UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA DISCIPLINA DE BIOLOGIA DE MICRORGANISMOS

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS TURMA DE CINCIAS BIOLGICAS

PM1a: NORMAS PARA TRABALHOS PRTICOS EM MICROBIOLOGIA Os alunos devero adquirir, para executar as prticas, o seguinte material: 01. Fsforo, Caneta para retroprojetor, cor preta ou azul, para identificao do material. 02. Uso obrigatrio do avental (de preferncia longo). 03. Observar o horrio e estar sempre munido de material solicitado. 04. Deve-se manter sobre a mesa apenas o material que ser utilizado na execuo do trabalho (h um escaninho para bolsas, casacos e objetos pessoais). 05. O laboratrio deve ser um recinto calmo. Os alunos devem ocupar sempre o mesmo lugar, evitando falar em voz alta e sair, desnecessariamente, de seus lugares. 06. No caso de acidentes, comunicar imediatamente ao professor. 07. As alas, pinas, pipetas, meios em tubos, etc., devem ser colocados nos suportes e no abandonados sobre a mesa. 08 As pinas usadas, lminas, lamnulas, etc., devem ser colocadas em recipientes apropriados, que se encontram sobre as mesas. 09. Manter o bico de gs aceso somente quando necessrio. 10. As alas, agulhas e esptulas de repicagem devem ser flambadas antes e, aps a sua introduo nos tubos de cultura. Estes devero ter as suas bocas flambadas aps a retirada da rolha e, tambm, antes de recoloc-la. 11. Ler o roteiro de prtica antes de iniciar o trabalho. 12. Os meios de cultura semeados devem ser identificados e levados para a estufa. As placas de Petri devero ser incubadas de cabea para baixo para evitar a condensao de vapor, que possibilita a contaminao do material inoculado. 13. Antes de qualquer observao microscpica devem ser verificadas as condies em que se encontram os microscpios (tipo de espelho, abertura do diafragma, posio do condensador, tipo de objetiva, etc.) S buscar ajuda aps certificar-se de que esse procedimento foi obedecido 14. Aps o uso do microscpio, limpar as lentes com leno de papel umedecido com xilol, se necessrio. 15. Terminado o exerccio prtico, guardar o microscpio, lavar e guardar a cuba de colorao e deixar a mesa em ordem. 16. Nunca dever ser colocado ou lavado material contaminado nas pias do laboratrio. 17. Sempre lavar as mos com gua e sabo aps terminar o seu trabalho. 18. No comer e no fumar no laboratrio

USO DO MICROSCPIO FOCALIZAO COM OBJETIVAS DE AUMENTO 10 E 45X 1. Retirar o microscpio da caixa. Coloc-lo sobre a mesa cuidadosamente. 2. Ligar a lmpada. Fazer coincidir os raios luminosos sobre o espelho. 3. Centrar o microscpio observando a posio da objetiva, do condensador e do diafragma, para se obter um campo bem iluminado. 4. Colocar a lmina preparada na platina do microscpio e com objetiva 10X em posio de foco, abaixar o canho do microscpio por meio de parafuso macromtrico at o aparecimento da imagem. Com o parafuso micromtrico, ajustar a sua nitidez. 5. Sem mover o canho e a platina do microscpio, mudar a objetiva de aumento 45X. Se houver necessidade, ajustar a iluminao e o foco. FOCALIZAO COM OBJETIVA DE IMERSO 1. Retirar o microscpio da caixa. Coloc-lo sobre a mesa cuidadosamente 2. Ligar a lmpada. Fazer coincidir os raios luminosos sobre o espelho. 3. Suspender o condensador ao mximo. Abrir todo o diafragma. Verificar se o campo do microscpio est bem iluminado. 4. Colocar a lmina, com uma gota de leo de cedro sobre o esfregao na platina do microscpio. 5. Baixar o canho do microscpio de modo a mergulhar a objetiva de imerso no leo. Suspender o canho do microscpio por meio de parafuso macromtrico at o aparecimento da imagem e, com o parafuso micromtrico ajustar a nitidez.

OBSERVAES SOBRE OS TRABALHOS PRTICOS Nos exerccios prticos apresentamos uma srie de questes. Estas questes no devem ser necessariamente respondidas pelos alunos ou professores. Trata-se de uma tentativa de sistematizao da curiosidade natural de um indivduo que tem seu contato inicial com um laboratrio de Microbiologia. importante que se reflita e se discuta sobre estas questes. Os exerccios prticos sero conduzidos de forma a fornecer elementos que os auxiliem a responder s mesmas. Ao fim de cada exerccio apresentamos novas questes. Desta vez com o objetivo de orientar sua observao e auxili-lo para que possa tirar suas prprias concluses, generalizlas e extrapol-las sempre que possvel. Alm do conhecimento propriamente dito, estes exerccios e questes tm por objetivo familiariz-lo com tcnicas bsicas, terminologia e habilidades necessrias execuo posterior de qualquer prtica em laboratrio de Microbiologia. RELATRIOS Relatrios so documentos preparados com o objetivo de estabelecer um balano dos resultados alcanados por um programa de trabalho. Desta forma, o relatrio devera conter e abranger o conjunto de prticas executadas sobre um mesmo assunto e ser composto de: TTULO: Deve indicar precisamente QUAL o contedo do relatrio. Se necessrio poder ser desdobrado em subttulos. INTRODUO: Deve abordar o assunto, com base na literatura, relacionando-o com o trabalho desenvolvido. OBJETIVO: deve ser o nico para o conjunto de prticas sobre um mesmo assunto. MATERIAL E MTODOS: No caso, no ser necessria a sua presena no relatrio, pois este encontra-se j descrito no roteiro de aulas prticas. Resultados: Devem ser apresentados com um mnimo possvel de discusso ou interpretao pessoal e acompanhados, se necessrio, de desenhos e tabelas. DISCUSSO: interpretao dos resultados restrita aos dados obtidos e deve ligar os achados com os conhecimentos anteriores e apresentao de novas perspectivas para o estudo. BIBLIOGRAFIA: Citar a bibliografia utilizada, segundo as normas. SUGESTES: Os alunos podero apresentar sugestes para o melhor desenvolvimento das prticas, bem como para a resoluo de dvidas surgidas no decorrer dos trabalhos.

PM1b: UBIQUIDADE MICROBIANA 1- ASSUNTO Demonstrao da ubiquidade dos microrganismos. 2- INTRODUO No h parte da biosfera onde no se encontre microrganismos. Na grande maioria dos casos, fazem parte do ecossistema, onde exercem profunda influncia no equilbrio biolgico e, consequentemente, na preservao da natureza - nestes casos so chamados de autctones, ou indgenas. No solo (em qualquer parte do globo terrestre) nas guas, na superfcie interna do organismo animal (pele, boca, estmago, intestino), na superfcie externa de vegetais, e, em certos casos no interior de seus tecidos, esto os microrganismos presentes, permenente ou transitoriamente. Os microrganismos so encontrados tambm, na atmosfera, embora sem qualquer atividade, pois para que possam se manter em atividade necessrio que estejam em contato com o substrato de onde retiram os nutrientes de que necessitam. No entanto, a demonstrao de existncia de microrganismos no ar de grande importncia e de aplicao em diferentes campos de atividades do microbiologista (na medicina, na indstria, na agricultura, nas tcnicas microbiolgicas, etc.) Quanto mais movimentado e populoso o ambiente, mais rico em microrganismos que podem ser disseminados pela movimentao do ar e pelas correntes areas. Onde so encontrados os microrganismos?
Relacione

alguns

ambientes

nos

quais

podemos

detectar

presena

de

microrganismos. Os microrganismos desempenham importante papel nestes ambientes? Explique. Como seria possvel demonstrar a existncia de microrganismos nestes ambientes? Qual a importncia desta demonstrao?
Existe alguma relao entre a natureza e sua populao microbiana?

3- MATERIAL
gar simples em placa, dois por mesa; gar Sabouraud em placa, dois por mesa; Terra (em gua), trs por sala; gua, trs por sala; Pipetadores automticos 100 e 200 L, quatro por sala; Ponteiras esterilizadas.

4- EXECUO

4.1.

O aluno dever escolher o ambiente (ar, gua ou terra), que ir usar para a

pesquisa da presena dos microrganismos (fungos e bactrias). Identificar as placas em relao mesa, data e ambiente escolhido (ar, gua ou terra). 4.2.Pesquisa de fungos e bactrias do ar: Marcar as placas de gar simples (AS) e as placas de gar Sabouraud (SB), que devero ser expostas ao ar durante cinco minutos e 15 minutos. 4.3.Pesquisa de fungos e bactrias da terra ou gua:

Inocular 0,1mL da suspenso de terra ou de gua e nas placas correspondentes. Incubar a 37C as placas de gar simples e a temperatura ambiente as placas

de sabouraud. 5- RESULTADO Anotar os resultados obtidos na tabela abaixo: NMERO DE COLNIAS PLACAS 1Simples 2Simples 3-gar Sabouraud 4-gar Sabouraud 6- CONCLUSO Que grupos de microrganismos formam colnias de aspecto filamentoso? E cremoso? O que ficou demonstrado atravs de exposio dos meios de cultura ao ar, gua e terra? Existe alguma relao entre tempo de exposio e a quantidade de material inoculado com os resultados observados? Qual a importncia destes resultados? gar gar ASPECTO FILAMENTOSO ASPECTO CREMOSO TOTAL

 O que se pode concluir em relao s condies de cultivo usadas e a populao microbiana em cada uma? Discuta, considerando a composio qumica dos meios de cultura utilizados.

GAR SIMPLES Peptona: 1,0 g NaCl: 0,5 g Extrato de Carne: 0,3 g gar: 1,5 g gua destilada: 100mL pH: 7.2 - 7.4 _____________________

GAR SABOURAUD Peptona: 1,0 g Extrato de Levedura: 0,5 g Glicose: 2,0 g gar: 1,5 g gua destilada: 100mL pH: 5.5 - 6.5 _____________________

AGAR SIMPLES (AS) pH 7.0 (neutro) Temp = 37 C ____________________

SABOURAUD (SB) pH 6.0 (cido) Temp = ambiente ____________________

Favorece o crescimento de BACTRIAS. colnias cremosas e pequenas. filamentosos.

Favorece o crescimento de FUNGOS. colnias cremosas Leveduras colnias filamentosas Fungos

Essa tcnica permite a demonstrao de todos os microrganismos presentes nos ambientes estudados? Qual a sua concluso sobre a prtica?

PM2: MORFOLOGIA DE FUNGOS MICROCULTIVO EM LMINA (TCNICA DE RIDELL) 1. MATERIAL Placa de agar Sabouraud proveniente da prtica de ubiqidade.

Laminas

de

Rhizopus,

Aspergillus,

Penicillium

Curvularia

(para

visualizao no microscpio das estruturas de reproduo assexuadas). Placas de petri estreis, montadas com suporte de vidro, lmina, lamnula e Alas de platina em gancho. Tubos com gua estril. Placas com gar Sabouraud dividido em cubos. Pinas. algodo hidrfilo.

2. EXECUO 2.1. Colocar sobre a lmina um pequeno cubo de meio de cultura (Sabouraud), assepticamente com o auxlio de pina. 2.2. Cada aluno semear amostra de fungo filamentoso (proveniente da placa de agar Sabouraud da prtica de Ubiqidade) nos 4 cantos do meio de cultura que est sobre a lmina. A colnia a ser escolhida tem que estar separada das demais, para evitar contaminao no microcultivo com outro fungo. 2.3. Cobrir a preparao com lamnula e comprimir suavemente a lamnula sobre a preparao, utilizando-se uma pina. 2.4. Umedecer o algodo contido na placa, com gua destilada esterilizada, criando assim uma cmara mida. 2.5. Identificar as placas de Petri na tampa com: mesa, lugar e data. 2.6. Incubar temperatura ambiente. EXAME MICROSCPICO Para o exame microscpico direto das culturas de fungos (escolhidas para a realizao do microcultivo em lamina), proceder para cada fungo da seguinte maneira: Colocar sobre a lmina 2 gotas de lactofenol (contendo azul de metileno). Retirar com ala de platina (em gancho) um pequeno fragmento da colnia e colocar sobre a lmina contendo lactofenol. Abrir as estruturas com auxlio do estilete. Cobrir com lamnula. Examinar com objetiva de 10 e 40X.

LACTOFENOL Fenol: 20,0 g cido Ltico: 20,0 g Glicerina: 40,0 g Azul de metileno (ou azul de algodo): 0,05 g gua destilada: 20,0 mL ZIMOGRAMA: PROVA DE FERMENTAO DE CARBOIDRATOS 6. MATERIAL

Culturas de Candida sp. Srie bioqumica: glicose, lactose, sacarose e maltose. Alas de platina em anel.

7. EXECUO 7.1 Descreva as colnias de fungos em relao a: aspecto e pigmentao (superfcie e verso. 7.2 Dentre as colnias filamentosas presentes na placa, escolha uma para repique e trabalhos posteriores. 7.3 Observar e anotar o aspecto e colorao dos meios de antes do inculo. 7.4 Identificar a srie bioqumica: nome dos acares, mesa, lugar e data. 7.5 Com a ala de platina em anel, tocar levemente na colnia de levedura. Semear a amostra separadamente nos quatro tubos contendo os acares, tomando-se o cuidado de sempre flambar a ala quando mudar de acar. 7.8 Incubar a 37C. 7.7 A Leitura ser feita na aula seguinte. 8. LEITURA E INTERPRETAO Compare os aspectos dos meios de cultura antes e aps inoculao e incubao e com base na composio qumica desses tente explicar a reao observada. Qual ser sua finalidade e importncia? 9. FRMULAS ZIMOGRAMA Peptona: 1,0 g Indicador de Andrade: 0,5mL

 gua destilada: 100mL

pH: 7,0 Distribuir 3,6 mL por tubo, esterilizar a 120C por 20 minutos e adicionar separadamente 4,0 mL das solues de acares a 20%. Acares: glicose, lactose, maltose, sacarose. Os acares devem ser esterilizados por filtrao. INDICADOR DE ANDRADE Fucsina cida: 0,5 g NaCH 1 N: 16,0 mL gua destilada: 100mL O indicador de Andrade um indicador de pH que sofre uma viragem ntida para o vermelho em pH abaixo de 7.0. CONCLUSO Qual a finalidade e o significado prtico do exame direto da cultura fngica? Quais so as suas limitaes considerando-se fungos filamentosos e leveduriformes? Qual o objetivo da utilizao do lactofenol? Discuta a funo de seus constituintes. Em relao ao Zimograma: compare aspectos dos meios de cultura antes e aps o inoculo e a incubao. Com base na composio qumica dos meios tente explicar a reao observada. Qual ser sua finalidade e importncia?

PM3: MORFOLOGIA E REPRODUO DOS FUNGOS LEVEDURAS KILLER 1. INTRODUO Que caractersticas devemos observar para a anlise do aspecto morfolgico microscpio dos fungos? 2. ASSUNTO Estudo da morfologia e reproduo de fungos Leitura do Zimograma 3. MATERIAL Lminas e lamnulas: Lminas preparadas com macroconidia, microconidia, gmulas, artrsporos, esporangiosporos. Um por mesa; Lactofenol; Cartazes. 4. EXECUO E RESULTADOS A. Observar ao microscpio com pequeno(10X) e mdio(40X) aumentos (lminas j preparadas) as estruturas de reproduo de fungos. Esquematize o observado. B. Preparar uma lmina da cultura do fungo filamentoso, da maneira descrita na prtica anterior. Observar ao M.O. Anotar e desenhar. 5. CONCLUSO Quais so as variaes morfolgicas observadas em relao aos esporos de reproduo assexuada? Discuta sua importncia prtica. Leveduras produtoras de micocinas extracelulares (toxinas Killers) 1 Introduo A produo de micocinas (toxinas killer) por leveduras um fenmeno de antagonismo entre linhagens na competio pelos recursos disponveis. Durante os processos fermentativos, a contaminao com leveduras produtoras pode levar a interrupo da fermentao pela eliminao das linhagens sensveis. As micocinas so protenas ou glicoprotenas codificadas por determinantes genticos, tais como RNA de fita dupla (dsRNA) viral, plasmdeos lineares de DNA, ou genes cromossmicos em algumas leveduras. As leveduras apresentam trs fentipos: killer para as linhagens produtoras, sensveis (S) e neutras (N) para as linhagens que no nem produtoras nem sensveis. Nos ltimos anos, a utilizao comercial de linhagens produtoras de micocinas para eliminar leveduras indesejveis em fermentaes industriais tem sido utilizada bom bastante xito. 2 Material

. Culturas de Candida glabrata Y-55 e Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006 (linhagens sensveis) crescidas em agar Sabouraud. . Culturas de linhagens de leveduras produtoras e no produtoras de micocinas (linhagens testes). . Placas com meio de cultura agar extrato de malte-extrato de levedura (YM) com azul de metileno: Extrato de leveduras 0.3% Extrato de Malte 0.3% Peptona 0.5% Glicose 1% Azul de metileno 0.003% Agar 2% pH 4.2 . Swabs estreis. . gua destilada estril. 3 Execuo 3.1 Fazer um suspenso de cada uma das duas linhagens sensveis (C. glabrata e S. cerevisiae), em gua destilada esterilizada. 3.2 Com o auxilio do swab, inocular por espalhamento as linhagens sensveis no meio de cultura, uma linhagem em cada placa. 3.3 Esperar cinco minutos 3.4 Marcar, com caneta de retroprojetor, no fundo de cada placa, o local a ser inoculado com as linhagens a serem testadas quanto a produo de micocinas. 3.5 Com o auxilio de uma ala de platina, fazer um inoculo pesado das linhagens a serem testadas, nos pontos previamente marcados. 3.6 Incubar as placas a temperatura ambiente por 2 dias 3.7 Observar a produo de halos de inibio ao redor da colnia da levedura teste. Caso seja obervado o halo, a levedura ser considerada produtora de micocina (toxina killer). 4 Leitura e Interpretao Observar a formao de um halo de inibio ao redor das colnias produtoras de micocinas. So consideradas produtoras de toxinas killer as colnias que aps 2 dias de incubao produzirem em torno de si um halo de inibio circundado por clulas azuis (aps a morte, as clulas sensveis ficam coradas de azul pelo azul de metileno presente no meio de cultura).

PM4 IDENTIFICAO DE FUNGOS 1. ASSUNTO Montagem e exame das culturas do microcultivo. Identificao dos fungos estudados. 2. MATERIAL Material do cultivo em lmina; Lminas e lamnulas; Cartazes; Lminas preparadas. 3. EXECUO E RESULTADOS Retirar a lamnula e coloc-la sobre a lmina contendo uma gota de lactofenol. A lmina est pronta para ser examinada ao microscpio. Com o auxlio da ala de platina, retirar o cubo contendo o meio de cultura que est sobre a lmina. No centro da lmina, colocar uma gota de lactofenol e cobrir com lamnula. Examinar com objetivas de pequeno (10X) e mdio (40X) aumentos. Desenhar. Com os dados obtidos durante as aulas e com o auxlio de manuais de identificao de fungos, identificar os fungos estudados. 4. CONCLUSO Qual a finalidade e o significado prtico do cultivo em lmina? Discuta comparando os resultados obtidos quanto ao exame direto da cultura. O habitat poderia exercer influncia na morfologia dos fungos? E o meio de cultura? Qual a relevncia e as limitaes do estudo da morfologia na caracterizao e identificao dos fungos? Discuta, considerando os fungos filamentosos leveduriformes. .

PRTICA: MORFOLOGIA E REPRODUO DE FUNGOS 1. MATERIAL Linhagens h+ e h- de Metschnikowia continentalis e Metschnikowia sp.; Meio de cultura gar GY (glicose 1%, extrato de levedura 0,01%, gar 2%). 2. EXECUO Misturar as linhagens de leveduras duas a duas no gar GY e incubar a temperatura ambiente por pelo menos 48 horas. Anotar os resultados em relao aos cruzamentos quanto a: 1- Presena / ausncia de ascas 2- Presena / ausncia de esporos 3- Porcentagem de ascas com esporos. LINHAGEN S M. continentalis h+ M. continentalis hMetschniko wia sp h+ Metschniko wia sp h3. DISCUSSO As duas leveduras representam uma s espcie? Porque? Discutir o conceito de espcie em microrganismos. M. continentalis h+ M. continentalis hMetschniko wia sp h+ Metschniko wia sp h-