UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA CURSO: ENGENHARIA AGRONMICA DISCIPLINA: BIOQUMICA TURMA: D2

RELATRIO DE AULAS PRTICAS

SO CRISTOVO, 2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA CURSO: ENGENHARIA AGRONMICA

RELATRIO DE AULA PRTICA

RELATRIO DE AULA PRATICA PARA A DISCIPLINA DE BIOQUMICA A PROFESSORA ROBERTA P. MIRANDA FERNANDES COMO PARTE DA 4 AVALIAO.

ALUNO: JOO VIEIRA DOS SANTOS FILHO

SO CRISTOVO, 2009

SUMRIO

DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS PELO MTODO DE BRADFORD.

1.1 INTRODUO

1.2 OBJETIVOS

1.3 MATERIAIS E MTODOS

1.4 RESULTADO E DISCUSSO

1.5 CONCLUSO 1.6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1.1 - INTRODUO: As protenas so as molculas orgnicas mais abundantes e importantes nas clulas e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. So encontradas em todas as partes de todas as clulas, uma vez que so fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e funo celulares. Existem muitas espcies diferentes de protenas, cada uma especializada para uma funo biolgica diversa. Alm disso, a maior parte da informao gentica expressa pelas protenas. Pertencem classe dos peptdeos, pois so formadas por aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas. Uma ligao peptdica a unio do grupo amino (-NH
2

) de um aminocido com o grupo carboxila (-COOH) de

outro aminocido, atravs da formao de uma amida.

O Mtodo de Bradford simples, preciso e rpido por isso mais indicado para a deteco e quantificao de protenas solubilizadas em meios sem detergentes. O mtodo requer poucas etapas de misturas, no necessita de aquecimento e possui uma grande estabilidade colorimtrica, com pouca ou nenhuma interferncia de ctions como sdio ou potssio. O reagente de Bradford contm como seu principal componente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 em soluo cida, este ao ligar-se s protenas, tem a sua absorbncia alterada de 465nm para 595nm. Esta interao entre o corante Coomassie com a protena, estabiliza a forma aninica do corante, causando uma visvel mudana de colorao inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentrao da protena. A absorbncia pode ser medida em um espectrofotmetro ou leitor de microplacas utilizando o comprimento de onda de 595nm. A comparao dos resultados com uma curva padro, com valores de concentraes conhecidos, permite a determinao da concentrao da protena em estudo.

1.2 - OBJETIVOS:

1. PRTICA DA DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS PELO MTODO DE BRADFORD Esta prtica tem como objetivo principal determinar a concentrao de protenas presentes na amostra da Albumina do Soro Bovino (BSA). 1.3 - MATERIAL E MTODOS:

Materiais Utilizados: Para ensaio Padro Corante Coomassie blue G-250 lcool Etlico 95% cido Fosfrico Soluo Estoque de BSA 1mg/1mL gua destilada Espectofotmetro com comprimento de onda de 595nm Cubetas com caminho tico de 1cm Tubos testes de 13 x 100mm Balo Volumtrico Rack para tubos de testes 13 x 100mm Vortex MIxer Filtro Whatman Funil para preparao do reagente Pipetas graduadas e fracos para preparao e armazenamento de reagente Pipetas de preciso de 100ul e 5,0ml Becker

Soluo de extrato de bulbo Soluo de extrato de abacaxi Soluo de extrato de folhas Mtodo: Preparo do Reagente de Bradford: 1 . Pesar 142,85 mg do corante Coomassie brilhante blue G-250 e dissolver em 50 mL de lcool etlico 95% agitando at completa dissoluo. 2. Transferir para a proveta e observar se houve diminuio do volume do lcool etlico 95% para um volume final de 50 mL. 3. Transferir a soluo anterior para um balo volumtrico e adicionar 100 mL de cido fosfrico e completar o volume para 100mL com gua destilada. 4. Filtrar a soluo do item anterior duas vezes ou mais, caso ela apresente precipitado. Prepara-se uma soluo estoque de 1mg/1mL, ou seja, pesa-se 1 mg de BSA e o dissolve em 1mL de gua destilada ou uma soluo de NaCl 0,15M. A concentrao desta soluo em microgramas por microlitro 1000ug de BSA em 1000uL de gua destilada. 1 Experimento O primeiro passo aps a preparao do reagente de Bradford foi coloca-lo em um Becker e em outro a gua destilada. Dispem-se seis tubos de ensaio na grade sobre a bancada, numerando-se todos de 1 a 6 . Em seguida utilizando as pipetas de acordo com o volume pretendido adicionou-se gua destilada nos tubos de ensaio de 01 a 06 fazendo diluies sucessivas de 100, 90, 80, 70, 60, 50 l. Juntou-se em seguida o BSA (Albumina Bovina Srica) gua destilada dos tubos de ensaio com as respectivas quantidades: 0, 10, 20, 30, 40 e 50 l. Adicionando-se em cada um dos seis tubos 2,5 ml do reagente de Bradford. Aps a adio da gua destilada, do BSA e do reagente de Bradford nos tubos de ensaio, esperou-se cinco minutos para que as protenas se ligassem ao reagente. Preparado o espectrofotmetro (0,000). Colocou-se gua destilada na cubeta na operao de absorbncia, fez-se a calibrao do aparelho zerando o valor da absorbncia medindo em seguida sua

absorbncia. Colocou-se o contedo do tubo n1 na cubeta e mediu-se a sua absorbncia. Utilizando-se do mesmo processo, exceto a calibrao do aparelho com a gua, adquiriu-se a absorbncia das amostras dos tubos de 02 a 06. Com os valores das absorbncias de todos os tubos tornou-se possvel determinar a curva padro do BSA. 2 Experimento Em outro ensaio para determinao total de protena contida em extrato de bulbo, extrato de abacaxi e extrato de folha, numerou-se 04 tubos de ensaio colocados na grade e em seguida adicionou-se 100 l de gua destilada no primeiro tubo e 90 l nos tubos 2, 3 e 4. Adicionou-se 10 l de suco de abacaxi no tubo 2; 10 l de extrato de folha no tubo 3 e 10 l de extrato de bulbo no tubo 4. Adiciona-se 2,5ml do reagente de Bradford em todos os tubos. Aps a adio da gua destilada, do suco de abacaxi, extrato de folha, extrato de bulbo e reagente de Bradford em seus respectivos tubos de ensaio e em suas respectivas quantidades, aguardou-se 5 minutos para a ligao do reagente as protenas. Uma a uma as solues contidas nos tubos de 01 a 04 foram colocadas na cubeta, e posteriormente no epectrofotmetro com comprimento de onda de 595nm para medio da absorbncia.

1 Experimento Grupo 1
BSA (g/100L) gua destilada (L) Soluo estoque de BSA (L) Reagente de Bradford (mL) A595nm

0 10 20 30 40 50 Grupo 2

100 90 80 70 60 50

10l 20l 30l 40l 50l

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

0,473 0,207 0,416 0,562 0,594 0,690

BSA (g/100L)

gua destilada (L)

Soluo estoque de BSA (L)

Reagente de Bradford (mL)

A595nm

0 10 20 30 40 50 Grupo 3
BSA (g/100L)

100 90 80 70 60 50

10l 20l 30l 40l 50l

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

0,502 0,096 0,183 0,308 0,346 0,610

gua destilada (L)

Soluo estoque de BSA (L)

Reagente de Bradford (mL)

A595nm

0 10 20 30 40 50

100 90 80 70 60 50

10l 20l 30l 40l 50l

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

0,506 0,312 0,402 0,526 0,601 0,749

Grupo 4
BSA (g/100L) gua destilada (L) Soluo estoque de BSA (L) Reagente de Bradford (mL) A595nm

0 10 20 30 40 50

100 90 80 70 60 50

10l 20l 30l 40l 50l

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

0,538 0,129 0,232 0,316 0,430 0,525

MDIA GERAL DOS 04 GRUPOS

0 10 20 30 40 50

100 90 80 70 60 50

10l 20l 30l 40l 50l

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

0,504 0,186 0,308 0,428 0,492 0,643

1.4 - Resultado e Discusso Observamos nos grficos a seguir referentes aos experimentos dos quatro grupos e no grfico da mdia dos mesmos que aumentando-se a concentrao de BSA aumentou-se a absorbncia e quanto maior o BSA maior foi a diferena de tonalidade das amostras sendo a mais azulada a que tem uma maior quantidade de BSA Grupo 01

Grupo 02

Grupo 03

Grupo 04

Mdia Geral dos grupos

2 Experimento

Amostra s Suco de Abacaxi Extrato de Folhas Extrato de bulbo

Quantidade (l) 10 10 10

Reagente de Bradford (ml) 2,5 2,5 2,5

Absorbncia 0,045 0,043 0,045

Concentrao(g/ml) 157,6 137,4 157,6

Relao da quantidade das amostras presentes das solues e de reagente de Bradford com suas respectivas absorbncias e concentraes.

Atravs da equao da curva padro obtem-se as concentraes. O valor da absorbncia e colocadono lugar do y obtendo g/10l , tranformando para g/l. Clculo dos valores e sua tranformao para a escala g/l. Y = 0,0099x + 0,0294 0,045 = 0,0099x + 0,0294 0,0099X = 0,045 0,0294 X = 0,0156/0,0099 X = 1,576 g/10l 1 Amostra: Suco de Abacaxi l 10 1000 X= 156,7 g/ml 2 Amostra: Extrato de folhas l 10 1000 X= 137,4 g/ml g 1, 374 X g 1, 576 X

3Amostra: Extrato de bulbo

l 10 1000 X= 156,7 g/ml

g 1, 576 X

A absorbncia das amostras do extrato de suco de abacaxi e extrato de Bulbo tiveram a mesma absorbncia nos levando a concluir que tm a mesma quantidade de protenas. Grfico das Anlises das amostras dos Extratos

O grafico demonstra as concentraes de protinas das trs amostras em determinadas absorbncias

Nos dois experimentos do primeiro tubo de ensaio que contina apenas gua destilada e o reagente de Bradford observou-se absorbncia mais elevada que todas as outras amostras dos experimentos.

1.5 Concluso

Ao fim dos dois experimentos foi possvel verificar que influncias do meio, como diferenas no volume manipulado das diversas substncias podem produzir diferentes leituras de concentrao como vimos no primeiro experimento, mas ao final nos permitiram medir a concentrao total de protenas das amostras pelo mtodo de Bradford.

1.6 - Referncias Bibliogrficas 1. LEHNINGER, Albert Lester, 1917-1986. Lehninger princpios de

bioqumica/ David L. Nelson, Michael M. Cox; traduzido por Arnaldo Antnio Simes, Wilson Roberto Navega Lodi. 3. Ed. So Paulo 2002. 2. PROTENAS/http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/c onst_microorg/proteinas.htm.