UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP

Faculté de Médecine, Pharmacie et Odontostomatologie

Département des Sciences Biologiques et Pharmaceutiques Appliquées

Techniques
Immuno-enzymatiques

Pr Moustapha Mbow
[email protected]

M2 Pharmacie – UE Immunotechnologie
Année universitaire 2023 – 2024

Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

1
 Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

Principe générale des méthodes

immunologiques
Ac => propriété de se
lier spécifiquement à un Ag

Outil de mise en évidence Techniques

des Ac ou des Ag immunologiques

Détection spécifique de molécules dans des

mélanges complexes ou tissus

2
 Réactions utilisant des
marqueurs

Ag Ac
Marqueur

Marqueur
Radio-isotope Enzyme
Elément fluorescent

Radio-immunologie Immuno-enzymologie

Immunofluorescence

Méthode immuno-enzymologie
(ELISA)

ELISA

3
 Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

Principe ELISA

Technique immuno-enzymatique (ELISA)

permettant de visualiser une réaction
antigène-anticorps grâce à une réaction
colorée produite par l'action d’un substrat
sur une enzyme préalablement fixée à
l'anticorps

4
 Principe ELISA

• Peroxydase: Avidin, horseradish peroxidase (HRPO)

• TMB: 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

Principe ELISA

Substrat
incolore Produit coloré

10

5
 Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

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ELISA direct (1/2)

Dosage d’Ag le plus souvent protéine virale ou

bactérienne
+
Ac associé à une enzyme

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6
 ELISA direct (2/2)

13

Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

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7
 ELISA indirect (1/2)

Ag plus souvent protéine virale ou bactérienne

+
Ac spécifique à l’Ag
+
Antiglobulines (anticorps anti-anticorps) couplés
à une enzyme

Notions Ag et Ac interchangeable !!!

15

ELISA indirect (2/2)

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8
 Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

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ELISA Sandwich (1/3)

Antigène à doser entre 2 anticorps spécifiques

reconnaissant des épitopes différents sur
l'antigène

Ac fixé
+
On ajoute le sérum à analyser (Ag ou Ac)
+
Anticorps de détection marqué par une enzyme
sur l'antigène recherché

18

9
 ELISA Sandwich (2/3)

19

ELISA Sandwich (3/3)

20

10
 Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

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ELISA par compétition (1/3)

Dosage d’un Ag (ou Ag) par compétition

Ac fixé
+
Ag à doser et Ag marqué entrant en compétition
avec ce dernier

Concentration de l’Ag marqué

inversement proportionnelle à l’Ag à
doser

22

11
 ELISA par compétition (2/3)

23

Méthodes ELISA (3/3)

Substrat
Substrat

Substrat Substrat
Ac secondaire Ac
marqué

Ac primaire
Ag Anti-Ac

ELISA direct ELISA indirect ELISA sandwich ELISA compétition

Ag à doser + Ac primaire Ac à doser Ac à doser

Ac marqué reconnu par en sandwich en compétition avec
second Ac marqué entre 2 Ac Ac marqué

24

12
 Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

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Coating (1/2)
Fixation dans des puits de l’Ag spécifique de
l'anticorps recherché

• Fixation de l‘Ag sur le fond des puits par

électrostatisme

• Incubation 4°C overnight

• Lavage pour éliminer les Ag en excès

26

13
 Coating (2/2)

27

Blocking (1/3)

Permet d’éviter les fixations non specifiques

• Solution de blocage pendant 1h à 37°C

• Molécules couvrant les sites non occupés

28

14
 Blocking (2/3)

29

Blocking (3/3)

Blocking

30

15
 Incubation de l’Ag (Ac) à doser
(1/2)
Incubation de l’Ag (Ac) à doser

• Incubation à 37°C de la solution d'anticorps à

doser pendant environ 30 minutes à 2 heures

• Fixation spécifique des Ac sur l‘Ag

• Lavage pour éliminer les anticorps à doser en

excès

31

Incubation de l’Ag (Ac) à doser

(2/2)

32

16
 Incubation de l’Ac de
détection (1/2)
• Incubation de l’Ac de détection à 37°C pendant
environ 30min

• Fixation spécifique des Ac de détection couplés

à une enzyme sur l’Ac (chromogène)
o TMB+++

33

Incubation de l’Ac de
détection (1/2)

34

17
 Révélation (1/3)
• Solution révélatrice contenant le substrat pour
l'enzyme (Peroxydase +++)
o HRP (Horse Radish Peroxidase)

• Incubation à température ambiante et à

l'obscurité pendant 10 minutes

• Coloration = présence de l‘Ac à doser

o Intensité proportionnelle à la concentration
d‘Ac recherché

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Révélation (2/3)
Réaction entre enzyme et substrat

Substrat
incolore Produit coloré

36

18
 Révélation (3/3)
Réaction entre enzyme et substrat

Solution stop: Acide sulfurique

37

Détermination de la
concentration (1/3)
Dilution du standard
100ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul

Standard 900ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul 500ul Blanc
1:1 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:512 1:1240 0
0

Courbe d’étalonnage

38

19
 Détermination de la
concentration (2/3)
Courbe d’étalonnage

39

Détermination de la
concentration (3/3)
Courbe d’étalonnage: logiciel d’exploitation

40

20
 Configuration plaque ELISA (1/2)

41

Configuration plaque ELISA (1/2)

42

21
 Kit ELISA

43

Lecteurs ELISA

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 Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Avantages et inconvénients
Conclusion

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Avantages

• Détection spécifique / anticorps monoclonaux

• Possibilité de quantification par un étallonage

o Courbe standard

• Haute sensibilité / utilisation d‘Ac secondaires

• Accessible

• Pas de nécessité d'appareillage spécialisé.

• Durée de validité des kits assez longue

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23
 Inconvénients

• Limite de détection est moins bonne que la

technique RIA.

• Réactions enzymatiques dépendantes de la

température, du pH et de la lumière.

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Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

48

24
 ELISPOT

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FluoroSpot (1/2)

 Modification du test ELISPOT

 Mesure sécrétion de plusieurs cytokines par

une même cellule

 Avantage pour un nombre restreint de

cellules

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25
 FluoroSpot (2/2)

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Multiplexing ou technique
Luminex® (1/2)
Principe: ELISA + Cytometrie
Bille

Ac primaire
Analyte

Billes de spectres de
couleur différent
Ac marqué
par la PE

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 Multiplexing ou technique
Luminex® (2/2)

Signal associé à
Laser vert
l’élément à doser

Signal associé au
Laser rouge nombre de billes

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Plan
Introduction
Méthodes immuno-enzymatiques
ELISA indirect
ELISA indirect
ELISA sandwich
ELISA compétition
Etapes de la méthode ELISA
Variantes des méthodes immuno-enzymatiques
Conclusion

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 Conclusion
Méthodes immuno-enzymatiques hautement
spécifique, sensibilité et accessible

Réalisation limitée par certaines conditions

physico-chimiques

De plus en plus remplacées par techniques

alternatives
• Plus sensibles permettant le dosage de
plusieurs marqueurs à la fois
• Point Of Care (POC)

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28