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TP/TD1. Saturation de type Michaelis :

Enzyme à un ou deux substrats

Génie enzymatique. 3ème Année Biologie Industrielle, Cycle Ingénieur INSAT.

Dr. Ines BEN REJEB & Pr. Mohamed GARGOURI.
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Expérimentation

Mesure de l’activité et étude cinétique d’une enzyme à un (ou deux) substrat(s).

Exercice 1 :
L’adénylate cyclase catalyse la formation d’AMPc à partir d’ATP. Elle peut aussi utiliser le
dATP (un analogue de l’ATP qui contient le désoxyribose à la place du ribose) qui donne du
dAMP cyclique.
Le tableau donne les vitesses initiales de la réaction, en nanomoles par min dans un essai de
100 µl, mesurées en présence de 3 µg d’enzyme partiellement purifié et de différentes
concentrations de dATP :
[dATP] (mM) 5,3 1,4 1 0,4 0,19

Vitesse 3,7 2,5 2,1 1,2 0,64

Déterminer la vitesse maximale de la réaction (en µmol/min mg de protéine) et la constante

de Michaelis.

Exercice 2 :
Les poumons et les testicules de lapin, possèdent une dipeptidyl-carboxypeptidase qui permet
de transformer l’angiotensine I en angiotensine II. Pour comparer les enzymes de ces deux
tissus, on a étudié leurs constantes de Michaelis pour un de leurs substrats, l’Hip-His-Leu
(L’acide hippurique est la N-benzoyl-glycine), qui est hydrolysé en donnant l’acide
hippurique et le dipeptide His-Leu.
Le tableau donne les vitesses intiales d’hydrolyse du substrat, exprimées en micromoles
d’acide hippurique libérées par min et par mg de protéine, en fonction de différentes
concentrations d’Hip-His-Leu :
[Hip-His-Leu] (mM)

0,45 0,9 2,4 4,5

Vitesse (enzyme de poumon) 2 3,6 6,7 8,9

Vitesse (enzyme de testicule) 3,7 6,4 2 16

Comparer les constantes de Michaelis obtenues avec les enzymes extraits des deux tissus.

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Exercice 3 :
Une réaction enzymatique (A ---> B) catalysée par une enzyme E a été étudiée en
suivant la cinétique d’apparition de B selon le tableau ci-dessous.
1. Tracez les cinétiques. Dresser le tableau des vitesses.

2. Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme par la méthode graphique de votre choix.

Temps (min)

[A]0 1 2 3 4 5 6

Variation d'absorbance (unités arbitraires)

[A]0 = 1 mM 1 2 3 4 5 6

[A]0 = 2 mM 2 4 6 7,5 9 10

[A]0 = 5 mM 4 8 12 15 17,5 19,5

[A]0 = 10 mM 5 10 15 19 22 24

[A]0 = 20 mM 6 12 18 23 27 30

Exercice 4 :

La galactose-1-phosphate uridyltransférase catalyse la réaction :

UDP-glucose + galactose-1-phosphate <===> UDP-galactose + glucose-1-phosphate

On mesure la vitesse initiale de la réaction pour différentes concentrations des 2 substrats

UDP-glucose et galactose-1-phosphate. Les résultats, exprimés en µM min -1 mg-1, sont les
suivants :

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[UDP-glucose] [galactose-1-phosphate] (10-3 M)

(10-3 M) 0,06 0,12 0,25 0,50

0,05 0,034 0,048 0,061 0,069

0,10 0,041 0,063 0,087 0,105

0,20 0,046 0,075 0,111 0,143

0,50 0,050 0,085 0,133 0,182

Déterminer le mécanisme et les paramètres cinétiques de cette réaction.

Exercice 5 :

L’ubiquinol-cytochrome c réductase peut catalyser une réaction d’oxydo-réduction entre un

dérivé de l’ubiquinol et le cytochrome c. on a étudié le mécanisme de cette réaction. En
mesurant la réduction du ferricytochrome c (forme oxydée du cytochrome c) à différentes
concentrations de ferricytochrome c et du dérivé en présence de 10-2 nM d’enzyme. Les
vitesses sont données dans le tableau en µM/5min.

[ferricytochrome c] (µM)
[dérivé] (µM) 0,38 0,6 0,9 1,25 3
2,1 3,4 4,1 4,6 5 5,6
3,3 4,1 5 5,9 6,6 7,6
5,5 4,7 6 7,2 8,2 10
11 5,3 7,1 8,8 10,2 13,4

1. Déterminer le mécanisme cinétique de la réaction et donner son principe.

2. Déterminer les constantes de Michaelis de chacun des substrats et la constante de vitesse
catalytique.

Exercice 6 :
Le mécanisme cinétique de la myokinase (ATP-AMP phosphotransférase) a été étudié par
mesure des vitesses initiales en fonction de la concentration de chacun des substrats. La
réaction catalysée est :

AMP + ATP 2 ADP

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La réaction a été suivie en couplant la production d’ADP à une réaction avec la pyruvate
kinase et la lactate déshydrogénase, en présence de phosphoénolpyruvate et de NADH :

ADP + phosphoénolpyruvate ATP + pyruvate

Pyruvate + NADH + H+ lactate + NAD+

On a mesuré au cours du temps la diminution d’absorbance entrainée par la disparition du

NADH (ε = 6220 M-1 cm-1), lorsque la concentration de myokinase était de 25 ng/ml (la
pyuvate kinase et la lactate déshydrogénase étant en excès). Les vitesses du tableau expriment
la variation d’absorbance au cours des deux premières minutes de la réaction :

[AMP] (mM)
[ATP] (mM) 0,095 0,153 0,24 0,96
0,106 0,19 0,24 0,29 0,39
0,127 0,2 0,26 0,305 0,405
0,27 0,26 0,32 0,36 0,45
1,08 0,32 0,375 0,41 0,48

Déterminer le mécanisme de la réaction et les paramètres cinétiques. Calculer le nombre

maximal de micromoles d’AMP transformées par minute et par mg de protéine.

Exercice 7 :
La nucléoside diphosphate kinase catalyse le transfert d’un résidu posphoryle d’un nucléoside
triphosphate vers un nucléoside diphosphate.
Pour déterminer le mécanisme de cette réaction, on a mesuré les vitesses initiales de
phosphorylation de la cytidine diphosphate (CDP) par l’adénosine triphosphate (ATP) à
différentes concentrations de ces substrats et en présence de 10 ng d’enzyme. Les vitesses
données dans le tableau sont exprimées en nanomoles de produit apparues par litre de milieu
réactionnel et par minute :

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[CDP] (mmol L-1)

[ATP] (mmol L-1) 4 2 1,5 1
0,08 25,5 24,2 23,5 22
0,16 39 36 34,3 31,4
0,24 47 43 40,7 36,6

1/ Par quel mécanisme cinétique procède la réaction ?

2/ Déterminer les paramètres cinétiques correspondants.

Exercice 8 :
L’étude d’une amine oxydase du plasma de bœuf a été entreprise, afin de déterminer le
mécanisme cinétique de la réaction qu’elle catalyse, l’oxydation de la benzylamine :

benzylamine + O2 + H2O benzaldéhyde + NH3 + H2O

La reaction peut etre suivie en mesurant l’augmentation de l’absorbance à 250 nm (due à

l’apparition du bezaldéhyde) ou en dosant l’eau oxygénée formée.
1- On a étudié les vitesses initiales de la réaction exprimées en unité arbitraire) pour
différentes concentrations de benzylamine et d’oxygène.

[benzylamine] (mM)
[O2] (µM) 0,209 0,418 0,835 3,34
7,85 0,16 0,25 0,34 0,478
15,9 0,175 0,29 0,425 0,66
46,2 0,188 0,32 0,505 0,876
257 0,194 0,34 0,55 1,02

a / Déterminer le mécanisme de la réaction.

b/ Déterminer les constantes de Michaelis pour chacun des deux substrats et la vitesse
maximale de la réaction.
2- Par ailleurs, on a mesuré la formation de benzaldéhyde lorsqu’on a travaillé en conditions

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anaérobies.

Enzyme (nmol) 5,95 5,95 2,12 2,12

Benzaldéhyde formé (nmol) 6,98 5,61 2,17 2,50

Ces résultats sont ils en accord avec le mécanisme déterminé par les études cinétiques

Exercice 9 :
Le récepteur de l’insuline présente une activité tyrosine kinase, que l’on peut étudier en
mesurant la phosphorylation d’un peptide de 13 acides aminés renfermant une tyrosine. Le
tableau résume les expériences effectuées à différentes concentrations d’ATP et de peptide, en
présence de 25 ng de récepteur. Les vitesses sont exprimées en 10 -12 moles de peptide
phosphorylés en 1 min dans un essai de 3 ml.

[ATP] (µM)
[peptide] (mM) 14 28 43 67 243
0,11 0,178 0,245 0,28 0,31 0,37
0,17 0,25 0,34 0,39 0,44 0,51
0,3 0,36 0,49 0,57 0,63 0,74
0,48 0,46 0,63 0,73 0,81 0,95
2 0,71 0,98 1,13 1,25 1,47

Déterminer le mécanisme de la réaction, les constantes de Michaelis correspondantes (K M

ATP et KM peptide) et la vitesse maximale, exprimée en nanomoles par min et par mg de
récepteur.
Exercice 10 :
L’adénosine 5’-phosphosulfate kinase est une enzyme qui participe à l’incorporation du
sulfate dans les molécules organiques. On a étudié la réaction qu’il catalyse dans le sens de la
formation d’ATP à partir d’ADP et d’adénosine 3’-phosphate 5’-phosphosulphate (PAPS).
1. le tableau suivant donne les vitesses initiales, exprimées en unités arbitraires, mesurées à
différentes concentrations d’ADP et de PAPS :

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[PAPS] (µM)
[ADP] (mM) 3,2 5,12 10,24 192
0,33 0,017 0,025 0,042 0,117
0,5 0,021 0,03 0,049 0,119
1 0,027 0,038 0,059 0,122
5 0,034 0,047 0,07 0,124

Déterminer le mécanisme de la réaction et les constantes correspondantes.

2. Pour confirmer ce mécanisme on a étudié l’inhibition par un analogue du PAPS, l’iso-
PAPS, en travaillant en présence de PAPS 16 µM et à différentes concentrations d’ADP.

[iso-PAPS] (µM)
[ADP] (mM) 0 14,4 28,8 43,2
0,25 0,05 0,034 0,026 0,021
0,33 0,055 0,037 0,027 0,022
0,5 0,063 0,04 0,029 0,023
1 0,073 0,044 0,031 0,024
5 0,084 0,047 0,033 0,025

Les résultats sont-ils en accord avec le mécanisme déterminé précédemment ?

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