UNIVERSITE DE YAOUNDE I THE UNIVERSITY OF YAOUNDE I

FACULTÉ DES SCIENCES FACULTY OF SCIENCE

Department of Biochemistry
Département de Biochimie

TRAVAUX DIRIGES DE L’UE BCH 311

ANNEE ACADEMIQUE 2024-2025

Série 2: Notion quantitative de fixation Protéine-Ligand, Liaison Protéine-Ligand

En salle, chaque étudiant devra apporter une calculatrice et des feuilles de papier millimétré.

Exercice A: Représentation de Scatchard

Une protéine P fixant un acide aminé ; probablement engagée dans le transport membranaire a
été libéré de E coli par choc osmotique et purifié. Son poids moléculaire déterminé est de 35000. Une
solution de cette protéine (0,5 mg/ml) est placée dans un compartiment de la chambre à dialyse. Un
volume équivalent de tampon contenant 4x10-5 M de leucine-14C est placé dans l’autre compartiment. Les
deux compartiments sont séparés par une membrane semi-perméable à travers laquelle l’acide aminé peut
traverser librement. Cependant la protéine est restreinte à un compartiment. Après équilibre, le
compartiment contenant la protéine a une concentration totale de leucine-14C de 2,3x10-5 M (libre + liée).
Le compartiment sans protéine contient la leucine-14C à une concentration de 1,7x10-5 M. Calculez :
1- La concentration de la leucine-14C fixée à la protéine.
2- La concentration de la protéine libre.
3- La constance de dissociation du complexe Protéine-leucine-14C.

Exercice B. La fixation du glucose et de l'ATP‐Mg sur l'hexokinase a été suivie par dialyse à l'équilibre.
Les résultats obtenus sont résumés dans les tableaux ci‐dessus:
1- Que pouvez‐vous conclure ?
2- Déterminer lorsque c'est possible, le nombre de sites et la constante de dissociation du complexe
enzyme‐substrat, sachant que les expériences sont réalisées à pH 8,9 ET 30°C avec une
concentration d'enzyme égale à 35 μM.

2
 Série 3: Cinétique enzymatique à un substrat

En salle, chaque étudiant devra apporter une calculatrice et des feuilles de papier millimétré.

A- Cinétique chimique: Ordre de la réaction et constances de vitesse

Exercice 1
La loi de vitesse d’une réaction peut être exprimée, par –dx/dt=k(x)n. Déterminer les unités de la
constante de vitesse k lorsque n= 0, 1, 2, 3, sachant que la vitesse de la réaction est exprimée en mol.L-1.s-
1

Exercice 2
On étudie la réaction suivante: A + B → P en mesurant la concentration de A en fonction du temps.
t (min) 1 2 3 6 10 14 20 26 33 40
[A] (mM) 5 4,82 4,7 4,25 3,76 3,3 2,6 2 0,94 0,15

a) Tracer la représentation de la concentration de A en fonction du temps. Commentez cette

représentation. Déterminez l’ordre de la réaction par rapport à A et la constante de vitesse de la réaction
de transformation de la substance A.
b) Calculer la concentration de A restant et de produit P formé au bout d’une heure de réaction si la
concentration de départ de la substance A est de 10 mM.
c) Calculer la demi-vie de la réaction.

Exercices supplémentaires
1- Les données du tableau suivant ont été obtenues pour la vitesse d’une réaction de stoechiométrie
A + B → P à différentes concentrations de A et de B. Déterminez l’ordre de la réaction par rapport
à A et à B et suggérez une explication pour l’ordre observée pour A.
[A] (mM) 10 20 50 100 10 20 50 100
[B] (mM) 10 10 10 10 20 20 20 20
v (µmol-1s-1) 0,6 1,0 1,4 1,9 1,3 2,0 2,9 3,9
[A] (mM) 10 20 50 100 10 20 50 100
[B] (mM) 50 50 50 50 100 100 100 100
v (µmol-1s-1) 3,2 4,4 7,3 9,8 6,3 8,9 14,4 20,3

2- The hydrolysis of sucrose: Sucrose + H2O → glucose + fructose takes the following time course.

Time (min) 0 30 60 90 130 180

Sucrose (M) 0,5011 0,4511 0,4038 0,3626 0,3148 0,2674

a- Determine the first-order rate constant and the half-life of the reaction.
b- Why does the bimolecular reaction follow the first-order rate law?
c- How will it take to hydrolyse 99 % on the sucrose initially present?
d- How will it take if the amount of sucrose initially present is twice that given in the table?

B- Cinétique enzymatique: Conditions d’équilibre et état stationnaire

1- For Michaelis-Menten reaction, k1 = 5x105 M-1s-1, k-1 = 2x104 M-1s-1, k2 = 4x102 M-1s-1. Calculate KS and
KM for this reaction. Does substrate binding achieve equilibrium or steady state?

3
Détermination de la Vitesse initiale des réactions enzymatiques et méthode de détermination de Vmax et
KM

On observe deux parties sur cette courbe :

• Une première partie pour les temps courts qui peut être assimilée à une droite. La quantité de
produit formé est proportionnelle au temps.
• Un plateau correspondant à l’arrêt de la production de produit car l’ensemble du substrat aura été
transformé en produit.
Ce type de graphique permet de calculer la vitesse initiale de la réaction, exprimée en µmol/min.
La vitesse initiale correspond à la quantité de produit apparu par unité de temps. Elle est calculée
en prenant la tangente à l’origine qui est une droite et dont la pente donne la vitesse initiale. (Pour
rappel : pente = (YB – YA)/(XB – XA).

2- Malate dehydrogenase catalyses the reaction:

(L)-malate + NAD ↔ oxaloacetate + NADH + H+

The rate of the forward reaction was investigated in the presence of saturating concentrations of malate
and a fixed concentration of enzyme. The following results were obtained:

NAD+ Absorbance (at 340nm) at time t (minutes)

concn
(mmol.l-1) t=0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
1.5 0.033 0.056 0.079 0.102 0.122 0.138
2.0 0.036 0.063 0.089 0.116 0.138 0.154
2.5 0.040 0.069 0.099 0.128 0.150 0.168
3.33 0.043 0.075 0.108 0.140 0.163 0.175
5.0 0.047 0.084 0.121 0.158 0.177 0.184
10.0, 0.052 0.095 0.137 0.180 0.192 0.200

a- Find the initial velocity at each concentration

b- Represent the initial velocity as a function of substrate concentration
c- Estimate Vmax and KM.
d- Use the lineweaver-Burk representation to calculate the values of Vmax and KM.
e- What can you conclude

3- Determination of Kcat
Penicillin is hydrolysed and thereby rendered inactive by penicillinase (also known as -lactamase), an

4
enzyme present in some resistent bacteria. The mass of this enzyme from Staphylococcus aureus is 29.6
kDa. The amount of penecillin hydrolysed in 1 min in 10 ml solution containing 10-9g of purified
penicillinase was measured as a function of concentration penicillin. Assume that the concentration of
penicillin does not change appreciably during the assay.
a- Plot 1/Vo versus 1/[S] for these data. Does penicillinase appear to obey Michaelis-Menten
kinetic? If so what is the value of KM?
b- What is the value of Vmax?
c- What is the turnover number of penicillinase under these experimental conditions? Assume
one active site per enzyme molecule.

[Penicillin] (M) Amount hydrolyzed (moles)

0.1 x 10-5 0.11 x 10-9

0.3 x 10-5 0.25 x 10-9

0.5 x 10-5 0.34 x 10-9

1.0 x 10-5 0.45 x 10-9

3.0 x 10-5 0.58 x 10-9

5.0 x 10-5 0.61 x 10-9

Exercices supplémentaires
1- An embryonic liver tissue contains an enzyme that catalyses the reaction S→P. Adult liver also displays
S→P activity. Some kinetic data are shown below. What conclusion can you draw concerning the identity
of the two enzymes?

[S] in M x 10-5 Observed initial velocity (µmoles x mg protein-1xmin-1)

Extract of adult liver E1 Extract of embryonic live E2
1.67 1.05 5.00
2.5 1.54 6.66
3.33 1.98 8.00
5.0 2.86 10.00
7.0 3.78 11.67
10.0 5.00 13.33
15.0 6.67 15.0
16.7 7.15 15.4
20.0 8.00 16.0
30.0 10.00 17.1

2- Le tableau ci-dessous donne les valeurs des concentrations de produits [P] en mM à différents temps
(en min) pour 5 valeurs différentes de la concentration initiale en substrat [A] en mM.
a. Estimez la vitesse initiale pour chaque concentration en substrat à partir des graphiques de [P] en
fonction de t.
b. Ensuite estimez KM et Vmax, en supposant que la vitesse initiale est donnée par
l’équation de Michaelis-Menten.
[A]=1 [A]=2 [A]=5 [A]=10 [A]=20
Temps
1 0,095 0,18 0,37 0,556 0,76

5
 2 0,185 0,34 0,71 1,08 1,50
3 0,260 0,49 1,01 1,57 2,20
4 0,330 0,62 1,29 2,04 2,88
5 0,395 0,74 1,56 2,57 3,50
6 0,450 0,85 1,80 2,87 4,12
7 0,505 0,95 2,02 3,23 4,66
8 0,555 1,04 2,22 3,59 5,24
9 0,595 1,12 2,40 3,92 5,74
10 0,630 1,20 2,58 4,22 6,24

Serie 4 : Inhibition enzymatique et effet du pH sur l’activité enzymatique.

A- Inhibition enzymatique
Exercice 1. Le tableau suivant montre les vitesses d’un substrat suite à une catalyse enzymatique qui suit
le mécanisme de Michaelis-Mentem : (1) en absence d’inhibiteur, (2) et (3) en présence respective de deux
inhibiteurs à 10mM de concentration. On suppose que [E]T est la même pour toutes les réactions.
[S] (1) (2) : Inhibiteur 1 (3) : Inhibiteur 2
(mM) Vo Vo Vo
(µM . s-1) (µM . s-1) (µM . s-1)
1 2,5 1,17 0,77
2 4,0 2,10 1,25
5 6,3 4,00 2,00
10 7,6 5,70 2,50
20 9,0 7,20 2,86
a. Déterminez KM et Vmax de l’enzyme.
b. Pour chaque inhibiteur déterminez le type d’inhibition
c. De quelle information supplémentaire avez-vous besoin pour calculer l’activité
moléculaire spécifique ?
d. Pour [S]= 5mM, Quelle fraction de molécules d’enzymes est fixée au substrat en
absence d’inhibiteur? En présence de 10 mM d’inhibiteur 2.

Exercice 2. The Following results were obtained for a single substrate enzyme catalyzed reaction (at fixed
initial enzyme concentration)
Substrate
Initial velocity (absorbance units.min-1) at initial inhibitor concentration [Io] (mmol-1)
concentration
(mmol.l-1) [Io]= 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
2.0 0.432 0.396 0.365 0.339 0.317
2.5 0.485 0.448 0.417 0.389 0.365
3.33 0.552 0.516 0.485 0.457 0.432
5.0 0.642 0.609 0.579 0.552 0.529

a. What can you deduce about the nature of inhibition?

b. Determine the catalytic (Vmax, KM) and inhibition constants for this enzyme.
c. When the substrate concentration is equal to 2.5 mM, what fraction of enzyme has a bound
substrate at 4.0 mM concentration of inhibitor?

Exercice 3. Inhibition de l’activité enzymatique de la -Galactosidase

On suit la cinétique d'hydrolyse de l'orthonitrophényl--D-galactopyranoside (ONPG) par la -
galactosidase, respectivement en absence d'inhibiteur et en présence d'orthonitrophényl- -D-
thiogalactopyranoside (ONPTG), de maltose (-D-glucopyranosyl-(1,4)--D-glucopyranose) ou de

6
mélibiose (-D-galactopyranosyl-(1,6)--D-glucopyranose). Les valeurs des vitesses initiales obtenues en
suivant la variation de l'absorbance à = 410 nm due à la coloration jaune de l’orthonitrophénol (ONP),
produit de la réaction, sont les suivantes :

[S]o (M) A.min-1

Sans I [ONPTG] [maltose] 0,26 M [mélibiose] 0,17
3 10-4 M M
0 0 0 0 0
2,5 10-5 0,033 0,018 0,016 0,027
5 10-5 0,055 0,033 0,027 0,041
1 10-4 0,082 0,055 0,041 0,055
2,5 10-4 0,118 0,091 0,059 0,069
5 10-4 0,138 0,118 0,069 0,075
1 10-3 0,150 0,138 0,075 0,079

a. Ecrivez les structures du substrat ONPG, et des inhibiteurs ONPTG, Maltose et Mélibiose.
b. Ecrivez la réaction catalysée par l’enzyme β–galactosidase.
c. A quelle classe appartient cette enzyme ? justifiez votre réponse.
d. Déterminer Vmax, KM et kcat (en s-1) à l'aide de la représentation de votre choix.
e. Déterminer les paramètres cinétiques Vmapp et KMapp en présence des inhibiteurs (les tracés à
effectuer sur le même graphique que le précédent).
f. Expliquer le type d'inhibition observé pour chacun des inhibiteurs de cet exercice.
g. Calculez les constantes KI pour l’un de ces inhibiteurs à votre choix, à partir de la relation qui lie
KMapp ou Vmaxapp de chacun de ces inhibiteurs à [I] et Ki.
h. Exprimez la Vmax en ONP apparu par unité de temps en utilisant la loi de Beer Lambert. Le
coefficient d’extinction molaire M de ONP en donné en fin d’exercice.
Données: [E]o = 1,19.10-9 M; M de ONP = 3300 M-1.cm-1; l = 1 cm

Exercice 4. La courbe A représente les résultats d’une étude cinétique de l’activité d’une enzyme E
sur un substrat S dans des conditions bien définies.

7
 A- Question n° 1:
a. Calculer le Km de l’enzyme pour son substrat.
b. Calculer la Vmax.
c. A quoi correspond la pente de cette courbe ? Calculer sa valeur en précisant les unités.

B- Question n° 2:
La courbe B représente les résultats d’une cinétique obtenue dans les mêmes conditions mais en

présence dans le milieu d’incubation d’un inhibiteur à une concentration de [I] = 8.10-5 M. Dans quel
type d’inhibition peut-on classer cet inhibiteur ? Justifier votre réponse.
C- Question n° 3:
Calculer la constante d’inhibition (Ki) de l’inhibiteur pour l’enzyme.
D- Question n° 4:

a) Déterminer v0 et v0 app pour [S]1 = 0,2. 10-4 M et pour [S]2 = 1.10-4 M. En déduire
le pourcentage d’inhibition. Commenter l’évolution de ce pourcentage lorsque [S] augmente.
b) Démontrer l’équation exprimant le pourcentage d’inhibition en fonction de (S), (I), KM et Ki.

B- Effet du pH sur l’activité enymatique

Exercice 1. An enzyme which follows the model for pH dependence for simple Michaelis-Menten enzymes
has pKES1=4 and pKES2=8.
a. What is the pH at which V’max is a maximum for this enzyme?
b. What fraction of Vmax does V’max achieve at this pH?

Exercice 2. Au cours de l’hydrolyse d’un substrat ester par la papaïne à température et concentration en
enzyme fixes mais à pH variables, les résultats suivants ont été obtenus.

Initial velocity (µmol.l-1 .min-1)

[So] (mmol.l-1)
pH 2.0 2.5 3.33 5.0 10.0
3.0 11 12 14 16 20
4.0 83 93 105 122 143
5.0 156 172 196 222 263
6.0 157 173 197 223 264
7.0 156 173 196 223 263
8.0 139 156 179 208 250
9.0 43 52 66 89 141
10.0 5 7 9 13 25

Trouvez les pKa des chaînes latérales des Aa engagés dans le site actif de la papaïne dans
l’exemple ci-dessus. Ceux du site de fixation et ceux engagés dans le complexe ES.