‫الجوهىريت الجسائريت الديوقراطيت الشعبيت‬

People's Democratic Republic of Algeria

‫وزارة التعلـين العالي و البحث العلوي‬
Ministry of Higher Education and Scientific Research

‫جاهعـت حسيـبت بن بىعلي الشـلف‬

Hassiba Ben Bouali University of Chlef

‫كليت علىم الطبيعت و الحياة‬

Faculty of Natural and Life Sciences
‫قسن البيىلىجيا‬
Biology department

Cours du module

Génie –génétique

Préparer par

Dr. ZIANI Mouna

Destiné aux étudiants de 3emeannée Licence de Biologie

moléculaire

2019/2020
 Sommer

Chapitre I : Les outils enzymatiques du génie génétique

1. Les enzymes de restriction.

2. Les autres enzymes d’usage courant en biologie moléculaire.

Chapitre II : L’hybridation moléculaire

1. Rappels sur le principe de la réaction d’hybridation.

2. L’hybridation en phase liquide.

3. L’hybridation sur support solide.

4. L’hybridation in situ

Chapitre III : Les vecteurs

1. Généralités sur les vecteurs.

2. Les plasmides

3. Les phages.

4. Les autres types de vecteur

Chapitre IV : Les sondes.

1. Le concept de sonde.

2. Les agents de marquages

3. Quelques stratégies de marquage

Chapitre V: Le clonage

1. Le principe du clonage.

2. Les bases du clonage de l’ADN

3. Les banques d’ADN.

4. Criblage de la banque d’ADN (Détection des recombinants)

Chapitre VI : La transformation génétique

1. Transformation par canon à particule.

2. Transformation par Agrobacterium tumefasciens

Chapitre VII: Génie-génétique et applications

Chapitre I -les outils enzymatiques du génie génétique

I-Les enzymes de restriction :

Généralités
Découvertes à partir de 1973. Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître
spécifiquement une courte séquence, de 4 à 10pb, et de cliver l'ADN au site reconnu. Ils
permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille réduite, ou de le couper à tel ou tel site
désiré. Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux fragments dont les
extrémités sont franches. Cependant, la plupart réalisent une coupure dissymétrique : on parle
dans ce cas d'extrémités cohésives (chaque fragment possède une chaîne qui dépasse l'autre de
quelques bases). Plusieurs centaines de ces enzymes ont été caractérisés: ils reconnaissent une
grande variété de sites de coupure.

Les enzymes de restriction sont utilisés pour établir une carte de restriction de toute molécule
d'ADN que l'on souhaite caractériser. Cela consiste à déterminer l'ordre des sites de restriction
le long de cette molécule, qui vont produire, après "digestion enzymatique" de cette molécule,
des fragments de tailles différentes dont la taille pourra être définie par électrophorèse.

Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases, c’est-à-dire des

enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur
d’un acide nucléique. Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la
molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).

Le phénomène de restriction :

Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement
des séquences dites palindromiques. Les séquences palindromiques sont des séquences où la
succession des nucléotides lue dans le sens 5’à3’ (gauche-droite) pour le premier brin est
identique à la séquence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens 5’à3’). Ces
séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4, 5 ou 6 paires de bases. Il faut
remarquer que dans les ADN, on rencontre statistiquement des séquences reconnues par des
enzymes de restriction. Ainsi, la séquence GATC reconnue par l’enzyme Mbo I est présente
avec une fréquence statistique de 1 / 256 paires de bases (1/ 44). En effet, la fréquence de
coupure d’un ADN par une enzyme de restriction donnée peut être approchée statistiquement
en considérant le nombre de nucléotides de la séquence spécifique reconnue par l’enzyme.
Ainsi, par exemple, dans la séquence de six nucléotides: GGATCC reconnue par l’enzyme
Bam HI, on aura donc une fréquence de coupure statistique de 1 / 46, soit 1 coupure tous les
4096 nucléotides.

Origine des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le plus souvent des bactéries.
Les bactéries peuvent être parasitées par des virus à ADN. Les bactéries fabriquent des
enzymes de restriction qui sont capables de cliver les ADN étrangers. Pour éviter une
autodestruction de leur propre ADN, elles se protègent contre leurs propres enzymes de
restriction par une modification des sites de restriction correspondants.
Nomenclature des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. Leur nom comporte
plusieurs lettres (3 ou 4). La première lettre de dénomination de l’enzyme est écrite en
majuscule, elle correspond au genre de la bactérie d’où a été extraite l’enzyme. La seconde
lettre et la troisième lettre (en minuscules) correspondent à l’espèce de la bactérie d’où
l’enzyme est extraite. On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule correspondant à
la souche bactérienne. Enfin pour terminer, un chiffre romain indique l’ordre de
caractérisation de ces enzymes.

Exemples:

Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC

Sma I Extraite de Serratiamarcescens site reconnu: CCC / GGG

Pst I Extraite de Providenciastuartii site reconnu: CTGCA / G

Les classes d’enzymes de restriction.

La plupart des enzymes de restriction utilisées au laboratoire présentent un site de

reconnaissance (souvent palindromique) et un site de coupure identique ou proche du site de
reconnaissance, ce sont des enzymes de type II. Certaines bactéries possèdent d’autres types
d’enzymes de restriction.

Les enzymes de type I reconnaissent des séquences sur l’ADN sans aucune symétrie. Ces
enzymes coupent non pas au niveau de la séquence de reconnaissance mais 1000 à 5000
paires de bases plus loin. Les enzymes de type III présentent également un site de
reconnaissance mais coupent une vingtaine de nucléotides plus loin.

Notion d’isoschizomères

Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître des mêmes sites spécifiques, on les
appelle isoschizomères. Les isoschizomères fournissent souvent après clivage enzymatique
des fragments dont les extrémités sont différentes.

Exemple :

Soit la séquence suivante: GGTACC, cette séquence est coupée par l’enzyme Kpn I et
l’enzyme Acc65 I:
Kpn I:

5’-G-G-T-A-C/C-3’
3’-C/ C-A-T-G-G-5’

Acc65 I:

5’-G/G-T-A-C-C-3’
3’-C-C-A-T-G/G-5’

Ces enzymes sont des isoschizomères, elles reconnaissent en effet la même séquence
nucléotidique GGTACC. On voit tout de suite que les extrémités des fragments obtenus
diffèrent.

Types de coupures realisées par les enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures: la coupure à bouts francs
et la coupure à bouts collants.

La coupure à bouts francs aboutit à une coupure au milieu de la séquence palindromique. La

coupure à bouts collants (ou à extrémités adhésives) correspond à une coupure qui se fait de
part et d’autre du centre de symétrie.

Les sites de restriction sont repérés dans l’ADN par l’enzyme de restriction qui coupe l’ADN
en principe autant que fois qu’il y a de sites de restriction. Ceci est valable pour une enzyme
de restriction donnée, pour une autre enzyme, la coupure se fera en une position différente sur
l’ADN. On voit tout de suite les possibilités considérables de ce type d’outils enzymatiques.
L’ADN est découpé en fragments variables et ceci aussi bien l’ADN circulaire des bactéries
ou des plasmides que l’ADN linéaire.

Méthylation des sites de restriction et inactivation des enzymes de restriction.

L’ADN bactérien présente des sites de restriction susceptibles d’être repérés par les enzymes
de restriction que possède la bactérie. Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de
modification de l’ADN bactérien interviennent. Ces enzymes de modification sont des
méthylases bactériennes (ou enzymes de méthylation). La méthylation de la cytosine (sur le
carbone 5) ou de l’adénine (sur l’azote 6) appartenant à des sites de restriction aboutit à une
inactivation de l’enzyme de restriction correspondante. Cette méthylation peut se réaliser sur
une base ou sur plusieurs bases appartenant au site de restriction. Les méthylases bactériennes
sont très spécifiques.

Les méthylations dans le génome des eucaryotes concernent les cytosines impliquées dans les
doublets dinucléotidiques CG. La recherche de ces doublets et de la présence ou non d’une
méthylation sur les cytosines est réalisée à l’aide de deux enzymes de restriction, une enzyme
insensible à la méthylation des cytosines et une autre enzyme sensible à la méthylation des
cytosines.

Utilisations des enzymes de restriction.

Les utilisations des enzymes de restriction sont très nombreuses en biologie moléculaire. Par
exemple, elles permettent de fractionner l’ADN en multiples fragments susceptibles d’être
séparés par les techniques d’électrophorèse. Les enzymes de restriction peuvent être utilisées
pour préparer un fragment d’ADN d’un gène donné (insert) à être inséré dans un vecteur
comme un plasmide. Les enzymes de restriction sont utilisées couramment pour rechercher
des mutations dans le génome.

Les enzymes de restriction sont utilisées pour rechercher dans l’ADN des cellules eucaryotes
les méthylations de bases. Ces méthylations ont une signification complètement différente des
méthylations de bases observées chez les procaryotes. Elles sont en relation directe avec des
modifications de l’expression des gènes des eucaryotes. La méthylation provoque le
verrouillage de l’expression de tel ou tel gène dans un tissu.

II-Les autres enzymes d’usage courant en biologie moléculaires génie génétique :

II-1.les polymérases :

Propriétés générales

Les enzymes recopiant aussi bien une chaîne d’ADN ou d’ARN ont les propriétés générales
suivantes:

- Elles synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’à3’.

- Cette synthèse s’effectue de manière complémentaire et antiparallèle.

- Elles nécessitent la présence de nucléosides triphosphates (NTPs) ou de désoxynucléosides
triphosphates (dNTPs).

Les enzymes recopiant un ADN en ADN

Ces enzymes sont des ADN polymérases ADN dépendantes. Elles ne sont pas capables de
synthétiser le brin nouveau d’ADN sans la présence d’une amorce d’acide nucléique.

Toutes les ADN polymérases possèdent les caractéristiques suivantes:

- Elles ont besoin d’une amorce avec une extrémité 3’-OH libre.

- La chaîne nouvelle d’ADN est synthétisée dans le sens 5’à3’.

- La chaîne nouvelle est complémentaire de la chaîne matrice d’ADN et antiparallèle.

Exemple1 L’adn polymérase I (extraite de E. Coli) et le fragment de klenow

Comme exemple-type d’ADN polymérase, nous citerons l’ADN polymérase I qui est extraite
d’E.coli. Cette enzyme possède des propriétés polymérasiques, mais aussi des propriétés
exonucléasiques. Il est important de préciser que les exonucléases peuvent couper les
nucléotides un par un à partir d’une chaîne polynucléotidique avec une spécificité soit de
l’extrémité 5’ (coupure 5’à3’), soit de l’extrémité 3’ (coupure 3’à5’). L’ADN polymérase I
possède les deux activités exonucléasiques: 5’à3’ et 3’à5’. Cette enzyme est constituée par
une seule chaîne polypeptidique.

Au laboratoire, on utilise souvent une enzyme préparée à partir de l’ADN polymérase I qui est
appelée fragment de KLENOW. Cette enzyme ne possède plus d’activité exonucléasique
5’à3’, il reste les propriétés polymérasiques et les propriétés exonucléasiques 3’à5’. L’activité
3’à5’ permet à l’enzyme au cours d’une synthèse d’un fragment d’ADN de contrôler si
l’appariement de la base qui vient d’être ajoutée est conforme aux règles de complémentarité.
Cette remarquable activité exonucléasique 3’à5’ est encore appelée la fonction d’édition de
l’enzyme.

Pour plus d’informations sur la DNA polymérase et sa mise en évidence voire le chapitre
synthèse in vitro de ce cours.

Exemple2 La Taq polymérase

La Taq polymérase est une ADN polymérase extraite de bactéries présentes dans les sources
chaudes. Elle permet de travailler à des températures plus élevées que les températures
usuelles (ambiante ou 37°C). Elle est très utilisée dans les réactions d’amplification génique et
également dans les réactions de séquençage de l’ADN. En principe, elle est dépourvue de
l’activité exonucléasique 3’à5’.

Les enzymes recopiant un ARN en un ADN

Exemple1 la rétrotranscriptase ou transcriptase inverse

Cette enzyme est surtout présente dans les rétrovirus (virus à ARN). Elle permet de fabriquer
à partir d’un ARN messager (mARN) un ADNc (ou séquence d’ADN complémentaire d’un
mARN).

Elle possède les propriétés suivantes:

- C’est une ADN polymérase qui synthétise le nouveau fragment dans le sens 5’à3’.

- Elle est ARN-dépendante.

- Elle est dépourvue d’activité exonucléasique 3’à5’, donc de fonction d’édition. Elle peut
donc insérer des bases par erreur.

- Elle a une activité RNAse.

Les enzymes recopiant un ADN en un ARN

Les ARN polymérases réalisent des transcriptions de l’un des deux brins d’ADN en un brin
d’ARN. Elles sont extraites des bactéries. Ces ARN polymérases possèdent les propriétés
suivantes:

- Elles synthétisent le brin nouveau dans le sens 5’à3’.

- Elles n’ont pas besoin d’amorce pour commencer la synthèse (à la différence des ADN
polymérases).

- Elles nécessitent des ribonucléosides triphosphates (ou NTPs) et également (comme les
autres polymérases) des ions Mg2+.

- Elles sont dénuées d’activité d’édition.

- Enfin, dans des conditions normales de transcription, les ARN polymérases ne peuvent
démarrer la transcription que si l’ADN à transcrire possède le promoteur spécifique
correspondant.

II.2.Les ligases
Les ligases sont capables de lier par une liaison ester un fragment avec un groupement
phosphate en 5’ et un groupement OH en 3’ et ceci en présence d’ATP. Elles peuvent
effectuer des ligatures sur des fragments d’ADN avec bouts francs ou des bouts collants (ou
extrémités cohésives). Elles sont extraites de bactéries. Il existe ADN et ARN ligases.

II.3.Les nucléases :

La DNase

La DNase utilisée au laboratoire est extraite du pancréas de bovin. Il s’agit d’une

endonucléase qui coupe l’ADN double brin (mais aussi l’ADN simple brin). Elle conduit à
des coupures ou « nicks » tout à fait au hasard, sans reconnaissance d’un site spécifique (ce
qui la distingue des enzymes de restriction). On obtient des fragments de tailles variées (ou
oligonucléotides) qui possèdent en leur extrémité 5’ un groupement phosphate. Cette enzyme
est sensible à des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+).

La nucléase S1

Cette enzyme extraite d’un champignon, n’attaque que l’ADN simple brin. Elle n’attaque pas
en principe les ADN doubles brins et les hybrides ADN-ARN.

II.4. Les enzymes enlevant ou ajoutant des groupes phosphates.

Enzymes enlevant des groupes phosphates

Ces enzymes sont appelées phosphatases. Les phosphatases alcalines sont actives à pH
alcalin. Elles permettent d’enlever le groupement phosphate situé en 5’ d’une chaîne d’ADN.
Elles sont extraites de bactéries ou d’origine animale (intestins). Elles sont utilisées pour
préparer de l’ADN recombinant.
Enzymes ajoutant des groupements phosphates
Les kinases permettent de fixer un groupement phosphate en présence d’ATP. Dans cette
molécule d’ATP, le phosphate fixé est celui situé en position gamma (position la plus externe)
de la molécule d’ATP. Le groupement phosphate est fixé à l’extrémité 5’ d’un ADN
préalablement déphosphorylé. Ces kinases sont extraites de bactéries.

Chapitre II : Hybridation Moléculaire

I-Rappels sur le principe de la réaction d’hybridation :

I-1/ Notion de température de fusion de l’ADN :

C’est une température, appelée également température de demi dénaturation (Tm) qui
correspond à l’ouverture ou au déroulement de 50% de la chaîne de l’ADN chauffé. C'est
l'effet hyperchromique qui correspond à la rupture des liaisons hydrogènes (liaisons faibles) et
la séparation des 2 chaînes entraîne une augmentation dans l'absorption d'U.V de 40% à 260
nm.

Figure N°1 : Mise en évidence du phénomène coopératif de passage de l’ADN double brin à
l’ADN simple brin et mesure de la Tm.

I-2 / Facteurs influençant la température de fusion :

Plusieurs facteurs peuvent influencer la valeur de la Tm :

1. la composition en bases : la complémentarité des deux brins de l’ADN estmaintenue grâce

à l’appariement entre G et d’une part et A et T d’autre part. Mais lenombre de liaison
hydrogène n’est pas le même pour chaque couple de base. Il estévident donc que le nombre de
bases sera un facteur non négligeable dans le calculde la Tm. De manière générale, on note
que la relation entre la composition en G+C et la Tmets de nature linéaire pour des ADN de
longueurs identiques ou suffisamment longs (> 100pb) :Tm = 69,3 + 0,41 (%G+C) Mais en
pratique, pour les oligonucléotides (duplexes deparfaits de 11 à 20 bases), on utilise plutôt la
formule : Tm = 2(A+T) + 4(G+C) dont ilfaut retrancher 1°C par motif AA, AA, ou TT et
ajouter 1°C par motif GG, GC ou CC.

2. les mésappariements : De manière générale, l’abaissement de la Tm est de 1°Cpour une

valeur de 1% de mésappariement.

3. la nature du milieu de l’ADN: les sels sous forme de cations monovalents, lorsqu’ilssont
ajoutés aux fortes concentrations (>1M) n’influencent pas les valeurs de TM. Parcontre, aux
faibles concentrations, la Tm diminue. Cette diminution est de 15°C pourune unité
logarithmique de concentration ionique. Les cations divalents ont un effetencore plus
important. D’autres substances telles que le formamide peuvent abaisserla Tm lors des
hybridations. Dans ce cas, la Tm est estimée selon la formule suivante(pour 100 pb) : ΔTm =
-0,6 x (% formamide).
4. la longueur des fragments des ADN : La Tm devient plus grande si la longueur del’ADN
l’est aussi : un ADN long contient plus de liaisons à dissocier qu’un ADN pluscourt. La
variation de température de fusion est donnée par la relation suivante :ΔTm = -500/nombre
de pb. On constate tout de même que l’effet longueur estimportant pour les petits fragments.

1-3/ L’hybridation : Si la séparation des brins de l’ADN est suivie d’unrefroidissement

progressif et lent, il y aura réassociation progressive des deuxbrins complémentaires de
l’ADN (Il s’agit de la propriété que présente une molécule d’ADNmonobrin de s’associer
spontanément et de façon spécifique et réversible à une autremolécule monobrin si celle-ci lui
est complémentaire): c’est le phénomène de l’hybridation.Cette réassociation peut
s’effectuer entre des séquences d’ADN et d’ARN ce qui permetd’obtenir des hybrides
ADN/ARN plus stables. La séparation des produits de l’hybridation(ADN simple brin, ADN
double brin et hybride ADN/ARN) se fait par centrifugation dans ungradient de concentration
de chlorure de Césium.

Plusieurs facteurs peuvent influencer le phénomène d’hybridation, à savoir :

• Concentration de l’ADN et temps : notion de CoT et de RoT. L’hybridation desséquences

nucléiques est aléatoire. Cependant, si la concentration de l’ADN est grande, le nombre de
copies hybridées sera grand. Il en résulte donc que la vitesse d’hybridation augmente lorsque
la concentration de l’ADN augmente. Il en est de même pour le facteur temps : la probabilité
d’association des brins complémentaires est importante lorsque le temps est long.
L’hybridation est quantifiée en fonction de ces deux variables prises ensembles. Dans le cas
des ADN, cette variable est nommée le CoT, pour le cas des hybrides ADN/ARN, elle est dite
le RoT:

Figure N°2 : Courbe de détermination du Cot et duRot

•La température : elle favorise la rencontre des deux séquences complémentaires,donc la

vitesse d’hybridation. On note que les meilleures vitesses d’association sontobservées pour
des températures inférieures à 25% de la Tm de la moléculeconsidérée.
• La taille du fragment nucléique : Dans le cas où les deux séquencescomplémentaires sont
parfaitement identiques, la vitesse de réassociation de ces deux brins augmente
proportionnellement avec la racine carrée de la longueur desfragments considérés.

• La nature des acides nucléiques : La vitesse de réassociation dépend à la fois de lanature

de l’hybride et de sa concentration. Si l’hybridation concerne un mélangeADN/ADN et si
l’ADN est en excès par rapport à l’ARN, la vitesse d’hybridationARN/ADN est 5 fois plus
faible que la réassociation ADN/ADN. En revanche, si l’ARNest en large excès, la vitesse de
réassociation sera identique à celle de ADN/ADN.

• La force ionique : la concentration en NaCl joue un rôle important dans lesréassociations

des segments complémentaires. Pour une concentration de NaCl quiavoisine 1M, la vitesse de
réassociation peut être multipliée par un terme de 10.Jusqu’aux environs de 1,2M et au-delà,
la force ionique sera sans effet.

II/ Les différents types d’hybridation :

II-1/ Hybridation en phase liquide :

Les segments complémentaires sont placésdans une solution contenant un tampon et de la

formamide. L’agitation thermique assure laliaison entre les fragments complémentaires. Cette
température est généralement inférieurede 15°C à la Tm de l’ADN concerné. Les hybrides
formés sont quantifiés selon troisméthodes :

1. les méthodes spectrophotométriques (la diminution en DO à 260nm est due

àl’augmentation du taux des hybrides)

2. la technique de la nucléase S1 (digestion des ADN et ARN simples brins)

3. La chromatographie sur hydroxylapatite (Seuls les doubles brins se fixent enraison d’une
forte concentration en sels).

II-2/ Hybridation sur support solide :

La séquence complémentaire cible est fixée(immobilisée) sur un support solide. Cette

méthode facilite la séparation des fractionshybridées de celles non hybridées. Cependant, la
vitesse d’hybridation est nettementinférieure à celle de la phase liquide (jusqu’à 10 fois).

L’hybridation sur support s’effectue avec plusieurs types de supports qui

permettentd’immobiliser les brins d’acides nucléiques :
• La nitrocellulose : représente le premier support d’immobilisation ayant été utilisépour la
fixation des acides nucléiques. Ce support, requiert une forte concentrationionique, ce qui
permet de créer des liaisons irréversibles sous vide et à 80°C.

• Les membranes synthétiques (à base de nylon) : De même, elles nécessitent desforces

ioniques fortes. Ces membranes permettent des liaisons plus stables que cellesobtenues avec
la nitrocellulose à cause de leur traitement par les rayons UV courts(254 nm). Ce type de
liaison, va permettre plusieurs déhybridations et réhybridations.

II-3/ Hybridationin situ (HIS):

C’est une technique qui permet, par l’utilisation desondes, de mettre en évidence et de repérer,
dans des cellules ou des tissus, desséquences d'acides nucléiques connues. Elle est très proche,
dans son principe, duSouthern et du Northern Blot et repose, comme eux, sur l'hybridation
d'une sonde d'acidenucléique (ADN ou ARN) marquée avec une séquence complémentaire
d'acides nucléiquesque l'on cherche à identifier et à localiser. A la seule différence que les
Southern et NorthernBlot se font sur des broyats de tissus, alors que l'HIS s'effectue sur une
coupe histologiquede tissu.

Au laboratoire, les principales applications de l’HIS sont la localisation des gènes sur
deschromosomes en métaphase et la recherche de bactéries qui ont intégré un plasmide ou
unphage recombinant.Plusieurs sondes peuvent être utilisées pour réaliser une HIS :

Tableau N°1 : Exemples de marquage des sondes

Marquage Révélation
sondes Isotopes radio-actifs (tritium H3, P32, Autoradiographie
chaudes P33ou S35)

Produits fluorescents (FISH : Fluorescent In Microscopie à

Situ Hybridization) : Le FISH est une fluorescence
technique decytogénétique permettant de
Sondes voir des éléments àl'intérieur de la cellule.
froides Haptènes: biotine dioxygénine Avidine et
streptavidine
Anticorps marqués
par un enzyme
Enzymes (phosphatase alcaline) : Anticorps ou
chromogènes

Chapitre III : Les vecteurs

1-Généralités sur les vecteurs

1-1 Concept et rôle :

Un vecteur est un petit élément génétique à réplication autonome, utilisé pour produire de
multitude de copie du gène d’intérêt. Ils sont spécialement conçus pour accomplir plusieurs
rôles :
Rôle de transporteur du morceau d’ADN à cloner.
Permet le maintien de l’ADN dans la cellule hôte
Permet la sélection des cellules recombinantes
1-2Propriétés des différents types de vecteurs
Vecteurs de clonage
Destinés à l’isolement d’un fragment d’ADN, appelé « insert » et à amplifier dans une cellule
hôte.
Vecteurs d’expression
Dérivent des vecteurs de clonage. Destinés à isoler une séquence codante (gène ou partie d’un
gène) pour introduire dans une cellule-hôte appropriée afin de l’exprimer.
II- Les Plasmides

Définition :
Molécule d’ADN circulaire capable de se multiplier de manière autonome dans un organisme
procaryote ou eucaryote.
Possède au minimum une origine de réplication et des gènes conférant un avantage à la
bactérie.
Les plasmides bactériens à l’état naturel :
- Réplication autonome grâce à l’origine de réplication
- Taille élevée (90 kb pour plasmide R1)
- Résistance aux antibiotiques souvent portée par des transposons (Tn3 pour plasmide R1)
- Nombre de copies variables suivant les plasmides :
Les plasmides utilisés comme vecteur en génie génétique sont des hybrides et ont été modifiés
par rapport aux originaux.

II-1 les différents types de plasmides

II-1-1plasmide de première génération : Plasmide pBR322
Le pBR322 appartient à une série de vecteurs de clonage de première génération,
partiellement construit par génie génétique.Fut construit par Bolivar et Rodriguez 1979.
 Le plasmide pBR322 est un ADN circulaire double brin de 4361 paires de bases. Par

convention le nucléotide n°1 est situé au milieu du site de restriction EcoR I en

direction du gène tetr.

 Il contient une origine de réplication (2535), un gène de résistance à la tétracycline

(tetr 86-1276) et un gène de résistance à l’ampicilline (ampr 4153-3293). Le gène ampr
code pour une protéine (β-lactamase) de 286 acides aminés capable de cataboliser cet
antibiotique.

 Le plasmide contient de nombreux sites de restriction répartis sur toute la séquence.

Beaucoup de ces sites sont uniques, permettant de transformer l’ADN circulaire en
ADN linéaire. Exemple, le site BamH I (position 375) au début du gène tetr.

 La digestion par BamH I permet de recombiner le vecteur avec un fragment de

digestion par BamH I d’un ADN à cloner. La ligase du bactériophage T4 permet de
recirculariser l’ADN du plasmide. Les cellules transfectées avec un tel plasmide
recombinant feront la réplication du plasmide au cours de leur croissance. Elles
n’expriment plus le gène tetr, mais restent résistantes à l’ampicilline ce qui permet de
les sélectionner et d’isoler l’ADN du plasmide ainsi cloné.

Figure 3 : Le plasmide pBR322

II-1-2Plasmides de secondegénération
De nouvelle génération de plasmides plus puissants sans cesse croissantes ont été développés
depuis pBR322 et ces dérivés. C’est le cas de la famille pUC appelés (les vecteurs de clonage
de seconde génération). Les vecteurs de clonage de seconde génération ce sont des petits
plasmides d’environ 2700pb. Le plasmide pUC19 contient :

- un fragment du plasmide pBR322 (AmpR)

- une origine ColE1 mutée dans le gène rop
- une partie de l’opéron lactose : gène Lac I, promoteur et opérateur de l’opéron, une partie du
gène lac Z (lac Z’ codant la partie N-ter de beta galactosidase)
- un site de polyclonage :
Le polylinker est inséré dans le gène lacZ qui intervient dans le catabolisme du lactose
permettant de révéler facilement l’intégration d’un insert par « inactivation insertionnelle).
L'utilisation d'un inducteur coloré comme le X-gal (5-bromo-4chloro-3-indonyl-β-D-
galactoside), l'hydrolyse de ce dernier en dibromo-5,5-dichloro-4, 4-indigo (de couleur bleu),
indique la production de β-galactosidase.

Figure 4 : La carte génétique de certain vecteur de type pUC dérivés de pBR322. Le site de
clonage multiple (polylinker) est introduit dans le gène lacZ, sans interrompre la fonction du
gène

III-Les phages

III-1.Définition et Utilisation des phages :

Assemblage supramoléculaire constitué de protéines qui constituent l’ensemble de la capside

et la queue du phage, et à l’intérieur de la structure protéique, le génome phagique qui est de
l’ADN. Un phage va infecter une bactérie.
Les phages présentent deux intérêts essentiels par rapport aux plasmides :
- taille de l’insert entre 12 et 22 kb : on peut insérer des morceaux d’ADN plus longs
- infection spontanée de cellules bactériennes : il n’y a que le génome qui entre dans la
bactérie.
II-2.Préparation d’un phage :

1- Produire une grande quantité de phage, la purifier, puis en extraire son ADN génomique,
qui sera digéré par une enzyme de restriction.
2- Hybrider les deux bras du phage avec le fragment d'ADN à cloner (ce dernier doit avoir
une taille adéquate) puis souder par l'ADN ligase.
3- Procéder à l'encapsidation in vitro de l'ADN recombinant en ajoutant les protéines
phagiques de tête et de la queue. Ces derniers ils vont s'auto assembler pour former les
nouveaux virions recombinants infectieux.
4- Infecter des bactéries (cellules hôtes) et les étaler sur boite de Pétri, chaque plage de lyse
correspond à un phage recombinant qui peut être récupéré.
5- Vérifier la présence d'un insert dans l'ADN recombinant par toute procédure appropriée
(hybridation ADN-ADN, séquençage, test bleu-blanc etc.)

III-3 .Les différents phages utilisés en biologie moléculaire :

III-3-1. Les phages de première génération : le phage λ

- le phage lambda a un génome de 48 Kb

- sur les 50 gènes, beaucoup sont impliqués dans la recombinaison et la lysogénie et ne sont
pas essentiels à la multiplication du phage et au cycle lytique.
- les gènes non essentiels peuvent être éliminés et remplacés par de l’ADN étranger.
- les vecteurs dérivés de lambda qui sont utilisés pour le clonage ont des sites de restriction de
part et d’autre de la partie qui peut être éliminée.

Figure 5 : vecteur dérivés du bactériophage lambda.

III-3-2. Les phages de seconde génération : Bactériophage M13
Le génome du phage M13 est circulaire, mesure 6,4 Kb et contient 10 gènes. Il n’infecte que
les bactéries F+. Son intégration à l’intérieur d’une bactérie F- se fait avec transformation.

Le M13 à des dérivés contenant une partie du gène lacZ(peptide α), avec un polylinker (MCS:
multiple cloning site) de 13 sites uniques de restriction (54pb). Ce qui permet d'insérer des
fragments d'ADN dans ces sites, et la sélection des colonies blanches sur des boites contenant
l'analogue X-gal.

Le phage M13 et ces dérivés peuvent être utilisés :

- Pour séquencer des fragments d'ADN même de séquences inconnues par la technique de
Sanger.

- Pour le clonage des fragments d'ADN de taille jusqu'à six fois plus grand que l'ADN viral.

- Pour la transfection des cellules compétentes d’E. coli.

- Dans la mutagénèse dirigée.

IV. Les autres types de vecteur :

VI-1Les cosmides
Vecteurs artificiels constitués d’un plasmide auquel a été ajouté le site cos
(permetl’encapsidation du bactériophage lambda). Possède les avantages du plasmide d’une
part et duphage lambda d’autre part :
- gènes de résistance et origine de réplication du plasmide
- capacité à s’encapsider du phage lambda.
Intérêt :
Les cellules transformées sont sélectionnées sur un milieu contenant de l'antibiotique
(ampicilline).Comme conclusion les cosmides permettent :
- L'encapsidation d'un plasmide modifié (recombinant) dans un virion.
- D'obtenir des rendements d'intégration bien supérieure à ceux que donne une transformation
bactérienne par un plasmide.
- Le clonage d'un fragment d'ADN plus grand (de 32 à 47 kb) que celle véhiculé par un
plasmide (≈ 10 kb) ou par le bactériophage λ (≈ 22 kb).
- Nécessite moins de clones pour créer une banque génomique.
- Les cosmides sont plus stables que les plasmides
Figure 4: Schéma d'un cosmide, dans le site multiple de clonage on a placé de part et d'autre
du site de clonage BamHI, des promoteurs phagiques afin de pouvoir transcrire et traduire un
gène de l'ADN étranger, qu'il soit inséré dans un sens ou l'autre. Un cosmide ayant une taille
de 4 à 6kbp en moyenne et devant attendre de 38 à 54 kbp pour son assemblage automatique a
donc une capacité de l'ordre de 45 kbp.

Figure 5: L'empaquetage in vitro d'un cosmide recombinant.

VI.2. Les vecteurs « navette » :

Les vecteurs navettes peuvent transporter un ADN cloné entre deux organismes différents et
se répliquer de manière stable dans chacun d'eux.

On utilise des vecteurs navettes capables de se répliquer et de se maintenir à la fois chez E.

coli et chez la levure
Ils sont de trois type: intégratifs, centromériques ou épisomales

les vecteurs intégratifs (YIp):

- Ce sont des vecteurs d’E. colitype pBR322, contenant un marqueur de sélection de levure.

- Ils ne contiennent pas d’origine de réplication chez la levure.

-Ils doivent donc s’intégrer dans le génome de la levure pour être propagé

Figure 6: Vecteurs intégratifs (YIp5)

les vecteurs épisomales (YEp)

-Ce sont des vecteurs d’E. colitypepBR322, contenant un marqueur desélection de levure.

-Ils contiennent l’origine deréplication du vecteur 2m de levure

-Ils sont propagés de façon stableavec 20 à 50 copies/cellule.

Figure 7: Vecteurs épisomales (YEp24).

Les vecteurs centromériques(Ycp):

-Ce sont des vecteurs d’E. colitype pBR322, contenant un marqueur de sélection de levure.
-Ils contiennent une origine de réplication chromosomique ARS
(autonomouslyReplicatingSequence) et le centromère CEN des chromosomes de levure
-Ils sont propagés avec un faible nombre de copies (1).

Figure 8: Vecteurs centromériques (Ycp50)

VI.3 Les vecteurs viraux eucaryotes :

 Vecteurs réplicatifs

– Vecteurs se répliquant de manière autonome

• Il n’est pasutiliser en thérapie génique

• Utilisation en biologie moléculaire, cellulaire, biochimie, biotechnologie à

l’échelle industrielle, vaccinologie et expression des protéines

Exemples : Pox Virus (Vaccinia virus) : cellules mammifères

Baculovirus : cellules d’insectes,

 Vecteurs non réplicatifs

– Les virus recombinants ne se répliquent que dans des cellules exprimant les
gènes essentiels à la réplication délètés dans la construction du vecteur

– Utilisation en biologie moléculaire et thérapie génique

Exemples : Adénoviraux : Ad2 & Ad5 et Rétroviraux : MLV, lentiviraux ( HIV).

 Chapitre IV : Les Sondes

I-Concept de sonde

Une sonde nucléique est une molécule d’acide nucléique antiparallèle et complémentaire
d’une séquence spécifique d’un génome ou d’une banque, capable de reconnaitre par
hybridation et de marquer cette séquence pour permettre son identification ou son isolement.

II-Les agents de marquages

Le marquage est principalement employé dans toutes les techniques qui utilisent une sonde
(hybridation, Northern, …..). On distingue le marquage dit 'chaud' utilisant des isotopes
radioactifs, et les marquages 'froids' qui utilisent des molécules aux propriétés fluorescentes,
luminescentes. Ces dernières sont de plus en plus employées car plus pratiques.

II-1.Les isotopes radioactifs :

Par définition un isotope radioactif est constitué d'un noyau atomique instable qui se
désintègre spontanément en un noyau plus stable (isotope radiogénique) en émettant de
l'énergie sous forme d'un rayonnement.

On distingue plusieurs méthodes selon la localisation du marquage (extrémités ou interne à la

molécule) et selon la nature de la séquence marquée (simple ou double brin).

Le Phosphore 32 est le radioisotope le plus utilisé. Incorporé dans la sonde enzymatiquement

au moyen d'un ou plusieurs nucléotides triphosphate radiomarqués Il existe des sondes mono
ou double brins Soufre 35, H3 utilisés plutôt pour le séquençage et hybridation in situ. On
peut aussi réaliser un marquage en 5' : avec la T4 polynucléotide kinase. La radioactivité est
aussi utile pour le marquage des oligonucléotides de synthèse.

II-2 .Marquage non radioactif :

Le marquage non radioactif des acides nucléiques implique l’incorporation de nucléotides

portant un groupement chimique ou une molécule pouvant être détecté facilement et
spécifiquement. Le groupement incorporé peut servir luimême de marqueur et être détecté par
une mesure directe dans le dosage. On utilise souvent un fluorophore (Tableau 1), groupement
chimique qui peut facilement être détecté car il absorbe l’énergie d’une certaine longueur
d’onde qui lui est spécifique (longueur d’onde d’excitation) et la réémet à une longueur
d’onde plus longue (longueur d’onde d’émission), mais également spécifique.
Alternativement, une mesure indirecte peut être utilisée. Un groupement chimique incorporé
sert de rapporteur spécifiquement reconnu et lié par une molécule d’affinité, comme un
anticorps dédié. La molécule d’affinité a un groupement marqueur qui lui est lié, un
groupement chimique ou une molécule, qui peut alors être facilement dosé (Figure 09).

Tableau 1 :Fluorophores pour le marquage des acides nucléiques

Fluorophore Longueurs d’onde maximales (nm)

Excitation Émission
Bleu
AMCA 350 450
DAPI 358 461
Vert
FITC 492 520
Fluorescéine 494 523
Rouge
CY3 550 570
TRITC 554 575
Rhodamine 570 590
Rouge Texas 596 620
CY5 650 670
AMCA, aminométhylcoumarine ; DAPI, 4′, 6- diamino- 2- phénylindole ; FITC, fluorescéine
isothiocyanate ; CY3, indocarbocyamine ; TRIT, tétraméthylrhodamine isothiocyanate ; CY5,
indodicarbocyanine.

Figure 09 : Détection indirecte de groupements marqués dans les acides nucléiques. Les
acides nucléiques peuvent être marqués par des groupements chimiques qui ne sont pas détectés
directement. Les groupements incorporés servent plutôt de groupements rapporteurs car ils sont liés
avec une grande spécificité par une molécule d’affinité qui, elle, porte un marqueur détectable. Ce
marqueur peut être détecté de différentes façons. Si c’est un colorant fluorescent, il pourra être détecté
par microscopie de fluorescence. Fréquemment, l’alternative est d’utiliser une enzyme, comme la
phosphatase alcaline, qui convertit un substrat pour donner un produit coloré qui peut être dosé par
colorimétrie.
Deux techniques sont largement utilisées pour détecter un marquage indirect. Le système à
biotine- streptavidine repose sur la très grande affinité entre deux ligands naturels. La biotine
(une vitamine) agit en tant que rapporteur car elle est spécifiquement liée par la streptavidine,
une protéine bactérienne, avec une constante d’affinité (aussi appelé constante de
dissociation) de 10–14, une des plus élevées qui soit connue en biologie. Les sondes
biotinylées peuvent être facilementobtenues en incluant un nucléotide adéquat biotinylé au
cours de la réaction de marquage. La streptavidine sert alors de molécule d’affinité
révélatrice. Un autre rapporteur largement utilisé est la digoxigénineUn anticorps spécifique
contre la digoxigénine sert de marqueur d’affinité.
III-Quelques stratégies de marquage :

III-1.La « Nick translation » ou déplacement de cassure

La technique de nick translation (déplacement de cassure) repose sur la réparation de cassures

(nicks) simple brin dans l’ADN, formant des extrémités 3′ OH et 5′ P terminales exposées.
Cette cassure peut être obtenue en utilisant une endonucléase appropriée, comme la
désoxyribonucléase I du pancréas (ADNase I). La cassure ainsi exposée va alors servir de
point de départ pour l’introduction de nouveaux nucléotides en utilisant l’ADN polymérase
d’E. coli, une enzyme composée de nombreuses sous- unités qui possède des activités d’ADN
polymérase et d’exonucléase 5′ → 3′. Alors que l’ADN polymérase ajoute de nouveaux
nucléotides à l’extrémité 3′- hydroxyle de la cassure, les nucléotides sont supprimés à l’autre
extrémité de la cassure par l’activité exonucléasique 5′ → 3′ de la même enzyme. La cassure
est ainsi progressivement déplacée le long de l’ADN dans la direction 5′ → 3′ (Figure 10). Si
la réaction est réalisée à une température relativement faible (environ 15 °C), elle ne se
poursuit par au- delà du renouvellement complet de la séquence nucléotidique existante. Bien
qu’il n’y ait pas de synthèse nette d’ADN à cette température, la réaction de synthèse permet
l’incorporation de nucléotides marqués à la place de ceux qui existaient précédemment dans le
nucléotide non marqué.
 Figure 10 : Marquage de l’ADN par nick translation (déplacement de cassure).

III-2. La « Random printing » ou Marquage de l’ADN à l’aide d’amorces aléatoires

La technique de marquage de l’ADN à l’aide d’amorces aléatoires repose sur l’hybridation

d’un mélange de nombreux hexanucléotides différents qui se lient au hasard à des séquences
complémentaires de l’ADN matrice dénaturé, et initient la synthèse de nouveaux brins d’ADN
(Figure 11). La synthèse des nouveaux brins complémentaires est catalysée par la sous- unité
de Klenow de l’ADN polymérase I d’E. coli (qui contient l’activité de polymérase sans
l’activité exonucléasique 5′ → 3′ associée).

Figure 11 : Marquage de l’ADN par amorce aléatoire.

III-3.Le marquage des sondes synthétiques (Oligo-nucléotides de synthèse) :

La réaction classique de PCR peut être facilement modifiée pour inclure un ou plusieurs
précurseurs nucléotidiques marqués qui s’incorporeront dans les produits de PCR sur toute
leur longueur.

III-4.Les sondes ARN(ribosondes) :

Des sondes à ARN (ribosondes) peuvent être obtenues par transcription in vitro d’ADN cloné
dans un vecteur d’expression plasmidique approprié. Ce vecteur contient une séquence
promotrice immédiatement adjacente au site d’insertion de l’ADN étranger, assurant ainsi la
transcription de la séquence insérée. Des promoteurs de phages très efficaces sont utilisés
communément, comme ceux des phages SP6, T3 et T7 et la polymérase correspondant au
phage est fournie afin d’assurer une transcription spécifique de l’ADN cloné. L’incorporation
de ribonucléotides marqués assure un marquage à l’ARN nouvellement synthétisé
(Figure 12).

Figure 12 : Les sondes ARN sont habituellement produites par transcription d’inserts ADN
clonés grâce à une ARN polymérase de phage.
 Chapitre V : Le clonage

I-Le principe du clonage :

Le clonage de l’ADN est une technique puissante qui permet de séparer des séquences
spécifiques d’ADN au sein d’autres séquences puis de les copier de sorte qu’on obtient des
quantités importantes permettant une analyse détaillée ou des manipulations. Une importante
utilisation du clonage de l’ADN est d’isoler de nouveaux gènes en leur permettant d’être
explorés et caractérisés.

Toutes les expériences de clonage de l’ADN reposent sur la construction de molécules

d’ADN recombinant. Ceci suppose de joindre ensemble différentes molécules d’ADN. La
molécule d’ADN à cloner est insérée dans une autre molécule d’ADN généralement
circulaire, appelée un vecteur. Le vecteur recombinant est introduit dans une cellule hôte,
généralement la bactérie E.coli, où il produit de multiples copies de lui-même. Lorsque la
cellule hôte se divise, des copies du vecteur sont ainsi produites et elles peuvent être purifiées
à partir des cultures de cellules hôtes et utilisées pour l’analyse de l’insert d’ADN étranger
(Tagu et Moussard ,2003 ; Walker et Raply, 2009).

II-Les bases du clonage de l’ADN :

La procédure du clonage de l’ADN dépend des vecteurs utilisés

II.1. Procédure de clonage par Plasmide :

Les plasmides forment le type le plus commun de vecteur de clonage. La procédure de

clonage peut être divisée en plusieurs étapes comme suit (Figure 13) (Winter et al., 2000 ;
Walker et Raply, 2009) :

 Le plasmide est digéré par une enzyme de restriction qui le coupe en un site unique et
transforme la molécule circulaire qu’il était en une molécule linéaire avec des
extrémités cohésives.
 L’ADN étranger à cloner est lui aussi digéré par la même enzyme de restriction pour
produire les mêmes bouts collants,
 Le plasmide et l’ADN étranger sont mixés, des molécules plasmides sont jointes à des
molécules d’ADN étranger via leurs extrémités cohésives communes et on obtient des
plasmides recombinants circulaires,
 L’ADN ligase est utilisé pour joindre de façon covalente les deux,
  Le plasmide recombinant est introduit dans la bactérie hôte (généralement E. coli) par
un processus appelé transformation,
 Les bactéries transformées sont ensuite étalées sur des plaques d’agar et les colonies
des bactéries composées de cellules ayant correctement intégré le plasmide
recombinant croissent,
 Des colonies individuelles sont séparées et cultivées en milieu liquide. De grandes
quantités de plasmides peuvent alors être purifiées à partir des cultures et on peut
récupérer l’ADN cloné pour l’analyse.

Figure 13 : Représentation schématique du clonage d’ADN via des plasmides (Pasternak,

2003).

II.2. Le phage lambda (λ) :

Le phage λ a été adapté à une utilisation comme vecteur de clonage. La portion centrale de
l’ADN de λ, qui n’est pas essentielle à l’infection, est détruite, laissant des fragments 5’ et 3’
appelés bras (Figure 14). La région ayant subit la délétion peut être remplacée par l’ADN
étranger pour produire un phage à ADN recombinant (Figure 14). Celui-ci est inséré dans les
capsides phagiques in vitro par un processus appelé empaquetage qui suppose de mélanger
l’ADN du phage recombinant avec un extrait d’empaquetage contenant les protéines de la
capside du phage et des enzymes nécessaires à la fabrication. Des particules de phages
recombinants sont produites et elles infectent E.coli avec une grande efficacité. Les cellules
infectées sont étalées sur une plaque d’agar et produisent un feuillet continu de bactéries
appelé une couche qui contient de petites zones de la taille d’une épingle à cheveux. Ces
zones correspondent aux plages de lyse produites par l’infection phagique. Des plages
individuelles peuvent être isolées et utilisées pour générer des quantités importantes d’ADN
cloné par infection de cultures fraiches d’E.coli (Winter et al., 2000 ;Tagu et Moussard
,2003).

Le principal avantage de λ en tant que vecteur de clonage est que la taille des fragments qui
peuvent y être insérés est bien supérieure à celle des inserts plasmidiques. Le phage λ peut en
effet héberger des fragments long jusqu’à 25Kpb, à comparer aux 10Kpbmaximales des
inserts dans les vecteurs plasmidiques. Cette possibilité de cloner de plus larges fragments a
conduit au développement de la principale utilisation de λ dans la construction de banques
d’ADN.

Figure 14 : (a) Le phage λ (b) Utilisation du phage λ comme vecteur de clonage (Winter et
al., 2000) .
II.3. Cosmides :

Ce type de vecteur combine des caractéristiques rencontrées chez les plasmides et le phage λ.
Les cosmides ont tous les trais normaux des plasmides, y compris un MCS et des gènes
conférant une résistance à des antibiotiques, mais ils incluent aussi des séquences issues de λ
appelées séquences cos. Elles sont situées aux deux extrémités de la molécule d’ADN de λ et
sont responsables de son insertion dans la capside du phage. Cloner avec des cosmides
combine des caractéristiques associés à l’utilisation de λ et de plasmides comme vecteur de
clonage (Figure 15). L’ADN des cosmides est clivé par une enzyme de restriction et lié à
l’ADN étranger. Le cosmide recombinant est ensuite empaqueté dans les capsides de λ et
utilisé pour infecter E.coli. Les cosmides ne contiennent ps tous les gènes de λ et ne forment
donc pas de plages après infection. Au lieu de cela, les cellules infectées sont cultivées sur de
l’agar contenant des antibiotiques et les colonies résistantes contenant des cosmides
recombinants sont isolées et peuvent être amplifiées de la même façon que des plasmides. Les
cosmides ont l’avantage d’être capable d’héberger de très gros inserts. Sachant que les
cosmides sont petits, typiquement 8Kpb et que la capside de λ peut accueillir 52Kpb, les
inserts cosmidiques peuvent mesurer jusqu’à 44Kpb (Winter et al., 2000; Tagu et Moussard
,2003).

Figure 15 : Cloner avec des vecteurs cosmidiques (Winter et al., 2000).

III-Les banques d’ADN

III-1.Les banques d’ADN génomique

III-1.1.Etablissement de la banque d’ADN :

Pour constituer une banque génomique, l’ADN génomique doit être purifié, ensuite fragmenté
au hasard en fragments qui ont la taille correcte pour le clonage dans le vecteur choisi.

La purification de l’ADN génomique des eucaryotes est habituellement effectuée par la

préparation initiale des noyaux ensuite l’élimination des protéines, lipides et autres
macromolécules non désirées par la digestion à l’aide de la protéase et la phase de l’extraction
(exemple : phénol-chloroforme). Les cellules procaryotes peuvent être extraites directement.
L’ADN génomique préparé de cette manière est composé de longs fragments de plusieurs
centaines de kilobases dérivés des chromosomes. Il existe deux techniques de fragmentation
aléatoire de cet ADN :

 le cisaillement physique
 la digestion par enzyme de restriction

Le cisaillement physique tel que le pipetage, le mixage ou la sonication fractionnera l’ADN

progressivement en petits fragments à peu prés au hasard. Le choix de la méthode et du
moment de l’exposition dépend de la taille du vecteur requis. Les extrémités produites seront
probablement des extrémités franches en raison du fractionnement des deux brins d’ADN,
mais il serait avisé de procéder à la réparation des extrémités avec la polymérase Klenow au
cas où certaines extrémités ne sont pas franches. Cette ADN polymérase remplira toutes les
extrémités -3’ des molécules d’ADN en suspension en présence de dNTP (Turner et al.,2000).

L’utilisation des enzymes pour digérer l’ADN génomique est plus sujette aux résultats non
aléatoires, en raison de la distribution non au hasard des sites de restriction. Pour générer des
fragments d’ADN génomique de 15-25 Kb ou plus (taille qui convient pour les vecteurs
cosmides et λ), il est nécessaire de procéder à une digestion partielle, où, en utilisant des
quantités limitées d’enzymes de restriction, l’ADN n’est pas digéré à chaque séquence de
reconnaissance, produisant ainsi des molécules de longueur plus grande que celle d’une
molécule complètement digérée. L’enzyme fréquemment utilisée est Sau3A (séquence de
reconnaissance 5’-/GATC-3’, où dénote le site de clonage) qui se clive pour produire une
extrémité collante compatible avec un vecteur qui a été cassé avec le BamHI (5’-G/GATCC-
3’). Le choix de l’enzyme de restriction doit prendre en compte le type des extrémités
produites (Collantes ou franches), si elles sont liées directement au vecteur clivé et si
l’enzyme est inhibée par les modifications des bases de l’ADN (telles que la méthylation CpG
chez les mammifères). Le temps de la digestion et le rapport de l’enzyme de restriction sur
l’ADN sont variés afin de produire des fragments mesurant les tailles désirées. Les tailles
correctes sont ensuite purifiées à partir d’un gel agarose ou gradient de saccharose (Turner et
al., 2000).

III-1.2 Amplification et Taille de la banque génique :

Il est possible de calculer nombre N de recombinants (plaques ou colonies) qui doivent être
contenus dans une banque génique pour fournir une probabilité particulière quant à une
séquence donnée. La formule est :

N=

p est la probabilité désirée et f est la fraction du génome dans un insérât. Par exemple, pour
une probabilité de 0,99 avec des tailles d’insérats de 20Kb, les valeurs des génomes de l’E.
coli (4,6 x 106pb) et humain (3x 109pb) sont :

NE. coli= = 1,1 x103

N humain = = 6,9 x105

Ces valeurs expliquent la possibilité de produire de bonnes banques génomiques à partir des
procaryotes dans les plasmides où la taille de l’insérât est de 5-10Kb, car l’opération ne
nécessitera que quelques milliers de recombinants. Pour des gènes plus gros, autant la taille de
l’insérât est grande, autant un nombre plus petit de recombinants est requis, ce qui explique
pourquoi les vecteurs cosmides et les YAC ont été développés. Cependant, les méthodes de
clonage dans λ et l’efficacité de l’empaquetage de λ le placent comme le meilleur choix pour
la construction des banques génomiques (Turner et al.,2000).

III-2. Les banques d’ADNc

Généralement, les banques d’ADNc ne sont pas constituées en utilisant l’ARNm procaryote,
car il est instable ; les banques génomiques sont plus faciles à constituer et contiennent toutes
les séquences du génome. La constitution de banques d’ADNc à partir d’un ARNm eucaryote
est très utile car les molécules d’ADNc ne possèdent pas de séquences introns d’où elles
peuvent être utilisées pour exprimer la protéine encodée dans E. coli. Vu qu’elles dérivent de
l’ARNm, les molécules d’ADNc représentent les parties transcrites du génome c.-à-d. les
gènes plutôt que l’ADN non transcrit (Turner et al., 2000; Kamoun et al.,2003).

III-2.1.Le passage de l’ARN à l’ADN :

Isolement, épuration et fractionnement de l’ARNm

Chez les eucaryotes, la majorité des ARNm sont polyadénylés et cette queue-3’ d’environ 200
résidus d’adénine permet l’isolement adéquat de l’ARNm eucaryote. L’oligo (dT) peut se
fixer à la queue poly A, et peut être utilisé pour la couverture de l’ARNm. Traditionnellement,
cela fut accompli en passant une préparation d’ARN total après extraction sous une colonne
de cellulose-oligo (dT). Cependant, afin de minimiser l’altération par les nucléases, une
méthode consiste à rajouter l’oligo-(dT) lié à des billes magnétiques directement au lysat et
d’en extraire l’ARN messager avec un puissant aimant. Une autre voie alternative pour isoler
l’ARNm consiste à la lyse des cellules et la préparation de complexes ARNm-robosome sur
gradients de saccharose (Kamoun et al.,2003; Ameziane et al., 2005).

Avant d’utiliser l’ARNm pour le clonage de l’ADNc son intégrité est fréquemment vérifier,
soit par l’électrophorèse par gel, soit par l’utilisation des systèmes de traduction acellulaires
tels que l’extrait de germes de blé ou le lysat des réticulocytes en forme de lapin(Roberts et
Paterson,1973; Endo et Sawasaki, 2006). Il est également possible de procéder à une
microinjection de l’ARNm dans les cellules pour vérifier si elles sont traduites. L’utilisation
de gels tels que l’agarose ou le polyacrilamide pour analyser l’ARNm est aussi fréquente. La
taille des molécules d’ARNm est souvent variable entre 0,5K b jusqu'à 10Kb ou plus.

Quelque fois il est utile de procéder au fractionnement ou à l’enrichissement de l’ARNm

avant le clonage de l’ADNc, spécialement si l’on essaie de coller un gène particulier plutôt
que de produire une banque d’ADN complète. Le fractionnement est souvent effectué en
fonction de la taille, et des ARNm de différentes tailles sont récupérées des gels agarose.
L’enrichissement est souvent réalisé par l’hybridation.

Synthèse de l’ADNc

La synthèse du brin d’ADNc est amorcée généralement par fixation d’une courte séquence
poly T sur l’extrémité poly A de l’ARNm. Une autre approche consiste à utiliser comme
amorce un mélange d’hexanucléotides synthétiques correspondant à de nombreuses séquences
différentes et s’hybridant au hasard sur l’ARNm. Cependant, comme par définition
l’amorçage de la synthèse de l’ADNc se fait sur des parties internes des ARNm, les ADNc
obtenus ne correspondent qu’à des fragments d’ARNm (Tagu et Moussard ,2003). Les quatre
dNTP doivent, tous, être ajoutés. Si l’ADNc peut être déterminée par l’analyse par gel.
L’enzyme copie la matrice, en ajoutant les nucléotides complémentaires à l’extrémité-3’ de
l’amorce prolongée. Malheureusement, l’enzyme a tendance à se dissocier de la matrice,
particulièrement à des régions de structure secondaire extensive, ce qui rend parfois difficile
la formation de molécules complètes d’ADNc (longueur complète) en une seule étape (Turner
et al., 2000 ;Carroll et al., 2013).

La synthèse du second brin nécessite aussi une amorce. Bien qu’il existe un nombre de
variations, la meilleure façon de former un ADNc à longueur complète est de suivre la queue
de l’extrémité-3’du premier brin, et d’utiliser ensuite une amorce complémentaire pour former
le second brin. La transférase terminale ajoute des nucléotides à l’extrémité -3’ des acides
nucléiques bicaténaires ou monocaténaires sans requérir de matrice. Si elle est dotée
uniquement d’une seule molécule de dNTP, par exemple, une dCTP (Figure 18), elle ajoutera
une queue homopolymérique constituée de résidus C aux extrémités -3’ du duplex ARNm-
ADNc. Après la destruction du brin ARNm avec de l’alcali, l’oligo (dG) peut être utilisé pour
amorcer la synthèse du second brin, en utilisant soit la transcriptase inverse ou le fragment
Klenow de l’ADN polymérase I de l’E.coli. Cette réaction produit un duplex d’ADNc, mais
les extrémités des molécules peuvent ne pas être appropriées pour le clonage. L’extrémité-3’
du premier brin peut faire saillie au-dessus de l’extrémité-5’ du second brin en fonction des
longueurs relatives de la queue poly (dC) et de l’amorce, oligo (dG). Il est donc nécessaire de
préparer les extrémités de l’ADNc pour le clonage (Turner et al., 2000 ; Carroll et al., 2013).

Traitement des extrémités de l’ADNc

La ligation de l’extrémité franche des gros fragments n’est pas efficace et les extrémités de
l’ADNc doivent être manipulées pour éviter le clonage de ces extrémités. On rajoute
habituellement des linkers d’acides nucléiques spéciaux pour créer des extrémités collantes
pour le clonage. La première étape consiste à préparer l’ADNc pour l’addition des linkers, qui
nécessitera l’utilisation d’une nucléase spécifique monoténaire (nucléase S1) pour enlever les
extrémités -3’ qui dépassent. Cette étape est suivie par le traitement, avec le fragment
Klenow, de l’ADN polymérase I et les dNTP pour remplir des nucléotides -3’oubliés. Si les
linkers contiennent un site d’enzyme de restriction qui peut probablement être présent dans
l’ADNc tel que EcoRI (Figures 17), l’ADN devrait être méthylé en utilisant la méthylase
EcoRI avant de compléter avec les linkers. Ce qui confirme que l’enzyme de restriction ne
peut pas cliver l’ADNc intérieurement. Après cela, les linkers peuvent être ligaturés à
l’extrémité franche de l’ADNc en utilisant l’ADN ligase T4. Cette étape ajoutera un linker à
chaque extrémité à l’ADNc phosphorylé-5’. Par ailleurs, de multiples linkers devraient être
rajoutés. Finalement, la digestion par l’enzyme de restriction avec l’EcoRI générera des
extrémités cohésives prêtes à la ligation au vecteur. Il existe plusieurs alternatives à la
préparation des extrémités de l’ADNc pour le clonage. Celles-ci incluent la poursuite avec la
transférase terminale ou l’emploi de molécules d’adaptation qui ont préformé des extrémités
collantes pour éviter le recours à la méthylation de l’ADNc (Turner et al., 2000 ; Carroll et
al., 2013).

III-2.2.Le choix du vecteur

Chaque vecteur possédant un site EcoRI devrait être approprié pour le clonage de l’ADNc
dans la figure 16. Comme les ADNc sont relativement courts (0,5- 10kb), des vecteurs
plasmides sont souvent utilisés ; cependant, les vecteurs du phage λ sont préférables pour
l’expression de grands nombres de clones et spécialement les banques d’ADNc. Il est utile de
déphosphoryler les vecteur avec l’enzyme phosphatase alcaline car celle-ci empêchera les
extrémités de se relier durant la ligation ; confirmant ainsi que seulement les molécules du
recombinant sont produites par le vecteur et l’ADNc joints. Le vecteur λgt11 possède un site
EcoRI placé prés du C terminale de son gène lacZ, permettant l’expression de l’ADNc comme
une partie de la protéine de la β- galactosidase. Celle-ci facilite le dépistage de la banque. La
ligation du vecteur à l’ADNc est effectuée en utilisant l’ADN ligase T4, et les molécules
recombinantes sont soit empaquetées soit transformées pour créer la banque de l’ADNc.

Pour finir une banque d’ADNc est forcément biaisée : l’abondance des séquences dans la
banque reflètera celle des ARNm et non pas celle des gènes, par exemple le messager de
l’ovalbumine représente 10% des messagers totaux extraits de l’oviducte de poule. En
choisissant correctement le tissu d’où seront extraits les ARNm, on pourra enrichir
considérablement la banque en ADNc particuliers. Au contraire, il sera difficile d’obtenir
l’ADNc d’un gène faiblement exprimé.
 Figure 16 : Clonage de d’ADNc (a) synthèse du premier et second brin ; (b) Préparation de
l’extrémité et addition du linker à l’ADNc (Turner et al., 2000).

IV-Criblage de la banque d’ADN (Détection des recombinants) :

Le criblage d’une banque d’ADN peut être réalisé en utilisant plusieurs méthodes. Le criblage par
hybridation de l'ADN des clones transformés avec une sonde spécifique constitue une
méthode de choix. L'hybridation peut se faire in situ : on effectue des répliques de clones
bactériens cultivés en boîte de Pétri sur des disques de nitrocellulose, après un temps de
culture suffisant, les bactéries de ces répliques sont ensuite lysées par la soude qui, en même
temps, dénature l'ADN, les molécules simple brin correspondantes se trouvent immobilisées à
l'emplacement de chaque clone. Après hybridation, avec la sonde radioactive,
l'autoradiographie révélera les clones positifs.

Le problème est déplacé vers celui de l'obtention de la sonde spécifique, correspondant au

gène recherché.

 s'il s'agit d'un gène peu évolué, on peut utiliser une sonde "hétérologue" (en fait une
séquence homologue mais provenant d'un autre organisme) en comptant sur une
homologie de séquence suffisante pour s'hybrider dans des conditions qui ne donnent
pas de faux positifs.

 lorsqu'une lignée cellulaire synthétise, à un moment donné du développement, un

messager majoritaire, on peut tenter sa purification et réaliser un ADN
complémentaire qui, une fois cloné servira de sonde pour une banque génomique.

 si l'on connaît très bien le produit du gène, c'est à dire la séquence, même partielle, en
acides aminés, on pourra construire des oligonucléotides selon les codes possibles et
"partir à la pèche" avec ces sondes artificielles.

 Dans les cas désespérés, c'est à dire lorce que l'on ne possède pas de sonde et que l'on
n'a aucune idée du produit du gène, connu uniquement par la manifestation
phénotypique d'un allèle muté, il reste d'autres solutions, par exemple, la "marche sur
chromosome" (chromosome walking) : Par des méthodes faisant appel à des
croisement traditionnels et à l'analyse mendélienne, on va essayer d'associer des
marqueurs RFLP au locus considéré. L'idèal étant d'encadrer le locus par des
marqueurs distants de moins d'un centiMorgan. Le premier marqueur constitue une
sonde pour identifier un clone (parmi une banque génomique) qui servira de départ. La
cartographie de restriction nous permettra d'identifier un segment situé à une extrémité
qui sera, à son tour utilisé comme sonde pour cribler un clone chevauchant et ainsi de
suite jusqu'à un second marqueur connu. La séquence recherchée se trouve
obligatoirement parmi les clones identifiés. Si l'un d'entre eux peut complémenter un
mutant (par transgénie restituant le phénotype sauvage par exemple), c'est qu'il s'agit
de la séquence recherchée.
Figure 17 : criblage par hybridation de l'ADN des clones transformés avec une sonde
spécifique
 Chapitre VI : La transformation génétique

Introduction :

La transformation génétique est l’une des biotechnologies les plus prometteuses pour
contourner certains des obstacles majeurs rencontrés dans les programmes d’amélioration
génétique des plantes. La transformation génétique permet en effet d’introduire un ou
plusieurs gènes conférant aux plantes cibles des caractères nouveaux sans globalement
perturber l’architecture génomique de la plante. Entre les deux méthodes majeures de
transformation, celle utilisant Agrobacterium a donné le plus de résultats positifs chez les
arbres, surtout chez les angiospermes, tandis que la microprojection reste un outil privilégié
chez les espèces peu sensibles à la transformation bactérienne comme les gymnospermes.

I-Transformation par canon à particule (biolistique) :

C’est une projection d’ADN (biolistique) dans les cellules de la plante par l’utilisation d’un
canon à particules qui projette dans les cellules des microparticules de métal (or ou tungstène)
enrobées des constructions géniques.

Le principe consiste à projeter sur des tissus des microparticules de tungstène ou d’or de 1 à 3
µm (1 µm = 10-6 m) de diamètre enrobées d’ADN, à l’aide d’un canon à particules. La force
de propulsion est obtenue par détente d’un gaz sous pression (l’hélium le plus souvent).
Certaines des microparticules pénètrent dans les cellules, transportant avec elles l’ADN.
Quand la bille atteint le noyau, elle permet à l’ADN qu’elle transporte de s’y intégrer.

Cette méthode est facile d’emploi et permet d’obtenir des plantes transgéniques, notamment
chez les monocotylédones, comme le maïs, le blé, le riz. C’est ainsi qu’a été obtenu le premier
maïs résistant à la pyrale. Cette méthode peut parfois engendrer l’insertion de nombreuses
copies du gène d’intérêt. Il faut donc trier les plantules obtenues par analyse moléculaire.
 Figure 18 : Transformation par canon à particule (biolistique).

II-Transformation par Agrobacterium tumefaciens

La bactérie du sol Agrobacterium tumefaciens provoque chez les plantes infectées une
tumeur, la galle du collet. Une autre espèce, Rhizobium (ex. Agrobacterium rhizogenes),
parasite également les plantes selon les mêmes mécanismes qu’A.tumefaciens. Elle provoque
le développement anarchique et très important du système racinaire appelé chevelu racinaire.

Figure 19 : la galle du collet.

Transfert naturel de l’ADN-T par Agrobacterium tumefaciens

Le parasitisme d’Agrobacterium repose sur le transfert d’une partie de son plasmide dans les
chromosomes de la plante. Cette partie qui est transmise au génome de la plante est appelée
ADN-T pour ADN Transféré.

Il s’agit d’une partie constante de l’ADN du plasmide de la bactérie qui est délimité par des
bordures, bordure gauche et bordure droite, constituées par des séquences de 25 nucléotides.
La région comprise entre ces frontières est transférée à la plante. Elle contient les gènes qui
confèrent à la plante des propriétés tumorales, c’est-à-dire qu’ils entraînent la prolifération
continue et incontrôlée des cellules végétales par production d’hormones de croissance.

Des gènes entraînant la synthèse d’opines sont également présents sur l’ADN-T. Les opines
sont des acides aminés spécifiques des bactéries qui ne sont pas habituellement présentes dans
les tissus végétaux sains. Les cellules végétales transformées synthétisent les opines qui
favorisent la multiplication des souches pathogènes en détournant une partie de l’activité
photosynthétique de la plante au profit des bactéries.

Sur le plasmide, en dehors de l’ADN-T, on trouve une région de virulence. Cette dernière
n’entraîne pas directement la formation de la maladie, mais est indispensable au transfert et à
l’intégration de l’ADN-T.

Figure 20: Schéma représentatif du plasmide Ti

Transfert naturel de la construction génétique par Agrobacterium tumefaciens

Une construction génétique par définition est une séquence d’ADN destinée à être transférée
dans une cellule, comprenant un gène d’intérêt, les séquences promotrices et régulatrices
indispensables à son expression et à sa régulation dans la cellule receveuse et un gène
marqueur.

Ce transfert naturel ou biologique de gènes, à l’aide d’Agrobacterium, est utilisé pour

transformer les végétaux.

 tumefaciens est la bactérie la plus employée. Le principe est de modifier son plasmide
Ti afin qu’il n’y ait pas de formation de la galle du collet, mais que le transfert et
l’intégration des gènes désirés dans le génome des plantes se fasse.

 Des plasmides Ti désarmés sont construits. Pour ce faire, les gènes situés sur l’ADN-
T, et responsables du pouvoir pathogène de la bactérie, sont délétés. Il est toutefois
nécessaire, pour la réalisation du transfert de gènes, de garder intactes les deux
bordures gauche et droite de l’ADN-T, ainsi que les fonctions de virulence. Entre les
deux bordures de l’ADN-T est insérée la construction génique. Elle est ensuite
introduite dans le végétal.

Les systèmes binaires de transfert

Des constructions ont été réalisées pour diminuer la taille des plasmides et pour simplifier les
méthodes d’insertion de gènes dans l’ADN-T. Ainsi, l’information génétique, nécessaire au
transfert et à l’intégration dans le matériel végétal de la construction génique, a été répartie en
deux plasmides.

L’un est le plasmide d’Agro¬bacterium sans son ADN-T et possédant encore les gènes de
virulence. Il induit à distance le transfert de l’ADN-T recombiné de l’autre plasmide, on parle
d’action en trans. L’autre plasmide est un vecteur de petite taille qui porte l’ADN¬-T
recombiné, donc la construction génique. Ce vecteur, appelé vecteur binaire, possède la
capacité de se répliquer dans Agrobacterium mais aussi dans E. coli. C’est donc à la fois un
vecteur de transfert et un vecteur de clonage
Figure 21: Transformation par Agrobacterium tumefaciens.