de água destilada em lugar da amostra e
repetir o procedimento. Anotar o volume consumido (Vbranco).
7 Calcular a porcentagem em volume de etanol produzido, pela formula:
sendo D = 10 ou 4 para aliquotas de 1,0 ou
2,5 mL de
destilado, respectivamente
8 Montar uma tabela que contenha os resultados obtidos para as diferentes condições
(diferentes grupos)
Experimento Vol. Titulado % EtOH Vol. Titulado % EtOH [EtOH]
(1mL) (1mL) (2,5mL) (2,5mL) médio
M1I1V1
9 Deduza a equação acima
10 Fazer o balanço de massa calculando quantidade de etanol produzida em função da
glicose cosumida (dosada anteriormente) e, se possível, calcular o rendimento e a
eficiência da fermentação.
11 Discutir os resultados comparativamente destacando o efeito de cada um dos
parâmetros investigados na produção de etanol
12 Concluir o relatório dizendo qual a condição que gerou mais etanol , qual o parametro
que mais influenciou e qual o que menos influenciou o processo.
22
 EXERCÍCIOS 7

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

1. Qual a diferença entre fermentação e respiração?

2. Em relação à via glicolítica, que se passa em anaerobiose, como se justifica a

necessidade da ocorrência de fermentações a partir do piruvato (fermentações lática e
alcoólica, por exemplo)?

3. Deseja-se fabricar vinho. Dispõe-se de dois vasilhames de mesmo volume, mas de

diferentes dimensões:
(a) 0,1m2 de base / 5 cm de altura
(b) 0,02m2 de base / 25 cm de altura
Qual dos dois seria mais apropriado para este tipo de fermentação? Justifique a resposta.

4. Sabendo-se que células de leveduras em anaerobiose são capazes de transformar

90,00% de glicose em etanol, qual a quantidade de glicose consumida e de etanol
produzido, quando este processo resulta na produção de 112,00mL de CO 2? Considerar
que 1 mol de CO2 ocupa um volume de 22,40L.

5. Células de S. Cerevisiae foram inoculadas em um meio contendo glicose 2,00%

resultando um volume final de 100,00mL. Após 60 minutos o meio foi centrifugado e o
sobrenadante diluído 20 vezes. Alíquotas de 0,50mL foram utilizadas para a dosagem de
glicose residual pelo método do DNS e forneceram uma absorvância média de 0,25 (f =
10,0 mol/mL). No tempo em que a fermentação se processou a produção de CO 2 foi de
800 moles.
Pergunta-se:
a) qual a porcentagem de glicose consumida?
b) qual o rendimento da fermentação?

23
 8 – PROPRIEDADES QUÍMICAS DE GLICÍDEOS

ANOTAR TODOS OS RESULTADOS E OBSERVAÇÕES NA TABELA E ANEXAR A

TABELA AO RELATÓRIO
A - Material

Solucão de glicídios (maltose, glicose, sacarose) na concentração 0,100M.

Suspensões de dextrina 0,50%, carboximetil celulose (CMC) 0,50%,amido 0,50%.
Solução de ácido glutâmico 0,100M.
Reagente de Antrona: Antrona em H2SO4 concentrado.
Reagente de Bial: orcinol em HCl concentrado.
Reagente de Seliwanoff: resorcinol em HCl.
Reagente de Benedict: CuSO4 em meio alcalino.
Solução de Lugol: l 2 e l-.
Banho-maria a 100,0 oC.

B - Procedimento:

Teste da Antrona

1. Em tubos de ensaio colocar 0,20mL das soluções a serem testadas.

2. Fazer um branco de reação com 0,20mL de água destilada.
3. Adicionar cuidadosamente 1,00mL do reagente de antrona.
4. Fazer o teste com soluções de glicose 0,100M, sacarose 0,100M, ácido glutâmico
0,100M, amido 0,70%, CMC 0,50%, frutose 0,100M e celulose (papel).
A reação é praticamente imediata e o teste é considerado positivo se apresentar
cor verde intensa.

OBSERVAR: a) com que glicídio aparece mais rapidamente a cor verde.

b) em que tubo a coloração verde é mais intensa.
c) o aquecimento provocado pela diluição de H 2SO4 na água
tocando cuidadosamente a base dos tubos.
Anotar os resultados em função da velocidade da reação.
Ex: +++ para reações muito rápidas;
++ para reações rápidas;
+ para reações lentas;
- para ausência de reação

Teste de Seliwanoff

1. Em tubos de ensaio colocar 0,20mL das soluções a serem testadas.

2. Fazer um branco de reação com 0,20mL de água destilada.
3. Adicionar 1,00mL do reagente de Seliwanoff.
4. Aquecer em banho-maria a 100,0 oC por 3 minutos.
5. Fazer o teste com soluções de glicose 0,100M, frutose 0,100M, sacarose 0,100M e
maltose 0,100M.
O teste é considerado positivo se apresentar a cor vermelha.
OBSERVAR:
a) em que tubos aparecem a cor e o tempo necessário para que isso ocorra.
b) a coloração obtida nos outros tubos.
Considerar o aparecimento da cor em função do tempo, como no teste anterior.
24
 Teste de Bial

1. Em tubo de ensaio colocar 0,50mL das soluções a serem testadas.

2. Fazer um branco de reação com 0,50mL de água destilada.
3. Adicionar 1,00mL do reagente de Bial.
4. Aquecer em banho-maria a 100,0 oC por 2 minutos.
5. Fazer o teste com soluções de glicose 0,100M e arabinose 0,100M,
O teste é considerado positivo se apresentar a cor verde ou verde azulada.

OBSERVAR:
a) em que tubo há aparecimento imediato da cor verde.
b) a coloração obtida nos outros tubos.
Considerar o aparecimento da cor em função do tempo, como no teste anterior.

Teste de Benedict

1. Em tubo de ensaio colocar 0,40mL das soluções a serem testados.

2. Fazer um branco de reação com 0,40mL de água destilada.
3. Adicionar 2,00mL do reagente de Benedict.
4. Aquecer em banho-maria a 100,0 oC por 5 minutos.
5. Fazer o teste com soluções de glicose 0,100M, frutose 0,100M, sacarose 0,100M,
maltose 0,100M e amido 0,500%.
O teste é considerado positivo se formar um precipitado vermelho

OBSERVAR:
a) em que tubo(s) verifica-se a formação do precipitado.
b) em que tubo(s) não há formação de precipitado.

Teste com Iodo

1. Em tubo de ensaio colocar 2,00mL das soluções a serem testadas.

2. Adicionar 0,50mL da solução de Lugol (I2 + Kl)
3. Fazer o teste com suspensões de amido 0,500%, dextrina 0,500%, CMC 0,500%.
4. Fazer também um branco de reação com 2,00mL de água destilada.
5. Aquecer os tubos por 5 minutos a 100,0ºC.
6. Resfriar os tubos em água corrente
O teste é considerado positivo quando apresenta cor azul intensa antes do
aquecimento.

OBSERVAR:
a) em que tubo aparece o complexo de cor azul.
b) qual(is) a(s) cor(es) que aparece(um) nos outros tubos.
c) o que ocorre após o aquecimento
d) o que ocorre após o resfriamento.

25
 EXERCÍCIOS 8
PROPRIEDADES QUÍMICAS DE GLICÍDEOS

1. Qual é o teste a ser feito para demonstrar a presença de glicídeos em materiais

biológicos? Justifique.

2. Por que não é conveniente realizar o teste de iodo com uma solução de amido
aquecida? Explique o que ocorreu com a solução após o aquecimento e após o
resfriamento.

3. Que testes você faria com um dissacarídeo para definir as seguintes características:

a) poder redutor
b) se pelo menos um dos monômeros constituintes é uma cetose
c) se pelo menos um dos monômeros constituintes é uma pentose

4. Identifique dentre os dissacarídeos abaixo os que dão teste positivo com o reagente
de Benedict:

maltose : glicose (alfa-1,4) glicose

lactose : galactose (beta-1,4) glicose
sacarose : glicose (alfa-1, beta-2) frutose
trealose : glicose (alfa-1, alfa-1) glicose

5. Duas aldohexoses diferem apenas na configuração do carbono 5, de modo que

em uma, a hidroxila pode ser representada à direita e na outra, à esquerda.
Podemos dizer que estas oses são epímeras?

6. Dos glicídeos abaixo, assinale aquele que satisfaz a todas as seguintes condições:

1 – Teste de Benedict positivo A( ) sacarose

2 – Teste de Barfoed positivo B( ) glicose
3 – Teste de Seliwanoff negativo C( ) arabinose
4 – Teste de Bial positivo D( ) maltose

26
B - FORMULÁRIOS DE RELATORIO

27
 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO

1. OBJETIVO:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ALTERAÇÕES DO PROCEDIMENTO:

Construiu-se a curva padrão de proteínas a partir da solução padrão de caseína 10

mg/mL e determinou-se as absorvâncias a 550 nm após ___ minutos da adição dos
reagentes. Determinou-se a concentração de caseína da AMOSTRA ___ desconhecida a
partir da curva padrão obtida.

3. RESULTADOS:

SOLUÇÃO REAGENTE
H2O ABS C
TUBO CASEÍNA BIURETO
(mL) (550 nm) (mg/mL)
(mL) (mL)
B 0,00 2,00 8,00
1 0,40 1,60 8,00
2 0,80 1,20 8,00
3 1,20 0,80 8,00
4 1,60 0,40 8,00
5 2,00 0,00 8,00

AMOSTRA DILUIÇÃO ABS 550 nm C (mg/mL)

Cálculos:

4. ANEXAR GRAFICO:

5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:

6. CONCLUSÃO:

28
 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

DOSAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES PELO MÉTODO DO ÁCIDO 3,5

DINITROSALICÍLICO

1. OBJETIVO:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ALTERAÇÕES DO PROCEDIMENTO:

Construiu-se a curva padrão de glicídeos redutores a partir da solução padrão de

glicose 10,00 µmol/mL e determinou-se as absorvâncias a 540 nm após a adição dos
reagentes e aquecimento por ____ minutos. Determinou-se a concentração de glicose da
AMOSTRA ___ desconhecida a partir da curva padrão obtida.

3. RESULTADOS:

SOLUÇÃO
H2O REAGENTE ABS C
TUBO GLICOSE
(mL) DNS (mL) (540 nm) (µmol/mL)
(mL)
B 0,00 1,00 1,00
1 0,20 0,80 1,00
2 0,40 0,60 1,00
3 0,60 0,40 1,00
4 0,80 0,20 1,00
5 1,00 0,00 1,00

AMOSTRA DILUIÇÃO ABS 540 nm C (µmol/mL)

Cálculos:

4. ANEXAR GRAFICO:

5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:

6. CONCLUSÃO:

29
 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASEÍNA EM FUNÇÃO DA FORÇA IÔNICA E DO pH

1. OBJETIVO:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. PROCEDIMENTO E RESULTADOS:

2.1. Curva de Solubilidade em Função da Força Iônica

Preparou-se os tubos conforme a tabela abaixo:

TUBO B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MgSO4 1,25M
--- --- 0,10 0,30 0,60 0,80 1,00 1,50 2,00 3,50 4,00
(mL)
Ac. Acético
--- 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
0,100M (mL)

H2O dest. (mL) 5,00 4,00 3,90 3,70 3,40 3,20 3,00 2,50 2,00 0,50 ---

Força Iônica,
µ (M)

Abs (570nm)

Log(1/Abs)

Adicionou-se a solução de caseína em acetato de sódio e imediatamente realizou-

se a leitura da turbidez das amostras a 570 nm.

Cálculos da força iônica

30
 2.2. Curva de Solubilidade em Função do pH

Preparou-se os tubos conforme a tabela abaixo:

TUBO B 1 2 3 4 5 6 7

H2O dest. (mL) 5,00 4,40 4,30 4,00 3,50 2,50 0,50 3,90

Ac. Acético
--- 0,10 0,20 0,50 1,00 2,00 4,00 ---
0,100M (mL)
Ac. Acético
--- --- --- --- --- --- --- 0,60
1,00M (mL)

pH

Abs (570nm)

Adicionou-se a solução de caseína em acetato de sódio e imediatamente realizou-

se a leitura da turbidez das amostras a 570 nm.

Cálculos do pH

3. ANEXAR GRAFICOS:

4. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:

5. CONCLUSÃO:

31
 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

PURIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES NO

ÓLEO DE OLIVA

1. OBJETIVO:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ALTERAÇÕES DO PROCEDIMENTO:

Purificou-se o óleo de oliva em coluna cromatográfica contendo alumina neutra.

Determinou-se o teor de ácidos graxos no óleo de oliva bruto e purificado, titulando-o com
NaOH, a fim de avaliar a eficiência da purificação.

3. RESULTADOS:

Padronização do NaOH

Erlenmeyer Vbiftalato (mL) Mbiftalato (M) VNaOH (mL) MNaOH (M)

1
2

Teor de ácidos graxos livres (óleo bruto)

VNaOH (mL) VNaOH (mL)

Erlenmeyer ∆V (mL)
Titulação da amostra Titulação do branco
1
2

Teor de ácidos graxos livres (óleo puro)

VNaOH (mL) VNaOH (mL)

Erlenmeyer ∆V (mL)
Titulação da amostra Titulação do branco
1
2

4. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:

5. CONCLUSÃO:

32
 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________
CINÉTICA ENZIMÁTICA: CURVA DE PROGRESSO DE REAÇÃO (EFEITO DA
CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO E DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS
CINÉTICOS KM E VM )
1. OBJETIVO:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
2. RESULTADOS: ANEXAR TABELA COM OS RESULTADOS DE TODOS OS
GRUPOS (contendo tubo, tempo, abs, [produto] e fator de cada grupo). INDICAR
PELO MENOS 1 CÁLCULO DE CADA TIPO

3. CÁLCULOS: INDICAR PELO MENOS 1 DE CADA TIPO

SNA REAÇÃO VELOCIDADE 1/[S] 1/v

E1 SORIGINAL (M)
( _______ ) ( ________ ) ( _____ ) ( _____ )
S1
S2
S3
S4

SNA REAÇÃO VELOCIDADE 1/[S] 1/v

E2 SORIGINAL (M)
( _______ ) ( ________ ) ( _____ ) ( _____ )
S5
S6
S7
S8

ATIVIDADE U total U/mL meio reaconal U/mL enzima U/mg enzima

E1
E2

PARÂMETROS PELO GRAFICO DE PELO GRAFICO DE

CINÉTICOS (UNIDADE) MICHAELIS MENTEN LINEWEAVER-BURK
KM (..................) l
Vm (..................)

4. GRÁFICO (ANEXAR): [P] x t para as diferentes [S], [P] x t para as duas [E], v x [S]
e 1/v x 1/[S]
5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
6. CONCLUSÃO
33
 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

CINÉTICA ENZIMÁTICA: EFEITO DA T E DO pH NA ATIVIDADE E NA ESTABILIDADE

DA ENZIMA

1. OBJETIVO:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. ALTERAÇÕES DO PROCEDIMENTO:
[SACAROSE]: _____ [INVERTASE]: ______ TEMPERATURA AMBIENTE: _____ºC

3. RESULTADOS:

Efeito da Temperatura na Atividade da Enzima

Tempo 5 minutos
9
pH 2,6 4,6 7,0
TUBO T(°C) v v v
1 0,0
2 Ambiente
3 55,0
4 100,0
Realizado por:

Efeito da Temperatura na Estabilidade da Enzima

pH 4,6
10
T (°C) 0,0 Ambiente 55,0 100,0
Tempo
TUBO v v v v
(min.)
1 15
2 10
3 5
4 1
Realizado por:

34
 Efeito do pH sobre a Atividade da Enzima

Tempo 5 minutos
11
T (°C) Ambiente 55,0 100,0
TUBO pH v v v
1 2,6
2 3,6
3 4,6
4 5,6
5 7,0
Realizado por:

Estabilidade do pH sobre a Estabilidade da Enzima

Temperatura Ambiente
12
pH 2,6 4,6 5,6 7,0
Tempo
TUBO v v v v
(min.)
1 20
2 15
3 10
4 5
5 1
Realizado por:

4. ANEXAR GRÁFICOS (todos os 4 gráficos):

5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:

6. CONCLUSÃO

35
 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
1. OBJETIVO:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. RESULTADOS: (exemplo de tabelas)

CO2
Situação Peso do erlenmeyer (g)
No início (m1)
Após retirar os 5,0mL (m2)
Peso após colocar a célula (m3)
Após desprendimento do CO2(m4)

Experimento Massa (g) CO2

m1 m2 m3 m4 m
M1I1V1 Mol

Quantificação da glicose
Experimento Tempo Abs Fator Diluição Vi:Vf [glicose] Média
(ex: M1I1V1)
T0

T60

Quantificação do etanol
Experimento Vol. Titulado % EtOH Vol. Titulado % EtOH [EtOH]
(1mL) (1mL) (2,5mL) (2,5mL) médio
M1I1V1

3. GRÁFICO ou TABELA: ([AR] e [etanol] em função do tempo – formato livre) COM

AS INFORMAÇÕES DE TODOS OS GRUPOS. Não esquecer de anexar os resultados
de todos os grupos

4. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:

5. CONCLUSÃO:

36
 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

NOME: _______________________________________ MATRÍCULA: ____________

PROPRIEDADES QUÍMICAS DE GLICÍDEOS

1. OBJETIVO:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

3. RESULTADOS:

Observar:
a) Com que glicídio aparece mais rapidamente a cor verde.
ANTRONA
b) Em que tubo a coloração verde é mais intensa.
c) O aquecimento provocado pela diluição de H 2SO4 na
água, tocando cuidadosamente a base dos tubos.
Branco (Água) Glicose 0,100 M Sacarose 0,100 M

Ácido Glutâmico 0,100 M Amido 0,700% CMC 0,500%

Frutose 0,100 M Celulose (papel)

-

Observações adicionais:

Observar:
a) Em que tubos aparece a cor e o tempo necessário para
TESTE DE SELIWANOFF
que isso ocorra.
b) A coloração obtida nos outros tubos.
Branco (Água) Glicose 0,100 M Frutose 0,100 M

Sacarose 0,100 M Maltose 0,100 M

-

Observações adicionais:

37
 Observar:
a) Em que tubos há aparecimento imediato da cor verde.
TESTE DE BIAL
b) A coloração obtida nos outros tubos no mesmo tempo.

Branco (Água) Glicose 0,100 M Arabinose 0,100 M

Observações adicionais:

Observar:
TESTE DE BENEDICT a) Em que tubo(s) verifica-se a formação do precipitado.
b) Em que tubo(s) não há a formação de precipitado.
Branco (Água) Glicose 0,100 M Frutose 0,100 M

Sacarose 0,100 M Maltose 0,100 M Amido 0,500%

Observações adicionais:

Observar:
a) Em que tubo aparece o complexo de cor azul.
TESTE COM IODO
b) Qual(is) a(s) cor(es) que aparece(m) nos outros tubos.

Branco (Água) Dextrina 0,500% Amido 0,500%

CMC 0,500%
- -

Observações adicionais:

5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:

6. CONCLUSÃO:

38
 C - REAÇÕES QUÍMICAS DE BIOMOLÉCULAS
1 - MÉTODOS PARA ESTIMATIVA E QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS (EXEMPLOS)

ABSORÇÃO NO UV

- suspensões puras abaixo de 230nm (ligações peptídicas = 200nm)

Obs1: Outros compostos orgânicos também absolvem nesta região

- aa aromaticos próximos a 280nm: Tirosina 275 nm

Triptofano 280 nm
Fenilalanina 260 nm
Obs2: ác. Nucleícos 260 nm

MÉTODO DE KJELDAHL : N total

50 - 55% C
PTN 6 - 7% H Obs3: outras moléculas não protéicas devem
20 - 23% O ser removidas antes da aplicação do método.
12 - 19% N
H2SO4
N orgânico CO2 + H2O + NH4 HSO4
alcalinização
catalis.* destilação
*Cu, Se, Hg NH3 é recolhido em ác. bórico
titulação

REAÇÃO DO BIURETO: utilizada para mostrar a presença de ptns em resíduos

biológicos ou para quantificação.

Acessado em 18/08/2017 http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfRpEAD/apostila-aulas-praticas?part=8

- Substância com duas C = O ligadas diretamente ou através de um átomo de C ou N

- Peptídeos que contenham no minimo 2 ligações peptídicas rosa
- Ptns em geral cor violácea

Obs4: Usado rotineiramente pois está menos sujeitos à deferência de contaminantes

( 1-10 mg ptn )

39
 MÉTODO DE FOLIN–LOWRY : Acoplamento da reação do biureto à redução do
ác. Fosfotungstico fosfomolibídico ( reagente de Ciocalteau pela TIR e TRP
presentes nas moléculas protéicas.

Folin-Ciocalteau
alcalino
Amostra + CuSO4 complexo produto oxidado + reagente reduzido

Obs5: 100 x + sensível que Biureto.

40
 2 - PROPRIEDADES QUÍMICAS DE GLICÍDEOS

Na presença de ácidos inorgânicos

 Diluidos a T. ambiente: anomerização

 Concentrados a quente : mudanças + complexas (ex: desidratação)

Exemplo:

HO OH
H+ 3 H2O +
O O
HO HO O

pentose furfural

HO OH
H+ 3 H2O +
O
HO O
HO HO
aldo
(hexose) 5 hidroxi metil furfural

2 H2O
O

O HO C

produtos + HCOH + HCH

escuros
(huminas) HCH

C O

CH3
ácido levulínico

Na presença de bases inorgânicas

 (NaOH 0,05M): Isomerização: glicose manose, frutose, ....

 (NaOH 2M): Clivagem: C6 C3 (ácido pirúvico, lático,...

41
 DESIDRATAÇÃO Poli Oligo Mono (OH) Furfural Produto
Colorido
Reação de Antrona - glícideos em geral

 reação com antranol na presença de H2SO4.

 Gera calor.
 Hidrolisa e desidrata produzindo OH-metilfurfural e furfural que se condensam
com antranol formando produtos coloridos.

OH
H
O + C OH
R O R O
OH

C6 - verde azulado
H
C5 - verde azulado C OH
R O H

Reação de Seli wanoff - cetoses x aldoses

 reação com resorcinol em HCl a quente

OH
cetose - rápida
O + cor vermelha
O OH aldose - lenta
HO

Reação de Bial pentoses e certos ácidos urônicos

 reação com orcinol na presença de HCl concentrado e Fe 3+

furfural (C5) - verde
O + cor verde
O HO OH HO furfural (C6) -
HO amarelo marrom

ceto hexoses
metil pentoses laranja pp verde escuro
cetoheptose púrpura

42
 PODER REDUTOR

Reduz sais de metais pesados em solução alcalina (Cu2+ , Ag+ , Be3+ , Hg3+ ) em
presença de ácido orgânicos

Reação de Benedict - Glicídeos redutores

 na presença de citrato e carbonato de sódio

Cu2+ glicídeo composto

citrato + redutor oxidado + Cu2O pp vermelho
Na2CO3

Reação de Barfoed modificado - mono x di redutores

 acetato de cobre em ácido latico (reagente de Barfoed) seguido de reação com

fosfomolibidato

Acetato de Cu + glicídeo composto + Cu2O + H3PO4 .12MoO3 cor

em ác lático redutor oxidado azul

Reação do DNS - Glicídeos redutores

COOH COO-
OH OH- OH
glicídeos + + produtos
redutores O2N NO2 O2N NH2 oxidados

amarelo laranja- vermelho

TESTE DO IODO

amilose ( > 40 residuos ) + I2 azul

amilose e amilopectina ( 40 residuos) + I2 vermelho -marron ou amarelo
glicogênio (só amilopectina) ) + I2 vermelha/castanha
dextrinas ( -amilase sobre amilopectina) + I2 vermelha
dextrinas pequenas + I2 não reagem

43
 D - BIBLIOGRAFIA

1 – Voet, D. e Voet, J.G. (1990) In: Biochemystry, John Wiley & Sons – N.Y., USA 1223pp

2 – Neto, A.L.C.S., Vasconcellos, A.M.H., Valle, A.B.F., Oliveira, M.L.C. (1994) Apostila de
Práticas do Depto de Bioquímica – Instituto de Química – UFRJ.

3 - Pinheiro, D.M. (1992) “Produção de lípases por Penicillium restrictum”. Tese de

Mestrado, UFRJ, Instituto de Química, Departamento de Bioquímica, Rio de
Janeiro, Brasil, 157 pp.

44