Des sPLA2 de venins de serpents à leurs homologues de

Mammifères: Rôles de ces enzymes dans la fécondation

Jessica Escoffier

To cite this version:

Jessica Escoffier. Des sPLA2 de venins de serpents à leurs homologues de Mammifères: Rôles de ces
enzymes dans la fécondation. Physiologie [q-bio.TO]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2009.
Français. �NNT : �. �tel-00441813�

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 UNIVERSITÉ JOSEPH FOURIER – GRENOBLE 1
SCIENCES, TECHNOLOGIES, SANTÉ
École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant

THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ JOSEPH FOURIER
Spécialité : Physiologie-Physiopathogies-Pharmacologie

Des sPLA2 de venins de serpents à leurs

homologues de Mammifères:
Rôles de ces enzymes dans la fécondation.

Présentée et soutenue publiquement

par

Jessica ESCOFFIER

Le 25 novembre 2009

Devant le jury composé de

Président : Pr. Stéphan NONCHEV

Rapporteurs : Dr. Valérie CHOUMET
Pr. Joël DREVET
Examinateurs : Dr. Gerard LAMBEAU
Dr. Christophe ARNOULT

Thèse réalisée à l’institut des neurosciences de Grenoble (GIN)

Au sein de l’équipe 3: Canaux Calciques, Fonctions et Pathologies
INSERM U 836–Grenoble
 Remerciements

Je remercie les membres du jury : Madame Valérie Choumet et monsieur Joel Drevet pour
avoir accepté d’être les rapporteurs de ce travail, ainsi que messieurs Gerard Lambeau et
Stéphan Nonchev d’avoir accepté de participer à l’évaluation de ce travail.

Je tiens tout particulièrement à remercier Christophe pour m’avoir fait confiance durant ces 4
ans, pour son encadrement riche en apprentissage, pour son soutien, son aide et l’attention
qu’il a porté à l’ensemble de mon travail et enfin pour sa patience les jours où je n’étais pas
très performante.

Je remercie Michel De Waard pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire, pour ses
conseils avisés et sa diplomatie.

Je remercie sincèrement l’ensemble de l’équipe « Canaux Calciques, Fonctions et

Pathologies» et plus particulièrement Michel Ronjat, Fabienne Pirollet et Maud Barbado,
pour m’avoir aussi bien accueillie et pour m’avoir aidée et soutenue tout au long de ces 4
années.

Je tiens aussi à remercier sincèrement les étudiants, Hicham qui a toujours le mot pour rire,
Narendra avec qui j’ai appris à m’exprimer en anglais, enfin je crois, Cathy qui a toujours des
bonnes idées pour s’éclater, Katell et sa bonne humeur bretonne, Julien pour sa gentillesse et
son beau phrasé et enfin Norbert qui s’est révélé être un énorme soutien moral.

Je n’oublie pas aussi les étudiants qui sont parti, mais qui m’on beaucoup aidé Sonia, Paola,
Gina, Ryadh , Julien, Emilie et bien sûr Abir.

Merci à tous…
 Résumé

Je n’oublierai pas de remercier également,

Cyril,

Merci pour ton soutien et ta complicité. Merci de partager mon quotidien et de me remonter le
moral quand il va mal. Merci de partager mes joies, mes peines. Merci de t’être intéressée à
mon travail et d’avoir cherché avec moi des solutions … En fait, merci pour tout ton amour.

Sabrina, Naima, Sylvie, Aurélie, Djam, Denis, Florian et Hervé

Merci pour votre soutien. Merci de m’avoir remontée le moral lorsque celui-ci n’étaient pas
au beau fixe. Merci de partager mes joies, mes peines. Merci de s’être intéressée à mon
travail. Merci pour tout.

Maman, Beau papa,

Merci de m’avoir donné le goût et les moyens de faire des études. Merci de m’avoir soutenu
durant ma longue formation. Merci de vous être tenus au courant de l’avancée de mes
recherches. Merci de votre réconfort. Merci pour tout. Cette réussite est aussi la vôtre.

Mes sœurs : Sandrine, Deborah, Maureen et Leslie et mes beaux frères : Minou, François,
Noy, et Yannick

Merci à l’ensemble de ma (nombreuse) famille pour leur soutien mais aussi pour les
discussions animées des repas familiaux et pour les questions récurrentes : « Mais quand est-
ce que tu auras réellement fini ? », « A quoi servent tes recherches ? » et les « à quand le
contraceptif masculin ? »…

Un grand merci à vous tous,

 TABLE DES MATIERES

Introduction 1
Les principes, les étapes et les exigences de la fécondation 1

Chapitre 1 : Le spermatozoïde de Mammifère 2

I. La tête du spermatozoïde 2
II. Le flagelle 3
1. La partie motrice principale du flagelle : complexe microtubulaire 3

2. Les dynéines axonèmales 4

3. Les fibres denses (ODF) 7

4. La gaine de mitochondries 7

5. La gaine fibreuse de la pièce principale 7

III. Les systèmes de transport ionique du spermatozoïde 9

1. Les ATPase membranaires 10

2. Les échangeurs ioniques 10

3. Les canaux ioniques 11

Les canaux sodiques 11

Les canaux potassiques 11

Les canaux chlorures 12

Les canaux sensibles aux nucléotides cycliques (canaux CNG) 13
4. Diversité des canaux calciques présents au niveau du spermatozoïde 14

Les canaux calciques dépendant du potentiel. 15

Les canaux de type SOC « Store Operated Channels » 17

Les récepteurs canaux. 19

Les canaux calciques du réticulum. 19

Chapitre 2 : La capacitation, étape de maturation des spermatozoïdes 22

I. Modification de la composition lipidique membranaire lors de la capacitation 23
1. La membrane plasmique du spermatozoïde avant capacitation 23

2. Le bicarbonate induit des modifications lipidiques de la membrane 26

3. Les lipoprotéines présents au niveau du tractus génital femelle induisent un efflux de

cholestérol 27

II. Modifications ioniques lors de la capacitation 29

 III. L’hyperactivation flagellaire. 31
1. Mécanisme moléculaire de la mobilité spermatique symétrique 31

2. Voies de signalisation de régulation de la mobilité spermatique symétrique 32

3. Voie de signalisation AMPc/PKA 33

4. Voie de signalisation Calmoduline/CamK/Calcineurine dépendante du calcium 34

5. Mécanisme moléculaire de l’hyperactivité flagellaire 35

Chapitre 3: La réaction acrosomique 38

I. Liaison des spermatozoïdes à la zone pellucide 38
II. La réaction acrosomique 42
III. Mécanisme moléculaire de la réaction acrosomique 43
1. Les protéines SNAREs 43

Modèle de fusion membranaire par les protéines SNAREs 47

2. La réaction acrosomique est contrôlée par une signalisation biphasique de calcium 49

3. La réaction acrosomique est également contrôlée par des messagers lipidiques

produits par les phospholipases 52

Les phospholipases sont les générateurs des messagers lipidiques spermatiques 53

Chapitre 4 : Liaison et fusion des spermatozoïdes avec l’ovocyte 60

I. Pénétration de la zone pellucide 60
II. Liaison et fusion des spermatozoïdes avec la membrane ovocytaire 60

Problématique 65

Méthodologie 73
II. Fractionnement des venins par chromatographie 75
II. Modèle biologique : la mobilité spermatique 75

Résultats 79
I. Découverte de nouveaux outils pharmacologiques à partir de venins d’animaux. 81
1. Introduction 81
 Article 1: sPLA2 from snake venom as a source of molecule modulating sperm
physiology: Phospholipases of the toxic snakes Oxyuranus scutellanus strongly modulate
sperm motility, sperm acrosome reaction and in vitro fertilization 83
2. Discussion 85

II. Évaluation du rôle des sPLA2 de mammifère dans la physiologie spermatique 87

3. Introduction 87

Article 2: Mammalian Group X secreted phospholipase A2 regulates specifically sperm

motility 89
Article 3: Group X phospholipase A2 is secreted during sperm acrosome reaction and
controls fertility outcome. 91
4. Discussion 93

Identification d’une nouvelle voie moléculaire de contrôle de la mobilité spermatique

(Article 2). 93

mGX est exprimée au niveau de l’acrosome des spermatozoïdes et relâché durant la
réaction acrosmique (article 3). 94

Rôle de mGX dans la physiologie spermatique (article 3). 94
III. Évaluation du rôle fonctionnel et physiologique des canaux CaV3.1 et CaV3.2 dans une
étape physiologie spermatique : La réaction acrosomique 97
5. Introduction 97

Article 4: Expression, Localization and Functions in Acrosome Reaction and Sperm

Motility of CaV3.1 and CaV3.2 Channels in Sperm Cells: an evaluation from CaV3.1 and
CaV3.2 Deficient Mice 99
6. Discussion 101

Les courants calciques dépendant du voltage de type T des cellules germinales est due
seulement à l'activation du canal Cav3.2 101

Le canal Cav3.1 est absent des spermatozoïdes matures 101
-/-

Seule la signalisation calcique des spermatozoïdes Cav3.2 est affectée lors de la
réaction acrosomique 102

Les canaux Cav3.2 ne sont pas les seuls canaux calciques impliqués dans la signalisation
de la RA 102

Conclusion générale et perspectives 105

Régulation de la physiologie spermatique par les phospholipases A2 secrétées 107
Implication des canaux calciques de type T dans la régulation de la réaction acrosomique 114

Références Bibliographiques 117

 LISTES DES FIGURES

Figure 1 : Représentation schématique des étapes de la fécondation chez la souris .................. 1

Figure 2 : Coupe longitudinale observée au microscope électronique de la tête de

spermatozoïde de souris et sa représentation schématique. ........................................................ 2

Figure 3 : Représentation schématique d’un spermatozoïde de Mammifère ............................. 3

Figure 4 : Coupe longitudinale observée au microscope électronique de la jonction entre la

pièce intermédiaire et la pièce principale d'un spermatozoïde de souris.. .................................. 3

Figure 5 : Structure de l’axonème du flagelle d’un spermatozoïde de mammifère.................... 4

Figure 6 : Organisation de la dynéine axonémale.. .................................................................... 6

Figure 7 : Représentation schématique de la gaine fibreuse....................................................... 7

Figure 8 : Représentation schématique des voies métaboliques de synthèse de l’ATP du

spermatozoïde ............................................................................................................................. 9

Figure 9 : Représentation schématique de la distribution des canaux calciques dans le

sperme de mammifères ............................................................................................................. 14

Figure 10 : Représentation schématique de la structure des canaux calciques dépendants du

voltage....................................................................................................................................... 15

Figure 11 : Représentation schématique du canal CatSper. ..................................................... 17

Figure 12 : Organisation structurale d’un monomère des TRPCs ............................................ 18

Figure 13 : Représentation schématique d’un monomère du récepteur à l’IP3. ....................... 20

Figure 14 : Représentation schématique de la structure du récepteur à la ryanodine............... 21

Figure 15 : Formules chimiques de quelques phospholipides communément observés et du
cholestérol ................................................................................................................................. 24

Figure 16 : Formules chimiques de la phosphatidylcholine (PC), choline plasmalogène et

de la sphingomyéline (SM). ...................................................................................................... 24

Figure 17: Membrane plasmique des spermatozoïdes immatures ............................................ 26

Figure 18 : Modèle des voies signalisations de la modification de la composition lipidique

membranaire lors de la capacitation des spermatozoïdes de mammifère ................................. 29

Figure 19 : Modifications ioniques lors de la capacitation des spermatozoïdes de

mammifères. ............................................................................................................................. 30

Figure 20 : Photo des trajectoires des têtes de spermatozoïdes de souris établis par un
appareil de mobilité spermatique (CASA) ............................................................................... 31

Figure 21 : Représentation schématique simplifiée du mécanisme moléculaire de la

mobilité spermatique. ............................................................................................................... 32

Figure 22 : Représentation schématique de la voie de signalisation AMPc/PKA qui régule

la mobilité spermatique des mammifères ................................................................................. 33

Figure 23 : Représentation schématique de la voie de signalisation

Calmoduline/CamK/Calcineurine qui régule la mobilité spermatique des mammifères ......... 34

Figure 24 : Représentation hypothétique du mécanisme de régulation de l’hyperactivité

flagellaire induite lors de la capacitation. ................................................................................. 35

Figure 25 : La réaction acrosomique ........................................................................................ 38

Figure 26 : La zone pellucide de l’œuf. .................................................................................... 39

Figure 27 : Représentation schématique des récepteurs spermatiques impliqués dans la
liaison avec la Zone pellucide................................................................................................... 41

Figure 28 : Photos de coupes sagittales de la tête de spermatozoïde de souris en

microscopie électronique à transmission représentants les étapes morphologiques de la
réaction acrosomique. ............................................................................................................... 43

Figure 29 : Représentation schématique du complexe SNARE présent au niveau des

membranes acrosomiques et plasmiques du spermatozoïde. .................................................... 47

Figure 30 : Représentation schématique de l’action des acides gras sur la syntaxine I. .......... 47

Figure 31: Représentation du cycle de fonctionnement des protéines SNAREs. ..................... 49

Figure 32 : Représentation schématique de la signalisation calcique biphasique au cours de

la réaction acrosomique. ........................................................................................................... 50

Figure 33: Représentation schématique du mécanisme moléculaire de la réaction

acrosomique.. ............................................................................................................................ 51

Figure 34 : Répésentation schématique de l’hydrolyse de la phosphatidylcholine par les

phospholipases A1, A2, C et D. ................................................................................................. 54

Figure 35 : Représentation schématique du contrôle lipidique du mécanisme de la réaction

acrosomique des spermatozoïdes de souris .............................................................................. 58

Figure 36 : Représentation schématique des protéines impliquées dans la fusion gamétique

des mammifère ......................................................................................................................... 62

Figure 37 : Analyse automatique du mouvement spermatique par le système CASA..........75

Figure 38 : Paramètres de mobilité CASA des spermatozoïdes de souris OF1........................ 76

Figure 39 :Comparaison des paramètres CASA de mobilité spermatique des

spermatozoïdes de souris OF1 capacité et non capacités in vitro. ............................................ 77
Figure 40: Modèle de la régulation de la physiologie spermatique par la
phospholipase A2 secrétée mGX……………………………………………………....107
Introduction
 Introduction

Les principes, les étapes et les exigences de la fécondation

Chez les espèces à reproduction sexuée, la formation d’un nouvel individu repose sur la
fusion des matériels génétiques haploïdes du gamète mâle, le spermatozoïde, et du gamète
femelle, l’ovocyte, au cours d’une étape appelée fécondation. Les gamètes, et plus
particulièrement le spermatozoïde, font l’objet de processus de maturation précoces et
tardives, indispensables au bon fonctionnement du spermatozoïde.
La fécondation s’effectue en plusieurs étapes individualisées. Après avoir traversé le
cumulus oophorus, le spermatozoïde ayant un acrosome intact se fixe de façon spécifique à
ZP3, une des trois glycoprotéines de la zone pellucide (ZP) qui entoure l’ovocyte (fixation
primaire). Une fois lié, il subit la réaction acrosomique (RA). La RA correspond à l’exocytose
de la vésicule de sécrétion (l’acrosome) située au niveau de la tête du spermatozoïde. Le
spermatozoïde se fixe alors plus solidement à la zone pellucide (fixation secondaire) et la
pénètre. Une fois l’espace périvitellin atteint, il se lie alors à la membrane plasmique
ovocytaire avec laquelle il fusionne. La fusion du spermatozoïde induit l’exocytose des
granules corticaux qui modifient la ZP afin de bloquer la polyspermie. L’ovocyte est alors
fécondé (Figure 1).

Figure 1: Représentation
schématique des étapes de la
fécondation chez la souris.
L’ensemble des étapes de la
fécondation durent en moyenne
90 min chez la souris.

Pour que la fécondation réussisse, les deux gamètes doivent se rencontrer à un moment et un
état de maturité propice. L’ovocyte doit être entouré des cellules folliculaires et bloqué en
métaphase de deuxième division méiotique. Le spermatozoïde doit se trouver dans un état
compatible, il doit être mobile afin de pouvoir traverser l’oviducte et être capable d’interagir
avec la zone pellucide et rentrer dans l’ovocyte.
1
 Introduction
Chapitre 1 : Le spermatozoïde de Mammifère
Le spermatozoïde est une cellule autonome qui mesure 100 à 150 µm de long. Il est constitué
de deux parties distinctes : la tête et le flagelle.

I. La tête du spermatozoïde
La tête du spermatozoïde (8 µm sur 4 µm) contient un noyau haploïde allongé recouvert sur
ses deux tiers antérieurs par la vésicule acrosomiale ou acrosome. Le noyau haploïde
renferme les chromosomes à l’état de chromatine compacte, condensation nucléaire renforcée
par l’association de l’ADN à des protamines.
L’acrosome est un organite intracellulaire dérivé de l’appareil de Golgi. Il contient plusieurs
enzymes hydrolytiques et protéolytiques telles que : la β-N-acétylglucosaminidase, la
hyaluronidase, la phosphatase acide et l’acrosine qui participent à la rupture des pontages
entre ZP1, ZP2 et ZP3, (Suarez 1987; Suarez, Vincenti et al. 1987; Ho and Suarez 2001; Ho,
Granish et al. 2002; Turner 2003; Turner 2006; Buffone, Foster et al. 2008)

La tête du spermatozoïde est constituée : d’une membrane plasmique, d’un espace péri-
acrosomique, d’une membrane acrosomique externe, d’un contenu acrosomique, d’une
membrane interne acrosomique, d’un espace sous acrosomique et d’un noyau haploïde (figure
2).

Figure 2 : Coupe longitudinale observée au microscope électronique de la tête de spermatozoïde de souris et sa

représentation schématique.

La tête du spermatozoïde est reliée au flagelle par un col court et rétréci. Ce dernier est
constitué des centrioles proximaux et distaux, qui sont à l’origine de l’axonème (Figure 3).
2
 Introduction

Figure 3 : Représentation schématique d’un spermatozoïde de Mammifère

II. Le flagelle

Le flagelle est un organite très complexe qui permet au spermatozoïde de se mouvoir.

Il est composé d’une pièce intermédiaire, d’une pièce principale cinq fois plus longue que
l’ensemble tête-col-pièce intermédiaire et d’une pièce terminale courte (figure 3).

1. La partie motrice principale du flagelle : complexe microtubulaire

La partie motrice principale du flagelle est appelée l’axonème. L’axonème est une structure
protéique très complexe, où les microtubules et leurs protéines associées sont organisés en un
long cylindre selon le schéma appelé 9 +2 (Ho and Suarez 2001). L’axonéme est un complexe
microtubulaire entouré de fibres denses externes (ODF) et de mitochondries (M) au niveau de
la pièce intermédiaire, et d’une gaine fibreuse (FS) au niveau de la pièce principale (figure 4).

Figure 4 : (a) Coupe longitudinale observée au

microscope électronique de la jonction entre la pièce
intermédiaire et la pièce principale d'un spermatozoïde
de souris. L’axonème, partie centrale du flagelle est
principalement constitué de microtubules, de dynéine et
de plus de 250 protéines associées. Il est entouré de
fibres denses externes (ODF) et de mitochondries (M)
dans la pièce intermédiaire, et d’une gaine fibreuse (FS)
dans la pièce principale. (b),(c) Coupe transversale
observée au microscope électronique de la pièce
intermédiaire et de la pièce principale, respectivement.
(d) Coupe transversale observée au microscope
électronique de l'axonème seul, montrant le modèle
appelé « 9 +2 », avec une paire de microtubules centrale
entourée d’un cercle de 9 paires de microtubules. La
barre d'échelle représente 200 nm (Ho and Suarez 2001).

3
 Introduction
L’axonème, dont le diamètre mesure environ 0.2 µm, est constitué d'un cercle de 9 doublets
microtubulaires et d’une paire centrale composée de deux microtubules simples. Les
microtubules de l’axonéme sont formés par association d'unités de tubuline α et β, deux
molécules très semblables. Ces dernières s’empilent de façon alternée afin de former des
protofilaments. Un microtubule est dit « complet » lorsqu’il est constitué de 13
protofilaments. Les 9 doublets microtubulaires de l’axonéme sont constitués en avant d’un
microtubule A « complet » de 13 protofilaments et en arrière d’un microtubule Β
« incomplet » de 10 protofilaments (figure 5).
Figure 5 : Structure de l’axonème du flagelle
d’un spermatozoïde de mammifère. A)
Représentation schématique d’un axonème de
spermatozoïde de mammifère. L’axonème est
constitué d'un cercle de 9 doublets
microtubulaires (A et B) et d’une paire
centrale composée de deux microtubules. Les
microtubules de l’axonéme sont formés par
association d'unités de tubuline α et β. les
différents doublets sont associés entre eux par
des ponts de nexine. Les microtubules A sont
reliés à la gaine centrale (Inner sheat) par des
fibres rayonnantes (Radiale spoke). Les
microtubules Α portent les bras de dynéine.
B) Photographie de l’axonème d’un
spermatozoïde de mammifère par microscopie
électronique (Inaba 2007).

Les différents doublets sont associés entre eux par des ponts très élastiques constitués
principalement de nexine. Les microtubules Α portent par ailleurs des bras de dynéine
ATPasique qui permettent de s'accrocher au microtubule Β du doublet adjacent. L’interaction
cyclique de la dynéine avec le microtubule Β génère un phénomène de « glissement » des
microtubules entre eux, permettant le mouvement flagellaire (cf page 32).

2. Les dynéines axonémales

Les dynéines sont des ATPases de haut poids moléculaire 1-2 MDa, impliquées dans
l’ondulation des cils et flagelles et dans le transport des vésicules le long des microtubules.
Les dynéines ont été découvertes il y a 50 ans (Gibbons 1996). Ces enzymes sont composées
de plusieurs chaînes lourdes qui portent l'activité ATPasique et qui sont codées par une
4
 Introduction
famille multigénique très conservée (Cosson 1996; Milisav 1998).
Les dynéines axonémales forment 2 rangées de bras portés par les microtubules A de chaque
doublet. On distingue les bras dits « externes » situés du côté de la membrane plasmique et les
bras dits « internes » situés du côté des microtubules centraux (figure 5). Ces bras sont
espacés tous les 24 nm le long des microtubules Α. Les bras externes et internes de dynéine
sont des complexes multiprotéiques formés d'une vingtaine de polypeptides. (Cosson 1996;
Inaba 2003; Turner 2006).
La structure des bras de dynéines axonémales a été beaucoup étudiée. L’organisme modèle
utilisé pour caractériser la structure des bras de dynéine axonémale est une algue unicellulaire
biflagellée, le Chlamydomonas reinhardtii (Yamamoto, Yanagisawa et al. 2006). Des études
chez Chlamydomonas reinhardtii, chez l’oursin et le verrat ont permis de caractériser la
structure des bras internes de dynéines axonémales. Elles sont composées de deux chaînes
lourdes α et β (500 kDa) (trois pour Chlamydomonas reinhardtii), de trois à cinq chaînes
intermédiaires (120-60 kDa) et de six chaînes légères (30-80 kDa) (huit Chlamydomonas
reinhardtii). La structure des bras de dynéines internes est plus complexe et moins étudiée,
car la purification des bras de dynéines internes est beaucoup plus difficile (Gatti, Nicolle et
al. 1994). Les bras de dynéines internes sont composés comme les bras internes de chaînes
lourdes (deux à six selon les espèces), de chaînes intermédiaires (trois à cinq) et de chaînes
légères (deux à huit). (Figure 6)
La partie C-terminale de chaque chaîne lourde (DHC) est constituée d’une tête globulaire
contenant le site ATPase, de deux hélices qui permettent la flexibilité et la mobilité de la
dynéine et d’une petite unité globulaire de liaison aux microtubules B. La tête globulaire est
constituée de six domaines ATPasiques nommés AAA1-6 (ATPase Associated with cellular
Activities). L’équipe de Talahide Kon a pu identifier par l’élaboration d’un mutant du
domaine AAA1 (remplacement de la lysine K1975 par la Thréonine) le site ATPasique qui
permet de générer la force de glissement des microtubules. En effet, ce site serait localisé au
niveau du domaine AAA1 (Kon, Nishiura et al. 2004).
Des expériences de cartographie de sites de phosphorylation de la chaîne lourde α du bras de
dynéine externe ont permis d’établir plusieurs sites de phosphorylations. Les sites majeurs de
phosphorylations de la dynéine sont situés prés du domaine AAA1 et de l’unité globulaire de
liaison aux microtubules Β (King and Witman 1994). Ces sites de phosphorylation vont
permettre la régulation de l’activité ATPasique des dynéines (Dillman and Pfister 1994).Dans
chaque espèce, il existe plusieurs gènes codant les différentes DHC : il y en a 12 pour

5
 Introduction
Chlamydomonas reinhardtii (Milisav 1998), 13 chez l'oursin (Milisav 1998), 12 chez la souris
(Vaughan, Mikami et al. 1996) et 13 chez l’homme (Chapelin, Duriez et al. 1997).
Au niveau de la partie N-terminale des chaines lourdes, on retrouve les chaînes
intermédiaires qui permettent d’augmenter l’interaction entre la dynéine et le microtubule Α ,
les chaînes légères et une série de protéines régulatrices de la dyénine.
Les chaînes légères (LC) vont réguler l’activité de la dynéine par des interactions avec
protéines régulatrices dépendantes du calcium comme la calmoduline et Tctex2. La
calmoduline va interagir avec les chaînes légères de la dynéine au niveau de son domaine
LC8. L’identification du domaine d’interaction des chaînes légères avec la calmoduline a été
caractérisée (Narisawa, Hecht et al. 2002) par des expériences de co-immuprécipitation par
l’équipe de Yang (Yang, Diener et al. 2001). Tctex2 lui aussi va interagir avec les chaines
légères de la dynéine, mais au niveau de son domaine LC1, la phosphorylation de Tctex2 par
la protéine kinase A spécifique au spermatozoïde (testis-specifique PKA) va permettre la
régulation de l’activité ATPasique des dynéines (Inaba, Kagami et al. 1999).

Figure 6 : Organisation de la dynéine axonémale. A) Représentation schématique d’un bras de dynéines

axonémal constitué de deux chaînes lourdes. La partie C-terminale de chaque chaîne lourde est constituée d’une
tête globulaire contenant les sites ATPasiques, de deux hélices qui permettent la flexibilité et la mobilité de la
dynéine et d’une petite unité globulaire de liaison aux microtubules Β (ΜT-binding). La base de la dynéine se
compose de la partie N-terminale des chaînes lourdes, des chaînes intermédiaires qui augmentent l’interaction
entre la dynéine et le microtubule Α, des chaînes légères. Les chaînes légères permettent l’ancrage du bras de
dynéine au microtubule A et la régulation de l’activité de la dynéine par des interactions avec des protéines
kinase et la calmoduline, et une série de protéines régulatrices de la dynéine. B) Représentation schématique de
l’organisation d’une chaine lourde. La tête globulaire se compose de six domaines AAA (ATPase Associated
with cellular Activities), dont le domaine catalytique de l’ATP est le domaine AAA1 (King 2000).

6
 Introduction
3. Les fibres denses (ODF)

Les fibres denses sont composées de 14 polypeptides, de protéines de filaments

intermédiaires, de protéines riches en cystéine ou en prolines. À l’heure actuelle, les fibres
denses ont été peu étudiées. Différentes équipes ont émis l’hypothése (Oko 1988; Shao,
Tarnasky et al. 1997) que ces fibres joueraient un rôle de maintien et d’élasticité du
spermatozoïde.

4. La gaine de mitochondries

La gaine, générateur énergétique (ATP) du spermatozoïde, est régulièrement disposée en

spirale au niveau de la pièce intermédiaire. Les mitochondries spermatiques sont extrêmement
différenciées et spécifiques. En effet, elles sont principalement constituées d’isoformes des
cellules somatiques. La gaine de mitochondrie va produire, grâce au processus de
phosphorylation oxydative, une partie de l’énergie nécessaire à la mobilité spermatique
(figure 8). Cependant, l’étude du phénotype d’une souris, dont le gène du cytochrome C
(protéine de transfert d’électron indispensable à la phosphorylation oxydative) a été invalidé,
a montré que la phosphorylation oxydative n’est pas le seul processus de fabrication d’ATP
au niveau du spermatozoïde. En effet, les spermatozoïdes provenant de souris invalidées pour
le cytochrome C sont mobiles, présentent un niveau basal d’ATP quasi normal et finalement
sont fertiles (Narisawa, Hecht et al. 2002).

5. La gaine fibreuse de la pièce principale

La gaine fibreuse est une structure unique du flagelle des spermatozoïdes. Elle entoure
l’axonème et les fibres denses ODF au niveau de la pièce principale. Elle se compose de deux
colonnes longitudinales reliées entre elles par des stries de fibres (figure 7).

Figure 7 : Représentation schématique de la gaine

fibreuse. La gaine fibreuse entoure l’axonème et les
fibres denses ODF au niveau de la pièce principale du
flagelle du spermatozoïde. Elle se compose de deux
colonnes longitudinales reliées entre elles par des
stries de fibre (Circumferential Ribs). Les colonnes
longitudinales sont reliées au niveau des doublets
microtubules 3 et 8 de l’axonéme (Eddy 2007).

7
 Introduction

La gaine fibreuse est constituée de polypeptides, de protéines de filaments intermédiaires

(keratine-like) (Eddy, O'Brien et al. 1991), de protéines riches en cystéines ou en prolines et
de protéines impliquées dans différentes voies de signalisation ou métaboliques comme la
signalisation des PKA, des Rho, et la glycolyse (Eddy, Toshimori et al. 2003; Eddy 2007).

Près de la moitié des protéines de la gaine fibreuse, isolées à partir du sperme de souris, sont
des protéines AKAP (A Kinase Anchoring Protein). Les protéines AKAP sont une famille de
protéines d’ancrage. Elles vont permettre, par une simple fixation sur des sous-unités
protéiques, de réguler la localisation des protéines kinases dépendantes de l’AMPc (PKA), des
phosphatases et d'autres enzymes de signalisation (Edwards and Scott 2000). Au niveau de la
gaine fibreuse, on retrouve les protéines AKAP 3, TAKAP-80 et AKAP 4, protéines
d’ancrage des protéines kinases dépendantes de l’AMPc (PKA). Elles sont impliquées dans la
structure et l’assemblage de la gaine fibreuse (Miki, Willis et al. 2002). Les souris déficientes
en protéines AKAP 3 et AKAP 4 ont des spermatozoïdes qui présentent une mobilité
spermatique déficiente, ceci entraînant une infertilité. Au niveau morphologique, la gaine
fibreuse est déstabilisée et le flagelle raccourci (Miki, Willis et al. 2002).

AKAP 3 est aussi une protéine d’ancrage des ropporines. Les ropporines sont impliquées
dans la voie de signalisation des Rho. Cette voie de signalisation permet la réorganisation de
l’actine, la régulation de la motilité et la cytokinèse (Bishop and Hall 2000; Takai, Sasaki et
al. 2001).

La gaine fibreuse est comme la gaine mitochondriale, un générateur d’ATP (figure 8). La
gaine fibreuse va produire l'énergie nécessaire à la mise en place de l’hyperactivité flagellaire
et ainsi permettre au spermatozoïde de traverser la zone pellucide. L’énergie est produite par
le processus de glycolyse grâce à la présence au niveau de la gaine fibreuse d’enzymes
glycoliques spermatogeniques telle que la lactate déshydrogénase isoenzyme C4 (Burgos,
Maldonado et al. 1995), l’hexokinase de type 1 (Mori, Nakamura et al. 1998) et la
Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDS).

8
 Introduction

Figure 8 : Représentation schématique des voies métaboliques de synthèse de l’ATP du spermatozoïde

(Vadnais, Galantino-Homer et al. 2007).

La gaine fibreuse est une structure cytosquelettique spermatique importante. Elle permet :
- la régulation des voies de signalisations impliquées dans la mobilité spermatique, la
capacitation et l’hypéractivation flagellaire grâce à ses protéines d’ancrage.
- la production d'énergie nécessaire pour traverser la zone pellucide.

III. Les systèmes de transport ionique du spermatozoïde

Le spermatozoïde de mammifères est équipé de nombreux systèmes de transport ionique,

similaires à ceux présents dans les cellules somatiques. Les canaux ioniques, surtout
calciques, seront plus particulièrement détaillés, du faite de leur importance considérable dans
les processus de signalisation du spermatozoïde (Darszon, Nishigaki et al. 2005).
Dans le spermatozoïde, il existe trois types de systèmes de transport ionique :

- Les Adénosines tri phosphatase (ATPase) membranaire, consommant de

l’adénosine tri phosphate (ATP), permettant d’expulser ou de faire rentrer des ions
contre leur gradient électrochimique.

- Les échangeurs ioniques, à l’inverse des ATPases membranaires sont des systèmes
où deux, voire trois transferts ioniques sont couplés.

- Les canaux ioniques sont des systèmes dont le fonctionnement ne dépend que du
gradient électrochimique. Ils présentent une capacité de transfert ionique élevée et
ont le plus souvent une sélectivité pour un ion donné, ainsi qu’une cinétique de
fonctionnement spécifique.

9
 Introduction
1. Les ATPase membranaires
Deux sortes d’ATPases membranaires sont particulièrement importantes :
- Les ATPases Sodium (Na+) / Potassium (K+), ont pour rôle le maintien d’un
gradient transmembranaire d’ion Na+ et K+ selon un transport actif de 3 ions Na+
vers l’extérieur et de 2 ions K+ vers l’intérieur. Les ATPases Na+/K+ permettent le
contrôle du potentiel de repos membranaire et sont impliquées dans la régulation
de la capacitation, la réaction acrosomique et la mobilité des spermatozoïdes
(Mrsny and Meizel 1981; Mrsny, Siiteri et al. 1984; Mrsny and Meizel 1985).
- L’ATPase calcique, permet l’expulsion de deux ions Ca2+ par molécule d’ATP
dégradée. Des APTases calciques sont présentes au niveau de la membrane
plasmique du spermatozoïde (Gordon and Barrnett 1967; Ashraf, Peterson et al.
1982; Breitbart and Rubinstein 1982; Breitbart, Stern et al. 1983). L’étude de
Roldan and Fleming 1989, a permis d’établir l’implication des ATPases calcique
dans la signalisation calcique régulant la capacitation, la réaction acrosomique et la
mobilité spermatique. Cette implication a été montrée par l’utilisation
d’antagonistes des ATPases calciques.

2. Les échangeurs ioniques

Les échangeurs ioniques, à l’inverse des ATPases membranaires, sont des systèmes où deux,
voire trois transferts ioniques sont couplés. L’énergie étant fournie par le mouvement de l’un
des ions qui suit son gradient électrochimique. Parmi les nombreux co-transporteurs connus,
quatre sont importants dans la physiologie spermatique :
- L’échangeur sodium/proton (Na+/H+) (NHX) assurant la régulation du pH interne,
entre 7.0 et 7.4, dont le maintien est indispensable à un déroulement correct des
voies de signalisation de la physiologie spermatique (Cross 2007).
- L’échangeur Na+/Ca2+ (NCX), de nature électrogénique, présents une
stoechiométrie de 3 molécules de Na+ pour une de Ca2+. L’échangeur Na+/Ca2+
(NCX) est présent au niveau du spermatozoïde et permet le maintien de
l’homéostasie calcique. Le blocage de l’échangeur Na+/Ca2+(NCX), par des
inhibiteurs tels que le bepridil, 3’-4’ dichlorobenzamil hydrochloride, et KB-
R7943, induit une modulation du potentiel de membrane et une immobilité
spermatique (Krasznai, Krasznai et al. 2006; Shiba, Marian et al. 2006).
- L’échangeur chlore/bicarbonates (Cl-/HCO3-), utilisant dans les conditions
normales le gradient entrant de Na+ pour produire l’extrusion de protons hors de la

10
 Introduction
cellule. L’échangeur chlore/bicarbonate (Cl-/HCO3-) permet une augmentation
intracellulaire de bicarbonate, première étape des modifications physiologiques,
intracellulaires ou membranaires du spermatozoïde qui lui permettra de féconder
l’ovocyte (Visconti, Muschietti et al. 1990; Gadella and Harrison 2000; Flesch,
Brouwers et al. 2001; Harrison and Gadella 2005). De plus, des études
fonctionnelles ont démontré qu’il existait dans les spermatozoïdes de souris deux
systèmes régulant le pH : un échangeur Cl-/HCO3- dépendant du Na+ et un système
-
inhibé par des antagonistes des canaux Cl mais qui ne possède pas toutes les
caractéristiques des échangeurs Cl-/HCO3- indépendants du Na+(Zeng, Oberdorf et
al. 1996).

3. Les canaux ioniques

Les canaux sodiques

Deux types de canaux sodiques sont actuellement bien décrits, des canaux sodiques activés
par une dépolarisation de la membrane (Nav.x) et des canaux sodiques couplés aux protéines
G. Actuellement, aucun enregistrement de flux sodique n’a été décrit dans le spermatozoïde
de mammifères, mais récemment l’équipe de Pinto (Pinto, Ravina et al. 2009) a montré par
une technique d’immunofluorescence la présence des canaux sodiques dépendant du voltage
Nav1.1 à 1.9 au niveau des spermatozoïdes humains à l'exception de Nav1.1 et Nav1.3.
L’équipe de Pinto a aussi montré un possible rôle de ces canaux dans la régulation de la
mobilité spermatique, car l’application de veratridine, un activateur des canaux Nav, sur les
spermatozoïdes induit une augmentation de leur mobilité.

Les canaux potassiques

Les ions K+ participent principalement à l’établissement et à la modulation du potentiel de
membranaire (Em). Les canaux potassiques permettent la diffusion passive et sélective des
ions K+ à travers la membrane plasmique. Dans les conditions physiologiques, le flux est
presque systématiquement dirigé vers l’extérieur permettant le maintien du potentiel
électrique à une valeur proche de celle du potentiel d’équilibre de l’ion K +. Il existe une
grande diversité de canaux potassiques qui se distinguent par des mécanismes modulant leur
activité. Ces canaux sont des multimères dont les sous-unités α forment le pore ionique et
déterminent le mode de régulation. Ils peuvent ainsi se différencier en plusieurs catégories
ceux dépendants du voltage, ceux sensibles au calcium, ceux couplés à une protéine G, ceux
sensibles à l’ATP et ceux à deux domaines P (K2P) (Lesage, Barhanin et al. 2000).
11
 Introduction
De nombreux canaux potassiques ont été identifiés dans les spermatozoïdes, ils sont
soupçonnés de jouer un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Au niveau des
spermatozoïdes, différents canaux potassiques ont été retrouvés, des canaux dépendants du
voltage tel que Kv1.1, Kv1.2, Kv3.1, Ksper, Slo3 et un canal couplé à une protéine G GIRK.
Ils ont été localisés au niveau de la pièce principale du flagelle et au niveau de la tête du
spermatozoïde (Schreiber, Wei et al. 1998; Felix, Serrano et al. 2002; Barfield, Yeung et al.
2005; Navarro, Kirichok et al. 2007). L’étude de Munoz 2001 a permis de mettre en évidence
le rôle des canaux potassiques dépendants du voltage à rectification entrante dans le
mécanisme de capacitation des spermatozoïdes. En effet, cette étude montre que le blocage
des courants K+ à l’aide de baryum et césium empêche l’hyperpolarisation de la membrane
plasmique (élément clef de la capacitation) et diminue le taux de réaction acrosomique induit
par la zone pellucide (Munoz-Garay, De La Vega-Beltran et al. 2001).
L’étude de Navarro et al, 2007 a permis de mettre en évidence le rôle Ksper dans
l’hyperpolarisation de la membrane plasmique durant la maturation du spermatozoïde. De
plus cette équipe a posé la question de savoir si Ksper et Slo3 ne sont pas le même canal
potassique. En effet, diverses observations vont dans ce sens, Slo3 et Ksper sont des canaux
potassiques régulés par le pH, ils présentent le même seuil d’activation de dépolarisation de la
membrane (-16 mV) et le gène codant pour Ksper est quasi identique au gène codant pour
Slo3 (Schreiber, Wei et al. 1998; Navarro, Kirichok et al. 2007).

Les canaux chlorures

Comparés aux autres canaux ioniques, les canaux Cl- ont longtemps joué le rôle d’outsiders
intéressants, mais marginaux. Cela est dû en partie à ce que les conductances Cl- sont plus
difficiles à détecter que d’autres et que les fonctions des canaux Cl- de la membrane
plasmique sont mal définies dans la plupart des tissus. Trois types de canaux chlorures sont
plus étudiés et retrouvés au niveau des spermatozoïdes (Meizel 1997) :
-
Les canaux Cl- couplés au récepteur GABAa, dont l’activation entraîne un influx
de Cl- sont responsable d’une hyperpolarisation de la membrane.
-
Les canaux Cl- couplés à un récepteur glycine, complexe membranaire
oligomérique formé de sous-unités protéiques.
- Les canaux Cl- dépendants du voltage ( ClC). Les ClC sont des protéines d’environ
680 à 910 acides aminés (70 à 95 kDa). Ils possèdent 13 domaines hydrophobes
qui s’organisent en hélice α, mais seulement 10 à 12 domaines seraient

12
 Introduction
effectivement transmembranaires. Les ClC s’organiseraient en homo- ou
hétéromultimères (par 2 ou par 4) pour former un canal fonctionnel.

Des récepteurs GABAa sont présents au niveau de la membrane du spermatozoïde humain

(Aanesen, Fried et al. 1996; Ritta, Calamera et al. 1998). Ils sont localisés dans la région du
segment équatorial (Wistrom and Meizel 1993). Chez l’homme, le GABA initie la réaction
acrosomique de façon dose dépendante selon un mécanisme dépendant du calcium
extracellulaire (Shi, Yuan et al. 1997). Cet effet sur la réaction acrosomique est
principalement lié à l’activation des récepteurs de type GABAa (Calogero, Burrello et al.
1999).

Les cellules spermatogoniques de souris possèdent aussi des canaux Cl- ouverts à des
potentiels au-dessus de -50 mV et sensibles à l’acide niflumique, inhibiteur anionique
(Espinosa, De la Vega et al. 1998). Chez la souris, ce dernier inhibe la réaction acrosomique
induite par différents inducteurs tels que la zone pellucide, la progestérone et le GABA
(Espinosa, De la Vega et al. 1998) (Espinosa, de la Vega-Beltran et al. 1998; Darszon,
Labarca et al. 1999). L’étude de Yeung 2005 a permis d’établir la présence de deux canaux
chlore dépendant du voltage : le CLCN3 et CLNS1A au niveau des spermatozoïdes humains.
Ces canaux sont impliqués dans la régulation du volume cellulaire des spermatozoïdes
humains (Yeung, Barfield et al. 2005).

Les canaux sensibles aux nucléotides cycliques (canaux CNG)

Les canaux sensibles aux nucléotides cycliques font partie de la famille des canaux ioniques
activés par des ligands. Les CNG sont des canaux ioniques non sélectifs (Kaupp, Niidome et
al. 1989). Ces derniers sont activés par des nucléotides cycliques tels que l’AMPc et le GMPc
(Dzeja, Hagen et al. 1999). Les CNG sont des tétramères. Chaque monomère est composé de
six segments transmembranaires et d’un domaine cytoplasmique de liaison aux nucléotides
cycliques.

Des études d’imunohistochimie ont montré la présence de deux canaux CNG au niveau du
flagelle des spermatozoïdes, CNGA3 et CNGA1 (Wiesner, Weiner et al. 1998; Kobori,
Miyazaki et al. 2000). Des études utilisant un analogue du GMPc, le 8-BrcGMP a permis de
montrer l’implication des canaux CNG dans la signalisation calcique spermatique. En effet,
ces études montrent que le 8-BrcGMP induit d’une part la réaction acrosomique (Rotem,
Zamir et al. 1998) et d’autre part une vague calcique au niveau de la tête des spermatozoïdes
13
 Introduction
(Kobori, Miyazaki et al. 2000). Cependant, l’invalidation du gène GNCA3 n’induit aucune
infertilité spermatique (Biel, Seeliger et al. 1999). La découverte d’une nouvelle famille de
canaux calcique dépendant du voltage et de l’activation par AMPc : « Catsper » au niveau du
flagelle des spermatozoïdes (Ren, Navarro et al. 2001), jette un doute sur le rôle des canaux
CNG dans la signalisation calcique spermatique.

4. Diversité des canaux calciques présents au niveau du spermatozoïde

Le calcium constitue un messager intracellulaire essentiel n’ayant ni précurseur ni produit de

dégradation. Il est mobilisable soit à partir du compartiment extracellulaire, soit à partir des
stocks internes comme le réticulum endoplasmique et l’espace intermembranaire du noyau.

Afin de répondre à la pluralité de fonctions cellulaires du calcium au sein d’une même cellule,
les canaux calciques présentent une variabilité moléculaire importante et permettent à la
cellule de mettre en place une large gamme de signalisations calciques différentes, d’une
élévation rapide, transitoire et localisée, à une augmentation persistante et généralisée. Le
répertoire en canaux calciques des cellules germinales en général, et du spermatozoïde en
particulier, est extrêmement étendu puisque nous retrouvons sur ces cellules des représentants
de toutes les familles de canaux calciques. (Figure 9)

Figure 9 : Représentation schématique de la distribution des canaux calciques dans le sperme de mammifères
(Darszon, Nishigaki et al. 2005).

14
 Introduction
Il a ainsi été décrit au niveau des spermatozoïdes :

Les canaux calciques dépendant du potentiel.

Ces canaux sont des protéines hétéro-oligomériques (Figure 10), situés sur la membrane
plasmique, qui s’ouvrent lorsque la cellule est soumise à une dépolarisation. Ces canaux sont
impliqués dans la réaction acrosomique et la mobilité spermatique. Il existe deux classes de
canaux calciques activés par le voltage. La classification de ces canaux a tout d’abord été
fondée sur des critères biophysiques (Tsien, Ellinor et al. 1991) puis sur des critères
pharmacologiques, avec la découverte de toxines spécifiques et enfin sur des critères
phylogéniques par la comparaison de leurs séquences génomiques.

Figure 10 : Représentation
schématique de la structure des
canaux calciques dépendants du
voltage. Les canaux calciques
dépendants du voltage sont
constitués d’une sous-unité
principale α1 qui constitue
notamment le pore du canal. Elle
comprend 4 domaines
membranaires (I-IV) qui
possèdent chacun 6 hélices
transmembranaires (S1-S6)
reliées par des boucles intra et
extracellulaires. Pour les canaux
HVA, la sous unité α1 est
associée à des protéines
auxiliaires : α2, δ, β et γ
(McCleskey 1994; Darszon,
Nishigaki et al. 2005).

Six canaux ont été clairement identifiés et regroupés en deux grandes familles (Nargeot and
Charnet 1994):

15
 Introduction
- La famille des canaux à haut seuil d’activation qui nécessitent de fortes
dépolarisations de la membrane (de -90 mV à 0 mV) pour s’activer. Ces canaux
appartiennent aux sous-familles Cav1.x et Cav2.x

- La famille des canaux à bas seuil d’activation qui nécessitent de faibles

dépolarisations de la membrane (de -90 à -50 mV) pour s’activer. Ils sont appelés
LVA (« Low Voltage-Activated »). Ces canaux correspondent aux canaux de type T
(« Transient ») ou Cav3.x. Ils sont caractérisés par un courant transitoire qui s’inactive
avec des constantes de temps de l’ordre de 10 à 50 ms.

Au niveau des spermatozoïdes, des membres de ces deux familles sont présents : Cav1.2,
Cav2.1, 2.2 et 2.3, Cav3.1, 3.2 et 3.3 (Florman, Corron et al. 1992; Aanesen, Fried et al. 1996;
Goodwin, Leeds et al. 1998; Perez-Reyes 1998; Westenbroek and Babcock 1999; Goodwin,
Karabinus et al. 2000; Wennemuth, Westenbroek et al. 2000; Park, Ahn et al. 2003; Trevino,
Felix et al. 2004; Escoffier, Boisseau et al. 2007). Ces canaux sont impliqués dans la
régulation de la réaction acrosomique (Florman and First 1988; Florman, Corron et al. 1992;
Florman 1994; Arnoult, Cardullo et al. 1996; Arnoult, Zeng et al. 1996; Lievano, Santi et al.
1996; Bai and Shi 2002; Escoffier, Boisseau et al. 2007).

Récemment, une nouvelle famille de ces canaux calciques, nommée CatSper, a été
découverte. Ce canal a été initialement trouvé par une recherche « in silico » basée sur des
homologies de séquences avec les canaux calciques dépendant du voltage (CCDV) (Quill,
Ren et al. 2001; Ren, Navarro et al. 2001). Cependant, contrairement aux CCDV, CatSper est
composé d’un seul domaine de 6 hélices transmembranaires (S1-S6), autrement dit, 4
molécules ou sous-unités de CatSper sont nécessaires pour former un canal calcique
fonctionnel, à l’image des canaux potassiques (Figure 11). Quatre gènes, situés sur des
chromosomes différents codent actuellement pour 4 isoformes de CatSper (CatSper1, 2, 3 et
4) (Ren, Navarro et al. 2001; Carlson, Westenbroek et al. 2003; Lobley, Pierron et al. 2003;
Carlson, Quill et al. 2005; Kirichok, Navarro et al. 2006). CatSper est associé à des protéines
auxiliaires : CatSper β (Liu, Xia et al. 2007) et CatSper γ (Wang, Liu et al. 2009). Mais
l’expression hétérologue des différentes isoformes de CatSper (séparément ou ensemble) n’a
pas permis de mettre en évidence la fonction canal de ces protéines. On suppose actuellement
que les canaux CatSper nécessitent d’autres sous-unités auxiliaires inconnues pour que la
fonction canal s’exprime.

16
 Introduction
Figure 11 : Représentation schématique du canal
CatSper. Le complexe CatSper est formé de
CatSper 1-4 et d'une sous-unité auxiliaires :
CatSper β. CatSper ß est constitué de 2 domaines
transmembranaires, séparés par une grande boucle
extracellulaire (~ 1000 acides aminés). Comme les
autres canaux calciques dépendant du voltage, les 4
isoformes de CatSper sont constituées de 6
domaines transmembranaires (S1-S6) reliés par des
boucles intra et extracellulaires. Le domaine
transmembranaire S4 constitue le senseur de
potentiel (sensor voltage domain). Les domaines

transmembranaires S5, S6 et les boucles S5, S6 transmembranaire constitue le pore du canal. La sélectivité du
canal pour le calcium est déterminée par une séquence consensus d’acides aminés négatifs ([T/S]x[D/E]xW)
située au niveau du pore du canal(Navarro, Kirichok et al. 2008)

Les quatre membres de la famille CatSper sont exprimés presque exclusivement dans le
testicule, et les spermatozoïdes de mammifère. Ces canaux sont localisés au niveau de la pièce
principale du spermatozoïde. Bien que leur mode d’activation reste inconnu, ces canaux
calciques sont impliqués dans l’hyperactivité du flagelle et la fertilité. L’invalidation d’un des
4 gènes de CatSper (CatSper 1, 2, 3 ou 4) chez la souris mâle induit une immobilité flagellaire
et une infertilité (Ren, Navarro et al. 2001; Avidan, Tamary et al. 2003; Carlson, Westenbroek
et al. 2003; Lobley, Pierron et al. 2003; Carlson, Quill et al. 2005; Qi, Moran et al. 2007;
Navarro, Kirichok et al. 2008; Carlson, Burnett et al. 2009)

Les canaux de type SOC « Store Operated Channels »

L’activation de ces canaux dépend du niveau de remplissage des stocks calciques internes,
d’où leur nom. Parmi les canaux SOC, la sous-famille de canaux, appelée TRPC (7 gènes),
semble majoritairement responsable de cette entrée de calcium (Figure 12). L’activation des
SOCs qui fait suite à la vidange des stocks est encore un mécanisme mal compris ainsi que
leur rôle dans la physiologie spermatique. Quatre modes d’activations des TRPC ont été
envisagés :

- un couplage conformationnel avec les canaux calciques des stocks intracellulaires

IP3R ou RyR (Berridge 1995; Kiselyov, Xu et al. 1998).

- un recrutement des canaux vers la membrane plasmique par exocytose (Yao, Ferrer-
Montiel et al. 1999).

17
 Introduction
- La vidange des stocks pourrait permettre le relâchement d’un facteur diffusant jusqu'à
la membrane plasmique (Randriamampita and Tsien 1993).

- Depuis les 3 dernières années, une nouvelle famille de protéine senseur de calcium a
été identifiée comme régulateur des TRPC : Les STIM (STromal Interaction
Molecule). Elles permettraient l’activation des TRPC par une interaction fonctionnelle
(Potier and Trebak 2008; Bojarski, Pomorski et al. 2009; Deng, Wang et al. 2009;
Potier, Gonzalez et al. 2009).

Ext Boucle du pore

Figure 12 : Organisation structurale d’un
monomère des TRPCs. Les TRPCs sont des
tétramères formé de 4 sous-unités identiques.
Chaque monomère comprend six domaines
transmembranaires et une partie Cter et Nter
Domaine
Cytoplasme TRP intracytoplasmiques. En Nter, il existe une
succession de 4 motifs de type ankyrin. La
Répétitions de région putative du pore se situe entre les
type ankyrine segments transmembranaires 5 et 6. La partie
Cter comprend une région très conservée
appelée « TRP box », une région d’interaction
entre l’IP3R et la CaM appelée domaine CIRB
N et un motif de type coil-coil (Felix 2005). La
C structure générale des TRPC est similaire à

celle des canaux CNG et des canaux calciques dépendants du voltage, sauf que le domaine S4 ne possède pas
de résidus positif, ce qui leur confère une insensibilité aux variations de voltage.(Darszon, Nishigaki et al. 2005)

Plusieurs membres des TRPC ont été décrits dans le spermatozoïde comme TRPC 1,
2, 3, 4 et 6 (O'Toole, Arnoult et al. 2000; Jungnickel, Marrero et al. 2001; Stamboulian,
Waard et al. 2002; Castellano, Trevino et al. 2003; Sutton, Jungnickel et al. 2004).
L’implication de TRPC2 dans la physiologie spermatique a été mise en évidence par
l’utilisation d’un anticorps spécifique dirigé contre TRPC2 qui permet l’inhibition des
courants calciques dépendant du TRPC2. L’inhibition de ces courants calciques bloque la
réaction acrosomique induite par ZP3 (Jungnickel, Marrero et al. 2001). Cependant, la souris
KO TRPC2 reste fertile (Leypold et al., 2002), suggérant que les autres TRPCs présents
pourraient se substituer à TRPC2.

18
 Introduction

Les récepteurs canaux.

Ces canaux, eux aussi localisés dans la membrane plasmique, s’ouvrent par la fixation d’une
molécule sur leur domaine extracellulaire. Le récepteur à l’acétylcholine qui appartient à cette
famille est lui aussi présent sur le spermatozoïde. Son rôle dans la physiologie spermatique
reste encore mal défini. Il pourrait cependant être impliqué dans le contrôle de la RA (Son and
Meizel, 2003).

Les canaux calciques du réticulum.

Ils permettent la vidange des stocks internes et sont de deux types : le récepteur à l’IP3 activé
par une augmentation de la concentration de l’IP3 (3 gènes) et le récepteur de la Ryanodine (3
gènes), activé par le calcium ou grâce à un couplage mécanique avec des canaux dépendant
du voltage de la membrane plasmique. Au niveau du spermatozoïde, on les retrouve
majoritairement au niveau de la membrane acrosomique (Walensky and Snyder 1995).

Le récepteur à l’inositol 1.4.5 triphosphate (IP3R) récepteur tétramérique est activé par la
liaison de l’inositol 1.4.5 triphosphate (IP 3 ). L’IP 3 est un messager secondaire, provenant de

la dégradation du phosphatidylinositol biphosphate (PIP 2 ) par la phospholipase C (PLC) en

réponse à la stimulation d’un récepteur couplé aux protéines G ou d’un récepteur aux
tyrosines kinases (Berridge, Lipp et al. 2000). En se liant au canal récepteur à l’IP 3 (IP 3 R),

l’IP 3 permet le relâchement de calcium contenu dans les stocks intracellulaires (figure 13).
Du point de vue de sa structure, il s’agit d’un tétramère (Jiang, Thrower et al. 2002). La
région du canal calcique possède des homologies avec le RyR et est localisée au niveau Cter
de la protéine. Le filtre de sélectivité est codé par une séquence précise en acides aminés
GVGD. La sélectivité au calcium est déterminée par un résidu Asp2550(Boehning, Joseph et
al. 2001). La protéine comprend six domaines transmembranaires et sa partie Cter se projette
dans le cytoplasme. Le site de liaison pour l’IP3 se situe au niveau Nter de la protéine. L’IP3R
est une très grosse protéine d’environ 1000 kDa.

19
 Introduction
Figure 13 : Représentation schématique d’un
monomère du récepteur à l’IP3. Le récepteur
l’IP3R est un tétramère formé de 4 sous-unités
identiques. Chaque sous-unité comprend six
domaines transmembranaires et une partie Cter
cytoplasmique. La sélectivité du canal pour le
calcium est déterminée par un résidu Asp2550
(Patterson, Boehning et al. 2004).

L’IP3R n’a pas qu’une fonction de canal calcique. En effet, de nombreuses protéines
interagissent directement avec l’IP3R qui est impliqué dans de nombreuses voies de
signalisations. La régulation de cette protéine est assez complexe. Plusieurs acteurs peuvent
réguler l’IP3R :
- Le calcium contrôle l’IP3R de façon biphasique. Le calcium à forte concentration
intracellulaire (100 nM) active l’IP3R et à faible concentration intracellulaire l’inhibe.
- La régulation de l’IP3R peut s’effectuer par le biais de phosphorylations. L’IP3R peut
être phosphorylé par plusieurs protéines kinases. La phosphorylation de l’IP3R modifie
les caractéristiques spatiotemporelles du relâchement de calcium (Ferris, Cameron et
al. 1991; Ferris, Huganir et al. 1991).
- L’ATP augmente l’influx de calcium via l’IP3R quand sa concentration est de 100 µM.
En revanche, lorsque sa concentration est élevée, l’ATP inhibe le relâchement de
calcium induit par l’IP3 (Ferris, Huganir et al. 1990).
- Régulation par des interactions protéine - protéines, plus de 25 protéines ont été
identifiées comme interagissant avec l’IP3R, comme l’ankrine, la calmoduline, la
myosine, la caspase 3, la calpain, le cytochrome C, TRPC, etc…

Walensky et Snyder en 1995 ont réalisé une étude de référence sur la présence du récepteur à
l’IP3 dans le spermatozoïde mature. Ils ont montré que le spermatozoïde était une cellule très
riche en IP3R, que l’IP3R se colocalisait essentiellement avec l’acrosome et que le signal
disparaissait lors de la réaction acrosomique (Walensky and Snyder 1995). D’autres études
ont par la suite démontré l’implication du récepteur à l’IP3 dans la mise en place de la
signalisation calcique qui induit la réaction acrosomique (Arnoult, Kazam et al. 1999).

Le Récepteur de la Ryanodine (RyR) forme une famille de récepteurs présentant de

fortes homologies avec le récepteur IP3. Comme pour le récepteur IP3, le récepteur ryanodine
est un tétramère formé de 4 sous-unités identiques de 560 kDa environ (Figure 14).
Initialement, ces récepteurs ont été mis en évidence au niveau du réticulum sarcoplasmique
20
 Introduction
des muscles squelettiques (RyR1) et cardiaques (RyR2). Depuis les récepteurs ryanodine ont
été identifiés dans beaucoup d’autres types cellulaires. Le RyR est présent dans les cellules
spermatogéniques. Des études de protection à la RNase, d’hybridation in situ (Giannini et al.,
1995) et d’immunocytochimie (Trevino et al., 1998) montrent que RyR1 et 3 sont présents
dans les tubules séminifères au niveau des régions enrichies en spermatocytes et spermatides.
RyR3 est le seul isoforme présent dans le spermatozoïde mature (Trevino, Santi et al. 1998).
Une étude récente (Chiarella et al., 2004) montre une expression différentielle de RyR1 au
cours de la spermatogénèse. Le RyR est fonctionnel dans les cellules spermatogéniques et la
mobilisation du calcium via le RyR participerait à la maturation de la lignée germinale.

Figure 14 : Représentation schématique

de la structure du récepteur à la
ryanodine. La protéine comprend six
domaines transmembranaires. Le
domaine C-terminal constitue le pore
ionique. Le domaine cytoplasmique N-
ter interagit avec le récepteur aux
dihydropyridines (DHP-sensible Ca2+
channels ou L-type calcium channel). Il
y a 3 sites de fixation du Ca2+ dans la
partie N-terminale, proche du canal.

Nous l’avons vu, le spermatozoïde est une cellule très complexe, hautement différencié. Il va
subir tout au long de son existence une série de modifications physiologiques, intracellulaires
ou membranaires qui lui permettront de féconder l’ovocyte. Ces changements
s’accompagnent de signaux et d’activation des voies de transduction intracellulaires. Ils sont
principalement composés de signaux ioniques et métaboliques. La première série de
modifications est la capacitation. La capacitation est une étape de maturation des
spermatozoïdes lors de leur ascension dans le tractus génital femelle. On appelle capacitation
l’ensemble des changements physiologiques qui rendent les spermatozoïdes capables de
féconder l’ovocyte.

21
 Introduction

Chapitre 2 : La capacitation, étape de maturation des spermatozoïdes

La capacitation est une étape de maturation des spermatozoïdes lors de leur ascension
dans le tractus génital femelle. On appelle capacitation l’ensemble des changements
physiologiques qui rendent les spermatozoïdes capables de féconder l’ovocyte. C’est un
phénomène réversible, les spermatozoïdes capacités peuvent être « décapacités » s’ils sont
incubés dans le plasma séminal (Vadnais, Kirkwood et al. 2005; Vadnais, Kirkwood et al.
2005). À l’heure actuelle, on ne connaît pas toutes les modifications moléculaires qui
accompagnent la capacitation, cependant on en connaît quatre principales :

- Modification de la composition lipidique de la membrane caractérisée notamment par

un efflux de cholestérol membranaire, induite par les protéines de l’albumine
présentes dans le tractus génital femelle (Martinez and Morros 1996; Nolan and
Hammerstedt 1997; Harrison and Gadella 2005; Visconti 2009) (Visconti, Galantino-
Homer et al. 1999).

- Modifications ioniques intracellulaires et membranaires : hyperpolarisation de la

membrane plasmique, augmentation de la concentration intracellulaire de calcium et
augmentation du pH interne (Arnoult, Kazam et al. 1999) (Zeng, Clark et al. 1995).

- Certaines protéines impliquées dans la fixation du spermatozoïde à la membrane

pellucide de l’œuf et dans l’exocytose de la vésicule acrosomiale vont être
phosphorylées au niveau de leurs résidus tyrosines (Jimenez, Gonzalez-Marquez et al.
2003) (Visconti, Bailey et al. 1995; Visconti, Moore et al. 1995; Salicioni, Platt et al.
2007).

- Hyperactivation flagellaire (Navarro, Kirichok et al. 2008).

22
 Introduction
I. Modification de la composition lipidique membranaire lors de la
capacitation
Lors de la capacitation, la membrane plasmique du spermatozoïde subit des modifications et
notamment des modifications lipidiques. Ces dernières correspondent à des changements dans
la distribution et la composition en lipides et phospholipides, ce qui conduit à une
augmentation de la fluidité membranaire et à des changements de l’architecture et de la
composition de la membrane (Baldi, Luconi et al. 2000; Gadella, Tsai et al. 2008).

1. La membrane plasmique du spermatozoïde avant capacitation

La composition lipidique des membranes des spermatozoïdes est inhabituelle par rapport à
celle des autres cellules somatiques de mammifères (Mack, Everingham et al. 1986; Alvarez
and Storey 1995; Martinez and Morros 1996) . En effet, ces membranes présentent :

- Un taux élevé de cholestérol (et de stérols-sulfates), distribué uniformément au niveau

des zones apicales et équatoriales de la membrane de la tête du spermatozoïde.

- Des glycérophospholipides essentiellement sous forme de phosphatidylcholine (PC) et

de phosphatidyléthanolamine (PE) mais aussi de plasmalogènes (choline et
éthanolamine) et des phosphatidylinositol (PI) à fort pouvoir antioxydant (figure 16)

- De la sphingomyéline (SM). La sphingomyéline est un sphingolipide constitué d’un

céramide substitué sur l’alcool primaire par un groupement phosphorylcholine (figure
x)

- Le rapport cholestérol/phospholipides (Chol/Pls) (indicateur de la fluidité

membranaire) est élevé de 0,21 à 1 selon les espèces.

- Des acides gras polyinsaturés tels que les acides arachidoniques, docosapentanoïque et
docosahexaénoïque fixés au niveau sn-2 des phospholipides (Ladha 1998).(figure 15)

- Des acides gras saturés tels que l’acide palmitique et l’acide stéarique fixés au niveau
sn-1 des PC et PE (Ladha 1998). (Tableau 1)

23
 Introduction

Figure 15 : Formules chimiques de quelques phospholipides communément observés et du cholestérol. La

nature du substituant (X) fixé sur l’acide phosphorique définit la nature du phosphoglycéride (Rejraji, Saez
et al. 2009).

Figure 16 : Formules chimiques de la phosphatidylcholine (PC), choline plasmalogène et de la sphingomyéline

(SM). Les plasmalogènes forment un groupe de phospholipides à résidu aldéhyde, contenant un AG estérifié
avec un glycérol et un ester insaturé à longue chaîne carbonée. Leur hydrolyse donne un aldéhyde gras et un AG.
La choline plasmalogène, la phosphatidylcholine et la sphingomyéline possèdent le même groupement polaire
phosphorylcholine (Rejraji, Saez et al. 2009).

24
 Introduction
Tableau 1: Noms et formules chimiques de quelques AG communément rencontrés dans les membranes
cellulaires (Murray, Mayes et al. 1999)

La quantité de lipides membranaires du spermatozoïde varie considérablement d’une espèce à

une autre. Les PE et les PC sont les phospholipides majoritaires de la membrane des
spermatozoïdes, quelques soient l’espèce animale ou l’état de maturité du spermatozoïde. En
guise d’exemple, PE et PC représentent à elles seules 70 à 80 % des phospholipides de la
membrane plasmique du spermatozoïde de bélier (Parks and Hammerstedt 1985; Parks, Arion
et al. 1987). La PS et le PI représentent respectivement 4 et 3 % des phospholipides totaux des
spermatozoïdes (Parks and Hammerstedt 1985). La SM représente en moyenne 15 % des
lipides totaux des spermatozoïdes. Les stérols (cholestérol) sont des éléments essentiels des
membranes cellulaires, ils représentent le deuxième constituant lipidique majeur des
membranes spermatiques après les phospholipides. Il y a 26 fois plus de cholestérol présent
dans les membranes spermatiques que dans les membranes des cellules somatiques(Mack,
Everingham et al. 1986).
La présence, d’une part, d’un taux élevé de cholestérol et de glycérophospholipides
contribuant à former des régions membranaires non diffusibles (Martinez and Morros 1996)
et, d’autre part, de la sphingomyéline interagissant avec le cholestérol (Schroeder, Jefferson et
al. 1991), conduit à rigidifier et à stabiliser la membrane. La fluidité membranaire
(notamment la mobilité des phospholipides dans la bicouche) est limitée tout comme la
perméabilité membranaire aux ions ou encore l’insertion de protéines (Schroeder, Jefferson et
al. 1991; Martinez and Morros 1996).
La diffusion limitée des phospholipides induit une asymétrie de la membrane : les
aminophospholipides (phosphatidylsérine (PS) et phosphatidyléthanolamine (PE)) sont de

25
 Introduction
façon prépondérante dans le feuillet interne (cytosolique) de la bicouche lipidique alors que
les phospholipides neutres (phosphatidylcholine (PC) et sphingomyéline) sont davantage
présents dans le feuillet externe (Flesch, Brouwers et al. 2001; Flesch, Wijnand et al. 2001;
Gadella, Tsai et al. 2008). Une large proportion de lipides peut cependant diffuser
latéralement dans la membrane (Gadella, Tsai et al. 2008).
Il existe également dans la membrane des spermatozoïdes des régions ou des microdomaines
particuliers, appelés « lipids rafts », riches notamment en sphingolipides, en phospholipides à
longues chaînes saturées et en cholestérol (Simons and Vaz 2004), mais aussi en protéines
spécifiques (cavéoline-1 par exemple) (Simons and Toomre 2000) (Figure 17).

Figure 17: Membrane plasmique des spermatozoïdes immatures. Modifié d’après (Vadnais, Galantino-Homer et al.
2007)

2. Le bicarbonate induit des modifications lipidiques de la membrane

Le bicarbonate est un ion ubiquitaire considéré comme un agent essentiel de la capacitation.

Les spermatozoïdes sont stockés au niveau de l'épididyme où le niveau de bicarbonate est
maintenu à une concentration assez faible (3-4 mM). Lorsqu’il arrive au niveau du tractus
génital femelle où le niveau de bicarbonate est plus élevé (>20 mM), ils subissent un afflux de
bicarbonate effectué par les échangeurs Cl-/HCO3- et les échangeurs Na+/HCO3- qui induit la
capacitation (Wang, Zhou et al. 2003).
L’élévation de bicarbonate constitue une des étapes essentielles dans l’initiation de la
capacitation. Elle induit un changement de la structure de la membrane lipidique des
spermatozoïdes par l'activation de la voie de signalisation AMPc/Protéine Kinase A (PKA).

L’AMPc est produite à partir d'ATP par une enzyme : l’Adénylate-Cyclase (sAC ou SACY).
L’adénylate cyclase du spermatozoïde est différente des autres adénylate-cyclases des cellules
somatiques : sa forme soluble la rend unique en son genre et des quantités élevées d’ARNm
codant pour cette enzyme s’accumulent dans les spermatides ronds de rat (Sinclair, Wang et

26
 Introduction
al. 2000). Ces caractéristiques sont différentes de celles des enzymes de la superfamille des
adénylate cyclases transmembranaires qui interagissent avec les protéines G. Elle est
insensible aux protéines G, à la toxine cholérique et aux GTP non hydrolysables (activateurs
des protéines G) (Hess, Jones et al. 2005; Visconti 2009). L’activité de cette adénylate
cyclase, qu’elle soit utilisée sous sa forme purifiée à partir de testicules, ou recombinante, ou
exprimée dans une lignée cellulaire, est stimulée par l’ajout de bicarbonate (sous forme de
NaHCO3 ouKHCO3) et de calcium (Litvin, Kamenetsky et al. 2003), et ceci, de façon
indépendante des modifications du pH intracellulaire (Chen, Cann et al. 2000). Cette
activation est aussi observée avec les ions bisulfites (Na2SO3 ou NaHSO3) dont la structure est
proche de celle des bicarbonates, mais pas avec les ions chlorures, sulfates ou phosphates.
L'AMPc produite à partir d'ATP par sAC est capable d'activer des protéines telles que la
protéine kinase A. La protéine kinase A activée va phosphoryler différentes protéines
transmembranaires et intracellulaires, dont les protéines scramblases (Darszon, Acevedo et
al. 2006; Vadnais, Galantino-Homer et al. 2007). La phosphorylation des protéines
« Scramblase » par la PKA va induire l’externalisation des phosphatidyléthanolamines et
phosphatidylsérines du feuillet interne vers le feuillet externe de la bicouche lipidique.

3. Les lipoprotéines présents au niveau du tractus génital femelle induisent un

efflux de cholestérol

L’efflux de cholestérol constitue une autre étape essentielle dans l’initiation de la capacitation.
Les lipoprotéines présentes dans les liquides folliculaires ou de l’oviducte (notamment
humains et bovins), plus spécifiquement les HDL (high density lipoproteines) vont capturer le
cholestérol des membranes plasmiques des spermatozoïdes (Visconti, Ning et al. 1999).
L’efflux de cholestérol est aussi induit par des protéines liant les lipides comme les protéines
de type « bovine séminal plasma » (BSP) présentes en quantité abondante dans le plasma
séminal bovin et humain (Aanesen, Fried et al. 1996; Moreau, Frank et al. 1999; Manjunath
and Therien 2002). Des études réalisées chez les bovins, montrent que les protéines BSP
pourraient être associées à des HDL du liquide folliculaire et donc avoir un effet synergique
dans la capacitation (Therien, Bousquet et al. 2001). L’activation d’un transporteur de stérol,
ressemblant au scavenger receptor de type 1, SRB-1 (Flesch, Brouwers et al. 2001) et
l’activation d’une sphingomyélinase seraient également impliquées dans cet efflux de
cholestérol (van Gestel, Brewis et al. 2005) .

27
 Introduction
L’efflux de cholestérol induit une augmentation de la fluidité membranaire (Vadnais,
Galantino-Homer et al. 2007) et permet la diffusion latérale du cholestérol restant (Travis and
Kopf 2002). Ce dernier se retrouve concentré uniquement dans la zone apicale ou partie
antérieure de la tête du spermatozoïde lors de la capacitation (Flesch, Brouwers et al. 2001).
C’est également dans cette zone que l’on observe une perte de l’asymétrie des phospholipides
due à leur réorganisation (Flesch, Brouwers et al. 2001).
À l’heure actuelle, il est difficile de savoir si la réorganisation des phospholipides est due à la
perte du cholestérol ou si la perte de cholestérol est due à la réorganisation des phospholipides
induite par l’augmentation de bicarbonate. En effet, différentes études montrent que la perte
du cholestérol provoque une interaction entre les cavéolines-1 et les protéines de translocation
de phospholipides appelées scramblases, ce qui conduit à leur activation et au passage des
phospholipides d’un feuillet à un autre (« flip-flop » ou scramble) (Flesch, Brouwers et al.
2001; Travis and Kopf 2002). D’autres études montrent que le bicarbonate présent à forte
concentration dans un milieu capacitant induit une translocation de phosphatidylcholine et de
sphingolipides du feuillet externe au feuillet interne via l’activation des scramblases (Flesch,
Brouwers et al. 2001; de Vries, Wiedmer et al. 2003; Gadella, Tsai et al. 2008). Et que le
réarrangement de la bicouche lipidique par les scramblases, permet une relocalisation du
cholestérol au niveau de la partie apicale de la tête du spermatozoïde. La relocalisation du
cholestérol semble nécessaire à son élimination par les accepteurs de cholestérol tels que
l’albumine, l’héparine ou le glycoaminoglycane (GAG) (figure 18).
La capacitation est également associée à l’augmentation de la méthylation des phospholipides
et à l’origine d’une synthèse accrue de phosphatidylcholine à partir de phosphatidyl
éthanolamine (Stojanoff, Bourne et al. 1988).

Les changements de propriétés de la membrane plasmique dans la zone antérieure de la tête

du spermatozoïde vont ainsi affecter directement la redistribution de protéines notamment de
la cavéoline-1 (Flesch, Brouwers et al. 2001) et de la flotilline- 1 (van Gestel, Brewis et al.
2005) suite à la modification de structure des « lipids rafts », ce qui favoriserait alors
l’interaction de molécules de signalisation. Ils font aussi apparaître des zones membranaires
fusiogènes et permettent l’externalisation de récepteurs spermatiques susceptibles d’intervenir
dans la liaison primaire avec la zone pellucide de l’ovocyte. Ils sont aussi responsables de
modifications de l’activité des canaux ioniques ou d’échangeurs d’ions augmentant ainsi la
perméabilité de la membrane aux ions dont les ions bicarbonates et calciques. Toutes ces
étapes sont indispensables à l’hyperactivation transitoire du spermatozoïde et à la réalisation
de la réaction acrosomique.
28
 Introduction

Figure 18 : Modèle des voies signalisations de la modification de la composition lipidique membranaire lors de la
capacitation des spermatozoïdes de mammifère (Flesch, Brouwers et al. 2001). En absence de niveaux élevés de bicarbonate
(c'est-à-dire dans l'épididyme ou le fluide séminal) et de lipoprotéines la réorganisation des phospholipides « scrambling »
est bloquée. Le cholestérol est localisé au niveau apical et équatorial de la membrane plasmique de la tête des
spermatozoïdes et les cavéolines-1 sont à l’extérieur des « lipids rafts ». En présence de niveaux élevés de bicarbonate
soluble et de lipoprotéines, l’échangeur Cl-/ HCO3- va s’activer et induire une augmentation intracellulaire de bicarbonate.
Le bicarbonate va activer l’adénylate cyclase. L’activation de l’adénylate cyclase par le bicarbonate initie la voie
AMPc/PKA aboutissant à la phosphorylation des protéines membranaire (Cheng et al., 2000). Cette voie conduit à
l'activation des scramblases, localisées au niveau apical de la membrane plasmique de la tête des spermatozoïdes (Gadella
and Harrison 2000) par l'intermédiaire d'une voie encore peu claire. L’activation de la scramblase va induire
l’externalisation des phosphatidyléthanolamines et phosphatidylsérines du feuillet interne vers le feuillet externe de la
bicouche lipidique. Ce réarrangement des phospholipides coïncide avec la relocalisation du cholestérol par les SRB-1
(Scavenger Receptor de type 1) au niveau de la partie apicale de la tête du spermatozoïde (Fielding and Fielding 2000), son
efflux par les lipoprotéines et la redistribution de protéines des « lipids rafts » notamment de la cavéoline-1.

II. Modifications ioniques lors de la capacitation

Les spermatozoïdes non-capacités présentent un pH interne (pHi) d’environ 6.6 et un

potentiel de membrane de - 35 à - 45 mV(Arnoult, Kazam et al. 1999). Durant la capacitation
des modifications des concentrations intracellulaires des ions K+, HCO3-, Na+ et Cl-, vont
induire l’hyperpolarisation de la membrane plasmique, une augmentation de la concentration
intracellulaire de calcium et une augmentation du pH interne (Figure19).
29
 Introduction

Les modifications ioniques :

- L’entrée de bicarbonate par des échangeurs Cl-/HCO3- et Na+/HCO3- va entrainer une

augmentation du pHi de 0.4 unité environ (Zeng, Oberdorf et al. 1996).
- L’hyperpolarisation de la membrane passant de -35/45 mV à -80 mV (Arnoult, Kazam
et al. 1999) est en partie due à un efflux de potassium K+ par les canaux potassiques de
type Kir qui s’activent par une élévation du pHi (Darszon, Acevedo et al. 2006).
L’hyperpolarisation de la membrane est aussi due à l’augmentation intracellulaire de
HCO3- par l’échangeur Na+/HCO3- et l’inactivation du canal sodique épithélial ENaC.
L’hyperpolarisation de la membrane et l’augmentation du pHi permettent aux canaux
calciques dépendants du voltage présents sur la membrane plasmique de passer d’un
état inactivé à un état activable (Arnoult, Kazam et al. 1999).
- Augmentation de la concentration calcique intracellulaire de 70 nM à 250 nM (Fraser
1987; Baldi, Casano et al. 1991; Marin-Briggiler, Gonzalez-Echeverria et al. 2003) :
L’élévation de Ca2+ cytoplasmique est produite par l’activation des canaux CNG par
l’AMPc (produit par l’activation de l’adénylate cyclase activée par le bicarbonate), par
des pompes calcium ATPasiques et des échangeurs Na+/Ca2+ (DasGupta, Mills et al.
1993; Yanagimachi 1994; Visconti, Bailey et al. 1995; Jagannathan, Publicover et al.
2002; Visconti, Westbrook et al. 2002).

Figure 19 : Modifications
ioniques lors de la capacitation
des spermatozoïdes de
mammifères. (schéma modifié
de (Darszon, Beltran et al.
2001)

30
 Introduction
III. L’hyperactivation flagellaire.

Les spermatozoïdes de mammifères présentent deux niveaux physiologiques de mobilité : une

mobilité dite « symétrique » qui est intrinsèque et une dite « asymétrique » qui est acquise lors
de la maturation des spermatozoïdes.

Lors de l’éjaculat, les spermatozoïdes présentent une mobilité symétrique. Cette

mobilité est caractérisée par une faible amplitude de mouvement et une trajectoire rectiligne.
(Turner 2003; Turner 2006)

La capacitation va permettre aux spermatozoïdes d’acquérir la mobilité asymétrique

appelée aussi hypéractivation flagellaire (Ho and Suarez 2001). Cette hypéractivation va
permettre aux spermatozoïdes de traverser le cumulus oophorus, la zone pellucide (membrane
de glycoprotéines qui entoure l’ovocyte), et ainsi féconder l’ovocyte. Cette mobilité est
caractérisée par une augmentation du battement flagellaire, une augmentation de l’amplitude
du mouvement et une trajectoire dite curvilinéaire (Figure 20).

Figure 20 : Photo des trajectoires des têtes de

spermatozoïdes de souris établis par un appareil de
mesure de la mobilité spermatique (CASA). A)
Spermatozoïdes immatures présentant une mobilité
symétrique caractérisée par une trajectoire
rectilinéaire. B) Spermatozoïdes matures présentant
une mobilité asymétrique caractérisée par une
trajectoire curvilinéaire.

1. Mécanisme moléculaire de la mobilité spermatique symétrique

Le mouvement flagellaire est créé par l’interaction cyclique des bras de dynéines
ATPasiques avec les microtubules β. Cette interaction génère un phénomène de
« glissement » des microtubules entre eux. La génération de ce glissement microtubulaire
nécessite la phosphorylation et la déphosphorylation des bras de dynéines ATPasique (Inaba
2003; Turner 2006). Après phosphorylation par la protéine kinase PKA, la dynéine
ATPasique est activée. Elle va alors pouvoir hydrolyser l’ATP, l’énergie qui en résulte va
permettre le glissement des bras de dynéine d’un microtubule à l’autre. La dynéine sera par la
suite inactivée par déphosphorylation par l’action du complexe calmoduline-calcineurine
phosphatase ou des sérines/thréonine phosphatases. Comme les bras de dynéines interagissent

31
 Introduction
toujours avec les mêmes microtubules adjacents, une activation et une inactivation
asynchrone des bras de dynéines le long de l’axonème sont nécessaires pour générer le
mouvement flagellaire symétrique (Figure 21).

Figure 21 : Représentation schématique simplifiée du mécanisme moléculaire de la mobilité spermatique

générée par le glissement des microtubules entre eux. Pour simplifier la figure, seulement 2 des 9 doublets de
microtubules externes (OMDA) sont représentés. La paire centrale de microtubules n'est pas montrée. Chaque
symbole représente les bras de dynéine ATPasique. (A) Aucun bras de dynéine ATPasique n’est activé, les
doublets de microtubules restent droits, il n’y a pas de mouvement flagellaire. (B) Le premier bras de dynéine
ATPasique (1) a interagi avec son doublet de microtubules adjacents. (C) Le premier bras de dynéine
ATPasique a hydrolysé de l’ATP et généré une force de glissement des microtubules adjacents (grandes
flèches), qui se traduit par une flexion de la tête du spermatozoïde. Le deuxième bras de dynéine ATPasique a
interagi avec son doublet de microtubules adjacents. (D) Le premier bras de dynéine ATPasique a relâché son
doublet de microtubules adjacents et revient à sa position initiale, tandis que le second bras de dynéine
ATPasique hydrolyse de l’ATP et génère une force de glissement des microtubules adjacents. Il en résulte la
propagation de la flexion du flagelle. (E) La flexion du flagelle se propage le long de l’axonème de la tête du
spermatozoïde vers la partie terminale du flagelle. Cette coordination des bras de dynéine aboutit a un battement
flagellaire symétrique. (Turner 2003; Turner 2006)

2. Voies de signalisation de régulation de la mobilité spermatique symétrique

À l’heure actuelle deux voies principales de signalisation de régulation de la mobilité

spermatique symétrique ont été décrites : une voie contrôlée par la cascade de signalisation
AMPc/PKA et une voie contrôlée par la cascade de signalisation CamK/Calcineurine (Suarez
1987; Suarez and Osman 1987; Suarez, Vincenti et al. 1987; Lindemann and Kanous 1989;
Brokaw 1991; Visconti, Johnson et al. 1997; Ho, Granish et al. 2002). D'autres cascades de
signalisation sont également susceptibles de jouer des rôles. Une cascade de signalisation
32
 Introduction
médiée par les protéines G a été récemment décrite (Hinsch, Habermann et al. 1993;
Nakamura, Fujita et al. 1999; Fujita, Nakamura et al. 2000; Carr, Fujita et al. 2001) ainsi
qu’une voie de régulation de la mobilité du à la modification du pH (Yanagimachi 1994).
Toutefois, il y a eu relativement peu d'études sur ces dernières voies de signalisation.

3. Voie de signalisation AMPc/PKA

La mobilité des spermatozoïdes est, au moins en partie, initiée et maintenue par la
phosphorylation et la déphosphorylation des bras de dynéines via l’activité de la PKA, elle-
même régulée par la concentration d’AMPc (Visconti, Johnson et al. 1997). L’AMPc est
produit à partir d'ATP par l’adénylate cyclase (sAC ou SACY). L’activation de l’adénylate
cyclase par le bicarbonate initie la voie AMPc/PKA aboutissant à la phosphorylation des bras
de dynéines ATPasique (Visconti, Johnson et al. 1997). La balance entre la phosphorylation et
la déphosphorylation des bras de dynéines ATPasique est régulée par des sérines/thréonine
phosphatase (Figure 22). Une autre famille de protéines kinases est importante dans cette
cascade de phosphorylation : les protéines kinase d’ancrage AKAP. AKAP est une famille de
protéines kinase qui est ancrée dans la gaine fibreuse (FS) du flagelle. Trois protéines
d’ancrage sont majoritairement présentes au niveau de la gaine fibreuse AKAP 4, AKAP 3 et
TAKAP-80. Les AKAP vont recruter les PKA qui ont été activées par l’AMPc, au niveau des
bras de dynéines ATPasiques. (Miki, Willis et al. 2002; Turner 2006). Les protéines AKAP
vont permettre une régulation géospatiale de la cascade de phosphorylation PKA/tyrosine
kinase au niveau du flagelle. Il en résulte une activation géospatiale des dynéines ATPasiques
qui permet le glissement des microtubules.

Figure 22 : Représentation schématique de la

voie de signalisation AMPc/PKA qui régule la
mobilité spermatique des mammifères (Turner
2006)

33
 Introduction
4. Voie de signalisation Calmoduline/CamK/Calcineurine dépendante du calcium

La mobilité des spermatozoïdes est, aussi régulée par la phosphorylation et la

déphosphorylation des bras de dynéines induite par la voie de signalisation
Calmoduline/CamK/Calcineurine.
La calmoduline est une protéine monomérique de 148 acides aminés, ubiquitaire, capable
d’interagir avec les ions Ca2+ présents dans le milieu cellulaire. Cette liaison induit un
changement conformationnel de la protéine, permettant ainsi la formation d’un complexe
calmoduline/calcium. Ce complexe permet l'activation par changement de conformation de
nombreuses protéines.
En présence de calcium, la calmoduline située au niveau de l’axonème va former un complexe
calmoduline/calcium/bras externes de dynéines au niveau du domaine LC8 de la dynéine. Le
complexe va alors activer la cascade de phosphorylation de la calmoduline kinase CamK, qui
à son tour va phosphoryler les bras de dynéines ATPasique situés dans son environnement
immédiat (Visconti, Johnson et al. 1997). La balance entre la phosphorylation et la
déphosphorylation des bras de dynéines ATPasiques est régulée par des phosphatases
particulières : les calcineurines. Cette cascade de signalisation CamK/Calcineurine va
permettre de contrôler la mobilité spermatique (Figure 23).

Figure 23 : Représentation schématique de la voie de

signalisation Calmoduline/CamK/Calcineurine qui
régule la mobilité spermatique des mammifères
(Turner 2006)

34
 Introduction
C’est la synergie entre les deux voies de signalisation AMPc/PKA et CamK/Calcineurine qui
va permettre la mise en place de la mobilité spermatique. L’absence de la cascade de
signalisation induite par la calmoduline peut être compensée par la voie de signalisation
AMPc/PKA. Par contre, la cascade de signalisation induite par la calmoduline ne suffit pas à
la mise en place de la mobilité spermatique. En effet, les spermatozoïdes de souris présentant
l’invalidation du gène de l’adénylate cyclase soluble, premier effecteur de la voie AMPc/PKA
sont immobiles (Wu, Ribar et al. 2000; Ignotz and Suarez 2005; Marin-Briggiler, Jha et al.
2005).

5. Mécanisme moléculaire de l’hyperactivité flagellaire

La capacitation va permettre aux spermatozoïdes d’acquérir la mobilité asymétrique

appelée aussi hyperactivation flagellaire. Cette mobilité est caractérisée par une augmentation
du battement flagellaire, une augmentation de l’amplitude du mouvement et une trajectoire
curvilinéaire. Le mécanisme d’activation de l’hyperactivité flagellaire n’est pas complètement
connu. On sait seulement que l’augmentation intracellulaire de HCO3-, Ca2+, d’AMPc lors de
la capacitation est indispensable à l’hyperactivité flagellaire.

Figure 24 : Représentation hypothétique du mécanisme de régulation de l’hyperactivité flagellaire induite lors

de la capacitation (Navarro, Kirichok et al. 2008).

35
 Introduction
L’augmentation intracellulaire de bicarbonate lors de la capacitation va activer l’adénylate
cyclase permettant ainsi la production d’AMPc. L’AMPc de manière directe ou indirecte va
activer un échangeur Na+/H+(NHX), ce qui permet alors une augmentation du pH interne.
L’augmentation du pH interne va activer les canaux potassiques appelés KSper (ou Slo3).
L’activation de KSper va permettre l’hyperpolarisation de la membrane plasmique du
spermatozoïde. L’augmentation du pH interne et l’hyperpolarisation de la membrane induite
par KSper vont permettre l’activation d’une famille de canaux dépendants du voltage :
CatSper, situés au niveau de la pièce principale du spermatozoïde. L’activation des canaux
CatSper va induire une forte augmentation intracellulaire de calcium (Figure 24). La
modification de la balance de calcium intracellulaire par les canaux CatSper va permettre aux
spermatozoïdes d’acquérir la mobilité asymétrique c'est-à-dire l’hyperactivation flagellaire.

L’invalidation d’un des 4 gènes de CatSper (CatSper 1, 2, 3 ou 4) chez la souris mâle induit
une immobilité flagellaire et une infertilité (Ren, Navarro et al. 2001; Avidan, Tamary et al.
2003; Carlson, Westenbroek et al. 2003; Lobley, Pierron et al. 2003; Carlson, Quill et al.
2005; Qi, Moran et al. 2007; Navarro, Kirichok et al. 2008; Carlson, Burnett et al. 2009).

À l’heure actuelle, on connait seulement deux voies de signalisation qui pourraient être
régulées par la modification de la balance de calcium : la voie de phosphorylation par les
Camk et la voie de la glycolyse.

- L’implication de la voie de phosphorylation par les Camk a tout d’abord été montrée
par l’étude de Brokaw and Nagayama 1985. Cette étude montre que l’addition de
calmoduline sur des spermatozoïdes sans membrane plasmique induit
l’hypéractivation flagellaire. De plus, l’exposition d’inhibiteur des Calmodulines tel
que le W7 et calmidazolium (CZ) sur de spermatozoïdes hyperactifs change la
caractéristique de leur mobilité. Ils réacquièrent une mobilité symétrique. Cette perte
de mobilité asymétrique est corrélée avec une diminution de phosphorylation des
protéines spermatiques (Tash and Means 1987; Si and Olds-Clarke 2000); Tash,
Krinks et al. 1988).
- La régulation de la voie glycolyse par la modification de la balance de calcium a été
mise en évidence tout d’abord par le fait intéressant que les spermatozoïdes CatSper1
-/-
montraient un taux faible d'ATP par rapport aux spermatozoïdes Wt et ensuite par le
-/-
fait que spermatozoïdes CatSper1 ne montraient aucune production de NADH,

36
 Introduction
produit intermédiaire de la voie de la glycolyse (Xia, Reigada et al. 2007; Navarro,
Kirichok et al. 2008).

Nous l’avons vu, la capacitation est une étape de maturation des spermatozoïdes lors
de leur ascension dans le tractus génital femelle. C’est une série de modifications
physiologiques, intracellulaires ou membranaires qui lui permettront de féconder l’ovocyte.
Ces changements s’accompagnent de signaux et d’activation des voies de transduction
intracellulaires. Cette étape lui permet de se trouver dans un état compatible, afin de pouvoir
traverser l’oviducte et d’être capable d’interagir avec la zone pellucide. Lorsqu’ils rentrent en
contact avec la zone pellucide, les spermatozoïdes subissent une modification physiologique
ultime la Réaction Acrosomique (RA). La RA correspond à l’exocytose de la vésicule de
sécrétion (l’acrosome) située au niveau de la tête du spermatozoïde. Les gamètes males ne
seront ensuite plus la cible de modifications, mais participeront à la transformation profonde
de l’ovocyte et à la création d’un nouvel individu.

37
 Introduction

Chapitre 3: La réaction acrosomique

Les spermatozoïdes de mammifères contiennent une seule vésicule de sécrétion, ou acrosome,

située sur la partie antérieure de la tête. Le contenu de cette vésicule de sécrétion est libéré
lors du contact du spermatozoïde avec la zone pellucide qui entoure l’ovocyte (Figure 25).
Cette exocytose de la vésicule de sécrétion est connue sous le nom de réaction acrosomique.
Les spermatozoïdes doivent effectuer la réaction acrosomique pour pouvoir en premier lieu se
lier à la zone pellucide (externalisation de protéines nécessaires à la liaison du
spermatozoïde), puis traverser la zone pellucide et enfin fusionner avec la membrane
plasmique de l’ovocyte. Si l'exocytose est effectué prématurément, les spermatozoïdes ne
peuvent plus se lier à la zone pellucide, traverser la zone pellucide et donc féconder l’ovocyte.
La réaction acrosomique, première étape de la fécondation, est irréversible et indispensable
(Cummins, Fleming et al. 1986).

Figure 25 : La réaction acrosomique. La vésicule de sécrétion située au niveau de la tête du spermatozoïde va

se désagréger et permettre le relâchement des enzymes responsables de la digestion localisée de la zone
pellucide de l’ovocyte. Cette réaction nécessite du calcium provenant de l’extérieur de la cellule et des stocks
calciques internes. La photo montre, en Microscopie électronique, la désagrégation de la membrane
acrosomiale (D’après Biologie du Développement (Gilbert) ed De Boeck Université).

I. Liaison des spermatozoïdes à la zone pellucide

La structure de la ZP a été étudiée surtout chez la souris et le porc, des espèces qui permettent
la récupération de beaucoup de matériel à faible coût. Malheureusement chez l’Homme son
étude est rendue très difficile par le peu de matériel disponible qui ne peut être que de la ZP
provenant d’ovocytes récupérés après un échec de fécondation in vitro, avec le consentement

38
 Introduction
des patients. La souris a donc été le modèle privilégié depuis le début des années 80. La zone
pellucide constitue une matrice extracellulaire de l’ovocyte. Il s’agit d’une structure épaisse et
complexe entourant l’ovocyte. Elle intervient lors de l’interaction gamétique en établissant
une barrière d’espèce, évitant ainsi des fécondations hétérospécifiques. Son maillage (Figure
26) est composé de 3 glycoprotéines ZP1, ZP2 et ZP3. ZP2 et ZP3 s’associent pour former
des filaments réunis par des ponts de ZP1 (Greve and Wassarman 1985; Wassarman and
Mortillo 1991). L’épaisseur de la zone pellucide est normalement de 12 µm. ZP1, ZP2 et ZP3
sont des glycoprotéines qui sont constituées d’une charpente polypeptidique et glycosylées de
façon hétérogène par des oligosaccharides de type asparagine (N) et sérine-thréonine (O). La
zone pellucide joue trois rôles principaux pendant la fécondation : elle empêche le brassage
inter-espèce, elle lie le spermatozoïde et déclenche la réaction acrosomique.

On connaît depuis les années 80 le rôle de ZP3 chez la souris. Cette protéine intervient dans la
fixation primaire du spermatozoïde à la zone pellucide (Bleil and Wassarman 1980). Des trois
glycoprotéines constituant la ZP, seule ZP3, purifiée à partir d’ovocytes de souris non
fécondés, est capable de lier les spermatozoïdes présentant leur acrosome intact (Bleil and
Wassarman 1980; Wassarman 1990). Cette capacité de liaison est modifiée après la
fécondation, car les ZP3 isolées à partir des zones pellucides d’œufs fécondés perdent cette
propriété (Bleil and Wassarman 1980; Wassarman 1990).

Figure 26 : La zone pellucide de l’œuf. Image de

microscopie élétronique montrant l’accrochage d’un
spermatozoïde au niveau de l’enchevêtrement
glycoprotéique qui constitue la zone pellucide.

Plusieurs observations indiquent que la charpente polypeptidique ne joue qu’un rôle mineur
comme ligand du spermatozoïde. En effet, chez la souris, l’aptitude de ZP3 à agir in vitro
comme récepteur spermatique n’est pas altérée par des températures élevées, des détergents,
des agents dénaturants ou par protéolyse partielle (Florman and Wassarman 1985). Les
récepteurs spermatiques de la zone pellucide sont spécifiques d’une espèce à l’autre, en effet
les préparations de ZP solubilisée d’un ovocyte de souris inhibent partiellement la fécondation

39
 Introduction
in vitro des œufs de hamster (Gwatkin and Williams 1977). L’interaction spécifique d’espèce
entre la ZP et son récepteur spermatique est un évènement plutôt médié par des sucres et
dépend de la nature des oligosaccharides de la ZP. Une inactivation chimique ou enzymatique
des oligosaccharides des ZP (Litscher, Juntunen et al. 1995) inhibe la liaison des
spermatozoïdes à la ZP chez la souris. Des oligosaccharides O-liée, isolés de ZP3 par
hydrolyse alcaline douce ou en conditions réductrices, inhibent également in vitro la liaison
des spermatozoïdes à la ZP (Florman and Wassarman 1985). Des expériences de type
protéolyse partielle (Litscher and Wassarman 1996) ou de mutagenèse dirigée (Kinloch, Sakai
et al. 1995) indiquent que les oligosaccharides, essentiels à la liaison avec le récepteur
spermatique, sont localisés chez la souris sur deux des cinq résidus sérine Ser-332 et -334,
dans une région polypeptidique proche de l’extrémité C terminale. La liaison entre ZP3 et son
récepteur spermatique est un événement complexe mettant en jeu des récepteurs spermatiques
à fortes et basses affinités (Thaler and Cardullo 1996). Il existerait au moins 30 000 sites de
liaison à ZP3 par le spermatozoïde de souris (Thaler and Cardullo 1996). Deux douzaines de
protéines différentes ont été identifiées, mais aucune n’a été formellement reconnue comme
étant « Le » récepteur à ZP3 (Wassarman 1999). Pourquoi un tel nombre et une telle
variété (Wassarman 1999) ? Plusieurs hypothèses ont été avancées :

- l’implication de différents types protéiques en fonction des espèces.

- La participation pour une espèce donnée de plusieurs types protéiques à la liaison de
ZP3, agissant de façon individuelle ou sous forme de complexe multiprotéique.
- L’existence de nombreuses protéines, ayant chacune une affinité différente pour ZP3,
et agissant de façon séquentielle.

Parmi les nombreux récepteurs spermatiques identifiés pouvant jouer un rôle dans la liaison
avec ZP3, seule une minorité semble impliquée dans la réaction acrosomique (Wassarman
1999)(Figure 27) :

- La β−galactosyltranferase
β− (GalTase) est une protéine testiculaire insérée dans la
membrane plasmique recouvrant l’acrosome. Elle est capable de se lier aux résidus N-
acetylglucosamine de ZP3 chez la souris (Shur 1991). L’interaction entre la
β−galactosyltranferase et la ZP3 induit la réaction acrosomique chez la souris (Gong,
Dubois et al. 1995). Les spermatozoïdes knock-out pour une isoforme de GalTase
présentent une diminution notable de la capacité à réaliser la réaction acrosomique en
présence de ZP3, de la capacité de pénétrer la zone pellucide et une diminution notable
40
 Introduction
du taux de fécondation (Lu and Shur 1997). L’existence de GalTase, ou de ses
isoformes chez l’homme à l’heure actuelle n’a pas été confirmée. Des études montrent
qu’il s’agirait d’une α-mannosidase qui jouerait un rôle similaire (Tulsiani, Skudlarek
et al. 1989; Brandelli, Miranda et al. 1996).
- La protéine SP56 est une protéine de souris, qui est localisée au niveau de la
membrane plasmique recouvrant l’acrosome. Cette protéine est aussi retrouvée chez le
rat et le singe (appelé AM67), mais pas chez l’homme. L’interaction entre SP56 et
ZP3 a été démontrée par des techniques de co-immunoprécipitation (Cheng, Le et al.
1994; He, Yan et al. 2003).
- La zonoadhésine est une protéine localisée au niveaux de la tête du spermatozoïde de
souris, des isoformes de cette protéine ont été retrouvés chez les porcs, les bovins, les
lapins et les primates. Elle joue un rôle dans la liaison du spermatozoïde à la ZP
(Hardy and Garbers 1995; Herlyn and Zischler 2008).

SP56 GalTase

Motifs sushi
zonadhésine
ZRK
EXT

Membrane plasmique

INT Coprécipitation
Retrouvé chez la souris Surexpression augmente
Non présent chez l ’Homme la liaison Sp-ZP et la RA
localisée au niveau de la Knock-out diminue la fertilité
tête du spermatozoïde
retrouvés chez les porcs, domaine catalytique
les bovins, les lapins et tyrosine kinase
les primates

AB inhibe la liaison sp-zp

localisation dorsale
ZP3 active l ’activité kinase de ZRK

Figure 27 : Représentation schématique des récepteurs spermatiques impliqués dans la liaison avec la Zone
pellucide.

- La Zona Receptor Kinase (ZRK) a été initialement décrite chez la souris. C’est une
protéine de 95 kDa qui présente une activité tyrosine kinase. Elle va
s’autophosphoryler sur des résidus tyrosine en présence de ZP3 (Leyton and Saling
1989; Leyton and Saling 1989). Son homologue humain Hu9 a été découvert à partir
41
 Introduction
d’un ADN complémentaire exprimé uniquement dans les cellules germinales mâles et
codant pour une protéine similaire à celle décrite chez la souris (Burks, Carballada et
al. 1995). Des anticorps dirigés contre le domaine intracellulaire de ZRK
reconnaissent une protéine de 95 kDa chez l’homme. Cette protéine humaine présente
une activité kinase quand elle est stimulée par la ZP3. Des peptides de synthèse
correspondant au domaine extracellulaire de cette protéine humaine inhibent la liaison
entre spermatozoïde et la ZP (Burks, Carballada et al. 1995). Enfin, l’induction de la
RA par ZP3 recombinante humaine (ZP3r) est associée à la phosphorylation des
résidus tyrosines de cette protéine de 95 kDa (Brewis, Clayton et al. 1998). La
protéine ZRK humaine joue un rôle dans le processus de stimulation acrosomique, car
les anticorps anti-ZRK inhibent la RA induite par ZP3r. Des études contradictoires on
émis un sérieux doute sur l’existence réelle de la protéine Hu9 au niveau des
spermatozoïdes. Ils ont montrés en se basant sur la séquence génomique de la protéine
Hu 9 de l’équipe de Burk que cette séquence présente une très forte homologie avec
une protéine humaine la proto-oncogéne c-mer ((Bork 1996; Tsai and Silver 1996)).
Ces études contradictoires on ainsi établit que la protéine Hu 9 n’existait pas. Aucune
étude depuis n’a été réalisée afin d’éclaircir cette controverse.

II. La réaction acrosomique

L’étude de la réaction acrosomique par microscopie électronique a permis l’identification des

différentes étapes de la réaction acrosomique (Figure 28). Le contenu acrosomique devient
diffus ; succèdent alors :

- De multiples points de fusion entre les membranes acrosomique externes et plasmiques

au niveau de la région antérieure de la tête.
- La vésiculisation de la membrane acrosomale.
- Et enfin l’exposition du contenu acrosomique et de la membrane acrosomique interne
(figure x) (Breitbart and Spungin 1997; Wassarman 1999; Tomes 2007).

42
 Introduction

Figure 28 : Photos de coupes sagittales de la tête de spermatozoïde de souris en microscopie électronique à

transmission représentant les étapes morphologiques de la réaction acrosomique. À gauche : le spermatozoïde
présente un acrosome intact. Au centre : stade précoce de la réaction acrosomique, présence de multitudes de
points de fusion entre les membranes acrosomales internes et externes. À droite l’exocytose de l’acrosome est en
cours : la fusion des membranes a eu lieu, générant des vésicules acrosomales (Tomes 2007).

III. Mécanisme moléculaire de la réaction acrosomique

L’exocytose de l’acrosome est un processus très régulé, composé de plusieurs étapes. Les
protéines SNAREs jouent un rôle primordial dans l’exocytose de l’acrosome. Elles constituent
des étiquettes qui permettent la reconnaissance mutuelle et le déclenchement de la fusion
entre la vésicule acrosomale et la membrane plasmique du spermatozoïde.

1. Les protéines SNAREs

Les premières protéines SNAREs (« Soluble NSF Attachement protein REceptors »)
identifiées furent celles de la famille des VAMP (« Vesicle Associated Membrane Proteins »)
ou synaptobrévines découvertes dans les vésicules synaptiques (Trimble, Cowan et al. 1988;
Baumert, Maycox et al. 1989), ensuite la famille des SNAP-25 (« SyNaptosome-Associated
Protein of 25kD ») (Oyler, Higgins et al. 1989), et la syntaxine 1 trouvée associée à la
membrane plasmique des terminaisons synaptiques des neurones de mammifères avec les
canaux calciques (Bennett, Calakos et al. 1992). Depuis 1998, 25 SNAREs ont été trouvé
chez la levure, 36 chez l’homme et 54 chez Arabidopsis, associées aux divers compartiments
cellulaires (Duman and Forte 2003; Weimbs, Low et al. 2003; Hong 2005; Jahn and Scheller
2006).

43
 Introduction
La famille des SNAREs est caractérisée par la présence d’un domaine SNARE de 60-70
acides aminés formant des heptades répétées adoptant une structure en hélice. D'autre part, la
plupart des SNAREs présentent soit un domaine C-terminal transmembranaire, soit des
résidus palmitoylés (cas de SNAP-25) ou encore une « boîte » CAAX permettant leur
farnésylation et ainsi leur ancrage membranaire (McNew, Sogaard et al. 1997).

Lorsque les SNAREs sont sous forme monomérique, elles ne sont pas structurées. C’est la
rencontre avec des partenaires définis (Rabs, NSF, α-SNAP et des facteurs d’arrimage) qui
permet l’association de leurs motifs en structures hélicoïdales très stables (Fasshauer, Antonin
et al. 2002; Fasshauer 2003) formées de quatre hélices α fournies par les motifs SNARE de
chaque partenaire du complexe. Chaque complexe implique 4 types d’hélices : Qa, Qb, Qc et
R, qui définissent des familles de SNAREs très conservées (Bock, Matern et al. 2001; Hong
2005). Les SNAREs sont associées à des compartiments spécifiques. Elles participent à la
mise en place de cette compartimentation et à la régulation des échanges vésiculaires en
contrôlant la fusion des vésicules avec leurs compartiments cibles. L'association préférentielle
de certaines synaptobrévines avec des syntaxines données, détermine la spécificité de la
fusion.

Les complexes SNAREs présents au niveau des membranes acrosomiques et plasmiques du

spermatozoïde sont constitués de quatre protéines : la syntaxine 1, la SNAP-25 (25 kDa
synaptosome associated protéine), la synaptobrevine et la synaptotagmine VI (Figure 29).

La syntaxine I (35 kDa) est une protéine membranaire de type II, localisée essentiellement
dans la membrane plasmique. Elle comporte une région N-terminale orientée vers le
cytoplasme (résidus 1-120), contenant trois motifs distincts en hélice, impliquée dans la
régulation de l’assemblage du complexe SNARE (Bennett, Calakos et al. 1992; Walch-
Solimena, Blasi et al. 1995; Tomes, Michaut et al. 2002; De Blas, Roggero et al. 2005;
Darios, Connell et al. 2007; Davletov, Connell et al. 2007; Tomes 2007). Le motif qui assure
la liaison des deux partenaires (SNAP-25 et synaptobrevine) est contenu dans une région plus
centrale (résidus 180-262) également structurée en hélice. Enfin, le segment
transmembranaire est très proche de l’extrémité C-terminale, laissant quelques résidus dans le
milieu extracellulaire. La Syntaxine I est présente au niveau de la membrane plasmique dans
une conformation fermée avec sa région amino-terminale cytoplasmique repliée contre son
domaine central. C’est l’intervention de protéines régulatrices et d’acides gras (Darios,

44
 Introduction
Connell et al. 2007; Davletov, Connell et al. 2007) qui lui permet l’acquisition d’une
conformation ouverte, permissive à la liaison de la SNAP-25 et finalement la mise en place du
complexe (Figure 30).

La SNAP-25 (25 kDa) ne possède aucune région transmembranaire. Elle est ancrée dans la
membrane plasmique par l’intermédiaire de la palmitoylation des résidus cystéine localisés au
milieu de la chaîne polypeptidique, et orientée vers le cytoplasme. La SNAP-25 renferme
deux motifs d’interaction avec les autres SNAREs, séparés par la boucle d’ancrage
palmitoylée (Oyler, Higgins et al. 1989; Walch-Solimena, Blasi et al. 1995; Sutton, Fasshauer
et al. 1998; Tomes, Michaut et al. 2002; Darios, Connell et al. 2007; Davletov, Connell et al.
2007; Tomes 2007).

La synaptobrévine (13 kDa) est une protéine membranaire des vésicules de sécrétion (Chin
and Goldman 1992). La partie N-terminale (résidus 1-33) est variable entre les différentes
isoformes, à la différence de la région centrale (résidus 33-96) impliquée dans la formation du
complexe SNARE. Le segment transmembranaire est localisé à l’extrémité C-terminale.
(Chin and Goldman 1992; De Blas, Michaut et al. 2002; Tomes, Michaut et al. 2002; De Blas,
Roggero et al. 2005; Hong 2005; Tomes 2007).

La synaptotagmine VI est une protéine senseur de calcium. Elle est située au niveau de la
membrane de l’acrosome. Elle possède deux domaines C2 (C2A et C2B) (Tomes 2007)
pouvant lier les lipides et le calcium, mais elle peut également interagir avec le complexe
SNARE, les canaux calciques et la calmoduline (Chapman, Hanson et al. 1995; De Blas,
Michaut et al. 2002; De Blas, Roggero et al. 2005; Davies and Zamponi 2008). De part ces
nombreuses interactions, la synaptotagmine permet de mettre en place une plateforme
fonctionnelle regroupant les acteurs indispensables au bon déroulement de l’exocytose.

Au niveau du spermatozoïde les facteurs de régulation du complexe SNARE sont la NSF, l’α-
SNAP et Rab3. Elles vont permettre d’une part l’association des protéines SNAREs en
configuration trans active (Fasshauer, Antonin et al. 2002; Fasshauer 2003), et d’autre part le
recyclage des protéines SNAREs après leur participation à la fusion membranaire.
La NSF (N-ethylmaleimidesensitive factor) est une protéine chaperone ATP dépendante. Elle
va permettre le recyclage des SNAREs après la fusion membranaire. C’est un hexamère de
sous-unités identiques de 752 résidus (Block, Glick et al. 1988; Whiteheart, Griff et al. 1993).
45
 Introduction

Chaque sous-unité de NSF comporte 3 domaines :

- Un domaine N (N-terminal) qui assure les interactions entre la NSF, les protéines
SNAPs et les protéines SNAREs (Zhao, Slevin et al. 2007).

- Un domaine D1 qui lie l’ATP et catalyse son hydrolyse, processus qui fournit l’énergie
pour la dissociation du complexe SNARE (Zhao, Slevin et al. 2007).

- Un domaine D2 (C-terminal) homologue à D1. Ce domaine est capable de lier l’ATP

avec une affinité très supérieure à D1, mais ne l’hydrolyse que très lentement, voir pas
du tout. D2 assure l’hexamérisation de la NSF indispensable à son activité (Zhao,
Slevin et al. 2007).

α-SNAP est une protéine soluble (NSF adaptor proteins) de 1.8 kDa. C’est une protéine
L’α
adaptatrice permettant la liaison de la NSF aux protéines SNAREs membranaires (Sollner,
Whiteheart et al. 1993; Whiteheart, Griff et al. 1993; Bock, Matern et al. 2001).

Les protéines Rab3 sont des petites GTPases. Ce sont des protéines qui basculent entre deux
états : lié au GTP (actif)) et lié au GDP (inactif) (Zerial and McBride 2001). Elles sont
associées à la membrane grâce à l’ajout d’acides gras. Il s’agit de deux acides géranyliques
ajoutés par la géranylgéranyltransférase II sur deux résidus cystéine spécifiques de la partie
hypervariable de leur queue C-terminale. Cette modification est essentielle à l’ancrage
membranaire, tandis que la partie hypervariable est spécifique d’un type de membrane
(Chavrier, Gorvel et al. 1991; Brennwald and Novick 1993; Novick and Brennwald 1993).
Les Rabs (liées au GTP) permettent le recrutement de facteurs d'arrimage (Gonzalez and
Scheller 1999; Pfeffer 1999; Waters and Hughson 2000; Zerial and McBride 2001; Tomes,
Michaut et al. 2002; Tomes 2007). Ces derniers rapprochent les membranes vésiculaires et les
membranes cibles, favorisant l'interaction entre les protéines SNAREs vésiculaires (v-
SNAREs) et les protéines SNAREs de la membrane cible (t-SNAREs) (De Blas, Michaut et
al. 2002; De Blas, Roggero et al. 2005; Tomes 2007).

46
 Introduction

Figure 29 : Représentation schématique du complexe SNARE présent au niveau des membranes acrosomiques
et plasmiques du spermatozoïde. Le complexe SNARE est formé par l’association des quatre hélices α de la
synaptobrevine, la syntaxine I et la SNAP-25. La synaptotagmine VI sert de senseur de calcium et régule le
« zippering » du complexe SNARE.

Modèle de fusion membranaire par les protéines SNAREs

Un modèle de fusion membranaire a découlé de l’étude des protéines SNAREs (Trimble,
Cowan et al. 1988; Baumert, Maycox et al. 1989; Chin and Goldman 1992; Sollner,
Whiteheart et al. 1993; Walch-Solimena, Blasi et al. 1995; Sutton, Fasshauer et al. 1998;
Pfeffer 1999; Duman and Forte 2003; Fasshauer 2003; De Blas, Roggero et al. 2005; Hong
2005; Jahn and Scheller 2006; Davletov, Connell et al. 2007; Zhao, Slevin et al. 2007).

Figure 30 : Représentation schématique de l’action des acides gras sur la syntaxine I. La syntaxine I se trouve
dans une conformation fermée avec sa région amino-terminale cytoplasmique repliée contre son domaine
central. Les Acides gras induisent un changement de conformation de la syntaxine I, qui lui permet
l’acquisition d’une conformation ouverte, permissive à la liaison de la SNAP-25 (Darios, Connell et al. 2007).

47
 Introduction

Initialement, la syntaxine I se trouve dans une conformation fermée avec sa région amino-
terminale cytoplasmique repliée contre son domaine central. L’intervention de protéines
régulatrices et d’acides gras favorise l’acquisition d’une conformation ouverte, permissive à la
liaison de la SNAP-25 (Figure 30).

L’assemblage du complexe SNARE débute dans les régions N-terminales du faisceau et

progresse spontanément en fermeture éclair « Zippering» vers les régions carboxy-terminales
transmembranaires (Hanson, Roth et al. 1997).

Plusieurs complexes SNAREs sont disposés en cercle à l’interface entre la vésicule

acrosomique et la membrane plasmique. Les complexes SNARE vont rapprocher la
membrane acrosomique vers la membrane plasmique pour induire un réarrangement des deux
bicouches opposées afin de former une seule bicouche entre l’acrosome et le milieu
extracellulaire. Un pore de fusion s’ouvre alors dans cette bicouche, et son expansion rapide
va conduire à la vésiculisation de la membrane acrosomique et à l’exposition du contenu
acrosomique et de la membrane acrosomique interne (Figure 31).

Lorsque l’exocytose de la vésicule acrosomique est complète, le complexe SNARE

dont l’assemblage débute en configuration trans (les protéines SNAREs sont ancrées dans
deux bicouches lipidiques différentes : la syntaxine I et la SNAP-25 au niveau de la
membrane plasmique et la synaptobrevine et la synaptotagmine au niveau de la membrane
acrososmique) se retrouve en configuration cis (tous les composants sont ancrés dans le même
plan lipidique) (Jahn and Scheller 2006; Sudhof and Rothman 2009).

Avant de réaliser la réaction acrosomique, les complexes SNAREs présents au niveau

des membranes acrosomiques et plasmiques du spermatozoïde sont en configuration cis
inactive (Tomes, Michaut et al. 2002; De Blas, Roggero et al. 2005).

48
 Introduction

Figure 31: Représentation du cycle de fonctionnement des protéines SNAREs. Les trois hélices α de la syntaxine
(en vert) et SNAP-25 (en rouge) (ancrées dans la membrane plasmique) s’assemblent avec l’hélice α de la
synaptobrévine (en bleu) (ancrée dans la membrane vésiculaire). Les SNAREs sont alors complexées en
configuration trans lâche. L’arrivé de la synaptotagmine (protéine régulatrice) au niveau du complexe SNARE
induit un resserrage de la configuration trans. Cela génère une force vers l'intérieur qui tire les membranes
ensemble, les forçant à fusionner. Lorsque la fusion a eu lieu, la force disparaît et les SNAREs se retrouvent
complexées en configuration Cis. Les protéines NSF et α-SNAP vont dissocier le complexe, pour permettre un
nouveau cycle. Modifié de (Jahn and Scheller 2006).

2. La réaction acrosomique est contrôlée par une signalisation biphasique de

calcium

Comme toutes les exocytoses, la réaction acrosomique est sous le contrôle d’une
augmentation biphasique de la concentration cytosolique en calcium. Dans le spermatozoïde,
le calcium nécessaire à cette réaction d’exocytose provient de deux sources, du milieu
extracellulaire et du stock calcique interne (acrosome). Les influx de calcium sont contrôlés
par des canaux calciques. La reconnaissance de ZP3 par les récepteurs spécifiques
spermatiques situés au niveau de la tête du spermatozoïde est l’élément déclencheur de cette
signalisation calcique biphasique.

49
 Introduction
La réaction acrosomique est rythmée par l’ouverture successive de différents canaux
calciques (Figure 32):

1) La fixation du spermatozoïde sur la zone pellucide provoque l’ouverture d’un canal

cationique peu sélectif qui entraîne une dépolarisation de la membrane. La caractérisation de
ces canaux n’est pas encore réalisée. Cette dépolarisation déclenche l’activation de canaux
calciques dépendants du voltage (Arnoult, Cardullo et al. 1996) situés au niveau de la
membrane. Le canal calcique de type T joue un rôle primordial dans la signalisation calcique
du spermatozoïde, car il est le premier canal à être activé, son inhibition éteint toute
signalisation calcique ultérieure et bloque la réaction acrosomique. Les propriétés
biophysiques et pharmacologiques de ces canaux se sont révélées différentes par rapport à
celles des cellules somatiques suggérant une diversité moléculaire de ces canaux de type T
(Arnoult, Villaz et al. 1998) . Au laboratoire, à partir de souris déficientes en différents types
de canaux calciques à bas seuil d’activation, il a été montré que ces canaux étaient de type
CaV3.2 (stamboulian, et al 2005, Escoffier et al, 2007).

Figure 32 : Représentation schématique de la signalisation calcique biphasique au cours de la réaction

acrosomique. Modifiée de (O'Toole, Arnoult et al. 2000). La fixation de ZP3 provoque un influx transitoire de
Ca2+ qui correspond à l’ouverture des canaux calciques dépendants du voltage de type T. L’augmentation
soutenue de la concentration calcique qui suit correspond à l’ouverture du récepteur à l’IP3 puis des canaux
SOCs.

50
 Introduction
2) Ensuite le récepteur à l’IP3 s’active et permet une libération massive de calcium à
partir de l’acrosome qui joue ici le rôle de stock calcique intracellulaire joué habituellement
par le réticulum endoplasmique.

3) Cette libération de calcium déclenche l’activation de canaux SOCs sensibles au

niveau de remplissage des stocks calciques intracelullaires. Ces canaux sont situés au niveau
de la membrane plasmique et permettent une entrée massive de calcium à partir de l’extérieur
de la cellule. Ils sont de types TRPC2 (Jungnickel, Marrero et al. 2001)

L’influx transitoire de calcium qui correspond à l’ouverture des canaux calciques

dépendants du voltage de type T:

- Va activer la protéine Rab3 (recrutement de facteurs d'arrimage), permettant d’initier

l'arrimage de la vésicule acrosomique avec la membrane plasmique.

Figure 33: Représentation schématique du mécanisme moléculaire de la réaction acrosomique. Avant de réaliser la
réaction acrosomique (à gauche), la synaptotagmine est phosphorylée et les protéines SNAREs sont engagées dans
la configuration cis. Toutes les protéines sont « inactives ». L’entrée de calcium extracellulaire permet l’activation
des protéines Rab3, NSF et α-SNAP. Il en résulte la déphosphorylation de la synaptotagmine et la dissociation du
complexe SNARE (deuxième à partir de la gauche). Le complexe SNARE va ensuite se rassembler en une
configuration trans active (troisième en partant de la gauche). Le deuxième influx calcique, provenant de
l’acrosome, va permettre l’activation de la synatotagmine et le « zippering » du complexe SNARE (quatrième en
partant de la gauche). Le zippering des SNAREs va générer une force d’invagination des membranes qui permet la
formation des pores de fusion (à droite). La Synaptobrevine est représentée en vert, la syntaxine est représentée en
rose (domaine Habc amino-terminale) et violette (motif SNARE et domaine transmembranaire), la SNAP-25 en
bleu. La synaptotagmine en bleu (domaine transmembranaire), en vert (domaine C2A) et en
jaune (domaine C2B). OAM, membrane externe acrosomale ; PM, membrane plasmique (De Blas, Roggero et al.
2005).

- Va aussi induire la dissociation des complexes SNAREs de la configuration cis

inactive par une déphosphorylation de la synaptotagmine et l’activation des protéines

51
 Introduction
NSF et α-SNAP. L’apport d’énergie produit par les NSF-ATPases va permettre de
dissocier le complexe SNARE de sa forme cis.

- Les complexes SNAREs vont être alors libres de se réunir en configuration trans, ce
qui va permettre l'irréversible arrimage de la membrane acrosomique externe à la
membrane plasmique. (Tomes 2007)

L’augmentation soutenue de la concentration calcique qui suit correspond à l’ouverture

du récepteur à l’IP3 puis des canaux SOCs :
- Va activer la synaptotagmine et permettre de déclencher les dernières étapes de la
fusion membranaire (figure 33).

3. La réaction acrosomique est également contrôlée par des messagers lipidiques

produits par les phospholipases
Les messagers lipidiques générés par les phospholipases semblent servir comme co-
activateurs de la réaction acrosomique. Deux types de messagers ont plus particulièrement été
étudiés : les lysophospholipides et les acides gras.
La première étude suggérant l’implication de lysophopholipides comme messagers lipidiques
dans le contrôle de la réaction acrosomique a été réalisée par Fleming et al 1981. Cette étude
montre que le prétraitement des spermatozoïdes de cobaye avec des lysophospholipides, le
lysophosphatidylcholine (lysoPC) diminue le temps de capacitation et abouti à une induction
rapide de la réaction acrosomique en présence de quelques mM de Ca2 +. D'autres études ont
par la suite confirmé que les lysoPC déclenchaient la réaction acrosomique des
spermatozoïdes de hamster (Ohzu and Yanagimachi 1982; Llanos, Morales et al. 1993) et de
taureau (Parrish, Susko-Parrish et al. 1988; Roldan and Fragio 1993).
Une autre preuve de l’implication des lysoPC dans les mécanismes de contrôle de la réaction
acrosomique provient d’expériences dans lesquelles l'activité des PLA2 a été bloquée, ce qui
se traduit par l’incapacité des spermatozoïdes à réaliser la réaction acrosomique induite par
L’A23187 et une inhibition de la libération des lysoPC dans le milieu extracellulaire. L’ajout
de lysoPC extracellulaire a permis de restaurer la capacité des spermatozoïdes de bélier à
réaliser la réaction acrosomique (Roldan and Fragio 1993; Garde and Roldan 1996; Garde and
Roldan 2000) ou d’ hamster (Llanos, Morales et al. 1993).
Il est intéressant de noter que tous les lysophospholipides n’ont pas un rôle activateur de la
réaction acrosomique. Ainsi, les lysoPC et les lysophosphatidylinositol (lysoPI) sont capables
de déclencher la réaction acrosomique, alors que les lysophosphatidylsérines (lysoPS) n’en

52
 Introduction
sont pas capables (Llanos, Morales et al. 1993; Roldan and Fragio 1993 ). En faite, les lysoPS
semblent avoir un rôle inhibiteur de la réaction acrosomique dans certaines conditions
(Llanos, Morales et al. 1993).
Les premiers travaux suggérant l’implication des acides gras comme messagers lipidiques
dans le contrôle de la réaction acrosomique ont été réalisés par Meizel et al. 1983. Cette étude
a permis de montrer que certains acides gras Cis-insaturés tels que l’acide oléique, l’acide
arachidonique et l’acide vaccénique induisaient la réaction acrosomique des spermatozoïdes
capacités de hamster (Meizel and Turner 1983). D’autres études ont par la suite confirmé
l’implication de l’acide arachidonique dans le contrôle de la réaction acrosomique par des
expériences d’inhibition du métabolisme de l'acide arachidonique (Meizel and Turner 1984;
Joyce, Nuzzo et al. 1987; Lax, Grossman et al. 1990). Ces études ont permis de mettre en
évidence que, bien que l’acide arachidonique soit une molécule fusiogène (Pollard, Burns et
al. 1988), il induirait la réaction acrosomique des spermatozoïdes de hamster par le biais de
ses dérivés métaboliques. En effet, la réaction acrosomique induite par l’acide arachidonique
est partiellement ou voir totalement bloquée par les inhibiteurs du métabolisme de l’acide
arachidonique tel que le Phenidone ou l’acide nordihydroguaiaretique (Meizel and Turner
1984). Ces résultats devront être réévalués, car les niveaux d'acide arachidonique ou des
métabolites générés par la voie métabolique n'ont pas été mesurés. Des études plus récentes
ont également montré que l'acide arachidonique est en mesure d'améliorer le pourcentage de
réaction acrosomique des spermatozoïdes de bélier en réponse à l’A23187 (Roldan and Fragio
1993).

Les phospholipases sont les générateurs des messagers lipidiques

spermatiques
Les phospholipases sont des enzymes hydrolysant les liaisons ester des phospholipides. Elles
générèrent différents messagers lipidiques dont certains sont impliqués dans la physiologie
spermatique comme la réaction acrosomique ou la mobilité flagellaire. Il existe quatre liaisons
ester dans un phospholipide, on distingue donc plusieurs enzymes selon leur site d’action sur
la molécule (Figure 34).
La phospholipase A1 enlève l’acide gras lié à la fonction alcool primaire du glycérol, libérant
un acide gras et un lysophospholipide.
La phospholipase A2 enlève l’acide gras lié à la fonction alcool secondaire du glycérol,
libérant un acide gras et un lysophospholipide.

53
 Introduction
La phospholipase C intervient sur la fonction ester liant le glycérol et le phosphate, libérant
un diacyglycéride et un inositol triphosphate.
La phospholipase D lyse la fonction ester entre la fonction acide du phosphate et l'alcool,
libérant un acide phosphatidique (PA) et un alcool.

Figure 34 : Répésentation schématique de

l’hydrolyse de la phosphatidylcholine par
les phospholipases A1, A2, C et D. R1 et
R2 sont les chaînes longues d’acides gras,
généralement saturées en R1 et non
saturées en R2 (Roldan and Shi 2007).

Au niveau des spermatozoïdes matures, on retrouve les phospholipases de type C (PLC), les
phospholipases de type D (PLD) et les phospholipases de type A2 (PLA2).

La phospholipase C, in vivo, catalysent l’hydrolyse du phosphatidylinositol diphosphate

membranaire (PIP2) en diacyclglycérol (DAG) et inositol-1-4-5-triphosphate (IP3). Il existe
plusieurs types de phospholipase C

- La phospholipase C-β, qui est activée par les récepteurs couplés aux protéines G.

- La phospholipase C-γ, qui est activée par des récepteurs à activité tyrosine kinase.

- La phospholipase C-δ, qui est activée par l’IP3.

- La phospholipase C-ζ, qui est activée comme la phospholipase C-δ par l’IP3.

Comme tous les messagers secondaires, le DAG et l’IP3 (produit par la PLC) sont rapidement
dégradés en métabolites inactifs au sein de la cellule. Le DAG a plusieurs molécules cibles :
parmi les cibles connues, on retrouve la protéine kinase C, qui, comme la protéine kinase A
(PKA), phosphoryle spécifiquement des protéines sur les résidus sérine et/ou thréonine ou
certains canaux de la famille des TRPC (Lucas, Ukhanov et al. 2003). La molécule cible de
l’IP3 est un canal calcique, « le récepteur à l’IP3 ». On sait depuis 1990 que L’IP3 et le DAG
sont impliqués dans la réaction acrosomique. En effet, lors de réactions acrosomiques induites
par l’ionophore calcique A23187, les concentrations intracellulaires de DAG et d’IP3
54
 Introduction
augmentent dans les spermatozoïdes de bélier (Harrison, Roldan et al. 1990; Roldan and
Murase 1994) ou de verrat (Vazquez and Roldan 1997), à la suite d’une stimulation d’une
phospholipase C (Roldan and Murase 1994). Différents types de phospholipases C pourraient
être impliquées dans cette activité. L’étude menée par Tomes et al 1996 a démontré
l’existence d’une PLCγ1 dans les spermatozoïdes de souris (Tomes, McMaster et al. 1996),
soulignant également que l’activité de cette enzyme était dépendante d’une activité tyrosine
kinase. Une PLCβ1 a également été identifiée dans la région acrosomique des spermatozoïdes
de mammifères (Walensky and Snyder 1995). L’étude menée par Heytens a montré la
présence d’une phospholipase C : la PLCζ au niveau de la région équatoriale de la tête dans
les spermatozoïdes humains par immunohistochimie et western blot (Yoon, Jellerette et al.
2008; Heytens, Parrington et al. 2009). Cette phospholipase est impliquée dans les vagues
calciques indispensables à l’activation ovocytaire (Parrington, Swann et al. 1996; Parrington,
Jones et al. 1999; Parrington, Jones et al. 2002; Saunders, Larman et al. 2002; Yoon, Jellerette
et al. 2008) et sa perte induit une infertilité masculine (Yoon, Jellerette et al. 2008; Heytens,
Parrington et al. 2009).

La phospholipase D hydrolyse les phospholipides en libérant un acide phosphatidique (PA)

et un alcool. L’implication de la phospholipase D dans la réaction acrosomique a été étudiée
par Garbi et al. 2000 à l’aide de techniques d’imunohistochimie et de western blot. Cette
étude a permis de mettre en évidence la présence de la PLD de type 1 au niveau de l’acrosome
des spermatozoïdes de bovins et l’activation de la PLD1 par la protéine kinase C (PKC). Son
activation va lui permettre de se transloquer de l’acrosome vers la membrane acrosomique
externe (Garbi, Rubinstein et al. 2000). Sur la base de ces résultats, il a été supposé que la
PLD activée par la PKC serait transportée au niveau de la membrane acrosomique externe, où
l'enzyme active pourrait générer l’acide phosphatidique (PA) qui aidera à l’induction de la
réaction acrosomique. Aucun autre élément de preuve de la participation de la PLD dans des
événements sous-jacents la réaction acrosomique n'a été présenté jusqu'à présent (Roldan and
Shi 2007).

Les phospholipases A2 (PLA2) sont des enzymes qui hydrolysent la liaison ester des
phospholipides membranaires en position sn-2, produisant ainsi des lysophospholipides et des
acides gras libres. Ce clivage des phospholipides est à l’origine de la synthèse des médiateurs
lipidiques. Ces enzymes sont classées en trois sous-groupes selon leur localisation, leur poids

55
 Introduction
moléculaire et leur sensibilité au calcium (Ca2+) nécessaire à leur activité catalytique (Dennis
1997; Schaloske and Dennis 2006) :

- Les PLA2 Ca2+ dépendantes cytosoliques (cPLA2). Ce sont des enzymes de haut poids
moléculaire (85 kDa) nommées ainsi de par leur localisation principalement
cytosolique. Ce sous-groupe de PLA2 comprend trois membres : les cPLA2 α, β et γ
également appelées respectivement cPLA2- IVA, -IVB et -IVC (Brown, Chambers et
al. 2003).

- Les PLA2 Ca2+ indépendantes (iPLA2). Elles comprennent uniquement deux membres :
la iPLA2β (VIA) et la iPLA2γ (VIB) (Bingham, Fijneman et al. 1999). Ce sont des
enzymes ayant un poids moléculaire de 85-88 KDa.

- Les PLA2 Ca2+ dépendantes secrétées (sPLA2). Elles ont été initialement découvertes
dans les venins d’abeilles et de serpents (Davidson and Dennis 1990). Ces sPLA2 sont
considérées comme myotoxiques et neurotoxiques puisque leur administration
entraine une nécrose rapide des fibres musculaires squelettiques ainsi que des
dommages nerveux importants (Kini and Evans 1989). Chez les mammifères, les
sPLA2 représentent le sous-groupe de PLA2 le plus volumineux, comprenant dix
enzymes ou isoformes différentes : sPLA2-IB, -IIA, -IIC, -IID, -IIE, -IIF, -III, -V, -X et
–XII. Le profil d’expression de ces différentes sPLA2 varie énormément d’une cellule
à l’autre. Cependant, elles partagent certaines caractéristiques communes soit un faible
poids moléculaire (14 à 19 kDa), un contenu important en ponts disulfures et le besoin
de Ca2+ (concentration de l’ordre du millimolaire) pour soutenir leur activité
catalytique. Ces enzymes sont exprimées et emmagasinées à l’intérieur des cellules.
Suite à une activation appropriée de ces dernières, les sPLA2 sont habituellement
sécrétées dans le milieu extracellulaire, mais peuvent également rester dans des
vésicules cytoplasmiques ou être associées aux membranes de différents organelles
(Dennis 1997; Bingham, Fijneman et al. 1999).

Il y a, malheureusement, peu d'informations sur le rôle des PLA2 au niveau des

spermatozoïdes de mammifères, mais certaines études récentes ont commencé à faire la
lumière sur cette question.

56
 Introduction
Les premières études montrant l’implication des phospholipases A2 dans le mécanisme de la
réaction acrosomique ont été faites à partir d’inhibiteurs des PLA2. Ces études montrent que le
traitement des spermatozoïdes de bélier (Roldan and Fragio 1993 ; Garde and Roldan 1996),
d’hamster (Lui and Meizel 1979; Ono, R. Yanagimachi et al. 1982 ; Llanos, Morales et al.
1993 ), de cochon d'Inde (Singleton and Killian 1983) et d’humain (Fry, Ghosh et al. 1992)
par des inhibiteurs de PLA2 tels que le Rho 31-4493, la quinacrine dihydrochloride, le p-
bromophenacyl-bromide, le PBx et la mepacrine diminuent le pourcentage de réaction
acrosomique qu’elle soit spontanée ou induite par le ionophore calcique A23187.

La diminution du taux de réaction acrosomique par l’inhibiteur de PLA2 peut être restaurée
par l’addition de lysoPC et d’acide arachidonique (Llanos, Morales et al. 1993; Garde and
Roldan 1996). Ces résultats fournissent des preuves solides pour penser que les PLA2 peuvent
avoir un rôle essentiel dans le mécanisme de la réaction acrosomique. Une autre preuve de
l’implication des phospholipases A2 dans le mécanisme de la réaction acrosomique a été
établie par l’équipe de Riffo en 1996. Cette équipe a montré que le traitement des
spermatozoïdes de hamster par un anticorps dirigé contre la phopholipase A2 secrétée IB a
inhibé la réaction acrosomique spontanée (Riffo and Parraga 1996).

Des efforts ont été ensuite principalement faits sur la caractérisation biochimique des PLA2
dans les spermatozoïdes de différentes espèces. Il a été ainsi décrit la présence de
phospholipases A2 secrétées IID, IIC, V, X et IIF au niveau des spermatozoïdes de souris par
la technique de Western Blot (Masuda, Murakami et al. 2004), mais leurs fonctions
particulières dans la réaction acrosomique reste à l’heure actuelle à être déterminée. Aucune
cPLA2 n’a été aujourd’hui découverte au niveau des spermatozoïdes.

Il a aussi été décrit la présence de l’iPLA2 de type VIA au niveau des spermatozoïdes de
souris par la technique de Western Blot (Bao, Miller et al. 2004). Cette iPLA2 semble jouer un
rôle important dans la physiologie spermatique. En effet des travaux effectués à partir
d’animaux, dont le gêne de la iPLA2 VIA a été invalidé montre que l’absence de l’iPLA2 VIA
induit une diminution de la mobilité spermatique et une réduction notable du taux de
fécondation (Bao, Miller et al. 2004).

Les diverses études montrant l’implication des messagers lipidiques et des phospholipases
dans le mécanisme de contrôle de la réaction acrosomique ont permis d’établir un modèle de

57
 Introduction
voie de régulation lipidique de la réaction acrosomique chez la souris (Figure 35) (Baldi,
Luconi et al. 2000).

Figure 35 : Représentation schématique du contrôle lipidique du mécanisme de la réaction acrosomique des

spermatozoïdes de souris. (Modifier de (Baldi, Luconi et al. 2000).

L’interaction de ZP3, avec son récepteur spermatique va induire son autophosphorylation qui
résulte en l’activation des protéines G. Les protéines G vont ainsi pouvoir activer les
phospholipases C. Les phospholipases C actives vont catalyser l’hydrolyse du
phosphatidylinositol diphosphate membranaire (PIP2) en diacyclglycérol (DAG) et inositol-1-
4-5-triphosphate (IP3). L’augmentation intracellulaire du DAG va induire l’activation de la
protéine kinase C qui résultent en la phosphorylation de diverses protéines et induit la réaction
acrosomique. L’augmentation intracellulaire d’IP3 va activer le récepteur à l’IP3 et permettre
une libération massive de calcium de l’acrosome (stock calcique). Les phospholipases A2 et D
présentes au niveau du spermatozoïde, vont être activées par l’augmentation intracellulaire de
calcium et par les protéines G. Elles vont permettre la production de lysophospholipides et

58
 Introduction
d’acide gras à partir des phospholipides membranaires. Les lysophospholipides et les acides
gras produits vont induire la réaction acrosomique.

Nous l’avons vu, la réaction acrosomique est finement régulée dans l'espace et le temps par
différents modes de régulation tels que le calcium, les protéines SNAREs, les phospholipases,
les messagers lipidiques. À l’heure actuelle, tous les mécanismes de contrôle de la réaction
acrosomique ne sont pas encore élucidés. Les spermatozoïdes qui ont réalisé leur réaction
acrosomique restent attachés à la ZP2 pour faciliter leur pénétration de la zone pellucide. La
pénétration de la ZP et la fusion avec l’ovocyte sont facilitées par la mobilité spermatique et
l’interaction avec différents partenaires protéiques.

59
 Introduction

Chapitre 4 : Liaison et fusion des spermatozoïdes avec l’ovocyte

I. Pénétration de la zone pellucide

La fusion de la vésicule acrosomale permet le relâchement d’un grand nombre d’enzymes

hydrolytiques et protéolytiques responsables de la digestion localisée de la zone pellucide de
l’ovocyte : telles que la β-N-acétylglucosaminidase, la hyaluronidase, la phosphatase acide et
l’acrosine. Le rôle des enzymes acrosomiques libérées n’est pas totalement connu. On sait que
la β-N-acétylglucosaminidase va intervenir dans la perte de la liaison entre le spermatozoïde
et l’hétérodimére ZP2-ZP3 et que l’acrosine va rompre localement les pontages entre ZP1,
ZP2 et ZP3. La désagrégation de la membrane acrosomiale va permettre aussi la mise à nu de
protéines sous membranaires du spermatozoïde jusqu'alors masquées. Ces protéines sous
membranaires, telle que la protéine SP-10 en entrant en contact avec des sites
complémentaires la zone pellucide permettront la liaison secondaire du spermatozoïde à ZP2
et la pénétration de la zone pellucide. La pénétration de la zone pellucide est facilitée par les
actions conjointes de la mobilité spermatique (Ren, Navarro et al. 2001) et d’hydrolyse
enzymatique (Wassarman and Litscher 2008).

II. Liaison et fusion des spermatozoïdes avec la membrane ovocytaire

Après avoir traversé la zone pellucide et atteint l’espace péri-vitelline, le spermatozoïde se

lie alors à la membrane plasmique ovocytaire au niveau des régions sous-équatoriales et
équatoriales de la tête et fusionne avec l’ovocyte en position tangentielle.
La fusion de la membrane acrosomique interne du spermatozoïde avec la membrane
plasmique ovocytaire est peu connue, on sait qu’elle fait intervenir différents partenaires
protéiques (Figure 36):

- La fertiline β et la cyritestine sont des protéines transmembranaires spermatiques. Ce

sont des hétérodiméres composées de deux sous-unités α et β. chacune de ces sous-
unités appartient à la famille des protéines ADAM (contains A Disintegrin And
Metalloproteinase domain, c'est-à-dire des protéines qui contiennent un domaine
désintegrine et métalloprotéases). La fertiline β et la cyritestine sont capables de se lier
à des récepteurs de type intégrine situés au niveau de la membrane ovocytaire. Des
tests d’inhibitions par des anticorps ont permis de proposer la fertiline β et la

60
 Introduction
cyritestine comme les protéines indispensables à la liaison et la fusion du
spermatozoïde à l’ovocyte (McLaughlin, Frayne et al. 2001). Des expériences
d’invalidation de gène ont montré que les souris fertiline β -/-
et cyritestine -/-
(Cho,
Bunch et al. 1998; Cho, Ge et al. 2000; Nishimura, Cho et al. 2001) présentaient une
diminution de fertilité. La fertiline β et la cyritestine font parties des éléments clés de
la fusion des gamètes.

- Des tests d’inhibitions ont permis de proposer l’intégrine α6β1 comme le récepteur du
spermatozoïde sur l’ovocyte (Almeida, Huovila et al. 1995). Mais, la situation est loin
d’être aussi simple, car diverses intégrines sont exprimées à la surface de l’ovocyte et
leur inhibition avec des anticorps ou des ligands spécifiques inhibent la fécondation.
Des souris femelles invalidées pour les intégrines de la famille β1, incluant les sous-
unités α2, α 3, α 5, α 6, α 9, α v, ainsi que αvβ3 et αvβ5, sont fertiles (Miller, Georges-
Labouesse et al. 2000; He, Brakebusch et al. 2003; Stein, Primakoff et al. 2004).
Toutes ces intégrines jouent un rôle dans la fusion des gamètes, mais ne sont pas
essentielles pour la fécondation. À l’heure actuelle leur rôle reste à définir.

- Des expériences de gène knock-out suggèrent que la fusion des gamètes de mammifère
dépend d’une interaction entre une protéine spermatique et une protéine CD9 de
l’ovocyte. La protéine CD9 appartient à la famille des tétraspamines, elle est
constituée de quatre domaines transmembranaires, deux boucles extra-cellulaires et de
deux petits domaines cytoplasmiques. La protéine CD9, située au niveau de la
membrane plasmique ovocytaire, est associée aux intégrines α6β1 et aux protéines
glycosylphosphatidyltinositol (GPI-anchored protéine) (Stein, Go et al. 2006). Les
souris femelles dépourvues de CD9 sont stériles (Miyado, Yamada et al. 2000), leurs
ovocytes ne permettent pas la fusion membranaire avec la membrane acrosomique
interne des spermatozoïdes. La protéine CD9 pourrait être un élément clef de la fusion
des gamètes (Miyado, Mekada et al. 2000; Miyado, Yamada et al. 2000).

- Une nouvelle protéine spermatique a été identifiée comme partenaire protéique de la

fusion gamétique, il s’agit d’une protéine membranaire, appelée Izumo, appartenant à
la superfamille des immunoglobulines. Elle est spécifique du spermatozoïde et
comporte une petite région extracellulaire. Cependant, à l’inverse des autres membres
de la famille, celle-ci ne contient qu’un seul domaine Ig-like, dont on connaît la
61
 Introduction
capacité de relayer l’adhérence intercellulaire, et permettant un contact plus étroit avec
la membrane ovocytaire. Les souris mâles dépourvues d’Izumo sont stériles, les
spermatozoïdes se lient à la membrane de l’ovocyte sans pouvoir fusionner.
-/-
L’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes Izumo permet le développement
d’un embryon. Les mécanismes impliqués dans la fusion ne sont pas encore décryptés,
mais on peut imaginer qu’Izumo interagisse avec la protéine CD9, directement ou en
collaboration avec d’autres protéines (Inoue, Ikawa et al. 2005).

Figure 36 : Représentation schématique

des protéines impliquées dans la fusion
gamétique des mammifère (Rubinstein,
Ziyyat et al. 2006).

- Un autre partenaire protéique impliqué dans le mécanisme de fusion du spermatozoïde

avec l’ovocyte a été identifié : les phospholipases A2. Les premières expériences
montrant leurs implications ont été réalisées par l’équipe de Fry et al en1992. Cette
équipe a montré que le prétraitement des spermatozoïdes humains avec un inhibiteur
de phospholipases A2, le PGBx, bloquaient leurs capacités de pénétrer les ovocytes de
hamster dé-pellucidés (Fry, Ghosh et al. 1992). D’autres études ont par la suite
confirmé l’implication des phospholipases A2 dans la fusion gamétique. En effet
l’étude de Riffo et al. 1997 a montré que le prétraitement de spermatozoïdes humains
avec un anticorps dirigé contre la phopholipase A2 secrétée IB diminue fortement le
taux de fécondation in vitro. La diminution du taux de fécondation par l’anticorps de
PLA2 secrétée IB peut être restaurée par l’addition de lysoPC (Riffo and Parraga
1997). Un résultat similaire a été observé chez le hamster (Riffo and Parraga 1996).
Une autre preuve de l’implication des phospholipases dans la fusion gamétique a été
faite par l’étude de Riffo et al 1999, en observant l’effet de l'un des produits de la
62
 Introduction
réaction enzymatique des phospholipases A2, les lysophosphatidylcholine (LPC), sur
la liaison des spermatozoïdes à des ovocytes prétraités par le lysoPC (chez la souris).
Le prétraitement in vitro des ovocytes par les LysoPC a dramatiquement augmenté la
capacité des spermatozoïdes à se lier à l’ovocyte (Riffo and Nieto 1999). À l’heure
actuelle, on ne sait exactement quelles sont les phospholipase A2 impliquées dans
l’interaction gamétique. L’étude de Bao et al. 2004 nous donne un élément de réponse.
Cette étude a permis d’établir l’implication d’une phospholipase A2 : la iPLA2 VIA
dans l’interaction gamétique. En effet, cette étude montre une diminution notable du
-/-
taux de fécondation in vitro entre des ovocytes iPLA2 VIA et des spermatozoïdes
+/+
iPLA2 VIA (Bao, Miller et al. 2004). Un nombre important de PLA2 sont présentent
au niveau du spermatozoïde (Masuda, Murakami et al. 2004), il reste à établir le rôle
des autres PLA2 dans l’interaction gamétique, peut être un mécanisme de redondance
ou compensatoire est à envisager.

La fusion de la membrane du spermatozoïde avec l’ovocyte induit l’exocytose des granules

corticaux. Les composants des granules corticaux vont modifier ZP2 et ZP3. Cette
modification de la zone pellucide va induire un blocage lent de la polyspermie. L’ovocyte est
alors fécondée.

63
Problématique
 Problématique

La baisse de la fertilité masculine mondiale ces dernières décennies est devenue préoccupante.
Ainsi, un homme sur quinze est subfertile (Auger, Kunstmann et al. 1995). Les principales
causes de l'infertilité masculine peuvent être réparties en trois catégories : les anomalies de la
production des spermatozoïdes de causes génétiques (Escalier 2006; Dieterich, Soto Rifo et
al. 2007 ) affectant la qualité et/ou la quantité de ces derniers (Sherins 1995); les obstructions
anatomiques et les facteurs environementaux (Sharpe and Skakkebaek 1993). Bien que
produits en nombre suffisant, les spermatozoïdes peuvent être immatures, présenter des
formes anormales ou être incapables de se déplacer correctement, caractéristiques qui les
priveront de leur capacité de féconder un ovocyte.

Les anomalies des spermatozoïdes, dues à des problèmes de production, de maturation des
spermatozoïdes et de transport, sont les causes les plus communes de l'infertilité masculine.
On en distingue quatre types :

- L'Oligospermie : elle correspond à une quantité insuffisante de spermatozoïdes dans

le sperme. Normalement il y a au moins 20 millions de spermatozoïdes par ml de
sperme. Il a été estimé qu’un nombre inférieur à 10 millions/ml peut être responsable
d'une infertilité (Grimes and Lopez 2007; Poongothai, Gopenath et al. 2009).

- L'Azoospermie : le liquide spermatique ne contient aucun spermatozoïde.

- L'Asthénospermie : elle correspond à un défaut de mobilité des spermatozoïdes qui

éprouvent des difficultés à se déplacer. Il y a normalement au moins 40 % de
spermatozoïdes mobiles dans le sperme. En dessous de ce seuil, on parle
d'asthénospermie.

- La nécrospermie : elle est caractérisée par un pourcentage élevé de spermatozoïdes

morts (> 50 %). Elle est souvent due à des infections.

- La tératospermie : elle correspond à une quantité trop importante de spermatozoïdes

mal formés et témoigne de la présence d'un taux anormalement élevé de
spermatozoïdes anormaux de l'ordre de moins de 50 %.

67
 Problématique
Bien que chacune de ces anomalies puisse exister séparément, elles sont généralement
combinées. On parle alors d’OATS (oligoasthénotératospermie).

Ces anomalies du spermogramme peuvent avoir des causes diverses (Jameson 1981;
Ceccarelli, Canale et al. 2008 ; Matsumoto, Hirose et al. 2008 ; Matzuk and Lamb 2008 ;
Poongothai, Gopenath et al. 2009 ; Shefi, Kaplan et al. 2009; Shefi, Levron et al. 2009 ) :

- des maladies infectieuses : certaines maladies infectieuses ou états inflammatoires,

comme le virus des oreillons, peuvent conduire à une infection des organes génitaux
ou entraîner une inflammation et une atrophie des testicules (Jameson 1981). Environ
25% des hommes ayant contracté les oreillons après leur puberté deviennent infertiles
(Erpenbach 1991).
- des troubles endocriniens : les troubles endocriniens ou hormonaux ne représentent
qu'une faible part (environ 2%-5%) des cas d'infertilité masculine. Une production
insuffisante des hormones contrôlant la sécrétion de testostérone et la production de
spermatozoïdes - l'hormone folliculostimulante et l'hormone lutéinisante - sont les
problèmes les plus courants.

- des problèmes immunitaires : certains hommes produisent des anticorps dirigés

contre leurs propres spermatozoïdes conduisant à une motilité insuffisante de ces
derniers ou à des agglutinations (les spermatozoïdes sont liés entre eux par la tête ou la
queue et incapables de féconder).

- des maladies génétiques :

o Le syndrome de Klinfelter, anomalie chromosomique, qui associe une
atrophie des testicules, une azoospermie (absence de spermatozoides dans
l'éjaculat) et une gynécomastie (McLachlan, Mallidis et al. 1998 ; Paduch,
Bolyakov et al. 2009)}.
o Des micro-délétions du chromosome Y: anomalie des gènes entrant dans la
fabrication des spermatozoïdes. Ces anomalies peuvent résulter d'une
transmission filiale, ou d'un accident lors de la détermination des
chromosomes de l'embryon. Elles pourraient concerner 15% des causes
d'azoospermie (Edwards and Bishop 1997; McLachlan, Mallidis et al. 1998 )
(Exemple : la mutation de l’Aurora kinase C AURKC (Dieterich, Soto Rifo
et al. 2007 ; Harbuz, Zouari et al. 2009) ou la mutation C677T de la
méthylenetetrahydrofolate réductase MTHFR(Singh, Singh et al. 2005)...)

68
 Problématique
o Des Mutations de l’ADN mitochondriale (Diez-Sanchez, Ruiz-Pesini et al.
2003; Diez-Sanchez, Ruiz-Pesini et al. 2003) : anomalies des gènes
mitochondriaux qui induisent une diminution de la production d’ATP,
indispensable à la mobilité spermatique.

Des facteurs liés à l'environnement (Sokol, Kraft et al. 2006) et au mode de vie peuvent
également affecter la qualité des spermatozoïdes. Une exposition à des composés chimiques
tels que les insecticides (Matzuk and Lamb 2008), une consommation excessive d'alcool, une
consommation de tabac (Collodel, Capitani et al. 2009), une exposition à des radiations
(Benoff, Jacob et al. 2000) et certains traitements anticancéreux peuvent inhiber la production
de spermatozoïdes, soit temporairement, soit définitivement. Dans 30% à 40% des cas
d'infertilité masculine, l'origine du problème reste inexpliquée.

Au cours des dernières décennies, de grands progrès ont été accomplis dans le traitement de
l'infertilité masculine et le choix de traitements actuellement disponibles comprend le
traitement médicamenteux, la chirurgie et les techniques d'Assistance Médicale à la
Procréation (AMP), notamment l'insémination artificielle, la fécondation in vitro et les
techniques de microinjection. Cependant, les progrès dans le traitement de l'infertilité
masculine restent à l’heure actuelle encore insuffissant, car sur 60% des embryons qui
peuvent être transféré, seulement 12.3 % des embryons se développe in utéro (Donnée ABM,
France 2005 en FIV humaine).

Si les causes de la baisse de la fertilité mondiale semblent être essentiellement liées à

l'environnement (Benoff, Jacob et al. 2000; Sokol, Kraft et al. 2006 ) et au mode de vie
(Sharpe and Franks 2002), il est essentiel de comprendre tous les mécanismes qui régulent le
pouvoir fécondant du spermatozoïde afin d’optimiser les techniques de procréations
médicalements assistées.

Le développement de nouveaux axes de recherche, expérimentaux et théoriques, pour

identifier les mécanismes sous-jacents de l’infertilité masculine est indispensable.

L’équipe de Inoue a développé une nouvelle stratégie pour identifier de nouveaux partenaires
qui régulent le pouvoir fécondant des spermatozoïdes. Ils ont découvert un nouveau partenaire
protéique « Izumo » impliqué dans la fusion des spermatozoïdes avec l’ovocyte (Inoue, Ikawa
et al. 2005) à partir d’un anticorps, identifié en 1987 par l’équipe d’Okabe, dont on ne
connaissait pas l’antigène, mais dont on savait qu’il est capable d’empêcher la fécondation in

69
 Problématique
vitro (Okabe, Adachi et al. 1987). Leur stratégie a été tout d’abord d’isoler l’antigène par
immunoblotting et d’identifier par spectrométrie de masse de l’anticorps capable d’empêcher
la fécondation in vitro. Ensuite d’identifiée par clonage in silico, à partir de cet antigène, la
protéine spermatique cible de l’anticorps. Cette dernière a été dénommée Izumo. Et enfin de
montrer l’implication d’Izumo dans la fusion des spermatozoïdes avec l’ovocyte avec
-/- -/-
l’élaboration de souris Izumo . Les spermatozoïdes Izumo même s’ils se lient à la
membrane de l’œuf sont incapables de fusionner avec l’ovocyte.

Ces dernières années, d’autres stratégies expérimentales ont été mises en avant pour
comprendre la régulation de mécanismes physiologiques. L’explosion de l’analyse
protéomique, le développement de techniques de séparation et d’analyse toujours plus
performantes et plus sensibles et l’émergence d’une nouvelle discipline : la vénomique (étude
du génome et du protéome des venins) ont permis le développement de nouveaux axes de
recherche fondamentale.

Ainsi, la vénomique a permis de découvrir de nouveaux outils pharmacologiques permettant :

- de mieux comprendre la mise en place de voie de signalisation et les interactions

moléculaires :
• Un exemple est la découverte des toxines nicotiniques (Malany, Osaka et al. 2000)
qui ont permis de mieux comprendre la mise en place de l’influx nerveux. Ces
toxines extraites de venin de serpent agissent sur la membrane post-synaptique et
bloquent l’influx nerveux en se fixant sur le récepteur de l’acétylcholine.

- de mieux comprendre le rôle physiologique de certains canaux ioniques :

• À titre d’exemple, l’ω-conotoxine GVIA (Colledge, Hunsperger et al. 1992)

extraite du venin de Conus geographus, a permis de mettre en évidence
l’implication des canaux de type N (Cav2.2) dans les voies nociceptives afférentes
(Reynolds, Wagner et al. 1986). L’ω-conotoxine GVIA est probablement la
conotoxine la plus utilisée en neuroscience puisque plusieurs centaines de
publications rapportent son utilisation comme outil pharmacologique pour
l’inhibition de la transmission synaptique.

70
 Problématique
- le traitement de certaines pathologies :
• Un exemple frappant est la création et le développement d’un médicament le
Captopril® à partir d’une toxine de venin la Teprotide. Elle a initialement été
extraite du venin du serpent Botrops jararaca (Ondetti, Williams et al. 1971) et
s’est révélée efficace pour le traitement de l’hypertension artérielle et les
insuffisances cardiaques.

- le développement de nouveaux outils de diagnostic :

• Comme par exemple le ProtacTM. Le ProtacTM est un agent pharmaceutique extrait du
venin d’Agkistrodon contortrix. Il permet d’activer artificiellement une
glycoprotéine, la protéine C, qui a un double effet anticoagulant (Marsh 2001). Le
test par le ProtacTM permet de vérifier l’intégrité de cette protéine dont les
défaillances sont à l’origine d’un grand nombre de thromboses (coagulation in vivo
d’une artère ou d’une cavité vasculaire ou cardiaque).

• Ou comme la BotrocétineTM, extraite du venin de serpent Botrops jararaca. La

BotrocétineTM est un puissant agrégant plaquettaire permettant le diagnostic de
plusieurs maladies hémorragiques d’origine génétique telle que la maladie de Von
Willebrandt (Marsh 2001). Cette maladie est caractérisée par le déficit en facteur
de von Willebrandt, indispensable à l’adhésion des plaquettes sanguines.

C’est dans ce contexte, de développement de nouvelles stratégies expérimentales pour la

compréhension des mécanismes de régulation du pouvoir fécondant du spermatozoïde que se
situe ce travail de thèse.

L’objectif de mon travail de thèse est de : comprendre les voies de signalisations qui régulent
la physiologie spermatique à l’aide de nouveaux outils pharmacologiques à partir de venins
d’animaux.

71
Méthodologie
 Méthodologie

Les venins sont composés de plusieurs centaines de molécules chimiques différentes. On y

retrouve essentiellement des peptides et des protéines, mais aussi des enzymes telles que les
phospholipases, les phosphatases et les protéases. Parmi les dizaines, voire les centaines de
constituants d’un venin, le défi est d’aller directement rechercher des toxines d’intérêts
ciblées. La difficulté réside dans le fait de cibler les molécules d’intérêt dans le mélange
complexe.
La stratégie que j’ai employée ici est la recherche de nouveaux outils
pharmacologiques par des tests d’activités biologiques. Cette stratégie comporte de
nombreuses étapes. Le venin étant très complexe, une première étape de fractionnement par
chromatographie est nécessaire. Chacune des fractions obtenues est alors testée sur un modèle
biologique, dans notre cas c’est la mobilité spermatique chez la souris, afin de déterminer si
elle contient ou non une activité intéressante. Dans le cas où le test est jugé positif, la fraction
sélectionnée est purifiée et caractérisée.

II. Fractionnement des venins par chromatographie

La recherche de nouvelles molécules bioactives sur les mouvements flagellaires des
spermatozoïdes a été réalisée à partir d’une banque de 23 venins, fournis par la Société
Latoxan, spécialisée dans la production de venin. Cette banque de venin a été établie en
fonction :

- Des espèces : Sélection des familles où il a déjà été décrit dans la littérature, la
présence de peptides bioactifs envers les canaux ioniques, tels que les serpents,
scorpions et araignées.

- De la zone géographique ex. : Inde, Europe, Pakistan, USA, etc.

Chaque venin a été fractionné par FPLC par l’intermédiaire d’une colonne d’exclusion
Superdex peptide 10/300 GL. La colonne d’exclusion va permettre de fractionner le venin en
fonction de la taille de ses composés et de ne garder que les molécules d’intérêt situées entre
1000 et 15000 Da.
Chacune des fractions obtenues est ensuite testée sur la mobilité spermatique.

II. Modèle biologique : la mobilité spermatique

La mesure des mouvements du spermatozoïde est aujourd’hui automatisée. Elle a été réalisée
par un analyseur de mobilité spermatique CASA (Computeur -Assisted Sperm Analysis).

75
 Méthodologie

Cet appareil permet à l’aide d’une caméra fréquencée à 50 Hz de suivre les mouvements de la
tête du spermatozoïde et d’en déterminer sa trajectoire. De cette trajectoire plusieurs
paramètres vont en être déduits (Figure 37) :

- La VLC : Vitesse curvilinéaire (µm/s).

- L’ALH : L’amplitude de déplacement de la tête (µm).
- La VSL : Vitesse de progression linéaire (µm/s).
- La VAP : Vitesse selon la trajectoire moyenne (µm/s).
- La LIN : Linéarité de la trajectoire (µm).
- La BCF : Fréquence de battement (battement/s).

Cet appareil de mesure de la mobilité spermatique est configuré spécifiquement pour mesurer
les déplacements de la tête des spermatozoïdes de différents types de mammifères tels que les
béliers, les verrats, les rats, les chevaux, les singes, les pigeons, les hommes, etc.…

Figure 37 : Analyse automatique du mouvement spermatique par le système CASA. Cet appareil permet à
l’aide d’une caméra fréquencée à 50 Hz de suivre les mouvements de la tête du spermatozoïde et d’en
déterminer sa trajectoire. De cette trajectoire plusieurs paramètres vont en être déduits : la VAP, la VSL, la
VCL, la STR, la LIN, la BCF et L’ALH.

76
 Méthodologie

Ces appareils permettent de mesurer les mouvements de nombreux spermatozoïdes

simultanément, et analysent de nombreux paramètres différents automatiquement. Avec ce
type d’appareil, il est possible de tester un nombre important de fractions de venins par jour
(entre 5 et 10)

De nombreux rapports montrent des problèmes au niveau de la configuration du logiciel

d’analyse de la mobilité spermatique pour différentes espèces (Smith and England 2001; Cox,
Alfaro et al. 2006). Chaque nouvel utilisateur du système de CASA doit lire tous les
documents publiés sur son espèce d'intérêt et doit avoir un aperçu de tous les problèmes qu'il
peut trouver. Pour certaines espèces, aucune configuration spécifique des déplacements de la
tête des spermatozoïdes n’est caractérisée. C’est la raison pour laquelle, j’ai dû tout d’abord
valider mon système d'analyse par des expériences préliminaires sur des spermatozoïdes de
souris, avant de tester l’activité biologique des différentes fractions de venins. Ces
expériences préliminaires m’ont permis de définir le profil de mobilité spermatique des souris
OF1 (Figure 38).

Figure 38: Paramètres de

mobilité CASA des
spermatozoïdes de souris OF1.

Sur les sept paramètres CASA, que l’appareil m’établissait, j’ai sélectionné seulement deux
paramètres CASA pour mon test d’activité biologique afin de réduire le temps d’analyse du
test. J’ai choisi deux paramètres les plus représentatifs de l’augmentation de la mobilité
spermatique due à la capacitation (Figure 39) : la vitesse curvilinéaire (VCL) et le
déplacement latéral de la tête (ALH).

77
 Méthodologie

Figure 39 : Comparaison des

paramètres CASA de mobilité
spermatique des spermatozoïdes
de souris OF1 capacité et non
capacités in vitro.

78
Résultats
 Résultats

I. Découverte de nouveaux outils pharmacologiques à partir de venins

d’animaux.

1. Introduction

Comme expliqués précédemment, les venins sont composés de plusieurs centaines de

molécules chimiques différentes. On y retrouve essentiellement des peptides et des protéines,
mais aussi des enzymes tels que les phospholipases, les phosphatases et les protéases.
La stratégie que nous avons employé pour trouver de nouveaux outils pharmacologiques est la
recherche de molécules par des tests activités biologiques. Cette stratégie comporte de
nombreuses étapes.

Le venin étant très complexe et une première étape de fractionnement par chromatographie a
était nécessaire. Chacune des fractions obtenues a été testées sur notre modèle biologique, ici
la mobilité spermatique chez la souris, afin de déterminer si elle contient ou non une activité
intéressante. Nous avons pu caractériser et identifier la composition des fractions des venins
qui présentait une activité biologique sur la mobilité spermatique par spectrométrie de masse
MALDI-TOF/TOF avec séquençage de novo en collaboration avec le Dr Michel Seve et
l’ingénieur de recherche Morgane Couvet de la Plate-forme de Protéomique Médicale de
Grenoble. Après avoir identifié les molécules d’intérêts, nous avons pu ensuite évaluer l’effet
de ces molécules sur les différentes étapes de la physiologie spermatique telles que : la
mobilité, la réaction acrosomique, la modification lipidique lors de la capacitation et la
fécondation in vitro, grâce à une collaboration avec le Dr Gérard Lambeau qui nous a fourni
ces molécules.

81
 Résultats

Article 1: sPLA2 from snake venom as a source of molecule modulating sperm

physiology: Phospholipases of the toxic snakes Oxyuranus scutellanus
strongly modulate sperm motility, sperm acrosome reaction and in vitro
fertilization

Jessica Escoffier, Ikram Jemel, Morgane Couvet, Michel Sève, Pierre Ray, Gérard
Lambeau, Michel De Waard and Christophe Arnoult

Article en préparation

83
 Venoms as a source of molecules modulating sperm physiology:
sPLA2s of the snake Oxyuranus scutellatus strongly modulate
sperm motility, sperm acrosome reaction and in vitro fertilization

Jessica Escoffier1,2, Morgane Couvet2,3, Harold de Pommier4, Pierre Ray5,6, Michel Sève2,3,
Gérard Lambeau7,8, Michel De Waard1,2 and Christophe Arnoult1,2*

1 Inserm, U836, Grenoble, F-38000, France ; 2 Univ Joseph Fourier Grenoble, Grenoble, F-
38000, France ; 3 Inserm, U823, Grenoble, F-38000, France ; 4 Latoxan, Valence, F-26000,
France ; 5 CHRU Grenoble, Hop Michallon, UF de Biochimie et Génétique Moléculaire,
Grenoble, F-38000, France ; 6 CNRS, UMR5525, La Tronche, F-38710, France ; 7 CNRS,
UMR6097, Valbonne, F-06560, France ; 8 Univ Nice-Sophia Antipolis, Nice, F-06000,
France.

* Corresponding author
Grenoble Institute of Neurosciences
Equipe 3 “Calcium channels, functions and pathologies”
Bâtiment Edmond J. Safra, Site Santé à La Tronche
BP 170 38042 Grenoble Cedex 9 - France tel: 33 456 520 564
E-mail: [email protected]
 ABSTRACT

We screened on sperm motility the effect of 16 snake venoms cleared of molecules with a
molecular weight above 15 kDa. Venoms known to be rich in neurotoxic sPLA2, like those of
Oxyuranus scutellatus or Daboia russelii, were potent inhibitors of sperm motility. In contrast,
venoms rich in myotoxic sPLA2 like those of Echis carinatus, Bothrops alternatus and
Macrovipera lebetina, were fully inactive. By a proteomic approach, OS1 and OS2, two
sPLA2 of the taipan Oxyuranus scutellatus, were identified in the inhibitory fraction of the
venom. Purified OS1 and OS2 sPLA2 inhibited sperm motility, triggered acrosome reaction
of sperm and induced lipid rearrangements of the plasma membrane. Catalytic activity of OS2
was required to modulate sperm physiology since catalytically inactive mutants of OS2
sPLA2 were inactive. Finally, sperm treated by OS2 were not as competent as control sperm
to induce in vitro fertilization. It is the first report of using toxins to modulate in vitro sperm
physiology.
INTRODUCTION

Since several decades, human reproduction is going downhill and is becoming a real
problem in modern society [1]. Human reproduction decline is due to several causes : societal
causes like the postponed decision of the first pregnancy at a later age of the mother,
environmental causes like endocrine disruptors [2] and obviously hereditary factors [3-5]. As
observed in many pathologies, infertility treatment is weakened by our incomplete knowledge
of sperm physiology and fertilization, especially at the molecular level. The molecular
pathways and the different proteins involved in the three main physiological steps of mature
sperm that are sperm motility, capacitation and acrosome reaction are still the object of active
research [6; 7]. Discovering new molecular pathways and/or proteins involved in the control
of sperm physiology is a necessity. Different strategies have been used to decipher the
molecular mechanisms of sperm physiology like invalidating gene or proteomic analyses.
Another strategy is based on the use of a very specific inhibitor of a cellular sperm function,
and the purification of the targeted protein by using the inhibitor as a bait. This strategy has
been very successful in the ion channels domain: for instance ryanodine, a plant alkaloid,
allowed to characterize a calcium channel of the reticulum, dihydropyridines allowed to
characterized another calcium channel of the tubule T in muscles [8]. In the sperm domain, a
similar approach, using a specific sperm antibody, allowed to characterize a unique protein
involved in sperm-oocyte binding that is izumo [9]. Venoms, as a source of biological active
molecules, have also been used to purify and characterize new proteins. For instance apamin,
a bee toxin, allowed to characterize a Ca2+-activated K+-channel [10]. Several types of
molecules are present in venoms, like proteins, peptides or polyamines and up to 100 different
molecules are present in one venom. Most of the venom compounds are very specific. This
high specificity is illustrated by the property of the toxin ω-AgaIVA, obtained from a spider
venom, which is able to differentiate two spliced variants: ω-AgaIVA inhibiting P-type
channels but in contrast not Q-type channels, two channels resulting from the alternative
splicing of the alpha 1A subunit gene [11]. The specificity of venom compounds is also
illustrated by the fact that several toxins or compounds structurally close of toxins are
currently used as drugs in the treatments of pain, neurological diseases, cancers or
autoimmune disease [12]. Based on the specificity of venoms compounds, we seeked, from a
venom bank, new biologically active molecules on sperm physiology, in order to find new
actors of sperm physiology.
In this paper, we screened venoms of 16 different snakes belonging to different families
(Elapidae, Viperidae, Colubidae) on sperm motility. Crude venoms have been fractioned in
order to remove proteases from the venom samples. We conserved and tested only fractions
containing molecules with a molecular weight (MW) below 15 kDa. Most of the tested
venoms were potent inhibitors of sperm motility except the venoms of Echis carinatus,
Bothrops alternatus and Macrovipera lebetina. The two most potent inhibiting venoms were
those of Oxyuranus scutellatus and Daboia rusellii. We then focused on the most potent
inhibiting fraction from the venom of Oxyuranus scutellatus. By proteomic analysis, we
demonstrated that this fraction is enriched in secreted phospholipase A2 (sPLA2), of which
OS1 and OS2, two neurotoxic sPLA2 [13]. We thus tested the effects of several recombinant
sPLA2, OS1, OS2 and different mutant proteins showing different enzymatic activities, on
sperm motility, sperm acrosome reaction (AR), and in vitro fertilization (IVF). In accord with
result previously obtained with mammalian sPLA2, recombinant OS1 and OS2 toxins were
potent inhibitors of sperm motility, and potent activators of acrosome reaction. However, OS2
sPLA2 did not mimic the improvement of mouse IVF performed by the sPLA2 of the group
X, but inhibited the IVF outcome instead.
MATERIAL AND METHODS

Venom separation —Venoms have been obtained from Latoxan, SA (Valence, France).
100 mg of crude venom was dissolved in 1 ml of 100 mM ammonium acetate and
centrifugated at 10 000 g during 10 min. 250 µl of the supernatant was used in the separation
stage. Separation of the different compounds of the venom was performed with a superdexTM
peptides 10/300 GL column: each fraction of 500 µL was frozen after collection. Fractions
containing molecules with a MW above 15 kDa were discarded (fraction A1 to A8). For the
screening procedure, we first pooled fractions A9-B4 to test global activity. The pooled
fraction corresponds to the addition of 100 µL of fractions A9 to B4. It was lyophilized and
re-suspended in 120 µL of M16 medium.

Computer-assisted motility analysis — Sperm cells from caudae epididymes were allowed to
swim in 1 ml of M2 medium for 10 min. Sperm was re-suspended in M16 and incubated with
different test fractions at 37°C for 10 min (247.5 µL of sperm were incubated with a aliquot of
12.5 µL of the test fraction). After incubation, the sperm suspension was immediately placed
onto analysis chamber (2X-CEL Slides, 100 µm depth, Leja Products B.V., Netherlands) kept
at 37 °C for microscopic quantitative study of sperm movement. Sperm motility parameters
were measured at 37°C using a sperm analyzer (Hamilton Thorn Research, Beverley). The
settings employed for analysis were as follows: acquisition rate: 60 Hz; number of frames:
100; minimum contrast: 25; minimum cell size: 10; low static-size gate: 2.4; high static-size
gate: 2.4; low static-intensity gate: 1.02; high static-intensity gate: 1.37 ; minimum elongation
gate: 12; maximum elongation gate: 100; magnification factor: 0.70. The motility parameters
measured were: curvilinear velocity (VCL) and amplitude of lateral head displacement
(ALH). A minimum of 100 motile spermatozoa for each sample were analyzed.

Proteomic analysis — In order to increase the sequence coverage of identified proteins, 3

experiments were performed with 2 distinct chromatography gradients and 3 mass
spectrometry methods. Protein samples (experiment 1 and 2: 21µL, experiment 3: 10µL) were
dried by vacuum centrifugation and resuspended in 50 mM ammonium bicarbonate (pH 8),
denatured with 2% SDS, reduced with 45 mM DTT (50°C for 30 min) and alkylated with 100
mM IAA at room temperature for 40 min. The protein mixture was then digested by addition
of a trypsin solution (Porcine modified, Promega) at 1:20 (experiments 1 and 2) and 3:20
(experiment 3) ratio (w/w), and incubated overnight at 37°C. Protein digests were dried by
vacuum centrifugation and resuspended in 20 µL of buffer A (2% acetonitrile in water with
0.05% TFA). 3 µL of the resulting sample were first loaded on a 300 µm i.d. × 5 mm C18
PepMap 5 µm, 100 Å precolumn cartridge (Dionex) for desalting and concentration and then
back-eluted onto the 75 µm i.d. x 15cm C18 PepMap column, 3 µm, 100 Å (Dionex). The
flow rate through the column was set to 300 nL/min. The buffers being used were: A = 2%
acetonitrile in water with 0.05% TFA and B = 80% acetonitrile in water with 0.04% TFA.
Peptides were separated using the following gradient: (i) experiments 1 and 3: 0-5 min 0-10%
(v/v) B, 5-45min 10-42% (v/v) B, 45-55min 42-58% (v/v) B, 55-65min 90% (v/v) B and then
re-equilibrated 65-80min 100% (v/v) A; (ii) experiment 2: 0-5 min 0-10% (v/v) B, 5-40min
10-42% (v/v) B, 40-55min 42-90% (v/v) B, 55-70min 90% (v/v) B and then re-equilibrated
70-85min 100% (v/v) A. The eluent was spotted directly onto a blanck MALDI target plate
(Applied Biosystems) using a Probot Micro Fraction Collector (Dionex) collecting 15 second
fractions. The eluent was mixed 1:3 (v/v) post-column with 2 mg/mL HCCA in 70%
acetonitrile and 0.1% TFA. MALDI analyses were performed on a 4800 MALDI-TOF/TOF
instrument (Applied Biosystems). The instrument was operated in positive ion mode and
externally calibrated. MS spectra from m/z 750–3500 were acquired for each spot. For each
sample spot, maximum 15–20 peptides were selected (only peptides above a S/N threshold of
50) for fragmentation, starting with the strongest (experiments 1 and 3) or weakest
(experiment 2) peptide. MS/MS spectra were collected at the most intense point of the
chromatographic elution profile, using air as the collision gas and a collision energy of 1kV.
For protein identification, all MS/MS data obtained (experiments 1, 2 and 3) were submitted
to ProteinPilot 2.0.1 software program (Applied Biosystems) using the Paragon protein
database search algorithm , with trypsin as the digestion agent, cysteine modification by
iodoacetamide and Rapid ID as search Effort. Searches were performed against the NCBI
protein database (update 05-10-2009), limited to Oxyuranus scutellatus sequences. Only
proteins identified with at least 95% confidence, or a ProtScore of 1.3, were reported.

Production of recombinant sPLA2s —Native OS1 and OS2 sPLA2s from Oxyuranus
scutellatus scutellatus (Taipan) snake venom and native Ba-II and Ba-IV K-49 sPLA2-like
proteins from Bothrops asper venom were purified as described [14; 15]. Recombinant wild
type OS2 and its catalytically-inactive mutants were prepared as described previously [13].
Acrosome reaction assay — Sperm cells from caudae epididymes were allowed to swim in
M2 medium for 10 min. If necessary, sperm were capacitated in M16 medium with 2% fatty
acid free BSA (Bovine Serum Albumin) at 37°C in a 5% CO2 incubator during various
periods of time. For sPLA2 treatment, sperm were incubated with sPLA2 in M16 medium at
37°C for the last 10 min. Cells were transferred in PBS solution and then fixed with 4% PFA
solution for 2 min. Sperm were washed with 100 mM ammonium acetate for 2 min and wet-
mounted on slides and allowed to air dry. Slides were then rinsed with water and stained with
Coomassie blue (0.22%) for 2 min and finally rinsed with water. Slides were counted
immediately and 150 sperm cells at least were scored per slide.

Confocal microscopy — Control untreated sperm cells (non capacitated or capacitated during
35 min in 2% BSA 5% C02) or equivalent treated sperm (10 min in the presence of 200 nM
OS2-sPLA2) were washed twice in PBS and transferred in a staining buffer (10mM
HEPES/NaCl, 0.14 M NaCl and 250 nM CaCl2, pH=7.4) containing both carboxufluorescein
diacetate (6-CFDA) and 1 µg/mL of annexin V-Cy3 for 15 min in the dark at room
temperature. After incubation with annexin V-Cy3, the sperm suspension was washed twice
with the binding buffer. Sperm cells were then fixed in 4% PFA and annexin-V staining was
measured using a confocal microscope (Leica).

Chemical compounds — M2 and M16 medium, low fatty acid BSA (fraction V) and Annexin
V-Cy3 (from Apoptosis dectection kit) were purchased from Sigma.
 RESULTS

sPLA2s from venoms inhibit sperm motility

We tested on sperm motility 16 different venoms from snakes belonging to different Families
(Elapidae, Crotalidae and Colubidae) and coming from different continents (South and North
America, Asia, Africa). First, the venoms were separated by size exclusion chromatography
and fractions containing large proteins of the venom were discarded, in order to remove
proteases, known to be present in snake venoms (figure 1A). Fractions containing proteins
above 15 kDa were spotted by calibrating the column with standart proteins (cytochrom C,
aprotinin and vitamin B12). A western blot was preformed to check that proteins above 15
kDa were absent of the fractions of interest (not shown). Second, a two-step screening
protocol was developed to test venoms. First, we tested in one shot all collected fractions from
a venom and thus containing all the compounds of the venom below 15 kDa. Second, we
focused on the most inhibiting venom and tested individually the different collected fractions.
In order to test the potency of the fraction of interest of each venom on sperm physiology, we
first evaluated the effect of the venom on sperm motility using a CASA system. We focused
more particularly on two sperm motility parameters, the VCL corresponding to Curvilinear
Velocity (microns/sec) and the ALH corresponding to Amplitude of Lateral Head
Displacement (microns). Figure 1B presents the effect of the 16 tested venoms on non
capacitated sperm incubated during 10 min with the pooled fractions (A9-B4) of low MW of
the different venoms. Two venoms were particularly potent by decreasing sperm VCL by
around 50%: the venoms of Daboia rusellii and Oxyuranus scutellatus. On the other side,
other venoms were inactive like venoms from Echis carinatus, Bothrops alternatus and
Macrovipera lebetina. In between very potent and inactive venoms, the other venoms
presented intermediate sperm toxicity. In order to determine the compounds involved in
sperm motility decrease, we tested individually the different fractions of Oxyuranus
scutellatus. The first fraction of interest, named A9, and corresponding to the compounds with
the heaviest molecular weight (10-15 kDa), was the most potent and decreased the VCL by
more that 30% (Figure 1C). The compounds present in this fraction was thus likely
responsible of the sperm mobility toxicity. Then, we analysed the composition of the A9
fraction with a proteomic approach. 16 non-redundant proteins were identified with at least
95% confidence (Table 1). Redundancy between proteins identified is minimized using a
grouping function, which assigns an "unused score" to the peptides that are unique to a
protein or group of redundant proteins. Thus, OS2 is a competitor protein of PLA-7 precursor
because it has nearly all the same peptides as PLA-7 precursor but has no peptides distinct
from it. Similarly OS1 is a competitor protein of PLA-1 precursor / OS5 precursor. We then
focused on the two proteins having the highest number of identified peptides that were two
sPLA2, named OS1 and OS2 and their precursors (Table 1). Based on our results on
mammalian sPLA2 [16], OS1 and OS2 represented putative molecules able to modulate
sperm motility. This hypothesis was tested by testing purified or recombinant OS1 and OS2
sPLA2 on sperm mobility. Ten min. incubation with OS1 and OS2 at a concentration of 200
nM modified the tracks of head sperm recorded by CASA system (figure 2A). The two sperm
motility parameters VCL and ALH were decreased by both compounds (figure 2B-C), with
OS2 being more potent that OS1. Very low concentrations of OS2 as 0.2 nM were able to
modify sperm VCL.

Catalytic activity is necessary for venom sPLA2 effects on sperm motility.

sPLA2 are relatively small proteins with a MW in between 13 and 18 kDa and have a
relatively well conserved structure whatever their species origin, with 5 to 8 disulfide bonds.
sPLA2 enzymes are characterized by their ability to hydrolyse the sn-2 ester of glycero-
phospholipids of the extracellular leaflet of the plasma membrane in two components, a fatty
acid (FA) and a lysophospholipid (LysoPL). sPLA2 from snake venoms are further divided in
catalytic or non catalytic enzymes against phospholipids, in function of the nature of the
amino acid number 49: D49-sPLA2 are highly catalytic active whereas K49-, S49- or N49
present low or no hydrolytic activity but strong myotoxic activity instead. Moreover, toxic
sPLA2 have two modes of action: an enzymatic mode where they hydrolyse phospholipids
[17] or/and a ligand mode where they act as agonists for specific lectin receptors [18]. The
mechanism of action of neuro-toxicity of sPLA2 is still an open question. Some publications
highlight the important role of sPLA2 metabolites, that are fatty acids and LysoPL in the
neurotoxic effect at presynaptic level [19]. In the other hand, the binding of OS2 on its
receptor plays also an important role in neurotoxicity [13; 18]. We thus wondered if
enzymatic activity was required for sperm motility modulation by sPLA2 from venom origin.
First, we tested a mutated OS2, with a substitution of one amino acid in its enzymatic pocket,
H48Q, leading to a complete loss of the enzymatic activity [13; 20]. In figure 3, we show that
the mutated OS2 was unable to affect sperm VCL (figure 3A). We also tested a chimeric OS2,
whose its C-terminal domain (AA 109-128) has been substituted by the C-terminal domain of
OS1. This chimera loses its specific enzymatic activity but retains most of the neurotoxicity
of the wild type OS2 enzyme [13]. The chimera was also unable to decrease sperm motility.
The screening experiment of snake venoms has showed that several venoms like those from
Echis carinatus, Bothrops alternatus and Macrovipera lebetina were inactive. The two first
venoms are characterized by the presence of a high level of myotoxic sPLA2s [15; 21; 22],
characterized by a mutation at amino acid 49 and leading to a strong decrease of its catalytic
activity. We tested two purified sPLA2-like enzymes BaII-K49 and BaIV-K49, both
myotoxins from the venom of Bothrops asper. These enzymes were totally inactive on sperm
motility (figure 3B), Finally, a mutated OS2, presenting the substitution D49K and mimicking
myotoxic sPLA2, was also fully inactive on sperm motility (figure 3B). All together, these
results confirm the importance of the catalytic activity of OS1 and OS2 in decreasing sperm
motility.

OS1 and OS2 are very potent activators of acrosome reaction

Mammalian phospholipase of the group X is able to induce acrosome reaction (AR) of mouse
sperm whatever is their level of capacitation [16]. We thus tested the potency of OS1 and OS2
to induce also AR. Figure 4 shows the dose-response curves of AR induced by these two
sPLA2. Again, OS2 is more potent than OS1. It is important to notice, that only a fraction of
the sperm subpopulation is sensitive to sPLA2. Indeed, concentrations above 100 nM did not
produce more AR of treated sperm, and around 40% of the sperm population is resistant to the
OS2 treatment. This result confirms earlier findings suggesting that sperm plasma membrane
composition is heterogeneous [16].

OS2 treatment does not impair sperm viability

Venoms are known to produce tissues lysis and cell death. We thus wonder if the effect of
OS2 on sperm motility was due to the death of a subpopulation of sperm. To test this
hypothesis, we first measured the speed distribution of sperm treated with OS2 in comparison
to the speed distribution of a control population. Figure 5A shows the speed distribution of
OS2 treated sperm in comparison to this one of control sperm. The distribution of the OS2-
treated sperm is characterized by the absence of fast sperm, i.e. sperm with a VCL above 200
µm/s, and by an over-representation of the slow sperm subpopulation, i.e. sperm with a VCL
in between 50-100 µm/s. On the other hand, OS2 treatment did not increase the immotile
subpopulation (0-10 µm/s). The fact that most of the treated cells were still motile after
treatment suggests that OS2 did not induce a fast cell death responsible of the measured effect
on sperm motility. To confirm this result, we loaded OS2 treated sperm with 6-
carboxufluorescein diacetate (6-CFDA), a compound entering freely into cells and producing
green fluorescence after de-esterification by endogenous non-specific esterases, only in living
cells. Figure 5B shows OS2 treated sperm cells subsequently incubated with 6-CFDA: most
of the cells present a strong green fluorescence, a hint that OS2 treatment did not induce a cell
death. Finally we measured phosphatidylserines staining via annexin-cyanin-3 binding before
and after OS2 treatment, as a hint of the modifications of the lipid composition of the plasma
membrane. It is important to point out that in sperm cells, externalization of
phosphatidylserines occurs naturally during capacitation and is not considered as a hint of
apoptosis. As expected from mammalian sPLA2 [23], OS2 induced on non-capacitated sperm
a strong externalization of phosphatidylserines at the plasma membrane (figure 5C). This
result suggests that OS2 treatment produces a lipid reorganization of the plasma membrane
similar to this one occurring during the capacitation event.

OS2 treatment impairs the fertilization potential of sperm

We have demonstrated that OS1 and OS2 are potent modulators of sperm physiology,
inhibiting sperm motility, triggering sperm AR and producing a lipid reorganization of the
plasma membrane. We demonstrated previously that treating sperm with the mammalian
sPLA2 belonging to the group X increases in vitro fertilization outcome and we wondered if
OS2 may modulate IVF. To address this possibility, we treated capacitated sperm briefly with
20 or 200 nM OS2 during 10 min before sperm were introduced within oocytes (figure 6A).
24 hours after fertilization, the rate of oocytes reaching the 2-cell embryo stages were counted
and compared to IVF realized with the same untreated sperm and oocytes from the same pool
(figure 6B). None of these two concentrations improved the IVF outcomes, but rather
decreased it (figure 6C).
 DISCUSSION

In this manuscript, we have demonstrated that the fractions containing molecules

below 15 kDa of most of the snake venoms inhibit sperm motility. Moreover, we have
demonstrated by size exclusion chromatography that the inhibiting activity of the venom of
Oxyuranus scutelattus on sperm motility is mostly due to the fraction containing molecules
with a MW around 15 kDa (10-15 kDa). By a proteomic approach and purified toxins, the
effects of the active fraction of Oxyuranus scutelattus were likely due to the neurotoxic
sPLA2 OS1 and OS2. Indeed, purified or recombinant OS1 and OS2 sPLA2 inhibited sperm
motility. Moreover, we demonstrated that OS1 and OS2 activities on sperm motility are due
to their enzymatic activity on phospholipids, since several types of enzymatically inactive
mutants were unable to modulate sperm motility. However several venoms were unable to
modulate sperm motility and more particularly venoms from Echis carinatus, Bothrops
alternatus and Macrovipera lebetina. These venoms are rich in specific myotoxic sPLA2,
which are characterized by a mutation in the amino acid 49, leading to a loss of their
enzymatic activity. Moreover purified sPLA2-like enzymes BaII-K49 and BaIV-K49, both
myotoxins from the venom of Bothrops asper, were totally inactive on sperm motility. All
together, these results suggest that the potency of a snake venom to decrease sperm motility is
directly dependent to the catalytic activity of the sPLA2s present in the venom. However, we
want to point out that the inhibiting or activating effects of other compounds present in the
venom may be covered by our screening procedure using pooled fractions and the strong
inhibitory effect of sPLA2 on sperm motility. Compounds with activating effects seem to be
present as suggested by the activating effect of fraction B1 of Oxyuranus scutellatus. Secreted
PLA2s are separated in ten different groups, namely I, II, III, V, IX, X, XI, XII, XIII and XIV
sPLA2. A large variety of sPLA2 are found in venom of different animals like insect
(Hymenoptera), scorpions and snake. Toxic sPLA2 belong to three different groups: sPLA2
from Elapidae and Hydrophidae snakes Families belong to the group IA, sPLA2 from
Crotalidae and Viperidae snakes Families belong to the group IIA and sPLA2 from insects of
the Hymenoptera Order belong to the group IIIA. We did not observe a difference of activity
between sPLA2 of the group IA and IB since the two most active venoms were those of
Oxyuranus scutellatus, of which sPLA2 belong to the group IA and Daboia rusellii of which
sPLA2 belong to the group IIB. The diversity of sPLA2 of snake venoms is particularly rich
and a snake venom can contain up to 15 different sPLA2s, with different pattern of enzymatic
activity and toxicity [24]. As suggested by the different potencies of the snake venoms, we
demonstrated that two different sPLA2 OS1 and OS2 presented marked difference in their
ability to inhibit sperm motility, OS2 being 10 times more potent than OS1. Recently, a
complex named “reprotoxin” and containing a sPLA2 was found to induce atrophy of testis
when injected at sub-lethal dose [25]. Our results show that sperm membrane composition are
deeply affected by OS2 and may lead to cell apoptosis, and thus main explain testis atrophy.

These results highlight the importance of sPLA2 as modulator of sperm physiology. Indeed,
mammalian secreted phospholipase A2 (sPLA2) are widely expressed in male reproductive
tissues and are likely involved in a large set of biological functions [26; 27]. Recently, we
showed that some mammalian secreted phospholipase A2 (sPLA2), and more particularly
sPLA2 belonging to group X, control specifically key events of mouse sperm physiology that
are sperm motility [23] and acrosome reaction [16]. This study confirms that changing the
sperm plasma membrane composition, and more particularly phospholipids via sPLA2
enzymatic activity has important physiological consequences in term of sperm motility,
capacitation and acrosome reaction. It is important to point out that the strong decrease of
sperm motility was not due to a loss of cell viability since treated sperm with OS2 were still
able to hydrolyse the fluorescent probe by non-specific esterases. The decrease of sperm
motility was likely related to the change of the composition of the plasma membrane, as
demonstrated by the change in annexin-V staining after OS2 treatment. This result supports
the idea that phospholipids are important for sperm motility as suggested by the knock-out of
the gene of internal PLA2 VIA (iPLA2β), which leads to a severe motility phenotype [28].
OS1 and OS2 were also very potent inducers of acrosome reaction, with marked effect from
0.2 nM for OS2. Interestedly, the potent OS2 sPLA2 was unable to trigger AR in the whole
sperm population even at very high concentrations, and more than 30-40% of sperm are fully
resistant to its action. This result is in accordance with the results obtained with group X
sPLA2 and confirms that a subpopulation of sperm is not sensitive to sPLA2 action, in regard
to acrosome reaction. This point highlights the heterogeneity of sperm population [29; 30] and
the great importance of sperm sorting, especially in ART, where a physiological sorting is
absent [31]. Finally, we have previously shown that mammalian sPLA2 of the group X is able
to improve the rate of success of in vitro fertilization (IVF) in mouse and this result suggest
that sPLA2 activity may be used as a therapeutic compound in infertility treatment. The fact
that venom sPLA2 are able to modulate sperm physiology, allows speculating that different
sPLA2 may have more potent effect on IVF, than mGX. Although these snake enzymes were
able to strongly modulate sperm physiology, they were unable to mimic the advantageous
action of the mammalian sPLA2 of the group X on the yield of IVF. We have tested several
mammalian sPLA2 (unpublished data) and none of these enzymes were also able to reproduce
the beneficial effect of the sPLA2 of the group X. The absence of beneficial effect on mouse
IVF of the different sPLA2 tested is likely related to specific enzymatic activity of each
sPLA2, characterized by the types of phospholipid hydrolyzed, the kinetic of hydrolysis and
its capacity to bind on a specific plasma membrane in function of the cell curvature [17].
Altogether, these results suggest that the effect of sPLA2 of the group X on mouse IVF
outcome is more specific than its effect on sperm motility.

Acknowledgments
We are grateful to J.M. Gutiérrez (San José, University of Costa Rica) for providing us Ba-II
and Ba-IV sPLA2s. This work was supported in part by the Région Rhône-Alpes (to C.A.),
CNRS (to C.A. and G.L.), INSERM (M.D.W.), the Association pour la Recherche sur le
cancer [grant 3977] and the Agence Nationale de la Recherche (to G.L.). J.E. is supported by
a fellowship by the Région Rhône-Alpes.
N Unused Total %Cov Accession Name Species
1 28,40 28,40 70,55 gi|71066730 PLA-7 precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
OS2=secretory phospholipase A2 [Oxyuranus scutellatus=Taipan snakes, ssp.
1 0,00 26,40 84,03 gi|913014 Oxyuranus scutellatus
scutellatus, venom, Peptide, 119 aa]
2 16,54 16,54 64,94 gi|71066720 PLA-1 precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
2 0,00 16,54 64,94 gi|66475088 OS5 precursor [Oxyuranus scutellatus scutellatus] Oxyuranus scutellatus scutellatus
OS1=secretory phospholipase A2 [Oxyuranus scutellatus=Taipan snakes, ssp.
2 0,00 16,00 73,23 gi|913013 Oxyuranus scutellatus
scutellatus, venom, Peptide, 127 aa]
3 13,57 13,57 65,06 gi|71066802 SNTX-1 precusor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
RecName: Full=Short neurotoxin 1; Short=SNTX-1; AltName: Full=Toxin 3; Flags:
3 0,00 13,57 65,06 gi|123910874 Oxyuranus scutellatus scutellatus
Precursor
3 0,00 13,52 57,83 gi|66475096 toxin 3 [Oxyuranus scutellatus scutellatus] Oxyuranus scutellatus scutellatus
3 0,00 12,00 67,74 gi|254772678 RecName: Full=Short neurotoxin 2; Short=SNTX-2 Oxyuranus scutellatus scutellatus
taicatoxin serine protease inhibitor component [Oxyuranus
4 10,69 10,69 91,94 gi|263546 Oxyuranus scutellatus
scutellatus=Australian taipan snakes, ssp. scutellatus, venom, Peptide, 62 aa]
5 10,00 14,00 57,93 gi|71066718 beta taipoxin variant 1 precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
5 0,00 14,00 57,93 gi|66475082 beta taipoxin precursor [Oxyuranus scutellatus scutellatus] Oxyuranus scutellatus scutellatus
5 0,00 14,00 71,19 gi|129435 RecName: Full=Phospholipase A2 homolog, taipoxin beta chain Oxyuranus scutellatus scutellatus
6 10,00 14,00 44,52 gi|66475084 alpha taipoxin-2 precursor [Oxyuranus scutellatus scutellatus] Oxyuranus scutellatus scutellatus
7 8,01 8,01 40,22 gi|254772668 RecName: Full=Long neurotoxin 1; Short=LNTX-1; Flags: Precursor Oxyuranus scutellatus scutellatus
7 0,00 8,01 40,22 gi|118151706 LNTX-1 precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
RecName: Full=Phospholipase A2, taipoxin alpha chain; AltName:
8 6,89 14,89 70,59 gi|129413 Oxyuranus scutellatus scutellatus
Full=Phosphatidylcholine 2-acylhydrolase
9 6,00 26,00 69,86 gi|66475090 OS6 precursor [Oxyuranus scutellatus scutellatus] Oxyuranus scutellatus scutellatus
9 0,00 24,00 68,49 gi|66475092 OS7 precursor [Oxyuranus scutellatus scutellatus] Oxyuranus scutellatus scutellatus
10 6,00 10,00 56,82 gi|239977265 RecName: Full=Venom protease inhibitor 1; Flags: Precursor Oxyuranus scutellatus scutellatus
RecName: Full=Taicatoxin, serine protease inhibitor component; Short=TCX;
10 0,00 10,00 56,82 gi|239938649 Oxyuranus scutellatus scutellatus
Flags: Precursor
10 0,00 10,00 56,82 gi|185533608 taicatoxin serine protease inhibitor precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
10 0,00 10,00 56,82 gi|129919019 venom protease inhibitor precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
10 0,00 10,69 62,50 gi|239977272 RecName: Full=Venom protease inhibitor 2; Flags: Precursor Oxyuranus scutellatus scutellatus
10 0,00 10,69 62,50 gi|129919043 venom protease inhibitor precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
11 4,96 4,96 75,00 gi|348613 alpha-neurotoxin-like taicatoxin component - Australian taipan (fragment) Oxyuranus scutellatus scutellatus
taicatoxin alpha-neurotoxin-like component {N-terminal} [Oxyuranus
11 0,00 4,96 75,00 gi|263548 scutellatus=Australian taipan snakes, ssp. scutellatus, venom, Peptide Partial, Oxyuranus scutellatus
28 aa]
12 4,00 4,00 53,33 gi|71725729 venom natriuretic peptide OsNP-d precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
12 0,00 4,00 53,33 gi|123916490 RecName: Full=Natriuretic peptide OsNP-d; Flags: Precursor Oxyuranus scutellatus scutellatus
RecName: Full=Peptide TNP-b; AltName: Full=Taipan natriuretic peptide;
12 0,00 4,00 29,73 gi|189047090 Oxyuranus scutellatus scutellatus
AltName: Full=Venom natriuretic peptide OxsSNPb; Flags: Precursor
RecName: Full=Peptide TNP-b; AltName: Full=Taipan natriuretic peptide;
12 0,00 2,00 88,57 gi|32363244 Oxyuranus scutellatus canni
AltName: Full=Venom natriuretic peptide OxsSNPb
RecName: Full=Peptide TNP-a; AltName: Full=Taipan natriuretic peptide;
12 0,00 2,00 88,57 gi|32363241 Oxyuranus scutellatus canni
AltName: Full=Venom natriuretic peptide OxsSNPa
RecName: Full=Peptide TNP-a; AltName: Full=Taipan natriuretic peptide;
12 0,00 2,00 88,57 gi|32363240 Oxyuranus scutellatus scutellatus
AltName: Full=Venom natriuretic peptide OxsSNPa
RecName: Full=Peptide TNP-c; AltName: Full=Taipan natriuretic peptide;
12 0,00 2,00 28,21 gi|32363246 Oxyuranus scutellatus canni
AltName: Full=Venom natriuretic peptide OxsSNPc
13 4,00 4,00 37,35 gi|239977119 RecName: Full=Scutellin-3; Flags: Precursor Oxyuranus scutellatus scutellatus
13 0,00 4,00 37,35 gi|185534290 scutellin-3 precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
13 0,00 4,00 37,35 gi|157683297 scutellin-3 precursor [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
14 2,00 4,00 29,73 gi|66475094 natriuretic peptide [Oxyuranus scutellatus scutellatus] Oxyuranus scutellatus scutellatus
RecName: Full=Peptide TNP-b; AltName: Full=Taipan natriuretic peptide;
14 0,00 4,00 29,73 gi|189047090 Oxyuranus scutellatus scutellatus
AltName: Full=Venom natriuretic peptide OxsSNPb; Flags: Precursor
15 2,00 4,00 12,50 gi|66475086 gamma taipoxin-2 precursor [Oxyuranus scutellatus scutellatus] Oxyuranus scutellatus scutellatus
RecName: Full=Phospholipase A2, taipoxin gamma chain; AltName:
15 0,00 4,00 14,29 gi|129446 Oxyuranus scutellatus scutellatus
Full=Phosphatidylcholine 2-acylhydrolase
16 2,00 2,00 3,27 gi|145982762 scutellatease-1 [Oxyuranus scutellatus] Oxyuranus scutellatus
Table 1: list of identified proteins in the fraction 9 of Oxyuranus scutellatus
N: rank of the specified protein relative to all other proteins in the list of detected proteins.
Unused (ProtScore): measure of the protein confidence for a detected protein, calculated
from the peptide confidence for peptides from spectra that have not already been completely
"used" by higher scoring winning proteins. Total (ProtScore): measure of the total amount of
evidence for a detected protein. The Total ProtScore is calculated using all of the peptides
detected for the protein. % Cov (% Coverage): number of amino acids matching to at least
one identified peptide divided by the total number of amino acids in the protein sequence,
expressed as a percentage. Accession: accession number for the protein. Name: name of the
protein. Species: species for this protein.
Figure 1: Snake venoms modulate sperm motility
A. Venoms have been separated by size exclusion chromatography and fractions containing
molecules above 15 kDa (A1-A8) have been discarded and not tested. Example of the
separation of the crude venom of Oxyuranus scutellatus (blue curve). A calibration run using
cytochrom C (12.3 kDa), aprotinin (6.5 kDa) and vit B12 (1.8 kDa) is presented (red curve).
Fractions of interest, corresponded to fraction A9-B4, were pooled in the global activity test
presented in panel B of figure 1 B. Global activity test of 16 different venoms on sperm
motility (VCL) performed with pooled fractions (A9-B4), containing molecules below 15
kDa. C. Effect of the different fractions of Oxyuranus scutellatus on sperm motility.
Figure 2: OS1 and OS2, two sPLA2s of the venom of Oxyuranus scutellatus inhibit
sperm motility
A. Tracks of the position of the head of non capacitated sperm measured by a CASA system
in three conditions: control (non treated) sperm, sperm treated with OS1 sPLA2 and sperm
treated with OS2 sPLA2. B. Dose-response curves corresponding to the inhibition of VCL
and ALH by the two sPLA2 OS1 and OS2.
Figure 3: Inhibition of sperm motility by OS2 is dependent of its enzymatic activity
A. Comparison of the effect of OS1, OS2, OS2-H48Q (catalytically inactive mutant) and
OS2-Cter (catalytically inactive OS2-OS1 chimera) on sperm motility at 200 nM. B.
Comparison of the effect of different myotoxins (BaII-K49 and BaIV-K49 are both myotoxins
from the venom of Bothrops asper) and OS2-D49K (catalytically inactive mutant) on sperm
motility.
Figure 4: OS2 is a potent activator of acrosome reaction
A. Image of non capacitated control sperm: most sperm are non-acrosome reacted and exhibit
dark staining in the apical head (arrows). B. Image of sperm incubated 10 min in the presence
of 200 nM OS2: most sperm are acrosome reacted, as indicated by the absence of a stained
region in the apical head (black arrows). Note that some sperm are not acrosome reacted
(white arrows) C. Dose response curves corresponding to the acrosome reaction triggered by
OS1 and OS2.
Figure 5: OS2 does not induce a sperm death and trigger externalization of
phosphatidylserine.
A,B. Distribution of the different subpopulations of sperm in function of the VCL or ALH of
non treated sperm (control red bars) and OS2-treated sperm (black bars). C,D. Image of non-
capacitated sperm incubated in the presence of carboxufluorescein diacetate (6-CFDA) for 15
min, after a 10 min pre-incubation with control medium (C) or in the presence of 200 nM OS2
(D). E,F. Image of non-capacitated sperm incubated in the presence of annexin-V for 15 min,
after a 10 min pre-incubation with control medium (E) or in the presence of 200 nM OS2 (F).
Figure 6: OS2 inhibits in vitro fertilization
A. Schematic drawing of typical IVF experiment. Sperm were first capacitated for 35 min in
M16-2% BSA and then incubated for the last 10 min with M16 medium containing 20 nM or
200 nM OS2. After treatment, sperm were washed by centrifugation to remove unbound OS2,
putative catalytic products and all acrosomal compounds released during sPLA2-induced AR.
Finally, washed sperm were introduced into droplets containing oocytes (20-85 oocytes per
experiment). After 4 hours of gamete mixing, unbound sperm were washed away and IVF
outcomes were scored at 24 h. B. Pictures of the different stages obtained after IVF at 24
hours: unfertilized oocytes; 2-cell embryos (normal development); aborted embryos
corresponding to oocytes with either multiple and uncontrolled divisions or presenting a
second polar body (2 PB) but no cell division (not shown). C. outcomes of in vitro
fertilization performed either with control sperm or with sperm treated briefly with 20 or 200
nM OS2.
 Reference List

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27. Sato H., Taketomi Y., Isogai Y., Miki Y., Yamamoto K., Hosono T., Arata S., Ishikawa Y., Ishii T.,
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31. Grunewald S., Reinhardt M., Blumenauer V., Said T.M., Agarwal A., Abu H.F., Glander H.J. & Paasch
U. (2008) Fertil.Steril.
 Résultats

2. Discussion

Afin de trouver de nouveaux outils pharmacologiques qui régulent la physiologie

spermatique, nous avons testé l’effet de fractions biologiques, obtenues à partir de 16 venins
de serpent appartenant à des familles différentes (élapidé, vipéridés, Colubidé), sur la mobilité
spermatique. Nous nous sommes concentrés sur les fractions les plus actives obtenues à partir
du venin de serpent Oxyuranus Scutellatus. L’analyse protéomique des fractions actives du
venin de serpent Oxyuranus scutellatus, nous a permis d’identifier deux composés
majoritaires : deux sPLA2, nommées OS1 et OS2.

Après avoir identifié les sPLA2 comme les molécules actives sur la mobilité spermatique, par
analyse protéomique, nous avons ensuite évalué l’effet des sPLA2 de venin sur les différentes
étapes de la physiologie spermatique (mobilité, réaction acrosomique et FIV), par
l’intermédiaire du Dr Gérard Lambeau qui nous a fourni les sPLA2 de venin (OS1 et OS2).

Utilisation des sPLA2 purifiées et des formes recombinante de OS2 nous a permis de mettre
en évidence que :

- OS1 et OS2 sont de puissants inhibiteurs de la mobilité spermatique (diminution de

40 % de la mobilité), de puissants activateurs de la réaction acrosomique
(augmentation de 60 % de RA) et de puissants inhibiteurs de la fécondation in vitro
(diminution d’environ 34 % du taux de FIV).

- La modulation de la mobilité spermatique par OS2 est effectuée via son activité
enzymatique, car les isoformes inactifs d’OS2, OS2-H48Q et OS2 C-term, ont été
incapables de moduler la mobilité des spermatozoïdes.

- La diminution de la mobilité spermatique par OS2 n’est pas liée à une perte de la
viabilité des spermatozoïdes, mais à une modification de la composition lipidique de la
membrane plasmique.

La recherche de nouveaux outils pharmacologiques dans les venins par des tests activités
biologiques nous a permis de mettre en évidence une voie de régulation de la physiologie
spermatique via les phospholipases A2 secrétées.

85
 Résultats

Dix gènes de PLA2 sécrétées différents ont été décrits à ce jour chez la souris,
correspondant aux groupes d'IB, IIA, IIC, IID, IIE, IIF, III, V, X et XIIA-sPLA2.
L’identification de ces nombreuses sPLA2 a été effectuée par homologie de séquences avec
les sPLA2 de venin (Valentin and Lambeau 2000). À l’heure actuelle, de nombreuses études
ont montré que les sPLA2 de mammifères étaient largement exprimées dans de nombreux
tissus et organes (Lambeau and Gelb 2008), mais leur rôle physiologique reste encore
largement inconnu.

Les sPLA2 de mammifères ne pourraient-elles pas comme la sPLA2 OS2 de venins réguler
les étapes de la physiologie spermatique ?

86
 Résultats

II. Évaluation du rôle des sPLA2 de mammifère dans la physiologie

spermatique

3. Introduction

Les phospholipases A2 (PLA2) sont des enzymes qui hydrolysent la liaison ester des
phospholipides membranaires en position sn-2, produisant ainsi des lysophospholipides et des
acides gras libres. Ce clivage des phospholipides est à l’origine de la synthèse des médiateurs
lipidiques.
Les organes reproducteurs mâles présente un large panel de sPLA2: les cellules
spermatogéniques, l’épididyme, le vas déférent et les vésicules séminales expriment les
sPLA2 des groupes IIC, IID, IIE, IIF, en V et X-sPLA2; la prostate exprime les sPLA2 des
groupes IIC, IID, IIE et IIF-sPLA2 et le spermatozoïde mature exprime les sPLA2 des groupes
IID, IIC, V, X et IIF (Masuda, Murakami et al. 2004).

Comme je vous l’ai expliqué dans l’introduction, il y a, malheureusement, peu

d'informations sur le rôle des sPLA2 au niveau de la physiologie spermatique des
mammifères. Les études jusqu’alors réalisées montrent que les sPLA2 pouvaient avoir un rôle
dans le mécanisme de la réaction acrosomique (Roldan and Fragio 1993 ; Garde and Roldan
1996) ; (Lui and Meizel 1979; Ono, R. Yanagimachi et al. 1982 ; Llanos, Morales et al.
1993 ); (Singleton and Killian 1983) ; (Fry, Ghosh et al. 1992) (Llanos, Morales et al. 1993;
Garde and Roldan 1996); (Riffo and Parraga 1996), la mobilité flagellaire et l’interaction
gamétique (Bao, Miller et al. 2004), mais leurs fonctions dans ces mécanismes restent à
l’heure actuelle inconnus.

Nous nous sommes demandés pourquoi un tel panel de sPLA2 était présent au niveau du
spermatozoïde. Quelle est l’implication réelle de ces phospholipases sPLA2 dans la
physiologie spermatique ? Les sPLA2 de mammifères ne pourraient-elles pas comme les
phospholipases de venins réguler les étapes de la physiologie spermatique ?

Afin de répondre à ces questions, nous avons regardé l’effet des différents sPLA2 de
mammifères sur deux étapes clés de la physiologie spermatique : la mobilité flagellaire (cf
Article 2) et la réaction acrosomique (cf Article 3).

87
 Résultats

Article 2: Mammalian Group X secreted phospholipase A2 regulates

specifically sperm motility

Jessica Escoffier, Ikram Jemel, Michel De Waard, Gérard Lambeau and Christophe
Arnoult.

Article en préparation

89
 Mammalian Group X secreted phospholipase A2 regulates
specifically sperm motility

Jessica Escoffier1, Ikram Jemel2, Michel De Waard1, Gérard Lambeau2 and Christophe
Arnoult1*

1Inserm U.836 Grenoble Institut of Neurosciences

Equipe 3 “Calcium channels, functions and pathologies”
Bâtiment Edmond J. Safra, Site Santé à La Tronche
BP 170 38042 Grenoble Cedex 9 - France

2 Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

CNRS - UMR 6097
Université de Nice-Sophia Antipolis
660 route des Lucioles, Sophia Antipolis
06560 Valbonne – France

* Corresponding author tel: 33 456 520 564 - E-mail: [email protected]

Abstract
Different mammalian sPLA2 are expressed in reproductive male organ and/or in sperm cell
but the physiological relevance is still a debated question. In mouse, group X phospholipase
A2 (mGX) modulated an important sperm function that is sperm motility, contrary to others
sPLA2s tested. By computer assisted sperm analysis (CASA) technique, we show that this
enzyme decreased both the track speed (VCL) and the lateral displacement of the head (ALH)
of non capacitated motile sperm by 30% and 17% respectively. The enzymatic activity of
mGX is required for sperm motility inhibition since H48Q-mGX and pro-mGX, two non-
catalytic active isoforms of mGX, were unable to modulate sperm motility. Moreover
LY329722, a specific inhibitor of mGX blocked the inhibition of mGX on sperm motility.
Sperm motility of capacitated sperm is also decreased but depends of a different molecular
mechanism. This change of molecular mechanism is likely due to enzymatic action of mGX
on different glycero-phospholipids present in the plasma membrane. Indeed, we shows that
mGX action on glycero-phosphatidylserine in the external leaflet of the plasma membrane
changes during capacitation. In conclusion, this paper demonstrates that sperm motility is
regulated by glycero-phospholipids composition of the plasma membrane, which is changed
by mGX.

INTRODUCTION

The molecular pathways involved in sperm flagellum beat are complex and still badly
understood. If several aspects of sperm flagellum beat, like the molecular structure of the
axonema (Escalier, 2006), the molecular machinery involved in microtubules sliding via the
macromolecular dynein complex (Esposito et al, 2004) or the control of flagellum beat by
Ca2+ (Ren et al, 2001;Castellano et al, 2003;Ho and Suarez, 2003;Schuh et al, 2004), have
been more particularly studied, the importance of the lipid composition of the plasma
membrane and the roles of lipid metabolism in sperm motility have been poorly explored.
Nevertheless several reports suggest that lipids are important for sperm motility. For instance,
sperm from male deficient in group VIA intracellular phospholipase A2 (iPLA2β) or group III
secreted phospholipase A2 (mGIII-sPLA2) present a strong decrease of their motility (Bao et
al, 2004;Sato et al, 2009). Moreover, platelet-activating factor (PAF; ether phospholipid 1-O-
alkyl-2-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphocholine), is secreted during capacitation and increases
sperm motility via a PAF receptor (Roudebush, 2001;Wu et al, 2001), underlining the
importance of lipids metabolism in sperm motility. These results suggest that lipid
rearrangement or lipid metabolites are important for flagellum beat, in order either to change
membrane fluidity or to control key proteins involved in flagellum beat. Besides
astenozoospermia (sperm with low motility) is associated in human with a defective sperm
plasma membrane composition with an excess of cholesterol and desmosterol (Montell,
1997;Buffone et al, 2009), a low concentration of specific fatty acid like decosahexaenoic
acid found in different phospholipids (Gulaya et al, 2001) and a overall increase of fatty acid
content (Ollero et al, 2001;Aksoy et al, 2006).
Irrespective of the above, capacitation of sperm leads to major reorganization of the plasma
membrane with lipid remodelling and formation of membrane subdomains (Gadella and
Harrison, 2000;Jones et al, 2007;Gadella et al, 2008). Cholesterol efflux is the most well-
known modification of the plasma membrane and plays a major role in sperm maturation both
in vivo and in vitro (Visconti et al, 1999;Travis and Kopf, 2002). Other major changes during
capacitation include efflux of desmosterol, changes in sterol sulfates, phospholipids,
sphingomyelin and ceramides, and finally remodeling of lipid rafts (Travis and Kopf,
2002;Buffone, Verstraeten, Calamera, and Doncel, 2009;Zalata et al, 2009). All these events
likely contribute to increase membrane fluidity by changing lipid packing and contribute to
increase heterogeneity of the sperm population. If obviously different families of lipolytic
enzymes are involved in these lipid rearrangements (Wang et al, 2004), phospholipases A2
(PLA2) are good candidates, because of their large diversity of action in phospholipid
remodeling and lipid mediator release in a large set of biological functions (Lambeau and
Gelb, 2008).
PLA2 is a large family of enzymes, and in function of their locations, they have been split in
two groups: intracellular and secreted PLA2s (Schaloske and Dennis, 2006). In the
intracellular PLA2 group, three different families of enzymes are present: the cytosolic PLA2s
(cPLA2s or also named group IV PLA2s) which are calcium dependent enzymes, iPLA2s
(also named group VIA PLA2s) and PAF-acetylhydrolase (also named group VIIIB PLA2s),
both group being calcium independent. For secreted PLA2s (sPLA2), ten different genes have
been described in mouse so far, corresponding to the groups of IB-, IIA-, IIC-, IID-, IIE-, IIF-,
III-, V-, X- and XIIA-sPLA2 (labelled mGy for mouse group y-sPLA2). In male reproductive
organs, both intracellular and secreted phospholipase A2 have been described (Bao, Miller,
Ma, Wohltmann, Eng, Ramanadham, Moley, and Turk, 2004;Masuda et al, 2004;Koizumi et
al, 2003;Yan et al, 2003). Concerning the sPLA2, a wide range of different groups is
expressed. Spermatogenic cells, epididymis, vas deferens and seminal vesicle express sPLA2
of the groups IIC, IID, IIE, II-, V and X; epididymis express sPLA2 of the groups IIC, IID,
IIE, IIF, III, V and X; prostate express groups IIC, IID, II- and IIFs and mature sperm X-
sPLA2 {Masuda, Murakami, et al. 2004 502 /id}(Sato, Taketomi, Isogai, Miki, Yamamoto,
Hosono, Arata, Ishikawa, Ishii, Kobayashi, Nakanishi, Ikeda, Taguchi, Hara, Murakami, and
Kudo, 2009;Escoffier et al, 2009). The reasons for such a diversity of sPLA2s expression in
the different components of the genital male organs, and for most of them, their specific
cellular functions are unknown so far. Deciphering the specific roles of each PLA2 involved
in male reproduction is a challenging goal. Recent studies point out specific roles for mGIII
and mGX: mGIII is involved in sperm lipid homeostasis in the epididymis and lack of this
sPLA2 leads to defective sperm (Sato, Taketomi, Isogai, Miki, Yamamoto, Hosono, Arata,
Ishikawa, Ishii, Kobayashi, Nakanishi, Ikeda, Taguchi, Hara, Murakami, and Kudo, 2009) and
mGX is present in the acrosome of mature sperm and paracrine secretion of mGX during
sperm capacitation promotes an anticipated acrosome reaction that excludes a sperm
subpopulation from fertilization (Escoffier, Jemel, tanemoto, Taketomi, Coatrieux, Sato,
Yamamoto, Masuda, Pernet-Gallay, Pierre, Hara, Murakami, De Waard, Lambeau, and
Arnoult, 2009).
Concerning the enzymatic activity, the sPLA2 family is characterized by its ability to
hydrolyse the sn-2 ester of glycero-phospholipids of the extracellular leaflet of the plasma
membrane in two components, a fatty acid (FA) and a lysophospholipid (LysoPL). These both
compounds have the ability to leave the plasma membrane. Because FAs rapidly equilibrate
between both leaflets of the membrane bilayers, they diffuse into the cytoplasm and control
different cellular signalling pathways as second messengers. By contrast, LysoPLs
accumulate in the outer leaflet. However, the lysophospholipid contains a polar group
(glycero-phospho head) and a more lipophil group (fatty acid in position 1 on the glycerol). In
function of the size of its fatty acid, the lysophospholipid may be able to leave the membrane
and may act as a bioactive metabolite in different extracellular pathways in an autocrine or
paracrine mode.

Here, we evaluated the effect of some different mammalian secreted phospholipase A2 known
to be present in male reproductive organs, like mGIIA, mGIID-, mGIIE-, mGV- and mGX-
sPLA2 {Masuda, Murakami, et al. 2004 502 /id} or in female tract like mGIIE (Valentin et al,
1999) on sperm motility. By using different strategies (modified inactive sPLA2, specific
inhibitors), we showed for the first time that mouse sperm motility is specifically modulated
by the enzymatic activity of mGX-sPLA2.
MATERIAL AND METHODS

Computer-assisted motility analysis — Sperm cells from caudae epididymes were allowed to
swim in 1 ml of M2 medium for 10 min. sperm was re-suspended in M16 and incubated with
different sPLA2 at 37°C for 10 min. After incubation, the sperm suspension was immediately
placed onto analysis chamber (2X-CEL Slides, 100 µm depth, Leja Products B.V.,
Netherlands) kept at 37 °C for microscopic quantitative study of sperm movement. Sperm
motility parameters were measured at 37°C using a sperm analyzer (Hamilton Thorn
Research, Beverley). The settings employed for analysis were as follows: acquisition rate: 60
Hz; number of frames: 100; minimum contrast: 25; minimum cell size: 10; low static-size
gate: 2.4; high static-size gate: 2.4; low static-intensity gate: 1.02; high static-intensity gate:
1.37 ; minimum elongation gate: 12; maximum elongation gate: 100; magnification factor:
0.70. The motility parameters measured were: curvilinear velocity (VCL) and amplitude of
lateral head displacement (ALH). A minimum of 100 motile spermatozoa for each sample
was analyzed.

Production of recombinant sPLA2s — Recombinant mouse sPLA2s group IIA, IID, IIE, V
and X and the H48Q mutant mGX sPLA2 were produced as described previously (Rouault et
al, 2007;Singer et al, 2002). Pro-mGX sPLA2 was produced as for WT mature mGX sPLA2
using the pAB3 vector in which the full-length cDNA coding for Pro-mGX was inserted in
frame with the ∆GST protein and the factor Xa cleavage site, which were removed from Pro-
mGX sPLA2 by using the factor Xa protease (Rouault, Le Calvez, Boilard, Surrel, Singer,
Ghomashchi, Bezzine, Scarzello, Bollinger, Gelb, and Lambeau, 2007).

Chemical compounds — M2 and M16 medium were purchased from Sigma.

PMSG is from Ceva santé animal and HCG is from Intervet. BSA, Cohn Fraction V and
processed to reduce fatty acid content was from Sigma.
RESULTS

mGX inhibits specifically sperm motility among 5 mammalian sPLA2

During its short life, sperm are confronted with several sPLA2, either with sPLA2 of
epidydimal or prostatic origins in seminal plasma (Masuda, Murakami, Matsumoto, Eguchi,
Urade, Lambeau, Gelb, Ishikawa, Ishii, and Kudo, 2004) or with PLA2 secreted by sperm
itself during acrosome reaction (Lessig et al, 2008), (Escoffier, Jemel, tanemoto, Taketomi,
Coatrieux, Sato, Yamamoto, Masuda, Pernet-Gallay, Pierre, Hara, Murakami, De Waard,
Lambeau, and Arnoult, 2009). We thus evaluated the effect of 5 different mammalian sPLA2
known to be present in female or male genital tractus (mGIIA, mGIID, mGIIE, mGV and
mGX) on motility of sperm, using computer assisted sperm analysis (CASA). Sperm tracks
are characterized with CASA system by four basic parameters allowing evaluating sperm
motility: the track speed (VCL), the progressive velocity (VSL), the path velocity (VAP) and
the lateral displacement of the head (ALH). We focused in this study only on two parameters,
the VCL and the ALH parameters. In a first set of experiments, we tested the 5 different
sPLA2 on non-capacitated sperm. Figures 1A,B shows clearly that only mGX-sPLA2 was a
potent modulator of VCL and ALH when incubated with uncapacitated sperm during 10 min
in M16 culture medium à 37°C. In the presence of 200 nM mGX, the mean VCL is decresead
by 23%, from 165.55 ± 5.44 (n=19) to 124.73 ± 6.65 µm/s (n=16), p<10-4 and the mean ALH
is decreased by 14%, from 11.45 ± 0.35 (n=19) to 9.81 ± 0.54 µm (n=16), p=0.01. In order to
better characterize the inhibitory effect of mGX on sperm motility, we determined the
minimal concentration of mGX leading to the inhibitory effect. Figure 1C, presenting dose-
response curves for VCL and ALH, shows that sperm motility, and more particularly VCL,
was affected by doses as low as 20 nM of mGX-sPLA2.

Heterogeneous response of sperm to mGX treatment.

Sperm motility presents a high degree of heterogeneity, even in a single cell population
obtained from one male. The heterogeneity was displayed by a wide range of VCL and ALH
values, indicating different subpopulations of sperm. The values for VCL started from 7.5
µm/s to values higher than 450 µm/s in a control cell population (figure 2A, blue bars/curve).
We noticed a same degree of heterogeneity for ALH, since ALH values were comprise
between 0 and 20 µm (figure 2B, blue bars/curve). In this study, static sperm cells and slow
cells were not counted and only sperm cells with a VAP > 7.5 µm/s have been analyzed. An
important question was to determine if mGX inhibits slow (VCL<150 µm), medium (150
µm<VCL<350 µm) or fast sperm subpopulations (VCL>350 µm) with a similar potency. To
address this question we first compared VCL or ALH distributions of a control and a mGX-
treated sperm population and then the VCL or ALH distributions of the mGX-treated sperm
population versus a theoretical distribution obtained after applying a reduction factor to the
speed of each subpopulation equivalent to the mean factor of reduction for VCL or ALH
obtained from the whole population of the sample. As showed in figure 2A-2B, , adding
mGX-sPLA2 modified the distribution of both studied motility parameters of sperm
population, by basically increasing the percentage of sperm with slow speed and low ALH
(black bars/curves). We thus traced a theoretical distribution of the speed of mGX treated
sperm by applying to all subpopulations an identical reduction factor corresponding to the
reduction measured on the whole population sample (red line in figure 2C; in this case, mean
reduction is 30%). Comparing measured and theoretical mGX treated sperm distributions
shows clearly that the theoretical distribution does not fit the mGX-treated sperm distribution
(figure 2C black curve versus red curve). This result strongly suggests that some
subpopulations were differently affected by sPLA2 treatment, and more particularly the VCL
of medium and fast sperm are less inhibited by mGX than expected. Similar calculation
applied to ALH allowed us to trace a theoretical distribution corresponding to a 17%
reduction of the ALH (17% is the mean factor of ALH reduction in this case) (figure 2D).
Similar comparisons between the distribution of ALH of mGX-treated sperm versus the
theoretical distribution strongly suggest that some subpopulations were also differently
affected by sPLA2 (figure 2D). The heterogeneity of sperm population is illustrated in the
tracks of figure 2E and 2F, representing the position of the head of sperm over a period of 30
s measured in control sperm and mGX treated sperm respectively.

mGX effect is dependent of sPLA2 enzymatic activity

sPLA2 have two modes of action: an enzymatic mode where they hydrolyse phospholipids
or/and a ligand mode where they act as agonists for specific lectin receptors. We wondered if
enzymatic activity was required for sperm motility modulation by sPLA2. First, we tested a
mutated mGX-sPLA2, with a substitution of one amino acid in its enzymatic pocket, H48Q,
leading to a complete loss of the enzymatic activity (Janssen et al, 1999). In figure 3, we show
that the mutated mGX-sPLA2 was unable to affect sperm VCL (figure 3A) or sperm ALH
(Figure 3C). mGX-sPLA2 is first synthetized as pro-mGX, a precursor molecule, which is
cleaved in mGX-sPLA2 and a peptide of 11 amino acids (Cupillard et al, 1997). Pro-mGX has
a very low phospholipase enzymatic activity. We tested the effect of 200 nM pro-mGX on
sperm motility and none modification have been observed on VCL and ALH (figure 3 A,C
respectively). These results suggest that enzymatic activity plays a crucial role in sperm
motility modulation by sPLA2. To confirm this result we tested a specific inhibitor of mGX-
sPLA2 sPLA2, LY329722. This compound inhibits mGX-sPLA2 enzymatic activity with an
IC50 of 75 nM (compound A in (Smart et al, 2006). In presence of LY329722 at 1 µm, mGX-
sPLA2 sPLA2 is less potent to modulate VCL and ALH (figure 3B and 3D, respectively).

mGX effect is modulated during capacitation

We know that capacitation leads to an important change in the lipid composition of the
plasma membrane and more particularly in phospholipids and this change could have as a
consequence a modification of the nature of substrates for mGX. Because mGX catalytic
activity is important for its action on sperm motility, the modification of the nature of mGX
substrates could then modify the action of mGX on sperm motility. We thus wondered if
mGX retained its ability to modulate sperm motility after capacitation. We first wanted to
confirm that the sperm plasma membrane composition, and more particularly phospholipids,
changes during capacitation and subsequently to investigate if catalytic mGX activity is
modified by theses modifications. Among phospholipids, phosphatidylserines are easily
identified because annexine V stains them specifically. We thus focused on this peculiar
phospholipid to evidence phospholipids changes during capacitation. Before capacitation, no
annexine V staining was present in sperm (figure 4A). In the other hand, a strong annexine V
staining appeared after 35 min of capacitation (figure 4B). We noticed a strong straining on
flagella. In the other hand, sperm head were not or weakly stained. This result demonstrates
that capacitation induced by cholesterol efflux and/or bicarbonate influx leads to a
modification of phospholipid asymmetry, promoting externalisation of new phospholipids at
the plasma membrane of the flagella and thus promoting new substrates for sPLA2. This
pattern of staining is strongly modified by mGX treatment: non capacitated sperm treated with
mGX were annexine V positive (figure 4C) and capacitated sperm were annexine V negative
(figure 4D). The fact that mGX produced an appearance of annexine V staining in non
capacitated sperm indicates a transfert of phosphatidylserines from internal leaflet of the
plasma membrane to its external leaflet. This result was interpreted as the catalytic activity of
mGX on non characterized lipids of the plasma membrane of non capacitated sperm. In a
similar way, the fact that mGX produced a vanishing of annexine V staining in capacitated
sperm indicates that phosphatidylserines were good substrates for mGX. All together, these
results demonstrate that the set of metabolites produced by mGX on non capacitated or
capacitated sperm are different. We next compared the inhibitory effect of mGX on the
mobility of non capacitated versus capacitated sperm. Sperm were capacitatited 90 min in 2%
BSA at 37°C in a 5% CO2 chamber and sperm motility was measured after 10 minutes
incubation with mGX. Because sperm were capacitated in the presence of low fat BSA, and to
avoid an artefact effect of BSA, capacitated sperm where washed with M16 before mGX
incubation in order to remove BSA. Thus, non capacitated and capacitated sperm were treated
with mGX in the same medium. Whereas mGX inhibited the VCL of non capacitated sperm
by ~18%; p<10-3, n=6, in capacitated sperm, mGX was less potent and inhibited VCL by
~9%, p-0.036, n=6 (figure 4E).

LY329722, a specific inhibitor of mGX, increases VCL of capacitated sperm

We have previously demonstrated that mGX is released during spontaneous acrosome
reaction and increase sperm fertility (Escoffier, Jemel, tanemoto, Taketomi, Coatrieux, Sato,
Yamamoto, Masuda, Pernet-Gallay, Pierre, Hara, Murakami, De Waard, Lambeau, and
Arnoult, 2009) by promoting spontaneous acrosome reaction. The facts that mGX is released
during capacitation and the fact that recombinant mGX is able to modify sperm mobility
raised the question of the control of sperm mobility by endogenous mGX. To test this
hypothesis, we compared VCL and ALH of sperm treated with LY329722, the specific
inhibitor of mGX during capacitation, versus non-treated sperm (control). We measured the
mean VCL and ALH at various time of capacitation (0, 45 and 90 min). There were no
statistically significant differences in VCL between control and LY329722 treated sperm
before and after 45 min of capacitation (figure 5). In contrast, difference of VCL measured
from control and LY329722 treated sperm were statistically significant (P < 0.05) after 90
min of capacitation: the mean VCL increased from 182.7 ± 5.1 to 191.1 ± 5.0 µm/s; p=0.036,
n=11 (figure 5). This increase of 5% of the mean VCL is in good accordance with the level of
inhibition induced by recombinant mGX in capacitated sperm (9%). Moreover, the fact that
LY329722 did not produce any effect before the 90 minutes is consistent with the kinetic of
release of the endogenous mGX during spontaneous acrosome reaction, as demonstrated
previously (Escoffier, Jemel, tanemoto, Taketomi, Coatrieux, Sato, Yamamoto, Masuda,
Pernet-Gallay, Pierre, Hara, Murakami, De Waard, Lambeau, and Arnoult, 2009).
DISCUSSION

The results presented in this paper are important for several reasons. First, they underline the
importance of phospholipid in sperm motility, second they demonstrate that mGX present a
unique feature among five different sPLA2, by decreasing sperm motility of non capacitated
sperm, and finally they demonstrate that endogenous mGX released during in vitro
capacitation controls sperm motility. Altogether, these results demonstrate that sperm motility
is dependent of i/ lipid homeostatis and ii/ enzymatic activity of secreted GX PLA2

Sperm motility is controlled by sPLA2.

From our knowledge, this paper is the first showing that sperm motility is directly controlled
by sPLA2 metabolism. The platelet activating factor (PAF), which is an ether phospholipid
increases sperm chemotactism but no data are available concerning the effect of PAF on
sperm motility parameters {Wu, Stojanov, et al. 2001 534 /id}. Finally, the disruption of the
internal PLA2 VIA (iPLA2β) gene leads to a severe motility phenotype but the direct
contribution of sPLA2 to sperm flagellum beat was not demonstrated. We have previously
showed that mGX is a strong inducer of acrosome reaction {Escoffier, Jemel, et al. 2009 628
/id} and an obvious question arising from the above results is: “is motility decrease due to a
modification of the acrosomal status of sperm?” In figure 6, we traced on the same graph the
dose-response curves for AR level and sperm motility decrease. From this figure, it is clear
that AR did not induce a sperm motility decrease since there was not correlation between both
phenomena. This absence of correlation is obvious, especially at low and high concentrations
of mGX. For instance, at 2 nM, the motility was not affected whereas this concentration
produced an increase of 30% of the number of acrosome reacted sperm.
The molecular mechanisms controlling the flagellum beat is not fully understood but two
second messengers play critical roles: cAMP and Ca2+. The main source of Ca2+ is the culture
medium and specific ionic channels, like CatSper {Ren, Navarro, et al. 2001 389 /id}, are
involved in Ca2+ flux in the flagellum. Membrane potential, and more particularly the driving
force, plays also a crucial role in Ca2+ flux. Membrane protein functions are influenced by
specific protein–lipid interactions that are dependent on the chemical structure of lipids. For
instance, voltage sensor of Kv2.1 potassium channel are modulated by charged phospholipids
and sphingomyelinase change strongly biophysical properties of this channel {Xu, Ramu, et
al. 2008 535 /id} and thus ion fluxes. Because sPLA2 modify plasma membrane lipid
properties and more particularly phospholipids distribution, ionic conductances controlling
Ca2+ flux directly or indirectly through membrane potential should be modulated by this
change in lipid composition and finally may be responsible for sperm motility alterations.

Heterogeneity of mGX action

We have previously showed that a small fraction of the sperm population is reluctant to the
AR induced by sPLA2 even at the highest concentration tested, that is 500 nM. This result
suggests that sperm cell population presents an heterogeneity with likely different levels of
fertile competences. The notion of heterogeneity of sperm population, with more competent
fractions is supported by our results concerning the motility in the sperm population. From
sperm velocity data, it is obvious that different subpopulations were present in a sperm
sample. This idea is reinforced by that fact that sPLA2 did not modify sperm velocity in an
equal way, since high-speed sperm (the most competent sperm subpopulation) are less
affected than low speed sperm by sPLA2 treatment (figure 3). From these results, we can
speculate that sPLA2 may contribute to sort competent sperm cells by two ways: first by
promoting AR of non functional sperm cells and second, by decreasing sperm motility of low
speed sperm, which has for consequence to decrease the chance of low speed sperm to reach
the crucial oocyte localization.
FIGURE and LEGENDS

Figure 1. mGX sPLA2 is the most potent inhibitor of sperm motility among 5 different
mammalian sPLA2s.
A, B: Effects of mGIIA, mGIID, mGIIE, mGV and mGX sPLA2 at 200 nM on sperm motility
were analysed with a CASA (computer assisted sperm analysis) system. Two different sperm
motion parameters “track speed” VCL (A) and “lateral displacement of the head” ALH (B)
are showed. For each sPLA2, we compared the values obtained in the presence of the enzyme
with the values obtained in a control experiment with sperm cells from the same animal, n=
16 for mGX, n=5 for mGV and n=3 for mGIIA, mGIID and mGIIE sPLA2. C: Dose response
curve of mGX sPLA2 on two different sperm motion parameters ALH (●) and VCL (◊).
mGX concentrations tested were 0.2, 2,20,200 and 500 nM.
Figure 2. The effect of mGX is heterogeneous and high-speed sperm are less affected
than low speed sperm by sPLA2 treatment.
A: Control sperm cells population presents an heterogeneous VCL distribution, ranging from
0-50 µm/s to value above 450 µm/s and showing two peaks (blue bars/line). In the presence of
200 nM mGX, we observed a shift of sperm VCL distribution (black bars/line). B: This
distribution is different of a theoretical distribution obtained after a 30% decrease of each sub-
population (red line), which is the mean decrease of the sperm VCL population sample in the
presence of 200 nM mGX sPLA2. C: Control sperm cells population presents an
heterogeneous ALH distribution, ranging from 0-2 µm to value above 18 µm (blue bars/line).
In the presence of 200 nM mGX, we observed a shift of sperm ALH distribution (black
bars/line). D: This distribution is different of a theoretical distribution obtained after a 17%
decrease of each sub-population (red line), which is the mean decrease of the sperm ALH
population sample in the presence of 200 nM mGX sPLA2. E, F: Effects of mGX sPLA2 on
individual sperm tracking (blue lines). Comparison of control sperm (E) and sperm incubated
with 200 nM mGX during 10 min (F) obtained from the same animal. Note that the length of
the tracks, which is proportional to the speed of the sperm cell, is more heterogeneous after
application of sPLA2. Static and slow cells have been erased.
Control and mGX conditions of graphs A and C corresponded to 3 different mice, where a
mean of 205 sperm per control mouse and 310 sperm per mGX-treated mouse were scored.
Figure 3. Enzymatic activity of mGX is required to affect sperm motility.
A, C: mutation of the catalytic site of mGX (H48Q) abolishes its ability to affect sperm
motility (n=3). Pro-mGX, the inactive pro-enzyme of mGX is also unable to affect sperm
motility (n=3).
B, D: the specific sPLA2 inhibitor LY329722 blocks the effect of mGX on sperm VCL and
ALH (n=5, for mGX at 200 nM and n=3 for mGX at 500 nM, p as indicated).
Figure 4. Change in lipid composition during capacitation decreases mGX potency.
Confocal images of sperm stained with annexine-V- cyanine-3. A. non capacitated sperm, B.
capacitated sperm, C. Non capacitated sperm treated with 200 nM mGX during 10 min., D
capacitated sperm treated with 200 nM mGX during 10 min. E. Mean VCL of control (black
bars) or mGX (200 nM) treated sperm populations (white bars), before capacitation (two left
bars) or after capacitation (two righ bars), n=6. Sperm were capacitated by incubating them in
2% BSA in M16 medium during 90 min.
 0 min 55 min 90 min
300

NS
250 p=0.73 NS ***
p=0.51 p=0.038

200
VCL, µm/s

150

100

50

LY 329722
- + - + - +
1 µM

Figure 5. LY329722, a specific inhibitor of mGX increases the mean VCL of sperm
capacitated during 90 min.
Sperm were capacitated by incubating them in 2% BSA in M16 medium in a % CO2
incubator at 37°C in the absence or presence of LY329722 a 1 µM. At various time of
capacitation, (0, 45 and 90 min), the VCL of control (black bars) or LY329722 treated sperm
(white bars) were compared, n=11.
Figure 6. Absence of correlation between acrosome reaction and decrease of sperm
motility

Acknowledgments
This work was supported in part by Région Rhône-Alpes (to C.A.), NNRS (to G.L.) and
INSERM (M.D.W.). J.E. is supported by a fellowship of Région Rhône-Alpes.

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 Résultats

Article 3: Group X phospholipase A2 is secreted during sperm acrosome

reaction and controls fertility outcome.

Jessica Escoffier, Ikram Jemel, Akemi Tanemoto, Yoshitaka Taketomi, Christelle

Coatrieux, Hiroyasu Sato, Kei Yamamoto, Seiko Masuda, Karin Pernet-Gallay, Virgine
Pierre, Shuntaro Hara, Makoto Murakami, Michel De Waard, Gérard Lambeau and
Christophe Arnoult.

Journal of Clinical Investigation (en revision)

91
 Group X phospholipase A2 is secreted during sperm acrosome
reaction and controls fertility outcome

Jessica Escoffier1, Ikram Jemel2, Akemi Tanemoto3, Yoshitaka Taketomi3,4, Christelle

Coatrieux2, Hiroyasu Sato3,4, Kei Yamamoto4, Seiko Masuda3,4, Karin Pernet-Gallay1,
Virgine Pierre1, Shuntaro Hara3, Makoto Murakami3,4,5, Michel De Waard1, Gérard
Lambeau2† and Christophe Arnoult1†*

1
Grenoble Institute of Neuroscience
Inserm U.836 Team 3 “Calcium channels, functions and pathologies”;
Université Joseph Fourier
Chemin Ferrini
38700 La Tronche, France

2
Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
CNRS - UMR 6097
Université de Nice-Sophia Antipolis
660 route des Lucioles, Sophia Antipolis
06560 Valbonne, France

3
Department of Health Chemistry, School of Pharmaceutical Sciences,
Showa University, 1-5-8 Hatanodai, Shinagawa-ku, Tokyo 142-8555, Japan

4
Biomembrane Signaling Project
The Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
2-1-6 Kamikitazawa
Setagaya-ku
Tokyo 156-8506, Japan

5
PRESTO, Japan Science and Technology Agency, 4-1-8
Honcho, Kawaguchi, Saitama 332-0012, Japan

†These two authors have equally contributed to this work

*Corresponding author
Christophe ARNOULT
Grenoble Institute of Neuroscience, Inserm U.836 Team 3 “Calcium channels, functions and
pathologies”; Université Joseph Fourier
Chemin Ferrini, 38700 La Tronche, France
Phone 33- 4 56 52 05 63 Fax 33- 4 56 52 05 72 E-mail: [email protected]

1
Nonstandard abbreviations used:

sPLA2: secreted phospholipase A2;

A comprehensive abbreviation system for the various mammalian sPLA2s is used: each

sPLA2 is abbreviated with a lowercase letter indicating the sPLA2 species (m for mouse),

followed by uppercase letters identifying the sPLA2 group (GIIA, GIID, GIIE, GIIF, GV, GX,

for group IIA, IID, IIE, IIF, V, X, respectively);

PAF: ether phospholipid 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphocholine;

LPL: lysophospholipid; LPC: lysophosphocholine;

AR: Acrosome reaction.

2
Ejaculated mammalian sperm must undergo a maturation process, the capacitation, as

they traverse the female reproductive tract and before they can fertilize the egg. Several

studies have suggested a role for one or more phospholipases A2 in capacitation,

acrosome reaction (AR) and fertilization, but the molecular nature of these enzymes and

their specific roles have remained elusive. We demonstrate here that mouse group X

secreted phospholipase A2 (mGX sPLA2) is the major enzyme present in the acrosome

of spermatozoa and that mGX is released in an active form during sperm capacitation

via spontaneous AR. The size of litters from male mGX-deficient mice was slightly

smaller than that of wild-type males. Spermatozoa from mGX-deficient mice exhibited

lower spontaneous AR associated to a decreased outcome of in vitro fertilization (IVF),

due to a drop of fertilization potential of sperm and an increase of the rate of aborted

embryos. Specific sPLA2 inhibitors and antibodies to mGX blocked spontaneous AR of

wild-type sperm and reduced IVF outcome. These effects were restored by addition of

lysophosphatidylcholine, a catalytic product of mGX. Finally, recombinant mGX

triggered AR in a catalytic- and dose-dependent manner and improved IVF outcome.

All together, our results reveal the presence of group X sPLA2 in sperm acrosome and

highlight a paracrine role of this enzyme during capacitation in which the enzyme

primes sperm for efficient fertilization and boosts premature AR of a likely

phospholipid-damaged sperm subpopulation to discard them from the fertilization race.

3
Introduction

Spermatogenesis in the testis leads to the production of morphologically mature sperm cells

which are still functionally immature, immotile and incompetent for fertilization. Before

fertilization, these sperm cells should undergo two major series of important morphological,

biochemical and functional modifications, one in the epididymis and the other in the female

reproductive tract after ejaculation. During their transit through the epididymis, sperm cells

acquire progressive motility and prime the signaling pathways that will eventually orchestrate

capacitation. The full fertilization potential of spermatozoa will be reached in vivo only after

capacitation, a final maturation process occurring in the female reproductive tract.

Capacitation was discovered by Austin and Chang in the early 1950s and is defined as a

complex set of molecular events that allow ejaculated sperm to fertilize an egg (1).

Fertilization starts with sperm binding on zona pellucida and is followed by the physiological

acrosome reaction (AR), which is essential for sperm-oocyte fusion. Only fully capacitated

spermatozoa can bind to the zona-intact egg and are competent for AR (2). However, during

capacitation, a large fraction of sperm (30-40%) undergoes an anticipated AR called

spontaneous AR (3). This process is currently interpreted as a sperm malfunction and suggests

that a subpopulation of ejaculated sperm does not tolerate the above final maturation process.

The endogenous factors responsible for spontaneous AR and the possible physiological

reasons for this process have not been identified. Indeed, the molecular mechanisms of sperm

capacitation is still poorly understood, even after 50 years of intensive research (4-7). If

capacitation clearly depends on ion fluxes and protein phosphorylations, this process is also

characterized by a strong dependence on the lipid membrane composition and lipid

metabolism. Indeed, major lipid remodeling events of sperm including reorganization of the

plasma membrane and formation of membrane subdomains have been observed during

4
capacitation at both chemical and biophysical levels (7-9). During capacitation, the most well-

known modification of the plasma membrane is cholesterol efflux which plays a major role in

sperm maturation both in vivo and in vitro (4;10). Other major changes during capacitation

include remodeling of lipid rafts, efflux of desmosterol, changes in sterol sulfates,

phospholipids, sphingomyelin and ceramides, all of them likely contributing to the increase in

membrane fluidity by changing lipid packing and thereby providing heterogeneity of the

sperm population (4;11-13). If obviously several families of lipolytic enzymes are involved in

these lipid modifications (14), phospholipases A2 (PLA2) are likely to be important, because

of their large diversity of action from phospholipid remodeling and lipid mediator release to

inflammation and host defense (15;16).

PLA2 catalyze the hydrolysis of phospholipids at the sn-2 position to generate free fatty acids

and lysophospholipids, which are precursors of different lipid mediators such as eicosanoids

and platelet-activating factor (PAF) (17-21). PLA2 metabolites either leave the cellular

membrane and are involved in different cellular signaling pathways or accumulate in the

leaflet of the membrane and change its biophysical properties. PLA2s constitute one of the

largest families of lipid hydrolyzing enzymes and have been classified into several groups

(15). Based on their respective structure and cellular localization, PLA2s can be divided into

two major sets of proteins: a set of Ca2+-dependent and Ca2+-independent intracellular PLA2s

and another set of Ca2+-dependent secreted PLA2s (sPLA2). The PLA2 family also comprises

a set of intracellular and secreted forms of PAF-acetyl hydrolase. Deciphering the biological

functions of each PLA2 member is challenging. Studies over the last decade have shown that

intracellular PLA2s including group IVA cytosolic PLA2 (cPLA2α) and group VIA Ca2+-

independent PLA2 (iPLA2ß) are mainly involved in the production of various lipid mediators

in different tissues and cell types activated by numerous stimuli (17-22). Production of these

lipid mediators is important in numerous and diverse physiological and pathophysiological

5
conditions. Several sPLA2s, in particular group IIA, V and X also contribute to the production

of lipid mediators in certain conditions and have been involved in diverse physiopathological

conditions including inflammation and associated inflammatory diseases, tissue injury and

host defense (16;23-25).

Several intracellular and secreted PLA2s have been described in the testis and other male

reproductive organs, but their respective functions in reproduction still remain largely

obscure. Group VIIIB PAF-acetyl hydrolase and iPLA2ß have been found in sperm cells and

the corresponding deficient mice present defects in early spermatogenesis and sperm motility,

respectively (26-28). cPLA2-ε has recently been cloned and found to be expressed in the

testis, but its function is still unknown (29). Previous studies have also shown that several

sPLA2s including group IIA, IIC, IID, IIE, IIF, V and X are present in various genital male

organs such as testis, epididymis, vas deferens, seminal vesicles and prostate, but their exact

functions are still speculative (30;31). More particularly, mouse group IIE, V and X sPLA2s

(mGIIE, mGV and mGX, respectively) have been localized in the late spermatids, but their

presence in mature sperm and their specific functions in capacitation or fertilization remain to

be determined.

Irrespective of the above, different studies have shown that one or several uncharacterized

PLA2s play an important role in capacitation, AR and the early steps of fertilization including

sperm binding and sperm-oocyte fusion (32). First, several biochemical studies have

demonstrated the presence of one or several low molecular weight Ca2+-dependent sPLA2-like

proteins in spermatozoa from different species, yet their true molecular nature still remains

elusive (33-36). Concerning capacitation, a spontaneous release of PAF during capacitation

has been linked to activation of spontaneous AR, but the enzyme responsible for PAF release

has not been identified (37). Concerning AR, non physiological and physiological stimuli of

AR using Ca2+ ionophore, progesterone and zona pellucida produce the release of arachidonic

6
acid and/or lysophosphatidylcholine (LPC), and is prevented by PLA2 inhibitors on sperm

from various species (38-41). However, the identity of the PLA2(s) involved in this exocytotic

event has not yet been revealed and the use of poorly specific PLA2 inhibitors such as Ro 31-

4493, aristolochic acid or ONO RS-82 in these studies cannot provide any clue (38;40;41).

PLA2 activation during AR is also supported by the fact that LPC and fatty acids accelerate or

promote exocytosis (42;43). Finally, LPC improves sperm binding on zona pellucida (44) and

sperm-oocyte fusion (45), supporting the notion that one or several PLA2s including an sPLA2

protein may be important for capacitation and fertilization.

In this paper, we have used mouse group X deficient mice (mGX-/-), sPLA2 inhibitors and

recombinant mGX protein to identify a novel role of this sPLA2. We demonstrated that mGX

sPLA2 is the major enzyme present in the acrosome of mature spermatozoa and is released as

an active enzyme during AR. mGX controls sperm physiology at two levels, first during

capacitation, by triggering spontaneous AR of a specific subpopulation of sperm, and second

during the subsequent fertilization by improving the sperm fertilization potential.

In our companion paper (46), Sato et al have shown that another enzyme, the mouse group III

sPLA2 is highly expressed in the proximal epithelium of epididymis and that mice deficient

for this sPLA2 exhibit male infertility because of profound defects in sperm maturation.

Together, our results show that two catalytically active sPLA2s are expressed in different

locations within the reproductive male organs and exert non redundant functions at two major

steps of maturation of spermatozoa, one during their transit through the epididymis and the

other during capacitation, with important impacts on male fertility in both cases.

7
Results

mGX sPLA2 is specifically expressed in late spermatogenic cells and mature spermatozoa.

Quantitative RT-PCR analysis showed that the mRNA coding for mGX is present at much

higher levels in the testis than epididymis (Figure 1A). In situ hybridization on tissue sections

of the testis from 8-week-old C57BL/6J mice showed that mGX mRNA is present in late

spermatogenic cells (spermatocytes and spermatids, but not spermatogonia) in the

seminiferous tubules (Figure 1B). In accordance with these results, immunohistochemistry

experiments on parallel tissue sections with a specific polyclonal mGX antibody showed the

presence of mGX in spermatocytes and spermatids, but not in spermatogonia (Figure 1C). In

magnified views (Figure 1C inset), scattered signals with crescent and elongated shapes were

evident in spermatocytes and spermatids, suggesting that mGX is localized in the acrosomal

area. To further support this finding, spermatozoa from cauda epididymis were stained with

anti-mGX or control antibodies. A strong immunofluorescent signal for mGX was confined to

the sperm head, in agreement with an acrosomal localization (Figure 1D).

mGX sPLA2 is released during AR.

To further demonstrate that mGX is an acrosomal protein, we monitored the release of the

protein from mouse mature sperm undergoing in vitro capacitation in conditions known to

induce spontaneous AR of 30 to 40% of the sperm population over the time of incubation.

mGX and other sPLA2s possibly present in the acrosome were seeked using specific and

sensitive (down to 5 pg per assay for mGX) time-resolved fluoroimmunoassays (TR-FIA)

recently developed for the different mouse sPLA2s (47). During the time-course of

capacitation, the amount of mGX was increased in the supernatant and concomitantly

decreased in the pellet (Figure 2A). Moreover, inducing AR by the Ca2+ ionophore A23187

8
almost doubled the amount of released mGX at 90 min of capacitation. The fact that mGX

redistributed from the sperm pellet to the cell supernatant during capacitation or after

A23187-induced AR clearly demonstrates that the enzyme is present in the acrosome of

mature sperm. When mGX-/- sperm were used in similar capacitation experiments, no mGX

TR-FIA signal was found, validating the specificity of the results (Figure 2B). We measured

in parallel the release of mGX sPLA2 by a sensitive sPLA2 enzymatic assay using

radiolabeled E. coli membranes as a substrate. In accordance with the TR-FIA results, the

sPLA2 enzymatic activity was increased in the supernatant and decreased in the pellet,

indicating that the mGX sPLA2 released during capacitation is active (Figure 2C). The

measured enzymatic activity was due to mGX since no variation of enzymatic activity was

observed in mGX-/- sperm (not shown). We also examined the presence of mGX and other

sPLA2s including mGIIA, mGIIE and mGV in the sperm of various mouse strains (C57BL/6J,

BALB/c and OF1) and found that mGX sPLA2 was the only detectable protein in all these

strains (not shown). These experiments collectively indicate that mGX is the major sPLA2

present in the acrosome of mature mouse sperm, that the enzyme is released during AR in an

active form, and that it contributes to most of the sPLA2 enzymatic activity released in the

sperm bathing medium during capacitation.

Disruption of the mGX gene results in a lower fertility outcome.

Although no obvious reproductive phenotype has been reported for mGX-/- male mice

(48;49), we re-investigated this question by studying the fertility outcome in natural mating

and in vitro fertilization experiments (IVF) (50). Both male and female mGX-/- mice were

fertile when mated with wild-type (WT) C57BL/6J mice (not shown); however, the average

litter size of mGX-/- male mice crossed with mGX-/- females (5.40 ± 0.76 pups, n=5 p<0.05)

was slightly lower than that of WT littermates (8.16 ± 0.39 pups, n=37) (Figure 3A), possibly

9
indicating a lower fertility of mGX-/- animals. To discriminate between male or female

reproductive deficiency, we performed IVF with mGX-/- sperm and WT oocytes. We scored

the different types of egg/oocytes obtained 24 hours after mixing sperm with oocytes:

unfertilized oocytes, 2-cell embryos (normal stage) and aborted embryos, and we used the 2-

cell embryos values to measure fertility (51), since 2-cell embryos are appropriate for transfer

into the female tract (Figures 3B and C). We controlled that oocytes incubated without sperm

in M16 medium for 24 hours did not present any type of cell division (not shown). In IVF

experiments, the fertilizing potential of mGX-/- sperm was clearly impaired when compared to

WT littermate sperm (Figure 3D). Indeed, the rate of 2-cell embryos was reduced from 67.6 ±

2.2% (n=13) for mGX+/+ sperm to 37.6 ± 3.9% (n=11, p<0.01) for mGX-/- sperm while the

rate of aborted embryos increased from 7.7 ± 1.6% to 11.9 ± 1.9% (n=11, p<0.05) for mGX+/+

and mGX-/- sperm, respectively. The percentage of unfertilized oocytes was also increased by

more than 2-fold for mGX-/- sperm. Interestingly, the impaired fertility of mGX-/- sperm was

rescued by incubating mGX-/- sperm with recombinant mGX protein throughout the

capacitation period (Figure 3E).

Endogenous mGX sPLA2 regulates spontaneous AR.

The fact that mGX sPLA2 is released during AR plus the fact that lysophospholipids and fatty

acids, two products of sPLA2 activity can activate AR (42;52) makes possible that the mGX

released during the early time points of capacitation boosts spontaneous AR in a paracrine

manner. To explore this possibility, we compared the kinetics of spontaneous AR between

sperm from mGX+/+ and mGX-/- mice. The early onset of spontaneous AR was unchanged

between mGX+/+ and mGX-/- sperm. However, the level of spontaneous AR of mGX-/- sperm

occurring during the late phase of capacitation (55-90 min) was markedly lower than that of

mGX+/+ sperm (Figure 4A) and reached a plateau during the late phase of capacitation (55-90

10
min). To confirm the ability of mGX to trigger AR, we evaluated the capacity of exogenous

recombinant mGX to trigger AR during capacitation (Figure 4B, C and D). The mGX

recombinant enzyme was highly effective since concentrations as low as 0.2 nM could induce

AR of about 25% of the sperm population when incubated with sperm for 10 min. mGX

caused a dose-dependent activation of AR with a maximal increase of ~50% observed at

concentrations higher than 200 nM. These results were expressed as total AR minus

spontaneous AR, in order to show the specific sPLA2-induced AR (Figure 4B). Incubation of

uncapacitated sperm for 10 min with 200 nM mGX increased the rate of total AR from 23.7 ±

1.4% to 68.1 ± 2.1% (n=23, p<10-5) (Figure 4C). Finally, a brief incubation of non-

capacitated or capacitated sperm with the enzyme for 10 min before scoring AR indicates that

mGX kept the ability to induce AR throughout capacitation (Figure 4D). Together, our results

demonstrate that spontaneous AR occurring during the late phase of capacitation is controlled

by the secretion and paracrine activity of mGX. Our results also indicate that mGX modifies

the ratio between two sperm subpopulations: the acrosome-reacted and the non-acrosome-

reacted sperm. Importantly, we observed that very high concentrations of recombinant mGX

sPLA2 did not induce AR of the entire sperm population, and that about 30% of the sperm

population remain fully resistant to mGX in our conditions of capacitation.

mGX sPLA2 triggers AR via its catalytic activity and independently of cytosolic Ca2+ rise.

To determine whether the catalytic activity of mGX is required for the induction of AR, we

first tested the catalytically-inactive H48Q mutant of mGX. As for several other sPLA2s with

a mutation at the active site histidine (53;54), the mGX H48Q mutant has less than 0.1% of

WT catalytic activity (not shown). This mutant was unable to trigger AR of uncapacitated

sperm (Figure 5A- □). We then tested the effect of recombinant pro-mGX, the zymogen form

of mGX, which has very low enzymatic activity (55). Pro-mGX was also unable to trigger AR

11
at 200 nM (Figure 5A - Δ). Finally, we tested LY329722, a very specific sPLA2 inhibitor

(compound A in (56)), and found that this inhibitor blocked the sPLA2-induced AR of

capacitated sperm at 1 µM (Figure 5B). Together, these results demonstrate that the catalytic

activity of mGX is essential for inducing AR. We also wondered whether Ca2+ influx was

required for mGX-induced AR. To address this question, sperm were loaded during 30 min in

a non capacitating medium with BAPTA-AM, a cell-permeant and fast chelator of Ca2+.

Sperm were then washed and incubated for another 30 min to allow for a complete de-

esterification of BAPTA-AM. At the end of this procedure, sperm were immobile, indicating

efficient chelation of cytoplasmic Ca2+ by BAPTA. Sperm were then incubated with mGX for

10 min and AR was scored. The effect of mGX was not prevented by BAPTA, indicating that

calcium signaling is not involved in sPLA2-induced AR (Figure 5C).

Acrosome- and non-acrosome-reacted sperm treated with mGX present normal

ultrastructural morphology.

We studied by electron microscopy the effect of mGX on sperm head ultrastructure. We first

found that non-acrosome-reacted sperm treated for 10 min with 200 nM mGX presented

ultrastructural characteristics (Figure 6A) which are undistinguishable to those of untreated

sperm (Figure 6B), without any apparent defect in the acrosomal area. We next analyzed the

morphology of acrosome-reacted sperm. There are 3 morphological criteria by which an AR

can be evaluated as normal : i) the outer acrosomal membrane should present vesiculation, ii)

the plasma membrane should fuse with the outer acrosomal membrane and iii) it should

present a characteristic double hairpin shape at the base of the acrosome (57). We compared

A23187-induced and mGX-induced AR. All the sperm which were acrosome-reacted by

A23187 presented a complete AR exhibiting the 3 above morphological criteria (not shown).

The sperm which were acrosome-reacted by mGX were judged as normal on the basis of the

12
same morphological criteria (Figure 6C). We also observed very early stages of AR-like

cavitation of the acrosomal matrix (Figure 6D). Together, our analyses indicate that treatment

of sperm with mGX produces non-acrosome-reacted sperm and acrosome-reacted sperm with

a normal morphology.

The fertility outcome is dependent on the rate of spontaneous AR controlled by mGX sPLA2.

A fraction of the sperm population was found to be fully resistant to recombinant mGX, even

at concentrations as high as 500 nM (Figure 4B). This suggests that recombinant mGX

specifically targets a subpopulation of sperm and trigger their AR prematurely, ie before

fertilization. Since endogenous mGX is released during capacitation (Figure 2), a similar

mechanism may be operating physiologically and the role of endogenous mGX would be to

target a specific subpopulation of sperm which may have defective sperm function. To

address this possibility, we performed in vitro fertilization experiments with WT sperm

pretreated with the sPLA2 inhibitor LY329722 throughout capacitation. Again, we used the 2-

cell embryos outcome as an endpoint to measure fertility (51), since the development of 2-cell

embryos is independent of female factor and they are appropriate for transfer into the female

tract. Treating sperm with LY329722 decreased the rate of 2-cell embryos by 23% (n=8,

p<0.023), which was compensated by the increased rate of aborted embryos (Figure 7A).

Importantly, the inhibitor did not alter the fertilizing potential of sperm since the rate of

unfertilized oocytes remained constant. We also followed spontaneous AR in the presence of

LY329722 during capacitation (Figure 7B). As expected and in accordance with the results

shown in Figure 4A, the onset of spontaneous AR was not modified by LY329722. However,

the spontaneous AR occurring during the late phase of capacitation (55-90 min) was markedly

reduced by the inhibitor. Similar results were obtained with indoxam, another sPLA2 inhibitor

(55) (not shown). Since inhibitors such as LY329722 have a low membrane permeability

13
(58), the inhibition of spontaneous AR is likely due to inhibition of mGX after its release in

the cell medium, and not to inhibition of mGX still present in the acrosome. The fact that

LY329722 blocks spontaneous AR and reduces fertility suggests that the level of spontaneous

AR controlled by mGX is an important factor controlling the fertility outcome. To confirm

this view, we performed IVF with sperm briefly treated with 200 nM recombinant mGX

during the last 10 min of capacitation (see Figure S1 for the time course of this type of

experiment). In accordance with the results of Figure 4C, this treatment elicited AR of ~70%

of treated sperm, and was blocked by LY329722 (Figure 8A). This treatment led to an

increased rate in 2-cell embryos from 38.09 ± 5.27% for control to 57.50 ± 4.69% for treated

sperm (n=13, p<0.0002) (Figure 8B). As for LY329722 (Figure 7A), mGX treatment did not

change the fertilization potential of sperm since the rate of unfertilized oocytes remained

constant: the increased rate of 2-cell embryos was compensated by the decreased rate of

aborted embryos, from 32.95 ± 5.06% to 19.85 ± 2.96% (n=13, p<0.005). Furthermore, we

found that embryos obtained with mGX-treated sperm developed normally to the blastocyst

stage (Figure 8C) and that re-implanted blastocyst embryos gave rise to normal pups (not

shown). The effect of exogenous mGX on fertility was dependent on its enzymatic activity

since preincubation of mGX with LY329722 for 15 min before the short sperm treatment

blocked the positive effect on IVF (Figure 8D). We then reasoned that mGX may influence

fertility by decreasing the number of sperm able to cross the zona pellucida, and thus by

decreasing the risk of polyspermy. Indeed, the number of sperm in an IVF droplet profusely

exceeded the minimal number necessary to maximize the IVF outcome. To test this

hypothesis, we evaluated the IVF outcome (2-cell embryos) with a non-acrosome-reacted

sperm concentration equivalent to the one obtained after mGX treatment. This dilution did not

increase the fertility rate (Figure 8E) and ruled out the hypothesis of a decreased risk of

polyspermy due to mGX treatment. Altogether, the results shown in Figures 7 and 8 clearly

14
indicate that the fertility outcome of our IVF experiments is linked to the level of AR

controlled by mGX.

LPC, an sPLA2 metabolite, increases the fertilization potential of sperm.

We have demonstrated above that mGX, which is spontaneously released by sperm during

capacitation triggers AR of a subpopulation of sperm via a paracrine amplification loop. Our

IVF experiments further support the notion that this subpopulation of sperm is less fertile and

poorly promotes normal embryo development. Moreover, mGX-/- sperm also present a deficit

of fertilization potential, as indicated by the decrease of fertilization rate (Figure 3D); and this

is suggestive of a role for mGX or its catalytic products downstream of capacitation. To test

this hypothesis, we allowed WT sperm to capacitate in the presence of YM26734, another

potent sPLA2 inhibitor (59), washed the sperm by centrifugation to remove the inhibitor, and

then performed IVF experiments in the absence or presence of LPC, a major catalytic product

of mGX (60). Interestingly, treatment with YM26734 alone decreased the rate of fertilization

by 50%, from 58.9 ± 6.8% to 35.6 ± 5.7% (n=3) while addition of LPC could rescue the

fertilization potential of YM26734-pretreated sperm with a fertilization rate of 52.7 ± 9.7%

(n=3) (Figure 9A). To confirm the effect of LPC, we performed similar experiments in the

presence of a mGX rabbit polyclonal antibody and obtained similar results: the 2-cell rate

decreased from 51.7 ± 5.2% with control sperm to 32.4 ± 2.1% with sperm treated with mGX-

Ab and LPC, introduced after the capacitation of Ab-treated sperm, rescued the 2-cell embryo

rate to 57.1 ± 8.2% (n=3) (Figure 9B). Importantly, we observed that treatment of sperm with

LPC alone had not effect on the rate of fertilization at this concentration (not shown). This

result demonstrates that LPC, a mGX metabolite, is required for normal fertilization and

suggests a second role for mGX, downstream of the control of spontaneous AR. The

fertilization potential of the non-acrosome-reacted sperm subpopulation is thus dependent on

15
mGX enzymatic activity and mGX or LPC is likely involved in one of the different steps of

fertilization occurring after capacitation, including sperm binding on ZP, ZP-induced AR

and/or sperm-egg fusion.

Discussion

This paper shows for the first time that mGX sPLA2 is present in large amounts in the sperm

acrosome and plays an important paracrine role in the control of spontaneous AR during

capacitation, which is associated to a dramatic impact on fertility outcome. Our results also

provide indirect evidence that mGX plays a role during the downstream fertilization step, and

thus likely acts at two major stages of reproduction, capacitation and fertilization. Finally, our

findings may open new possibilities for the improvement of assisted reproduction techniques.

We first unambiguously identified mGX sPLA2 as the major enzyme loaded in the mouse

sperm acrosome, based on in situ hybridization, immunohistochemistry and time-resolved

fluoroimmunoassays using mGX-/- mice as negative control. There have been numerous

biochemical reports in the past 40 years showing the presence of an sPLA2-like protein in

sperm cells, but the identity of this sPLA2 was never clarified (32-36). This enzyme was of

low molecular mass, reported as a proenzyme, resistant to heat and acid extraction, Ca2+-

dependent, could hydrolyze both phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine, and was

sensitive to non specific sPLA2 inhibitors such as mepacrine, p-bromophenacyl bromide,

aristolochic acid, Ro-4493 and Ro-4639. All of these features match those of group X sPLA2

(61-63). The enzyme was detected in sperm of several mammalian species including mouse,

hamster, rabbit, bull, ram and humans. Although several sPLA2s are present in mouse male

reproductive organs (31), we did not detect mGIIA, mGIIE and mGV sPLA2 proteins in

mature mouse sperm cells throughout in vitro capacitation while the expression of mGX was

very high, reaching several ng of mGX protein per million of sperm cells. This value appears

16
very high when compared to the level of expression of mGX protein in various mouse tissues

(64) and fits with the very high expression of mGX mRNA detected in testis by RNA dot blot

analysis (62). Whether group X sPLA2 is also present in the sperm acrosome in other species

including humans remains to be determined. Interestingly, a proenzyme form was detected in

human sperm (34), and this would fit with the fact that human group X sPLA2 has a

propeptide sequence (61). Langlais et al then reported the N-terminal sequence of a low

molecular mass PLA2 purified from human sperm (35), but this sequence did not match any

known human sPLA2s including group X. More recently, Riffo et al (45) and Lessig et al (36)

reported the presence and release of an sPLA2 from human sperm, but the two studies were

performed using antibodies with unknown specificity towards the different sPLA2 isoforms,

and were thus inconclusive regarding the identity of the sPLA2. Finally, there are evidence

suggesting that other PLA2s including group VIA iPLA2 and likely a cPLA2 member are

present in sperm cells (28;32). The locations of these intracellular PLA2s and their likely

distinct roles in sperm function remain to be investigated using inhibitors targeting

specifically these enzymes.

We then investigated the role of mGX during in vitro capacitation and found that the sPLA2

controls to a large extent the percentage of sperm cells undergoing “spontaneous” or

premature AR, thereby inactivating them for the fertility race. Our experiments with WT

versus mGX-deficient sperm first indicate a delayed paracrine role of endogenous mGX

sPLA2 on the rate of spontaneous AR (Figure 4A). Concerning the delayed action of mGX, it

has been shown that different lipid mediators such as PGE1 and PAF can trigger AR and are

produced early during in vitro capacitation (37;65). It is thus tempting to speculate that such

lipid mediators are produced at the onset of capacitation on a subpopulation of “excessively

primed” or damaged sperm by an intracellular PLA2-dependent mechanism that triggers

17
initial AR and thereby releases mGX sPLA2 which in turn amplifies spontaneous AR in a

paracrine loop of activation.

The use of recombinant mGX sPLA2 shows that subnanomolar concentrations of the enzyme

can promote AR all over the time course of capacitation (Figure 4B, C and D) and thus

demonstrates the high potency of mGX on AR. Interestingly, the action of mGX on AR

reaches a maximal effect, even when using very high concentrations (Figure 4B), and leaves

intact a subpopulation of sperm cells showing a normal morphology (Figure 6) and capable of

fertilizing oocytes (Figure 8). Together, our results indicate that mGX likely contributes as an

important factor to explain spontaneous AR and to participate to in vitro capacitation, at least

by triggering “spontaneous” AR in a subpopulation of likely damaged sperm. This suggests a

role of mGX in sperm cell sorting during capacitation as a mechanism to improve fertility

outcome. Our current view of the in vivo situation is that the heterogeneous population of

ejaculated sperm becomes exposed to mGX sPLA2 (and possibly other sPLA2 activities) after

their mixing with seminal plasma secretions and during their swimming through the female

tract. Indirect evidence supporting this view include the fact that i) various populations of

sperm with a different lipid composition, a damaged plasma membrane and externalization of

phosphatidylserine related to “spontaneous” AR have been identified (12;13;66) ii) seminal

plasma and female tract secretion both contain endogenous PLA2 regulators (67-70) iii) a

relationship was found between PLA2 activity in human sperm, semen fluid and male fertility

(71),

The mechanism by which mGX promotes AR clearly depends on its enzymatic activity first

because the catalytically-inactive mutant H48Q and the proenzyme form of mGX are inactive

and second because the specific sPLA2 inhibitor LY329722 prevents mGX-induced AR

(Figure 5A and B). The target of mGX is likely phosphatidylcholine and

phosphatidylethanolamine enriched in polyunsaturated fatty acids at the sn-2 position, which

18
are reorganized in the sperm head plasma membrane in microdomains during capacitation

(7;72-75). Sphingomyelin may have a role of regulator of mGX activity. Indeed, we and

others have shown that mGX has a potent hydrolytic activity on such phospholipids and that

sphingomyelin could regulate its activity (63;76;77). Moreover, sphingomyelinase speeds up

sperm capacitation and increases spontaneous AR (78). The fact that the two major products

of mGX sPLA2, LPC and free fatty acids are able to trigger AR also supports this mechanism

(42;43;52). This direct mechanism also fits with the fact that mGX-induced AR does not

require intracellular Ca2+ (Figure 5C). Whether mGX may be acting on a particular population

of damaged sperm with altered plasma phospholipid asymmetry including externalized

phosphatidylserine or oxidized phospholipids associated with a decreased fertility potential

also remains to be determined (14;66;79;80).

We have clearly demonstrated that mGX sPLA2 is a potent regulator of spontaneous AR

during capacitation, and a defect in this process or its inhibition has a marked negative effect

on the fertility outcome, by increasing the rate of aborted embryos and decreasing the rate of

2-cell embryos. We have indeed demonstrated that i) decreasing AR by inhibition of mGX

decreases fertility outcome while increasing AR by addition of recombinant mGX increases

fertility outcome, and ii) mGX-/- sperm shows simultaneously a lower rate of spontaneous AR

and a higher rate of aborted embryos, when compared to mGX+/+ sperm. In sperm from

CD46-deficient mice, a positive link between the rate of spontaneous AR and fertility has

been mentioned but not demonstrated (3). It is important to note that the effectors used to

modify the rate of spontaneous AR have been applied only during capacitation and then

washed out, and thus these effectors or mGX catalytic products are unlikely to affect the

downstream fertilization events. Our experiments thus support a model where mGX sPLA2

targets a subpopulation of sperm, triggers their premature AR during capacitation, and thereby

discards them from the competition race for fertilization.

19
Our experiments also provide evidence for a second role of mGX during fertilization, after

zona pellucida-induced AR and the release of mGX in the sperm-egg environment. Indeed,

we have shown that mGX-/- sperm presented a fertilization rate lower than that of mGX+/+

sperm, with a mean decrease of 44% to 68% (Figure 3D and 3E). In comparison, blocking

mGX activity during capacitation of mGX+/+ sperm also produced a decrease of the

fertilization rate, but remarkably lower than mGX-/- sperm, with mean decreases of only 24%

(with LY329722, Figure 7A), 39% (with YM26734, Figure 9A) and 37% (with mGX

antibody, Figure 9B). These results clearly support a second role of mGX downstream of

capacitation. Assuming that mGX has two different mechanisms of action, one during

capacitation and another during fertilization, one can expect to see a more robust effect on

fertility when using mGX-/- sperm than when using an sPLA2 inhibitor or an antibody which

were only added during capacitation and that would block only released mGX sPLA2. Indeed,

it is important to note that in the experiments using sPLA2 inhibitor or mGX antibody, the

acrosomal mGX present in non-acrosome reacted sperm should remain fully active since

inhibitors have low permeability (58), antibodies are impermeant, and these compounds were

washed out before gametes mixing. Second, the fact that LPC, which was only added during

the fertilization step, was able to restore the fertilizing potential of sperm capacitated in

conditions where mGX was inhibited, may also supports a role of mGX when secreted during

zona-pellucida-induced AR. Besides, LPC increases both sperm binding to ZP and sperm-

oocyte fusion (44;45). The targets of the mGX metabolites allowing sperm to efficiently

fertilize egg remain however to be determined. In conclusion, we have demonstrated that the

fertility outcome is controlled by mGX, acting at two different stages, and any defects in

mGX activity at these stages in vitro produces a drop in fertility.

We have however observed no defect in fertility when crossing mGX-deficient male mice

with WT females (not shown). This would argue for a non critical role of mGX in sperm

20
function, but given the essential role of sperm in the propagation of life, a redundancy of

systems would not be unexpected. Indeed, there are many examples of knockout mice lacking

important genes in sperm physiology and AR which are apparently fertile because of

redundant or compensatory mechanisms. A non-exhaustive list of such genes include Ca2+

channels (81;82), acrosin (83), caveolin-1 (84) or a sperm specific aminophospholipid

transporter (14). The lack of obvious reproductive defect in mGX-/- mice is supported by the

fact that multiple extra or intracellular PLA2 activities have been described in sperm

physiology which may act in concert or may be partially redundant(27;28;32). However, we

observed a lower fertility when crossing male and female mGX-deficient mice (Figure 3).

This result suggests that mGX is also present in the female tract and may compensate for the

deficit of mGX in sperm. This view is supported by our preliminary data showing the

presence of mGX sPLA2 in the female reproductive tract, notably in the uterine and

endometrial epithelium (unpublished data). Similar observations have been made for group

VIA phospholipase A2 knockout mice, where crossings between group VIA-deficient males

and females produced almost no offspring while crossings between group VIA-deficient

males and WT females did (28). More generally, this mGX-/- sperm phenotype illustrates a

well-known human infertility situation where the infertility of a couple is due to the

combination of male and female deficits. Such a cause is involved in approximately 20% of

infertile couples (83).

Sperm population is very heterogeneous and an important fraction (20-30%) presents

morphological or functional defects that impair embryo development as demonstrated for

human sperm with pre-apoptotic status (85),(86) and therefore reduces the overall fertility

outcome. Our data support the view that mGX triggers a premature AR of an unfertile sperm

subpopulation which is unable to ensure normal embryo development; and mGX would

prevent this population to participate as negative competitors to the fertilization process.

21
Therefore, the so-called “spontaneous AR” would correspond in part to the premature AR

triggered by mGX and could represent a physiological mechanism of sperm cell sorting, that

compensates for the unreliable production of sperm. Such mechanisms would be important to

optimize fertility both in vivo and in vitro. We have demonstrated that recombinant mGX

boosts the endogenous effect of mGX on spontaneous AR and improves noticeably the rate of

success of IVF. Moreover, sperm resistant to mGX-treatment, i.e. non-acrosome-reacted

sperm, presented a normal ultrastructural morphology and fertilized oocytes obtained with

mGX-treated sperm developed normally up to the blastocyst stage in vitro. Besides, a recent

study has shown that removal of a human sperm population with externalized

phosphatidylserine may enhance fertility potential in assisted medical procreation (80) and

group X sPLA2 may be useful to eliminate this population. Thus, mGX is a peculiar sPLA2

that represents a hope for new therapeutic strategies to fight against human male infertility:

mGX could be used as a potent therapeutic agent in assisted reproduction techniques, either to

improve IVF outcome or to select sperm for intra-cytoplasmic sperm injection based on its

acrosomal status .

22
Methods

All animal procedures were run according to the French and Japanese guidelines on the use of

living animals in scientific investigations with the approval of the respective local Ethical

Review Committee.

In situ hybridization . Paraffin embedded blocks and sections of 8-wk-old mouse testis for in

situ hybridization (ISH) were obtained from Genostaff Co., Ltd. The mice were dissected,

fixed with Tissue Fixative (Genostaff Co., Ltd.), and then embedded in paraffin by their

proprietary procedures, and sectioned at 6~8 µm. For in situ hybridization, tissue sections

were de-waxed with xylene, and rehydrate through an ethanol series and PBS. The sections

were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 15 min and then washed with PBS. The

sections were treated with 8 µg/ml proteinase K in PBS for 30 min at 37°C, washed with PBS,

re-fixed with 4% paraformaldehyde in PBS, again washed with PBS, and placed in 0.2 N HCl

for 10 min. After washing with PBS, the sections were acetylated by incubation in 0.1 M tri-

ethanolamine-HCl, pH 8.0, containing 0.25% acetic anhydride for 10 min. After washing with

PBS, the sections were dehydrated through a series of ethanol. Sense and antisense cRNA

probes for mGX were prepared by random priming with digoxigenin (DIG) RNA Labeling

Mix (Roche). Hybridization was performed with the probes at concentrations of 300 ng/ml in

the Probe Diluent-1 (Genostaff Co., Ltd.) at 60°C for 16 h. After hybridization, the sections

were washed in 5 x HybriWash (Genostaff Co., Ltd.), equal to 5 x SSC, at 50°C for 20 min

and then in 2 x HybriWash containing 50% formamide at 50°C for 20 min, followed by

RNase treatment in 50 µg/ml RNase A in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, containing 1M NaCl and

1mM EDTA for 30 min at 37°C. Then the sections were washed twice with 2 x HybriWash at

50°C for 20 min, twice with 0.2 x HybriWash at 50°C for 20 min, and once with TBST (0.1%

Tween 20 in TBS). After treatment with 0.5% blocking reagent (Roche) in TBST for 30 min,

23
the sections were incubated with anti-DIG alkaline phosphatase conjugate (Roche) diluted

1:1000 with TBST for 2 h at room temperature. The sections were washed twice with TBST

and then incubated in 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, containing 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2,

and 0.1% Tween 20. Coloring reactions were performed with NBT/BCIP solution (Sigma)

overnight and then washed with PBS. The sections were counterstained with Kernechtrot

stain solution (Mutoh), and mounted with Crystal/Mount (Biomeda).

In situ hybridization was performed with a probe of mouse group X phospholipase A2 (mGX)

that encompassed the residues 221-576 ([G+C]% = 55.90) of the Accession # NM_011987.

Quantitative RT-PCR. Total RNAs were isolated from testis and epididymis of 8-week-old

male C57BL/6 mice with TRIzol reagent (Invitrogen) and purified using an RNeasy RNA

Purification Kit (Qiagen). First-strand cDNA synthesis was performed using a High Capacity

cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems Japan). For quantitative RT-PCR

analysis, the reaction was carried out on an ABI Prism 7000 Sequence Detection System

(Applied Biosystems) using Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) and

the Taqman probe for mGX (Mm00449530_m1). The thermal cycling conditions comprised

an initial denaturation step at 50°C for 2 min and 95°C for 10 min followed by 40 cycles of

amplification at 95°C for 20 s, 55°C for 20 s, and 72°C for 30 s. The expression of 18S

ribosomal RNA (accession # X00686) was used for normalization.

Immunohistochemistry. Mouse testis samples were fixed in 10% formalin and embedded in

paraffin. The tissue sections (4 µm thick) were incubated with Target Retrieva Solution (Dako

Cytomation) as required, and then incubated overnight at 4°C with rabbit anti-mGX antibody

(from M. H. Gelb, University of Washington, Seattle) or normal rabbit IgG at 1:100 dilution

in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 0.15 M NaCl (TBS). The sections were then treated

24
with a CSA (catalyzed signal-amplified) System Staining Kit (Dako Cytomation) with

diaminobenzidine substrate, followed by counterstaining with hematoxylin and eosin.

Immunofluorescent microscopy. Epididymal spermatozoa from C57BL/6 mice were washed

with PBS and fixed on glass slides with 3% (v/v) paraformaldehyde in TBS for 1 h. After 3

washes with PBS, fixed cells were treated with blocking solution (1% (w/v) bovine serum

albumin and 0.5% (w/v) saponin in TBS) for 1 h, with rabbit anti-mGX or control antibody as

a primary antibody at 1:200 dilution in blocking solution for 2 h, and then with FITC-

conjugated anti-rabbit IgG antibody at 1:200 dilution in blocking solution for 2 h, with 3

washes in each interval. After 6 washes with TBS, immunofluorescent signals were visualized

with a laser scanning confocal microscope (IX70; Olympus).

Acrosome reaction assay. Sperm cells from caudae epididymes were allowed to swim in M2

medium for 10 min. If necessary, sperm were capacitated in M16 medium with 2% fatty acid

free BSA (Bovine Serum Albumin) at 37°C in a 5% CO2 incubator during various periods of

time. For sPLA2 treatment, sperm were incubated with sPLA2 in M16 medium at 37°C for the

last 10 min. Cells were transferred in PBS solution and then fixed with 4% PFA solution for 2

min. Sperm were washed with 100 mM ammonium acetate for 2 min and wet-mounted on

slides and allowed to air dry. Slides were then rinsed with water and stained with Coomassie

blue (0.22%) for 2 min and finally rinsed with water. Slides were counted immediately and

150 sperm cells at least were scored per slide.

Electron microscopy. Sperm cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate

buffer pH 7.4 during 2 hours at room temperature. Cells were then washed with buffer and

post fixed with 1% Osmium tetroxyde in the same buffer during 1 hour at 4°C. After

extensive washing with water cells were then stained with 0.5% uranile acetate pH 4

overnight at 4°C. Cells were then dehydrated through graded alcohol (30%-60%-90%-100%-

25
100%-100%) and infiltrate with a mix of 1/1 epon/alcohol 100% during 1 hour before several

baths of fresh epon (Flukka) during 3 hours. Finally, cells were centrifugated and immersed in

fresh Epon and polymerised during 3 days at 60°C. Ultrathin sections of the cell pellet were

cut with an ultramicrotome (Leica). Sections were post-stained with 4% uranile acetate and

1% lead citrate before being observed in an electron microscope at 80 kV (JEOL 1200EX).

Detection of sPLA2 proteins in sperm cells. Sperm cells from 8 caudae epididymes of

different mouse strains (C57BL/6J mGX sPLA2-deficient mice or their WT littermates, OF1

and BalbC) were allowed to swim for 15 min at 37°C in 2.5 ml of M2 medium. Five hundreds

µl aliquotes of sperm cells were then diluted in 4.5 ml of M16 medium containing 2% fatty

acid free BSA and further incubated at 37°C for 10, 45 and 90 min. In some assays, A23187

Ca2+ ionophore (5 µM) was added between 60 and 90 min of incubation. After incubation,

sperm cells were spun down for 8 min at 1,200 rpm, and supernatants and cell pellets were

flash frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. sPLA2 protein and enzymatic activity were

analyzed on crude supernatants and cell pellets after resuspension in 500 µl of M16 medium

containing a cocktail of protease inhibitors (EDTA-free complete inhibitor set, Roche

Biochemicals) and lysis with a Branson 350 Sonifier Cell disrupter. Time-resolved

fluoroimmunoassays (TR-FIA) for sPLA2 was performed as described with minor

modifications (64). Briefly, 1 to 5 µl of protein sample were diluted in 100 µl of Delfia assay

buffer (Tris–HCl buffered NaCl solution, pH 7.8, containing NaN3, BSA, bovine gamma

globulins, Tween 40, DTPA and inert red dye, Perkin Elmer Wallac, Turku, Finland) and

added to sPLA2 IgG-coated microtiter wells previously washed twice with TR-FIA washing

solution (10 mM Tris–HCl, pH 7.8, containing 0.9% NaCl, 0.04% NaN3 and 0.02% Tween

20). After incubation at room temperature with constant shaking at 200 cycles/min for 30 min,

wells were washed four times with TR-FIA washing solution, incubated with 100 μl of Eu-

labeled mGX IgG tracer (0.5 μg/ml diluted in Delfia Assay Buffer), and washed again four

26
times as above. After washing, 100 μl of Delfia enhancement solution were added to wells,

incubated at room temperature for 5 min with shaking at 200 cycles/min and thereafter for 10

min without shaking. Time-resolved fluorescence was measured using a Wallac Envision

Perkin Elmer plate reader and optimized optical modules for DELFIA assays. sPLA2

enzymatic activity was measured using radiolabeled E. coli membranes as substrate (63).

Briefly, 5-50 µl of cell lysates or supernatants were incubated for 60 min in 300 µl of sPLA2

activity buffer (0.1 M Tris pH 8.0, 10 mM CaCl2, and 0.1% bovine serum albumin containing

100,000 dpm of [3H]oleate-radiolabeled E. coli membranes. Reactions were stopped by

addition of 300 µl of stop buffer (0.1 M EDTA pH 8.0 and 0.5% fatty acid-free bovine serum

Albumin). Mixtures were centrifuged at 10,000 g for 5 min, and supernatants containing

released [3H]oleate were counted.

Production of recombinant sPLA2s. Recombinant mouse group IIA, IIE, V and X sPLA2s

were produced as described previously (87). PromGX sPLA2 and the H48Q mutant of mGX

sPLA2 was produced as for mature WT mGX sPLA2 using the pAB3 vector in which the full-

length cDNA coding for PromGX was inserted in frame with the ∆GST protein and the factor

Xa cleavage site, which were removed by using the factor Xa protease (87). The detailed

procedure for the production and full characterization of promGX sPLA2 will be reported

elsewhere (Jemel et al., in preparation).

In vitro fertilization. Sperm cells, obtained by manual trituration of caudae epididymes from

male mice (OF1, mGX-/- or WT littermates), were allowed to swim in M2 medium for 10 min.

Eggs were collected from mature OF1 females (6-weeks old) synchronized with 7.5 units of

PMSG (pregnant mare serum gonadotrophin) and 7.5 units of hCG (human chorionic

gonadotrophin) before collection. Per condition, the number of scored oocytes was 43 +/- 19

(mini 20 ; max 109). We carried out IVF using standard protocols (50). Eggs were incubated

with approximately 1.5 to 5 105 sperm cells/ml (37°C, 5% CO2) in M16 medium. Unbound

27
sperms were washed away after 4 hours of incubation. Twenty four hours after fertilization,

we scored the different stages (unfertilized oocytes, 2-cell embryos as an indication of

successful fertilization and aborted embryos). Schematic course of IVF experiments (Figure

S1): after swimming, sperm were first capacitated for 35 to 60 min in M16-2% BSA (37°C,

5% CO2). When necessary, mGX inhibitors of mGX antibody was included during the full

period of capacitation. For recombinant mGX treatment, sperm cells were incubated after

capacitation for 10 min in M16 medium containing 200 nM mGX, 1µM LY329722 or mGX +

LY329722. After treatment, drugs were removed by centrifugation (1200 rpm, 5 min) and

washed to remove unbound drug, possible lipid metabolites and all acrosomal compounds

released during sPLA2-induced AR. The rationale for this procedure was to avoid a

subsequent and uncontrolled effect on IVF outcome by an uncharacterized compound released

during AR like PAF (37). After drug washing, the concentration of remaining unboud mGX

was estimated to be 1 nM, from dilution calculation. We checked that 1 nM mGX did not

induce effects on sperm-oocyte fusion (38). For this purpose, we performed IVF experiments

in which sperm and oocytes were incubated with 1 nM mGX throughout the capacitation and

the fertilization: no difference was found between control and treated gametes (data not

shown). Finally, washed sperm were introduced into droplets containing between 20 and 109

oocytes. For LysoPC rescue experiments, LysoPC is introduced in the fertilization droplets in

the same time than sperm. After 4 hours of co-incubation, unbound sperm were washed away

and IVF outcomes were scored at 24h00.

Chemical compounds. M2, M16 medium and BSA (Cohn Fraction V-low fatty acid) were

purchased from Sigma. PMSG is from Ceva santé animal and HCG is from Intervet. LPC (L-

alpha-lysophosphatidylcholine from chicken egg) is from Avanti and YM26734 from

Yamanouchi Pharmaceutical, Japan.

28
Statistical study. Statistical analyses were performed with SigmaPlot. T-test was used to

compare effect of various compounds on AR. For IVF experiment, in order to avoid problem

with the variability of male fertility, the sperm from a unique male was used to compare

control and treated conditions in one experiment. Thus, we used paired t-test to compare the

rate of 2-cell embryos and aborted embryos.

Acknowledgments

This work was supported in part by the Région Rhône-Alpes (to C.A.), CNRS (to C.A. and

G.L.), INSERM (M.D.W.), the Association pour la Recherche sur le cancer [grant 3977] and

the Agence Nationale de la Recherche (to G.L.), and by grants-in aid for scientific research

from the Ministry of Education, Science, Culture, Sports and Technology of Japan and

PRESTO from the Japan Science and Technology Agency (to M.M. and S.H.) and the

NOVARTIS Foundation for the Promotion of Science, and the Toray Science Foundation

(M.M.). J.E. is supported by a fellowship by the Région Rhône-Alpes. We thank Lexicon

Genetics Inc. for providing us mGX–deficient mouse and Pr. Michael Gelb for providing

LY329722, indoxam and mGX antibody. We thank H. de Pommier and Latoxan for their

support.

29
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35
Figure 1
Expression of mGX sPLA2 in mouse spermatogenic cells. (A) Quantitative RT-PCR analysis revealed that
mGX mRNA is expressed in the testis, but only minimally in the epididymis. (B) In situ hybridization. Sections
of the testis from 8-week-old C57BL/6J mice were hybridized with antisense and sense probes for mGX.
Positive signal for mGX was detected in spermatogenic cells (spermatocytes and spermatids, but not
spermatogonia) in the seminiferous tubules. (C) Immunohistochemistry. Sections of the testis from 8-week-old
C57BL/6J mice were stained with anti-mGX antibody or control antibody. Intense staining was found in
spermatocytes and spermatids in the seminiferous tubules, but not in spermatogonia. In magnified views,
scattered signals with crescent and elongated shapes were evident in spermatocytes and spermatids, suggesting
labeling in the acrosomal area. (D) Spermatozoa from cauda epididymis were stained with anti-mGX antibody
or control antibody. Immunofluorescent signal for mGX sPLA2 was confined to the sperm head.

36
Figure 2 Catalytically-active mGX sPLA2 is released from sperm during AR. (A) Total amount of mGX
protein from time-resolved fluoroimmunoassays were measured in parallel in cell pellets and supernatants of WT
sperm during capacitation (up to 90 min) and after AR triggered by addition of the Ca2+ ionophore A23187 (5
µM) between 60 and 90 min. (B) Similar assays using mGX-/- sperm, showing no mGX signal. (C) total sPLA2
enzymatic activity measured using E. coli radiolabeled enzymatic assays in cell pellets and supernatants of WT
sperm during capacitation. Data (A,B,C) correspond to the mean of two separate experiments, with 4 mice each.

37
Figure 3
Lack of mGX in sperm affects male fertility. (A) The litter sizes of mGX-deficient mice are lower than those of littermates
WT mice. (B) Pictures of the different stages obtained after IVF at 24 hours: unfertilized oocytes; 2-cell embryos (normal
development); aborted embryos corresponding to oocytes with either multiple and uncontrolled divisions or presenting a
second polar body (2 PB) but no cell division (arrows). (C) pictures of embryo development at 24 hours after fertilization:
(+/+), WT sperm crossed with WT oocytes; (-/-), mGX-/- sperm crossed with WT oocytes; arrows show unfertilized oocytes
and asterix show aborted embryos (D) IVFs performed with mGX-/- sperm and WT oocytes (black bars) have a lower rate of
2-cell embryos and a higher rate of aborted embryos than IVFs performed with WT littermate sperm and WT oocytes (white
bars, n=11). (E) The low fertilizing potential of mGX-/- sperm is rescued by recombinant mGX. IVF was performed by
mixing WT oocytes with (i) WT control sperm from littermates (black bars, n=4), (ii) mGX-/- sperm (white bars, n=4), or (iii)
mGX-/- sperm briefly treated with 200 nM mGX (treatment for 10 min at the end of the capacitation period (grey bars, n=4)).
The development of eggs was evaluated after 24 hours by counting the different stages: unfertilized oocytes, 2-cell embryos
and aborted embryos. *** statiscally significant, p as indicated.

38
Figure 4
Endogenous mGX regulates spontaneous AR during capacitation. (A) Spontaneous AR of mGX-/- sperm
does not progress beyond 55 min of in vitro capacitation. Spontaneous AR was quantified during capacitation at
10, 55 and 90 min in mGX+/+ littermate sperm (white bars, n=5) and in mGX-/- sperm (black bars, n=6). (B)
Recombinant mGX sPLA2 is a potent inducer of AR. Dose-response curves for AR of non-capacitated sperm
triggered by mGX (●, n=3 to 8). Results are expressed as total AR minus spontaneous AR to underline specific
sPLA2-induced AR. (C) Recombinant mGX at 200 nM induced AR of non-capacitated sperm, n=23. Here,
results correspond to total AR (D) Recombinant mGX sPLA2 is a potent inducer of AR throughout in vitro
capacitation (n=3). AR triggered by sPLA2 was compared to spontaneous AR at 10 and 90 min of capacitation.
Sperm were capacitated at 37°C in M16 with 2% BSA in a 5% CO2 chamber. *** statistically significant, p as
indicated.

39
Figure 5
mGX triggered AR via its catalytic activity and independently of cytosolic Ca2+ rise. (A) Dose-response
curves for AR of non-capacitated sperm triggered by mGX (●, n=3 to 8), mGX-H48Q ( , n=3) and pro-mGX
(Δ, n=3). Results are expressed as sPLA2-specific AR, i.e. total AR minus spontaneous AR. (B) The specific
sPLA2 inhibitor LY329722 (1 µM) blocked the ability of 200 nM mGX to trigger AR of sperm capacitated
during 45 min (n=3). Results correspond to total AR (C) Loading sperm with 10 µM BAPTA did not modify
spontaneous AR (two left columns, n=3) and mGX-induced AR (two right columns, t-test N.S., n=3) of sperm
incubated in a non capacitating medium (no BSA). In the presence of BAPTA, the level of AR between non-
treated sperm and mGX treated sperm is statistically significant, p as indicated.

40
Figure 6
Ultrastructure of the head of mGX-sPLA2 treated sperm (A) Electron micrographs of non acrosome-reacted
sperm treated by 200 nM mGX (non capacitated sperm). (B) Electron micrographs of non acrosome-reacted
control (untreated) sperm (non capacitated sperm). (C) Acrosome-reacted sperm (non capacitated sperm) in the
presence of 200 nM mGX presented a normal morphological feature of sperm undergoing AR: fusion between
the plasma and acrosomal membrane produced vesiculation (left picture) and the outer acrosomal membrane was
fused with the plasma membrane and presented a typical double hair pin shape at the base of the acrosome (right
picture) or (D) presented early stages of AR, i.e. cavitation.

41
Figure 7
Blocking endogenous mGX with the specific inhibitor LY329722 impacts both fertility outcome and
spontaneous AR. (A) Endogenous mGX, secreted during spontaneous AR, controls the yield of viable embryos,
without changing the rate of fertilization. IVF experiments were performed either with control sperm (white
bars) or with the same sperm treated throughout capacitation with 1 µM LY329722 (black bars, n=8 males) and
unfertilized oocytes, 2-cell embryos and aborted embryos were scored: inhibiting mGX decreases 2-cell embryos
and increases aborted embryos. The design of the experiments clearly indicates that LY329722 controls the yield
of viable embryos by inhibiting endogenous mGX secreted during spontaneous AR. (B) The sPLA2 inhibitor
LY329722 blocked the late phase of spontaneous AR. Spontaneous AR was quantified during capacitation at 10,
55 and 90 min in the absence (white bars) or presence of 1 µM LY329722, (black bars, n=5). *** statistically
significant, p as indicated (paired t-test).

42
Figure 8
Exogenous mGX reinforces the effect of endogenous mGX on spontaneous AR and improves the fertility outcome. (A)
Sperm used for IVF and briefly pretreated with exogenous mGX present a higher rate of spontaneous AR. WT sperm were
allowed to capacitate for 45 min and incubated during the last 10 min of capacitation with mGX alone (200 nM), LY329722
alone (1 µM), or mGX preincubated with LY329722. Only the mGX treatment triggered significant AR over the untreated
condition (n=6). (B) Recombinant mGX controls the yield of viable embryos, without changing the rate of fertilization. IVF
was performed either with control sperm (untreated, white bars) or with the same sperm treated briefly 10 min before the end
of the capacitation period with 200 nM mGX (black bars, n=13 males, p<0.01) and unfertilized oocytes, 2-cell embryos and
aborted embryos were scored: recombinant mGX increases 2-cell embryos and decreases aborted embryos. (C) 2-cell
embryos obtained with mGX -treated sperm developed normally to the blastocyst stage in comparison to control embryos.
(D) The specific mGX inhibitor LY329722 blocks the mGX-dependent increase in fertility. IVF was performed either with
control sperm (untreated, white bars) or with the same sperm treated briefly for 10 min before the end of the capacitation
period with 200 nM mGX (black bars, n=6 males, p=0.02) or with the same sperm treated briefly with 200 nM mGX but
preincubated with 1 µM LY329722 (grey bars, n=6, p=0.02) and unfertilized oocytes, 2-cell embryos and aborted embryos
were scored (E) The number of sperm incubated with oocytes does not impact the fertility outcome. IVF were performed at
two different concentrations of WT sperm. The number of non-acrosome-reacted sperm measured at the low concentration of
sperm (70% of 1.5 x 105 cells – obtained from Figure 8A) was similar to the number of non-acrosome-reacted sperm
measured at the high concentration when treated by 200 nM mGX (35% of 3 x 105 cells - obtained from Figure 8A), (n=4,
p=0.21). Thus, changing sperm concentration does not change the 2-cell embryos and aborted embryos outcomes. ***
statistically significant, p as indicated (paired t-test).

43
Figure 9
Addition of LPC during fertilization rescues the fertilization potential of sperm treated with sPLA2
inhibitor or anti-mGX antibody during capacitation. (A) IVF experiments were performed with sperm
treated or not with the sPLA2 inhibitor YM26734 only during the capacitation period. LPC (1 µg/ml) was added
only during gamete mixing. The ~50% reduction of the IVF rate measured with YM26734-treated sperm (grey
bar n=3, p<0.05) was restored by supplementation with LPC (black bar). (B) A similar reduction and recovery of
IVF were observed when sperm were treated with anti-mGX antibody during capacitation and LPC added back
during gamete mixing (n=3, p<0.05), respectively.

44
Figure S1
Schematic drawing of typical IVF experiments. Sperm were first capacitated for 35 min in M16-2% BSA and
then incubated for the last 10 min with M16 medium containing the different effectors as specified in Figure
legends, i.e. mGX recombinant protein, sPLA2 inhibitors or a combination of both. After treatment, sperm were
washed by centrifugation to remove unbound effectors, putative mGX catalytic products and all acrosomal
compounds released during sPLA2-induced AR. Finally, washed sperm were introduced into droplets containing
oocytes (20-109 oocytes per experiment). After 4 hours of gamete mixing, unbound sperm were washed away
and IVF outcomes were scored at 24 h.

45
 Commentaires des rewiever pour l’article: Group X
phospholipase A2 is secreted during sperm acrosome reaction
and controls fertility outcome

Dear Dr. ARNOULT,

I am writing to you on behalf of the Journal of Clinical Investigation's Editorial Board to

thank you for submitting your manuscript, "Group X phospholipase A2 is secreted during
sperm acrosome reaction and controls fertility outcome" (our reference 40494-RG-1). After
careful examination of your manuscript by both expert outside reviewers as well as the
Editors, the Board has determined that your manuscript, in its current form, does not achieve
the priority necessary for publication in the Journal of Clinical Investigation. Although all
reviewers agree that your study is of potential interest and importance, a number of
substantive concerns were raised upon review. If you believe that you can respond to the
issues raised in the review process, we would be pleased to consider a revised version of this
manuscript.

We hope that you will find the reviewers' comments helpful as you revise your manuscript.
Following receipt of a revised manuscript, your paper will be re-evaluated and assigned a new
priority ranking. Please be aware that current editorial policy permits only one revision of this
manuscript and that we can offer no assurances that the work will ultimately be accepted.
Also bear in mind that we will be reluctant to approach the original referees again in the
absence of appropriate changes to address their concerns.

If you choose to resubmit, please enclose a point-by-point response to the reviewers'

comments and a list of the incorporated changes, including the location in the manuscript of
those changes. Thank you for giving us the opportunity to review this work, and we look
forward to seeing the revised manuscript.

Sincerely,Laurence A. Turka, M.D.Editor-in-Chief

Reviewer comments:Reviewer A:

This manuscript provides novel information on the role of mGX sPLA2 in male fertility. The
clinical relevance of the study would be enhanced if the authors could demonstrate the
presence of GX sPLA2 in human sperm.

Specific comments:

Abstract: The statement “The size of litters from male mGX-deficient mice was slightly
smaller than that of wild-type males” is somewhat misleading.

Methods: The authors should describe how the GX sPLA2-/- mice were generated (or provide
reference).

Figure 1D: If the authors want to conclude that GX sPLA2 is “confined” to the sperm head,
they should provide more convincing data. Fluorescent microsopic images (rather than
Nomarsky(?)) showing multiple cells would be appropriate. For the example shown, there
seems to be green staining along the length of the tail region.

There are aspects of the data presented in Fig. 2 that don’t appear to “add up”. For example,
it is notable that the Ca2+ ionophore triggers a ~2-fold increase in GX sPLA2 release at 90
min, yet the amount of GX sPLA2 in the pellet does not change. Also, the kinetics of the loss
of GX sPLA2 mass in cells does not correspond to loss in activity (e.g., 45 min. time point).
No error bars are indicated on the histograms; how many times was this experiment
performed, and with how many replicates?

For enzymatic assays of cell pellets (Fig. 2C), how does the assay distinguish between sPLA2,
cPLA2 and iPLA2? The authors provide data for mGX sPLA2 mass in WT and KO mice
(Fig. 2B), but no data for sPLA2 activity. What does “the measured enzymatic activity was
due to mGX since no variation of enzymatic activity was observed in mGX-/- sperm” mean
(p. 9, line 10)?

The authors should include activity data for WT and KO mice to make clear the contribution
of GX sPLA2.The text describing Fig. 4 is confusing, and this is confounded by the fact that
the data is presented as “% of spontaneous AR”, “% of mGX-induced AR” and “% of total
AR.” The authors state “mGX caused a dose-dependent activation of AR with a maximal
increase of ~50%...” (p. 11 line 5); what is being compared? Is the effect of GX sPLA2
deficiency on spontaneous AR statistically significant (Fig. 4A)? What is the dose of mGX
used in Fig. 4D ?

How is the experiment depicted in Fig. 4C different from Fig.4D, 10 min timepoint? Results
presented in Fig. 4A and Fig. 7B give the impression that the sPLA2 inhibitor has a greater
effect on the late phase of spontaneous AR than deficiency in GX sPLA2, suggesting the
possible involvement of another sPLA2 in this process or non-target effects of the inhibitor.

Discussion: The authors suggest that GX sPLA2 improves fertility by triggering spontaneous
AR in a subpopulation of damaged cells, perhaps by targeting phospholipid-damaged sperm.
This would imply that hydrolysis per se, and not the generation of lipolytic products, is
important in this paracrine effect of GX sPLA2. To complement the studies in Fig. 9, the
authors should determine whether addition of LPC rescues the decrease in spontaneous AR
produced by LY329722 treatment.

Reviewer B:

This manuscript by Escoffier et al describes the invalidation of mGX sPLA2 a member of the
secreted Phospholipase A2 family and its impact on mouse fertility. This manuscript is
presented as an accompanying paper with another manuscript from a Japanese group (Sato et
al., MS 40493) reporting the KO of another testis- and epididymis-expressed sPLA2.

Specifically dealing now with the Escoffier's story, the manuscript is correctly written but
unecessarilly too long especially in the Discussion section. Although at a lower extent, the
Introduction and the results sections could be more concise. The number of references is also
large and should be kept to the most relevant articles. The story is of particular interest to
specialists in male reproductive issues however it is relatively not that important in terms of
clinical relevance. Although the invalidation of mGX PLA2 has an impact on fertility
outcome when crosses were conducted with both males and females deficient for mGX PLA2,
the fact that there is no fertility problem when KO-males were crossed with WT females
argues for a non critical role of this enzyme in sperm function.

The female mGX

PLA2 activity thus compensates for the sperm defects.It should also be noted that the impacts
recorded by the authors in terms of spontaneous AR with the male deficient gametes are quite
small (10% difference).The same observation can be made regarding the impact of blocking
mGX activity on the percentage of oocytes reaching the 2 cell stage or/and on the percentage
of aborted embryos. These figures are not in agreement with the "marked negative effect" on
fertility outcome claimed by the authors.It is not clearly indicated at which age (both for
males andfemales) were carried out the different crosses to evaluate the fertility impact? May
be more serious impact on fertility could be observed with aging KO males?The obseravation
that mGX sPLA2 is the major mouse sperm sPLA2 and that it contributes to most of the
sPLA2 enzymatic activity should be illustrated at least as supplemental data.The fact that
even high concentrations of recombinant mGX never induce AR in at least 30% of the sperm
should be tentatively explained. One could eventually consider that this fraction of sperm
cells are not responsive because they are damaged.

Minor points:

The title should be changed since the mGX sPLA2 is not "secreted" but released during AR.In
the Introduction it is stated that capacitation depends on ion fluxes and protein
phosphorylations. This is correct however according to Gagnon and Aitken it should be also
stated that capacitation and AR are dependent on ROS signalling events that are as important
as ions fluxes to trigger tyrosine phosphorylation events.

Figure 1D "upper panel" is not convincing at all. The selected spermatozoa appears quite
abnormal.

Figure 2A: It is surprising to note that if you add the amount of protein found in the pellet to
that present in the supernatant at 0 min it is largely less (by 25%) that the amount of protein
present when you add the pellet and supernatant fractions at 90min + A23187 ? This might
reflect that n=2 is probably not sufficient to be confident with the data.

Figure 3A. As said above, it would be more appropriate and correct to indicate here that
males-/- mated with WT females present no change in fertility (as far as litter size is
concerned).If the numbers are correct YM26734 treatment of sperm decrease the rate of
fertilization by 40% and not by 50%.

Figure 4A. A 10% decrease overall in spontaneous AR is not that drastic.

Figure 6 is totally dispendable.

There are confusing statements: In the first paragraph of the Discussion section it is stated that
the protein was detected in the sperm of several mammals including human while two
sentences later it is indicated that its presence in human sperm should be checked out? Overall
the Discussion is speculative. Although the idea of mGX sPLA2 released from sperm and
functionning as a sperm cell sorting actor in order to remove a certain population of sperm
cells presenting membranous lipid abnormalities is interesting, it is difficult to understand
how the enzyme would sense these gametes?
 Résultats

4. Discussion

Comme je l’ai précisé dans la partie introduction, plusieurs études ont suggéré un rôle pour
une ou plusieurs phospholipases A2 secrétées au niveau de la capacitation, la réaction
acrosomique (AR) et la fécondation, mais la nature moléculaire de ces enzymes et leurs rôles
spécifiques restent à l’heure actuelle encore inconnus. Le spermatozoïde mature exprime les
sPLA2 des groupes IID, IIC, V, X et IIF (Masuda, Murakami et al. 2004). Nous avons regardé
dans ces deux manuscrits l’effet de différents sPLA2 de mammifères sur deux étapes clés de la
physiologie spermatique : la mobilité flagellaire (cf Article 2) et la réaction acrosomique (cf
Aticle 3).

Identification d’une nouvelle voie moléculaire de contrôle de la mobilité

spermatique (Article 2).
A l’heure actuelle, plusieurs aspects de la mobilité flagellaire ont été étudiés : la structure
moléculaire de l’axonéme (Escalier 2006), les mécanismes moléculaires impliqués dans le
glissement des microtubules par le complexe dynéine (Esposito, Jaiswal et al. 2004), la
régulation de la mobilité spermatique par le Ca2+ (Ren, Navarro et al. 2001; Castellano,
Trevino et al. 2003; Ho and Suarez 2003; Schuh, Cartwright et al. 2004), la régulation de la
mobilité spermatique par les lipides (Roudebush 2001; Wu, Stojanov et al. 2001). Mais les
voies moléculaires impliquées dans la mobilité spermatique sont complexes et restent encore
mal comprises. Nous avons ici montré pour la première fois que la motilité spermatique de
souris est spécifiquement modulée par une nouvelle voie moléculaire : la voie enzymatique
des sPLA2, plus précisément par la sPLA2 mGX.

Nous avons évalué l'effet de différentes phospholipase A2 sécrétées de mammifères connus

pour être présents dans les organes reproducteurs mâles, comme mGIIA, mGIID, mGIIE,
MGV-et MGX-sPLA2 (Masuda, Murakami et al. 2004) ou dans les voies féminines comme
mGIIE (Valentin, Ghomashchi et al. 1999) sur la mobilité des spermatozoïdes en utilisant
l'analyse du mouvement spermatique par le système CASA.

Seule la sPLA2 mGX module la motilité des spermatozoïdes, contrairement aux autres sPLA2s
de mammifères. mGX diminue les paramètres de la mobilité spermatique de 30 % pour la
VCL et de 17 % pour l’ALH. La modulation de la mobilité spermatique par mGX est

93
 Résultats
effectuée via son activité enzymatique, car deux isoformes de mGX inactif, H48Q-mGX et
pro-mGX, ont été incapables de moduler la mobilité des spermatozoïdes.

La sPLA2 mGX est une enzyme qui hydrolyse la liaison ester des phospholipides
membranaires en position sn-2, produisant ainsi des lysophospholipides et des acides gras
libres. Nous avons voulu voir si le mécanisme d’action de mGX sur la mobilité spermatique
n’était pas lié à un changement lipidique de la membrane. Pour ce faire, nous avons utilisé un
marqueur spécifique des phosphatidylsérines (PS) l’Anexine V-Cy3. Nous avons pu observer
une externalisation des PS au niveau du feuillet externe de la membrane plasmique des
spermatozoïdes après l’application de mGX. Nous pouvons en conclure que mGX va moduler
la mobilité des spermatozoïdes par un changement de la composition phospholipidique de la
membrane plasmique.

mGX est exprimée au niveau de l’acrosome des spermatozoïdes et relâché

durant la réaction acrosmique (article 3).

Nous avons ici, montrée pour la première fois par hybridation in situ, imunohistochimie et
technique TR-FIA (Time Resolved fluoroimunoassays) que mGX est la principale sPLA2
présente dans l'acrosome des spermatozoïdes de souris. Les résultats de TR-FIA et de réaction
acrosomique in vitro nous ont permis de montrer qu’elle était libérée au cours de la réaction
acrosomique sous sa forme active, et qu’elle contribue à l’établissement d’une activité
enzymatique sPLA2 dans le milieu extérieur où sont situé les spermatozoïdes pendant la
capacitation.

Rôle de mGX dans la physiologie spermatique (article 3).

Nous avons évalué le rôle paracrine de mGX sur les spermatozoïdes voisins durant la
capacitation, pour ce faire nous avons quantifié le taux de réaction acrosomique spontanée des
spermatozoïdes mGX-/-, des spermatozoïdes traités avec un inhibiteur de sPLA2 et des
spermatozoïdes traités avec des protéines recombinantes inactive de mGX et des
spermatozoïdes traités avec mGX.
L'utilisation des formes recombinantes de mGX, des souris mGX-/- et de l’inhibiteur de sPLA2
nous a permis de mettre en évidence :
- que la phospholipase A2 mGX augmente le taux de réaction acrosomique spontanée
des spermatozoïdes en cours de capacitation (de 30 à 40%) et ce à des concentrations
inférieures au nanomolaire.
94
 Résultats
- que l’augmentation du taux de réaction acrosomique spontanée par mGX est effectuée
via son activité enzymatique, car les deux isoformes de mGX inactif, H48Q-mGX et
pro-mGX ont été incapables de déclencher la RA et que l’inhibiteur de sPLA2 diminue
le taux de RA spontanées des souris contrôles.
- que mGX induit la RA d’une sous-population de spermatozoïdes.

De ces résultats, nous avons pu en conclure que mGX contrôle la physiologie spermatique au
cours de la capacitation, par le déclenchement de réaction acrosomique spontanée d'une sous-
population spécifique de spermatozoïdes.

Nous avons ensuite effectué des fécondations in vitro avec des spermatozoïdes mGX-/-, des
spermatozoïdes traités avec un inhibiteur de sPLA2, des spermatozoïdes traités avec mGX des
et spermatozoïdes mGX-/- traités avec mGX. Ces fécondations in vitro nous a permis de
montrer que mGX améliore le pouvoir fécondant des spermatozoïdes, en augmentant le taux
d’embryons au stade 2 cellules et en diminuant le taux d’embryons avortés.

Tous ces résultats nous suggèrent que le rôle de mGX dans la physiologie spermatique est
d’induire des réactions acrosomiques à une sous-population de spermatozoïdes dite sous-
fertile afin de trier les spermatozoïdes pour améliorer le taux de fécondation.

95
 Résultats

III. Évaluation du rôle fonctionnel et physiologique des canaux CaV3.1 et

CaV3.2 dans une étape physiologie spermatique : La réaction
acrosomique

5. Introduction
Comme je l’ai déjà précisé dans la partie introduction, la réaction acrosomique exige
l’activation successive de trois types différents de canaux : le premier à s’activer est le canal
calcique dépendant du voltage de type T (CCVD-bas seuil), puis c’est le tour du récepteur à
l’IP3 (Walensky and Snyder 1995; O'Toole, Arnoult et al. 2000) et le dernier à s’ouvrir est le
canal de type SOC (appelé TRPC2).
L’ouverture des canaux calciques dépendants du voltage produit un courant transitoire
calcique, environ 1 seconde après l’application de ZP3 (Arnoult, Kazam et al. 1999), ce
transitoire va contrôler l’activation du récepteur à l’IP3 et in fine l’activation de TRPC2.
Différents types d’inhibiteurs comme les dihydropyridines, bloquent les canaux calciques
dépendants du voltage.
L’utilisation de ces inhibiteurs sur les spermatozoïdes va bloquer le courant calcique
transitoire (correspondant à l’ouverture des canaux calciques dépendants du voltage de type
T) et le courant calcique soutenu (correspondant à l’ouverture des canaux IP3 R et TRPC2). Ils
vont ainsi bloquer la réaction acrosomique (Arnoult, Cardullo et al. 1996). La caractérisation
moléculaire et le rôle physiologique des canaux calciques dépendants du voltage dans les
spermatozoïdes sont très étudiés et sont le sujet de beaucoup de discordes. (Arnoult, Cardullo
et al. 1996; Santi, Darszon et al. 1996; Goodwin, Leeds et al. 1997; Goodwin, Leeds et al.
1998; Arnoult, Kazam et al. 1999; Serrano, Trevino et al. 1999; Westenbroek and Babcock
1999; Jagannathan, Punt et al. 2002; Stamboulian, Kim et al. 2004). Comme il est impossible
d’enregistrer des courants calciques dépendants du voltage par Patch Clamp dans les
spermatozoïdes matures, beaucoup d’équipes travaillent sur la caractérisation moléculaire de
ces canaux dans les cellules spermatogéniques (Arnoult, Cardullo et al. 1996; Lievano, Santi
et al. 1996; Espinosa, Lopez-Gonzalez et al. 1999; Sakata, Saegusa et al. 2001; Jagannathan,
Punt et al. 2002; Stamboulian, Kim et al. 2004). Les cellules spermatogéniques représentent
un bon modèle d’étude des courants calciques dépendants du voltage des spermatozoïdes
matures. Dans ces cellules, seuls les courants calciques de type T ont été enregistrés par Patch
Clamp. Bien que des études de RT-PCR ont révélé la présence des transcrits de Cav3.1 et

97
 Résultats

Cav3.2 dans les cellules spermatogéniques, les résultats de la caractérisation moléculaire des
souris Cav3.1-/- suggèrent que Cav3.2 est le principal canal calcique dépendant du voltage de
type T dans les cellules spermatogéniques (Stamboulian, Kim et al. 2004).
Si la plupart des études montrent le rôle central des canaux LVA dans la réaction
acrosomique, quelques autres études suggèrent que les canaux HVA joueraient un rôle
important dans la physiologie du spermatozoïde (Goodwin, Leeds et al. 1998; Goodwin,
Leeds et al. 1999). Ainsi, plusieurs auteurs ont tenté de démontrer qu’une partie des courants
calciques dépendants du voltage de type T était dû à l’activation de canaux HVA, tels que
Cav1.2 (Goodwin, Leeds et al. 1999) ou Cav2.2 et Cav2.3 (Wennemuth, Westenbroek et al.
2000) ; Westenbroek and Babcock 1999)
La conclusion concernant le rôle central des canaux LVA dans la réaction acrosomique, a
été essentiellement obtenue à partir d’outils pharmacologiques spécifiques conçus contre des
canaux LVA (Arnoult, Villaz et al. 1998). Cependant la spécificité des bloqueurs des canaux
LVA n'est jamais totale et une concentration bloquant la plupart des canaux LVA, bloque
également une petite proportion de canaux HVA.
Le développement des souris Cav 3.1-/- et Cav3.2-/- nous donne l’opportunité aujourd’hui
dans cette étude d’évaluer la contribution des canaux Cav 3.1 et Cav3.2 dans la physiologie
des spermatozoïdes comme la réaction acrosomique et la fertilité.

98
 Résultats

Article 4: Expression, Localization and Functions in Acrosome Reaction and

Sperm Motility of CaV3.1 and CaV3.2 Channels in Sperm Cells: an
evaluation from CaV3.1 and CaV3.2 Deficient Mice

Jessica Escoffier, Sylvie Boisseau, Catherine Serres, Chien-Chang Chen, Daesoo Kim,
Séverine Stamboulian, Hee-Sup Shin, Kevin P. Campbell, Michel De Waard, And
Christophe Arnoult1

Journal of Cellular Physiology. 212: 753–763, 2007

99
ORIGINAL ARTICLE 753

Expression, Localization and

Functions in Acrosome Reaction
and Sperm Motility of CaV3.1
and CaV3.2 Channels in Sperm
Cells: an Evaluation from CaV3.1
and CaV3.2 Deficient Mice
JESSICA ESCOFFIER,1 SYLVIE BOISSEAU,1 CATHERINE SERRES,2 CHIEN-CHANG CHEN,3
DAESOO KIM,4 SÉVERINE STAMBOULIAN,1 HEE-SUP SHIN,4 KEVIN P. CAMPBELL,3
MICHEL DE WAARD,1 AND CHRISTOPHE ARNOULT1*
1
INSERM U836 Equipe 3, Laboratoire ‘‘Canaux Calciques Fonctions et Pathologies’’; CEA/Grenoble, iRTSV; Université Joseph Fourier,
Grenoble France
2
Service d’Histologie-Embryologie-Biologie de la Reproduction, Université Paris René Descartes—Faculté de Médecine, Paris, France
3
Howard Hughes Medical Institute, Department of Physiology and Biophysics, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine,
University of Iowa, Iowa City
4
National CRI Center for Calcium and Learning, Korea Institute of Science and Technology, Cheongryang, Seoul, Republic of Korea

In spermatozoa, voltage-dependent calcium channels (VDCC) have been involved in different cellular functions like acrosome reaction
(AR) and sperm motility. Multiple types of VDCC are present and their relative contribution is still a matter of debate. Based mostly on
pharmacological studies, Low-Voltage-Activated Calcium Channels (LVA-CC), responsible of the inward current in spermatocytes, were
described as essential for AR in sperm. The development of CaV3.1 or CaV3.2 null mice provided the opportunity to evaluate the
involvement of such LVA-CC in AR and sperm motility, independently of pharmacological tools. The inward current was fully abolished in
spermatogenic cells from CaV3.2 deficient mice. This current is thus only due to CaV3.2 channels. We showed that CaV3.2 channels were
maintained in sperm by Western-blot and immunohistochemistry experiments. Calcium imaging experiments revealed that calcium influx
in response to KCl was reduced in CaV3.2 null sperm in comparison to control cells, demonstrating that CaV3.2 channels were functional.
On the other hand, no difference was noticed in calcium signaling induced by zona pellucida. Moreover, neither biochemical nor functional
experiments, suggested the presence of CaV3.1 channels in sperm. Despite the CaV3.2 channels contribution in KCl-induced calcium
influx, the reproduction parameters remained intact in CaV3.2 deficient mice. These data demonstrate that in sperm, besides CaV3.2
channels, other types of VDCC are activated during the voltage-dependent calcium influx of AR, these channels likely belonging to high-
voltage activated Ca2þ channels family. The conclusion is that voltage-dependent calcium influx during AR is due to the opening of
redundant families of calcium channels.
J. Cell. Physiol. 212: 753–763, 2007. ß 2007 Wiley-Liss, Inc.

The acrosome reaction (AR), the first step of fertilization, is an phase, the opening of VDCCs elicits a very short transient
exocytotic event, allowing sperm to cross the zona pellucida calcium rise, of about 100 msec duration (Arnoult et al., 1999),
(ZP) and to become competent for fusion with the oocyte, by ii) a second phase, corresponding to the activations of the InsP3
unmasking the izumo protein (Inoue et al., 2005). ZP3, one of receptor and subsequently TRPC store-operated calcium
the three glycoproteins present in the zona pellucida, channels, is characterized by a slow calcium increase (between
represents the main physiological agonist of the AR in rodent. few second to few minutes, dependent of reports), followed by
The fusion of the outer acrosomal membrane with the plasma a long lasting calcium entry. Different types of VDCC blockers
membrane is dependent of a cytoplasmic calcium rise. The like amiloride, PN200-110 (a dihydropyridine) or pimozide (a
calcium signaling requires the successive opening of at least diphenylbutylpiperidine) inhibit both the calcium transient and
three different types of calcium channels. Voltage-dependent the subsequent slow calcium increase and calcium plateau
calcium channels (VDCC), localized in the plasma membrane,
are the first to be activated. Subsequently, an Inositol-1,4,5-
triphosphate (InsP3) receptor, localized in the outer membrane
of the acrosome, is activated (Walensky and Snyder, 1995;
O’Toole et al., 2000) and leads to the calcium depletion of the *Correspondence to: Christophe Arnoult, CEA/Grenoble, iRTSV,
acrosome, an operational calcium store (De Blas et al., 2002; Laboratoire ‘‘Canaux Calciques Fonctions et Pathologies,’’ Unité
Herrick et al., 2004). The depletion of this store finally leads to INSERM U836 Equipe 3, 17 rue des martyrs, F-38054 Grenoble
Cedex 9- France. E-mail: [email protected]
the activation of store-operated calcium channels like TRPC2
(Jungnickel et al., 2001). Received 7 September 2006; Accepted 6 February 2007
The successive activation of these channels determines two DOI: 10.1002/jcp.21075
phases in the sperm acrosome calcium signaling: i) during a first

ß 2 0 0 7 W I L E Y - L I S S , I N C .
754 ESCOFFIER ET AL.

(Arnoult et al., 1996; Arnoult et al., 1999). In consequence, the electrophysiological data. Moreover, the calcium signaling
calcium influx through VDCC is currently understood as the induced by high Kþ is not affected in CaV3.1 deficient mice.
key triggering element for the second phase of calcium signaling These data, taken together, strongly suggest that CaV3.1
in sperm cells. channels do not play a physiological role in sperm.
Voltage-dependent calcium channels are subdivided in Despite the presence of CaV3.2 channels and their
high-voltage (HVA) and low-voltage-activated (LVA) calcium contribution in Kþ-induced calcium influx, the reproduction
channels, represented by L, N, P/Q, R and by T-type calcium parameters (sperm concentration per epididymis, pups
channels, respectively. At the molecular level, 10 different genes number, delay between mating and delivery), and the cellular
encode for VDCC a1 subunits, the pore subunit. The molecular functions (AR and sperm motility) of CaV3.2 deficient mice
characterization of VDCC present in sperm cells and their remain intact. These data demonstrate that in sperm,
respective role in the sperm physiology is a hotly debated and besides CaV3.2 channels, other types of VDCC are activated
studied question (Arnoult et al., 1996; Santi et al., 1996; during the voltage-dependent calcium influx of AR. The absence
Goodwin et al., 1997; Goodwin et al., 1998; Arnoult et al., 1999; of reproduction phenotype at the animal or cellular levels,
Serrano et al., 1999; Westenbroek and Babcock, 1999; indicates that the expression of different types of VDCC are
Jagannathan et al., 2002; Stamboulian et al., 2004; Zhang et al., redundant.
2006). Finally, we show in this paper that the motility parameters of
Owing to the high difficulties to record voltage-dependent sperm from CaV3.1 or CaV3.2 deficient animals are not
calcium currents in mature sperm cells, many groups have statistically different to those obtained from sperm of wild-type
worked on the molecular characterization of voltage- animals, suggesting that neither CaV3.1 nor CaV3.2 are involved
dependent channels in spermatogenic cells (Arnoult et al., 1996; in sperm motility.
Lievano et al., 1996; Espinosa et al., 1999; Sakata et al., 2001;
Jagannathan et al., 2002; Stamboulian et al., 2004). In these cells,
only T-type calcium currents are recorded during patch-clamp Materials and Methods
experiments. Although mRNA encoding for both CaV3.1 Biological preparations
(Sakata et al., 2001) and CaV3.2 (Jagannathan et al., 2002) have
been found in spermatogenic cells, results from CaV3.1 Knock-out mice. CaV3.1 (Kim et al., 2001b) and CaV3.2 (Chen
deficient mice suggested that CaV3.2 is the main calcium channel et al., 2003) deficient mice have been described previously. Control
in spermatogenic cells (Stamboulian et al., 2004). On the other mice corresponded to C57BL/6 males if non specified (Charles River-
France). The genetic backgrounds of both knockout mice are different.
hand, several authors have claimed that part of the T-type The genetic background of CaV3.1 deficient mice is a cross between
current in spermatogenic cells could be due to activation of C57Bl/6 strain and SVJ129 strain. On the other hand, the genetic
HVA channels, CaV1.2 (Goodwin et al., 1999) or CaV2.2 background of CaV3.2 deficient mice is a C57Bl/6 strain.
and CaV2.3 (Wennemuth et al., 2000). The development of Spermatogenic cells preparation. Seminiferous tubules were
transgenic mice deficient in CaV3.2 channels provides the isolated from the testes of mice (8–16 weeks old) and incubated at
opportunity to evaluate the actual contribution of CaV3.2 378C for 30 min in 3 ml of a solution containing (mM): NaCl (150), KCl
channels in the inward calcium current of spermatogenic cells. (5), CaCl2 (2), MgCl2 (1), NaH2PO4 (1), NaHCO3 (12),
In this manuscript, we compare for the first time the inward D-glucose (11), pH 7.3 and collagenase type IA (1 mg/ml - Sigma).
calcium current density from wild-type spermatogenic cells Tubules were rinsed twice in collagenase-free medium and cut into
2 mm sections. Spermatogenic cells were obtained by manual
with those of spermatogenic cells isolated from CaV3.1 trituration and attached to culture dishes coated with Cell-Tak
or CaV3.2 deficient mice. The inward current elicited by (Beckton Dickinson France). Pachytene spermatocytes and round
depolarization is fully abolished in spermatogenic cells obtained spermatids are the prominent cell types obtained from the diploid
from CaV3.2 deficient mice. This result ends a long-term meiotic and the haploid post-meiotic stages of spermatogenesis,
controversy over the molecular identity of the LVA inward respectively. These cells are readily distinguished based on cellular
current in spermatogenic cells: this current is due only to and nuclear morphology (Romrell et al., 1976). These stages were
activation of CaV3.2 channels. In mature sperm cells, Western routinely used for electrophysiological recordings. However, similar
blotting experiments demonstrate for the first time the results were obtained with both stages and data were pooled for
presence of CaV3.2 channel protein. By immunohistochemistry, presentation.
Sperm membrane preparation. Sperm cells, obtained by manual
we illustrate that CaV3.2 is localized in a specific patch of the trituration of caudae epididymes from CaV3.1, CaV3.2 deficient mice or
plasma membrane located at the base of the acrosome, an area control C57Bl/6 mice (16 weeks old, Charles River), were pelleted
known to be the starting point of the calcium signaling during (500 g, 10 min) and re-suspended in RIPA buffer containing in (mM) Tris
the acrosome reaction. Moreover, this area of the plasma (50), NaCl (150), 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC) complemented
membrane that contains the CaV3.2 channels overlays the with a cocktail of protease inhibitors (Complete Mini, EDTA-free,
external acrosomal membrane involved in exocytosis during Roche). Sperm cells were then sonicated (Sonicator Ultrasonic
acrosome reaction, since the CaV3.2 immunoreactivity is lost Processor XL, Misonix, Farmingdale, NY) for 1 sec on ice, repeated 30
on acrosome reacted spermatozoa. Because of the presence times, with 7 sec intervals. Cell debris were pelleted (500 g, 15 min) and
of CaV3.2 channels in mature sperm cells, it was important to the supernatant used for Western blotting. To obtain a head-plasma
membrane enriched fraction, sperm were capacitated in M16
evaluate the contribution of CaV3.2 channels in sperm calcium (Sigma-Aldrich France) supplemented with 2% BSA (fraction V, Sigma-
signaling. First, we evaluated the contribution of CaV3.2 Aldrich France) pH 7.4 for 1 hour at 378C. Sperm were pelleted (500 g,
channels in voltage-dependent calcium influx, induced by high 10 min) and treated with 10 mM A23187 during 30 min at 378C in the
external Kþ. The depolarization-induced calcium signaling is presence of a cocktail of protease inhibitors. Sperm were then
biphasic: a calcium rise followed by a calcium plateau. In CaV3.2 centrifuged 5 min at 1000 g. The supernatant was collected and
deficient mice, both calcium rise and calcium plateau are subsequently ultra-centrifuged at 100 000 g for 1 hour at 48C. The
reduced, demonstrating the functional state of CaV3.2 channels pellet was re-suspended in RIPA buffer.
in mature sperm cell. Second, we evaluated the importance of Cell culture and transfection. HEK-293 cells were grown in
such channels in calcium signaling induced by solubilized ZP. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Invitrogen)
supplemented with 10% FBS (Invitrogen) and 1% penicillin/
In CaV3.2
/
sperm, the calcium signaling induced by ZP was streptomycin and transiently transfected with a plasmid
identical to the one measured in wild-type sperm. containing CaV3.1 cDNA (generous gift of Dr Anne Feltz) or CaV3.2
Concerning CaV3.1 channels, we were unable to find any cDNA (generous gift of Dr Emmanuel Bourinet), using JetPEI from
specific staining with an antibody designed specifically Qbiogene according to the instructions of the manufacturer. Two
against CaV3.1 channels, in agreement with the days after transfection, transfected and control cells were collected

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 C a V3 . 1 / 3 . 2 C H A N N E L F U N C T I O N S I N S P E R M P H Y S I O L O G Y 755

and re-suspended in RIPA buffer complemented with a cocktail of (10 mg/ml in PBS) for 15 min at room temperature, in the dark before
protease inhibitors (Complete Mini, EDTA-free, Roche). starting the immunostaining protocol for calcium channels detection.
Slides were analyzed on a confocal laser scanning microscope (Leica
Electrophysiological recordings TCS-SP2, Mannheim, Germany).
Ca2þ currents were recorded in the whole-cell configuration of the
patch-clamp technique. Pipettes were pulled from Corning #7052 glass Calcium imaging
(Gardner Glass Co., CA) and fire polished. Pipette resistance was
1–3 MV. Currents were obtained with an Axopatch 200B amplifier Sperm cells were obtained from C57Bl/6 mice (12 weeks old, Charles
(Axon Instruments). All traces were corrected for leak currents, Rivers, France), CaV3.1 and CaV3.2 deficient mice from caudae
filtered at 2 kHz, and digitized at 20 kHz. epididymides by manual trituration. The fraction of motile sperm was
The pipette solution was designed to eliminate all Kþ currents and determined by visual inspection within 10 mi, and preparations with
consisted of the following components (mM): Cs-glutamate (130), <75% motile cells were discarded. Sperm were loaded with 5 mM of
D-glucose (5), HEPES (10), MgCl2 (2.5), Mg2ATP (4), EGTA-Cs (10) the calcium indicator Oregon green BAPTA 1-AM (Molecular probes)
pH 7.2 (adjusted with 1 N CsOH). For experiments, the bath solution by a 40 min incubation (378C) in a solution A containing (in mM): NaCl
was changed to a recording solution containing (mM): NaCl (100), KCl (109), KCl (4.8), MgCl2 (1.2), CaCl2 (1.7), KH2PO4 (1.2), NaHCO3
(5), CaCl2 (10), MgCl2 (1), TEA-Cl (26), Na-lactate (6), HEPES (10), (10), HEPES (25), sodium lactate (25), sodium pyruvate (1), D-glucose
D-glucose (3.3) and pH 7.4 (adjusted with 1 N NaOH). All experiments (5.6) and BSA 0.1%.
were done at room temperature (258C). Sperm were then centrifuged (5 min, 1200 rpm) and re-suspended
in the solution A containing 2% BSA in order to promote in vitro
Primary antibodies capacitation for a period of 80 min incubation (378C).
Sperm were then centrifuged and re-suspended in the solution A
In the absence of specific commercial antibodies designed for without BSA and kept at 378C until imaging experiment. 100 ml
immuno-histochemistry, we designed two antipeptide antibodies aliquots of capacitated sperm cells (6  106 /ml) were transferred to
against the II-III loop of the CaV3.2 channels, a region presenting no an imaging chamber, in which the lower surface was a glass coverslip
homology with other VDCC. The peptides have been chosen in the treated with Cell-Tak (Beckton-Dickinson, France). The chamber
II-III loop of the alpha1 subunit and correspond to the amino acids was then connected to the perfusion apparatus and at least 10 ml of
1025-1034 (Ab-1025) and 1169-1180 (Ab-1169) of the swissprot locus fresh medium was washed through. All experiments were carried out
CAC1H_MOUSE, accession O88427. Antibodies against CaV3.1 were at 378C in a continuous flow of medium. Solubilized zona pellucida,
from Alomone Labs - Israel. For Western blotting: antibodies prepared as precisely described (Rockwell and Storey, 2000), was
against CaV3.2 were Ab-1025 or Ab-1169 or a commercial Ab introduced in the recording medium by adding 10 mL of a solution
(sc-16261 from Santa Cruz Biotechnology, Inc. CA); antibody containing 20 solubilized ZP by mL (final volume 100 mL). Thus, the
against CaV3.1 was a commercial Ab (ACC-021 from Alomone, final solubilized ZP concentration is 2 ZP/mL. Only sperm presenting
Israel). a motile flagellum were studied. Cells were imaged on an inverted
Nikon TE200U microscope, fitted with an X-cite 120 EXFO source.
Western blot analysis Images were acquired with an IXON ANDOR TE885KCS-VP camera
and the frame acquisition frequencies are 4 Hz for KCl and 1 Hz
Proteins of sperm enriched plasma membrane preparation were for ZP.
separated on 10% polyacrylamide denaturing gels and Data were processed offline using ANDOR IQ 1.5 software.
elecrotransferred for 90 min at 350 mA to Immobilon P transfer Fluorescence was measured in the whole head of the sperm.
membrane (Millipore). The membranes were then blocked 60 min with
4% non-fat dry milk (Biorad) in PBS Tween 0.1%. The primary antibody
was added and incubated overnight at 48C. After washing in PBS Tween Acrosome reaction assay
0.1%, the secondary antibody was added at 1:10,000 during 3 hours at Sperm cells from the caudae epididymes were allowed to swim in M2
room temperature. Brain and testis proteins were separated on 7% medium for 10 min. Then sperm cells were capacitated for 45 min at
polyacrylamide denaturing gels and elecrotransferred over night at 378C in M16 medium containing 20 mg/ml BSA. The AR was triggered
22 V to Immobilon P transfer membrane (Millipore). The membranes by lacto-N-fucopentaose III-BSA (LNFP III-BSA). The compounds were
were then blocked over night with 5% non-fat dry milk (Biorad) in PBS injected in the capacitation medium and sperm were incubated for an
Tween 0.1%. The primary antibody was added and incubated for additional period of 80 min. Sperm cells were then fixed in 4% PFA and
2h00 at room temperature. After washing with 5% non-fat dry milk stained with coomassie blue, as previously described (Arnoult et al.,
(Biorad) in PBS Tween 0.1%, the secondary antibody was added at 1996).
1:10,000 during 30 min at room temperature. The reactive proteins M2 and M16 medium were purchased from Sigma and LNFP
were detected using chemiluminescence assay followed by exposure to III-BSA from Dextra laboratories (Reading, UK). 1 mg of LNFP
Biomax film (Kodak). III-BSA was diluted in 500 ml of solution A, corresponding to a
Immunohistochemistry and indirect immunofluorescence concentration of 23.6 mM. LNFP III-BSA was used at a final
concentration of 5 mM.
Sperm cells were harvested from the caudae epididymes, washed in
PBS and fixed in 4% PFA for 30 min on ice. Fixed spermmatozoa were Computer-assisted motility analysis
allowed to air-dry on poly-L-Lysine coated slides. The slides were
washed in PBS (3  5 min), 50 mM NH4Cl (2  15 min), PBS Five hundred ml of sperm suspension in M2 medium were mixed with
(3  5 min), 0.1% triton X-100 in PBS (15 min) and PBS (3  5 min). the same volume of M2 medium containing 4% BSA (Fraction V Sigma)
Slides were blocked with 1% BSA and 2% normal goat serum during to initiate the capacitation. After incubation for 1 hour at 378C, 10 ml of
60 min at room temperature. Antibodies against CaV3.1 or CaV3.2 the sperm suspension was immediately placed onto analysis chamber
alpha1 subunit, as described above were diluted in blocking solution at (2X-CEL Slides, 80 mm depth, Leja Products B.V., Netherlands) kept to
1/100 and slides were incubated overnight at 48C. Slides were then 378C for microscopic quantitative study of sperm movement.
incubated 60 min with secondary alexa fluor546-conjugated antibodies Sperm motility parameters were measured at 378C using a sperm
(Molecular probes), diluted at 1/1000 and washed in PBS (3  5 min). analyzer (Hamilton Thorn Research, Beverley). The settings employed
For a double stain of the acrosomal status and CaV3.2 channels, lectin for analysis were as followed: acquisition rate: 60 Hz; number of frames:
from Pisum sativum conjugated to fluorescein isothiocyanate (PSA- 30; minimum contrast: 30; minimum cell size: 4; low-size gate: 0.13;
FITC, Sigma Aldrich, France) was used to label the acrosomal matrix, high-size gate: 2.43; low-intensity gate: 0.10; high-intensity gate: 1.52;
allowing to identify the PSA-FITC negative cells as acrosome reacted minimum elongation gate: 5; maximum elongation gate: 100;
cells. For the double staining experiments, sperm cells were first magnification factor: 0.81.
treated with 10 mM A23187 for 30 min after a 60 min capacitation The motility parameters measured were: straight line velocity (VSL);
period in a solution (M2, Sigma-A.) containing 2% BSA, to obtain curvilinear velocity (VCL); averaged path velocity (VAP); amplitude of
acrosome reacted sperm. Staining with PSA-FITC was used to evidence lateral head displacement (ALH); beat cross frequency (BCF); linearity
acrosome reacted sperm. Fixed sperm were washed in PBS for (LIN); straightness (STR). A minimum of 100 motile spermatozoa by
3  5 min and incubated with PSA-FITC sample was analysed.

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756 ESCOFFIER ET AL.

Results testis was confirmed by Western Blot analysis. A specific

Recording of inward current in spermatogenic cells antibody against CaV3.2 channels immunodecorates around
250 kDa a band on brain and testis loaded proteins, obtained
In order to determine the molecular identity of the channels from wild-type animals. In the other hand, no band is present at
responsible for the inward calcium current in spermatogenic the same molecular weight of 250 kDa on brain and testis
cells, still unresolved since their first recording in 1984 loaded proteins, obtained from CaV3.2
/
animals (Fig. 1B).
(Hagiwara and Kawa, 1984), we first performed patch-clamp Fig. 1C shows representative traces of inward calcium current
experiments, in the whole cell configuration, on spermatogenic of pachytene spermatocytes from wild-type and both deficient
cells from CaV3.x deficient mice. In Fig. 1A, we compared the mice.
current-density of inward current elicited by depolarization
from a holding potential of
90 mV to a test potential of Presence and Localization of CaV3.2 channels

20 mV of spermatogenic cells obtained from three different in mature sperm cell
mouse strains: wild-type-OF1 (control), CaV3.1 and CaV3.2
deficient mice. The current density was fully abolished in The molecular identification of channels responsible for the
spermatogenic cells from CaV3.2 deficient mice. In comparison, inward current in spermatogenic cells made us to wonder if
no modification of inward current in CaV3.1 deficient the CaV3.2 channels are still present in the mature sperm cell.
pachytene spermatocytes was noticed, as already published By Western blot, two different antibodies, designed
(Stamboulian et al., 2004). The absence of CaV3.2 channels in against CaV3.2 channels and named Ab-1025 and Ab-1169,
immunodecorate a band at the same molecular weight (around
250 kDa) on wild-type head-plasma membrane enriched
fraction (Fig. 2A, lanes 2 and 4 respectively). To check that both
antibodies immunodecorate the same band, both antibodies

Fig. 2. Immunodetection and localization of CaV3.2 channels in

Fig. 1. Inward calcium current in spermatogenic cells measured in mature sperm cells. A: Western blot showing the presence of CaV3.2
the whole cell configuration of the patch-clamp technique. A: Current channels in mature sperm cells. The microsomes recovered by
densities measured at the peak current, corresponding to a centrifugation after acrosome reaction of sperm from CaV3.2
depolarization of a holding potential of S90 mV to a test potential of deficient animals (lanes 1 and 3) or wild-type OF1 animals (lanes 2,
S20 mV in spermatogenic cells from wild-type, CaV3.1 and CaV3.2 4 and 5) were loaded on polyacrylamide gel and transferred to
deficient mice. Results are expressed as mean W SD. Above nitrocellulose. Lanes 1 and 2, antibody Ab-1169; lanes 3 and 4,
histograms, n indicates the number of cells recorded. B: Western antibody Ab-1025, lane 5 both antibodies. B: Specific antibody
blots of mouse testis membrane proteins obtained with anti-CaV3.2 against CaV3.2 channel evidences a specific localization of CaV3.2
Ab. Membrane proteins were loaded on polyacrylamide gel and channels, at the base of the acrosome (red staining in control sperm).
transferred to nitrocellulose. The apparent molecular size markers The staining is absent in sperm from CaV3.2 deficient mice. The
are indicated on the left. C: Representative superimposed traces of fluorescence and phase contrast pictures were superimposed to
inward current recorded in spermatogenic cells from wild- precisely localize the staining in relation to structures. The staining
type, CaV3.1 or CaV3.2 deficient mice. Holding potential S90 mV, test obtained in flagellum is unspecific since identical staining was
potentials from S60 mV to R30 mV, 10 mV increments. observed in flagellum of wild-type or CaV3.2S/S sperm.

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 C a V3 . 1 / 3 . 2 C H A N N E L F U N C T I O N S I N S P E R M P H Y S I O L O G Y 757

have been mixed: in these conditions, only one band is elicited staining was strongly diminished or lost during acrosome
around 250 kDa (Fig. 2A, lane 5). Moreover, these bands are reaction since CaV3.2 immunostaining was very strongly
absent on sperm microsomes from CaV3.2
/
sperm reduced in acrosome reacted spermatozoa. From the western
(Fig. 2A, lanes 1 and 3 respectively). The CaV3.2 deficient mice blot of Figure 2A and the immuno-histochemistry of Figure 3
guaranty the specificity against CaV3.2 channels of the results, we can conclude that at least, part of the CaV3.2
immunostaining. The CaV3.2 channels are thus present in channels are localized in the plasma membrane that merged
mature sperm cells. with the acrosome membrane during acrosome reaction.
By immuno-histochemistry, the antibody Ab-1169 evidenced
a head staining, localized at the base of the acrosome, whereas Calcium signaling in CaV3.1 and CaV3.2 deficient mice
no staining was observed in the sperm head of CaV3.2 deficient
sperm, attesting again the specificity of this reactivity (Fig. 2B). The localization of CaV3.2 channels at the base of the sperm
The same antibody gave unspecific staining in the flagellum, acrosome, is of potential interest since it has been
making impossible to conclude whether the CaV3.2 channel was demonstrated that calcium signaling induced by agonists as
present in the tail (data not shown). progesterone or ZP3 starts precisely in the same subcellular
It is well known that membrane reorganization occurs during area (Shirakawa and Miyazaki, 1999; Kirkman-Brown et al.,
capacitation. We followed the CaV3.2 staining during 2000; Fukami et al., 2003). We therefore studied the
capacitation and we observed that it was not modified during voltage-dependent calcium signaling in sperm from CaV3.2
this step (Fig. 3A). deficient mice, to further analyze the impact of the loss
From studies in neurons, we know that calcium channels of CaV3.2 channels. We also studied for the first time the impact
involved in neurotransmission are localized in close vicinity to of the loss of CaV3.1 channels on voltage-dependent calcium
the secretion vesicles (Kim and Catterall, 1997). In order to signaling, using sperm from CaV3.1 mice. Control capacitated
further study the specific localization of CaV3.2 channels, we sperm cells, loaded with the calcium dye Oregon green,
investigated if CaV3.2 channels are positioned in the pool of the presented a large calcium increase in the head sperm, when the
plasma membrane merging with the outer acrosomal plasma membrane was suddenly depolarized with a high
membrane during acrosome reaction. After capacitation, concentration of external potassium (Fig. 4). For CaV3.1
sperm cells were incubated 30 min in the presence of the Ca2þ deficient sperm cells, the amplitude and kinetics of
ionophore A23187, and a double staining was performed using high-Kþ-induced calcium signaling were similar to those
PSA-FITC to assess the status of the acrosome and Ab-1169 to recorded for control sperm cells. By contrast, for CaV3.2
localize the CaV3.2 channels. Acrosome reacted sperm were deficient sperm cells, both amplitude and kinetics of
evidenced by the loss of the specific acrosomal matrix staining high-Kþ-induced calcium signaling were modified: the mean
(negative PSA staining). Figure 3B shows clearly that the CaV3.2 amplitude was decreased by 30% and the calcium signal was
more transient (Fig. 4). By comparing the integrated calcium
signal from control and CaV3.2 deficient sperm cells, a decrease
of 68% was observed in the latter.
Because Kþ-induced calcium increase was modified
in CaV3.2 deficient sperm cells, we wondered if the calcium
signaling induced by solubilized ZP, the physiological agonist,
would be also altered. Indeed, voltage-dependent calcium
channel antagonists were described to inhibit both the
amplitude of the short calcium transient (Arnoult et al., 1999)
and the rate of calcium increase which follows the short calcium
transient (Arnoult et al., 1996). Solubilized ZP elicited a fast
calcium increase, followed by a calcium plateau, returning
slowly to zero, in both wild-type and CaV3.2 deficient sperm
cells (Fig. 5A). In order to characterize calcium signaling, we
calculated for each sperm cell responding to ZP, the time to
peak, the normalized maximum amplitude and the time
necessary to decrease the calcium peak by two (t1/2). In our
experimental conditions, peaks were reached in 14.5  6.9 sec
and in 11.4  3.9 sec in wild-type (n ¼ 9) and in CaV3.2
/

sperms (n ¼ 7), respectively (Fig. 5B), showing no statistical
difference. These values fall in the range of previously described
ZP-induced kinetics. Indeed, a wide range of ZP-induced
calcium increase kinetics have been reported in the past and
peaks were reached from few seconds (Shirakawa and Miyazaki,
1999; Rockwell and Storey, 2000; Fukami et al., 2003) to
minutes (Arnoult et al., 1996; Fukami et al., 2003). This range is
likely due to experimental differences between groups, like ZP
concentration, capacitation time or medium composition. No
difference was also noticed for normalized peak amplitude
and t1/2 (Fig. 5B). In our experimental conditions, normalized
Fig. 3. CaV3.2 channels localization after capacitation and acrosome peak amplitudes were 1.45  0.1 and in 1.47  0.3 and the
reaction. Double-staining with anti-CaV3.2 antibody and with lectins
from Pisum sativum conjugated to FITC (green), localized CaV3.2 time necessary to decrease the calcium peak by two were
channels and the acrosome matrix, respectively. A: Capacitation does 66  35 sec and in 62  52 sec, in wild-type (n ¼ 9) and
not modify CaV3.2 staining (images of the left column): capacitated in CaV3.2
/
sperms (n ¼ 7), respectively.
sperm cells displayed a staining at the base of the acrosome, identical to The facts that we still recorded voltage-dependent calcium
that observed on non capacitated sperm. B: Acrosome reacted sperm
loose the CaV3.2 channel staining (images of the two right columns). influx in CaV3.2 deficient sperm and that CaV3.1 deficient
AR is evidenced by the absence of PSA staining sperm did not present calcium signaling defect, strongly
suggests that the remaining voltage-dependent calcium influx

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758 ESCOFFIER ET AL.

Fig. 4. Comparison of high-KR-induced calcium signaling in sperm from wild-type, CaV3.1 or CaV3.2 deficient animals. KCl-induced
depolarization elicits a large calcium signaling in control sperm (*, n U 7) and a similar calcium signaling in sperm from CaV3.1 deficient animals (*,
n U 10). On the other hand, calcium signaling is reduced in sperm from CaV3.2 deficient animals (&, n U 13). Results are expressed as normalized
mean intensities W s.d.

observed in CaV3.2 deficient sperm is due to the opening of functions. Again, the development of transgenic mice deficient
different type of VDCC. High-voltage-activated calcium in CaV3.1 or CaV3.2 channels provided a unique opportunity
channels or CaV3.3 channels, present in sperm cells, could be to test the physiological importance of such channels in sperm
responsible of the remaining calcium influx in CaV3.2 deficient functions. We compared the number of acrosome reacted
spermatozoa. sperm induced by the lacto-N-fucopentaose III-BSA
(LNFP III-BSA), a synthetic molecule designed to replace the
signaling sugars of ZP3 (Hanna et al., 2004), after a capacitation
Reproduction parameters of CaV3.1 and CaV3.2 of 120 min in 2% BSA (Fig. 8A). In these peculiar conditions, we
deficient mice did not observe a lower rate of acrosome reacted sperm
in CaV3.2 deficient mice, when compared to control mice,
We showed that CaV3.2 channels are present in mature sperm suggesting that the remaining voltage-dependent calcium
cell and that CaV3.2 deficient sperm cells present an altered influx in CaV3.2 deficient mice is sufficient to promote a
Kþ-induced calcium signaling profile, with lower amplitude and complete acrosome reaction. From experiments using
a more transient calcium signals. These changes in calcium pharmacological tools, it has been suggested that LVA calcium
signaling induced by the loss of CaV3.2 channels may decrease channels could be involved in sperm motility (Trevino et al.,
the fertility of CaV3.2 deficient males. We studied two 2004). Using a sperm movement analyzer, the different
macroscopic reproduction parameters, the interval between parameters characterizing sperm movement were studied
mating and birth and the litter size. No difference in these for CaV3.1 and CaV3.2 null mice or control capacitated sperm
two parameters was noticed (Fig. 6A, B) when males of (Fig. 8B). No statistical difference was observed between the
C57Bl/6, CaV3.1 and CaV3.2 deficient strains were interbred mean values of the different parameters measured for the
with OF1 females. three populations of sperm.
The absence of a specific macroscopic reproductive
phenotype defect does not exclude i) an alteration of Presence and immunolocalization of CaV3.1
spermatogenesis leading to a reduction of sperm number or ii) channels in sperm
a lowering of some sperm functions at the cellular level.
Although membrane potential of spermatogenic cells does not The absence of inward calcium currents in spermatogenic cells
allow T-type calcium activation, the fact that inward calcium from CaV3.2 deficient mice, the specific staining of CaV3.2
current was totally absent in CaV3.2 deficient spermatogenic channels in sperm head and the decrease of depolarization-
cells indeed raises the question of a role of CaV3.2 channels in induced calcium influx in sperm from CaV3.2 deficient animals,
sperm production. We measured the sperm concentration in clearly demonstrate that CaV3.2 channels are present and
cauda epididymis and no difference was noticed between functional in sperm. On the other hand, the presence of CaV3.1
wild-type and in CaV3.2
/
sperms (Fig. 7), both having a channels in sperm is still controversy since i) CaV3.1 deficient
standard sperm concentration of around 5 millions of sperm spermatogenic cells present no alteration of the inward current
per milliliters. and ii) CaV3.1 deficient sperm exhibit a similar depolarization-
Because voltage-dependent calcium channels are supposed induced calcium to control sperm cells. The presence of CaV3.1
to play a role in both sperm acrosome reaction and sperm channels in rodent sperm is only supported by RT-PCR
motility, we focused our studies on these two cellular experiments, which clearly shows specific products

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 C a V3 . 1 / 3 . 2 C H A N N E L F U N C T I O N S I N S P E R M P H Y S I O L O G Y 759

Fig. 5. Comparison of calcium signaling induced by solubilized ZP in single sperm from wild-type or CaV3.2 deficient animals. A. Solubilized
ZP (2 ZP/mL) elicits a fast calcium increase, followed by a calcium plateau in both control sperm (*) and sperm from CaV3.2 deficient animals
(*). Acquisition rate, 1 Hz. B. Characteristics of calcium signaling induced by solubilized ZP. Histograms showing the time to peak, the
normalized maximum amplitude, and the time necessary to decrease the calcium peak by two (t1/2) for wild-type (black bars, n U 9) and for
CaV3.2S/S sperms (white bars, n U 7). In our experimental conditions, peaks were reached in 14.5 W 6.9 sec and in 11.4 W 3.9 sec, normalized
peak amplitudes were 1.45 W 0.1 and in 1.47 W 0.3 and the time necessary to decrease the calcium peak by two were 66 W 35 sec and in 62 W 52 sec in
wild-type and in CaV3.2S/S sperms, respectively. Results are expressed as mean W s.d.

amplification (Trevino et al., 2004). In order to better (25 mg) than control HEK cells extract (14 mg) was loaded in
understand this apparent discrepancy between functional and the gel.
molecular data, we did important efforts to attempt to
evidence CaV3.1 channels by immunohistochemistry and
Western blotting. For immunohistochemistry experiments, we Discussion
tested a commercial antibody (Alomone, anti CaV3.1). In our In spermatogenic cells, inward current is only due
experimental conditions, this antibody did not evidence a to CaV3.2 channels
specific staining by immunochemistry in sperm (Fig. 9A). The
flagellum is stained by the antibody but the CaV3.1 deficient The molecular identity of voltage-dependent inward calcium
sperm present an identical staining. In Western blotting, the current in spermatogenic cells has been a debated question. If
same antibody specifically recognized a band of approximately the pharmacological and biophysical properties of this current
at 240 kDa in HEK-293 cells transfected with CaV3.1 clone. This are close to those expected for CaV3.2 channels, some doubts
band corresponds to CaV3.1 channels since in non transfected were still present because the spermatogenic calcium current
HEK-293 cells, no band is evidenced in the same area of present some specific biophysical (Stamboulian et al., 2004) and
molecular weight. In the whole sperm plasma membrane pharmacological (Arnoult et al., 1998; Wennemuth et al., 2000)
preparations, no signal was detected by the Alomone antibody properties in comparison to those obtained by re-expression of
(Fig. 9B), even if, to compensate an eventual low level of CaV3.1 cloned channels. The fact that no inward current is present
channels expression in sperm, 1.7 times more of sperm protein in CaV3.2 deficient spermatogenic cells, represent a conclusive

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760 ESCOFFIER ET AL.

Fig. 7. Testis weight and sperm count of CaV3.2 deficient animals. A

t-test indicates that neither testis weight nor sperm count are different
between wild-type animals (n U 6) and CaV3.2S/S animals (n U 6).

progesterone or ZP3-activated acrosome reaction (Shirakawa

and Miyazaki, 1999; Kirkman-Brown et al., 2000; Fukami et al.,
2003). This result indicates that it may be one of the first calcium
channel activated during the depolarization event that follows
ZP3 receptor activation. Moreover, we demonstrated herein
that the plasma membrane, which merges with the acrosomal
membrane during acrosome reaction, contains CaV3.2
channels. This result provides essential information. First,
although CaV3.2 channels are expressed early during
spermatogenesis, CaV3.2 channels play a physiological role in a
narrow temporal window between the end of the capacitation,
when it becomes functional, and the end of the acrosome
reaction, when it is lost in membrane vesicle secretion. Indeed,
as a low-voltage-activated calcium channel, CaV3.2 is fully
Fig. 6. Macroscopic reproduction parameters of CaV3.1 and CaV3.2 inactivated at potential above
60 mV. Spermatogenic cells and
deficient animals. A: Interval between mating and pups delivery in
function of the different strains of mice. B: Average litter size in non-capacitated sperm cells have a membrane potential around
function of the different strains of mice. Results are expressed as
30 mV and only fully capacitated sperm present a
mean W SD. Above histograms, n indicates the number of litter hyperpolarized membrane potential (Arnoult et al., 1999).
studied. Among all voltage-dependent calcium channels present in
sperm (Westenbroek and Babcock, 1999), only CaV3.2
channels present an early expression pattern during
proof that spermatogenic inward calcium current is only due to spermatogenesis and the reasons of this specific expression
the opening of CaV3.2 channels. It would be interesting to clone pattern are still not understood. Secondly, the fact that
spermatogenic CaV3.2 channels in order to further understand immunostaining of CaV3.2 disappears in acrosome reacted
the biophysical and pharmacological specificities carried by this sperm demonstrates that the surface of the plasma membrane
channel at the molecular level. merging with the outer acrosomal membrane is not restricted
to the acrosomal crescent when AR is induced by A23187 but
CaV3.2 channels are present in mature sperm head and extents to the equatorial segment. The fact that CaV3.2
participate to the voltage-dependent calcium influx channels are present at a strategic localization for calcium
during acrosome reaction signaling in sperm head made us wonder if calcium signaling is
affected during acrosome reaction. In CaV3.2 deficient sperm,
In this manuscript, we showed that CaV3.2 channels are present the peak calcium increase, elicited by KCl-induced
from pachytene stages, by patch-clamp experiments, to mature depolarization, is diminished by 30% and the calcium signal is
sperm cells, by Western blot and immuno-histochemistry more transient. The integrated calcium signal is reduced overall
experiments. The CaV3.2 deficient mice channels provide by 68%. These results indicate that sperm CaV3.2 channels
the unique opportunity to guaranty the specificity of are functional and contribute significantly but partially to
immuno-localization. Its localization, at the base of the KCl-induced calcium signaling. This result differs from those
acrosome is unique, and different to the localizations already obtained previously (Wennemuth et al., 2000), where
described for other voltage-gated channels (Westenbroek and KCl-induced calcium signaling has been attributed mainly to
Babcock, 1999; Trevino et al., 2004) or store-operated HVA calcium channels. This difference evidences the recurrent
channels (Jungnickel et al., 2001; Trevino et al., 2001; Castellano problem of the specificity of calcium channels blockers. The
et al., 2003; Sutton et al., 2004). The localization of CaV3.2 localization of CaV3.2 channels in sperm head and their
channels is particularly interesting since its localization seems to functionality strongly suggest that they contribute significantly
coincide with the locus of calcium signaling initiation during to the calcium signaling during acrosome reaction.

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Fig. 9. No evidence for the presence of CaV3.1 channel in mouse

sperm. A: Immunostaining with anti-CaV3.1 antibody from Alomone
on two types of mature sperm: control sperm (OF1) and CaV3.1
deficient sperm. B: Western blot with anti-CaV3.1 Alomone antibody
(upper part). The specificity of the antibody was checked on HEK-293
cells transiently transfected with plasmids containing CaV3.1 versus
non transfected cell. A polyacrilamide gel, loaded with the identical
protein amounts as used for the Western blot, was stained with
coomassie blue, to indicate the protein loading (lower part).

an increase of intracellular calcium concentration. The initial

rise is due to voltage-dependent calcium channels opening.
If CaV3.1 channels were present and activated during this initial
phase, calcium signaling elicited by KCl-induced depolarization
should be affected in CaV3.1 deficient sperm in comparison to
control sperm, in a similar way to CaV3.2 deficient sperm. No
difference was observed in CaV3.1 deficient sperm in
Fig. 8. Cellular reproduction parameters of CaV3.1 and CaV3.2 comparison to control sperm. This result clearly shows
deficient animals. A: Acrosome reaction induced by 5 mM LNFP that CaV3.1 does not play a role in calcium signaling during
III-BSA of CaV3.2 deficient mice and wild-type mice. The two left
columns correspond to sperm incubated during 125 min in the acrosome reaction. In order to test a putative role of CaV3.1 in
capacitation medium, the two right columns correspond to sperm sperm motility, we compared with a sperm movement analyzer
incubated first during 45 min in the capacitation medium, and the different characteristics of sperm motility after capacitation
subsequently in the presence of 5 mM of LNFP III-BSA for an extra of CaV3.1 sperm versus control sperm. No obvious difference
period of 80 min in the capacitation medium. Mean W SD. of three
independent experiments. In each experiment, more than 150 sperm was observed.
cells have been analyzed. B: Sperm motility parameters of CaV3.1 The lack of cellular phenotype of CaV3.1 deficient mice is in
and CaV3.2 deficient animals in comparison to wild-type sperm. The good accordance with biochemical or immunohistology results
motility parameters measured were: averaged path velocity (VAP); obtained. Indeed, we were unable to obtain a specific staining
straight line velocity (VSL); curvilinear velocity (VCL); amplitude of
lateral head displacement (ALH); beat cross frequency (BCF); of CaV3.1 channels using the same antibody previously used
straightness (STR); linearity (LIN). Black columns: control sperm (Trevino et al., 2004). We did obtain a signal in flagellum as well,
cells, light grey columns: sperm cells from CaV3.1 null mice and dark but CaV3.1 deficient sperm presented identical staining. From
grey columns: sperm cells from CaV3.2 null mice. Results are our experiences, a lot of antibodies, known to give specific
expressed as mean W SD.
staining in several tissues, stain also sperm flagellum in a non
specific manner. In Western blot, the absence of signal in sperm
extract does not necessary mean that CaV3.1 channels are
absent, but this result is in good accordance with the absence of
Functional CaV3.1 channel protein is likely phenotype of CaV3.1 deficient mice.
absent in rodent sperm Although the presence of CaV3.1 channels in flagellum sperm
remains to be established, this result demonstrates that the
The presence of CaV3.1 channels in mature sperm cell was contribution of CaV3.1 channels to sperm flagellum beat would
previously suggested, based on RT-PCR experiments (Trevino be very minor.
et al., 2004), in situ hybridization (Jagannathan et al., 2002) and
immuno-histochemistry experiments. From inhibition CaV3.2 channels are not the only VDCC activated
experiments, it was suggested that CaV3.1 channels may play a during acrosome reaction
role in flagellum beat (Trevino et al., 2004). The CaV3.1 deficient
mice gave us the opportunity to search for the CaV3.1 channels The facts that i) the Kþ-induced calcium signaling was not
implications in two important sperm functions: acrosome abolished and ii) the second phase of ZP-induced calcium
reaction and sperm motility. Acrosome reaction is activated by signaling was not altered in CaV3.2 deficient sperm, suggest that

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other voltage-dependent calcium channels are present and or CaV2.3 (Sakata et al., 2001) deficient mice, which do not
functional in sperm head, as well. Because calcium signaling is present any fertility trouble, as well. The likely conclusion is that
not affected in CaV3.1 deficient sperm, it is unlikely that the voltage-dependent calcium influx during acrosome reaction is
remaining voltage-dependent calcium increase in CaV3.2 due to the opening of redundant families of calcium channels.
deficient sperm is due to CaV3.1 channels opening. Finally, the redundancy of VDCC seems to be a general feature.
Different publications pointed out the presence of several Indeed, there is a large discrepancy between the high number of
other VDCC in spermatogenic or mature sperm cells. cellular types where VDCC are expressed and the low number
High-voltage-activated (HVA) calcium channels, but of physiological anomalies generated by the lack of only one
also CaV3.3, the last member of the LVA calcium channel family, VDCC in the different knock-out mice (Jun et al., 1999; Saegusa
have been described to be present. CaV3.3 RNA have been et al., 2000; Kim et al., 2001a; Kim et al., 2001b; Chen et al.,
amplified in spermatogenic cells. In mature sperm cells, two 2003).
groups have showed by immunohistochemistry realized with
two different antibodies that the channels is restricted to
Acknowledgments
the flagellum and is absent of the head (Trevino et al., 2004;
Zhang et al., 2006) and then, CaV3.3 unlikely contributes to We are thankful to Florence Appaix (INSERM U836-Grenoble-
the remaining calcium influx in sperm head from CaV3.2 F) and Emmanuel Bourinet (IGH/CNRS-Montpellier-F) for
deficient mice. Westernblotting expertise and to Isabelle Marty for her skills in
HVA channels, CaV1.2, CaV2.2 and CaV2.3, are present in the antibody design (INSERM U836-Grenoble-F).
sperm head (Goodwin et al., 1999; Westenbroek and Babcock,
1999; Wennemuth et al., 2000). These HVA channels are likely
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JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY DOI 10.1002/JCP

 Résultats

6. Discussion
Le développement des souris Cav3.1-/- et Cav3.2-/- nous a donné l’opportunité aujourd’hui
d’évaluer la contribution des canaux Cav3.1 et Cav3.2 dans une étape de la physiologie des
spermatozoïdes : la réaction acrosomique.

Dans ce manuscrit, nous avons tout d’abord caractérisé pour la première fois les courants
calciques dépendants du voltage de type T dans les cellules germinales. Nous avons ensuite
statué sur la présence et le rôle physiologique des canaux Cav3.1 et Cav3.2 dans les
spermatozoïdes matures, grâce à des expériences d’immunofluorescence, de Western Blot, de
mobilité spermatique, de fécondation, d’imagerie calcique et de réaction acrosomique in vitro.

Les courants calciques dépendant du voltage de type T des cellules

germinales est due seulement à l'activation du canal Cav3.2
Bien que des transcrits pour Cav3.1 et Cav3.2 aient été identifiés dans les cellules
spermatogéniques, nos résultats montrent que la sous-unité Cav3.1 ne participe pas à
l’établissement des courants calciques voltages dépendants de type T des cellules germinales.
En effet, la densité de courant calcique T dans les cellules spermatogéniques des souris
déficientes pour Cav3.1 est identique à celle des souris contrôles et le courant calcique entrant
de type T provoquée par une dépolarisation de la membrane disparaît entièrement chez la
souris déficiente pour Cav3.2. Ces résultats mettent fin à la controverse sur l'identité
moléculaire du courant calcique entrant dépendant du voltage de type T dans les cellules
germinales : ce courant est dû seulement à l'activation des canaux Cav3.2.

Le canal Cav3.1 est absent des spermatozoïdes matures

Jusqu'à présent, la présence des canaux Cav3.1 et Cav3.2 dans le spermatozoïde mature était
seulement soutenue par des expériences de RT-PCR, qui ont montré clairement la présence de
transcrits de Cav3.1 et Cav3.2 dans les précurseurs des spermatozoïdes : les spermatocytes
(Trevino, Felix et al. 2004).
Dans ce manuscrit, nous avons observé pour la première fois la présence du canal Cav3.2 au
niveau des spermatozoïdes matures par immuno-histochimie ou par Western Blot mais aucune
présence du canal Cav3.1. L’absence du canal Cav3.1 est confirmée par le fait que la
signalisation calcique, la mobilité flagellaire et la fertilité des spermatozoïdes Cav3.1-/- ne sont
pas affectées. On peut donc dire clairement que les canaux Cav3.1 ne jouent pas de rôle dans
la signalisation calcique qui initie réaction acrosomique.
101
 Résultats

Seule la signalisation calcique des spermatozoïdes Cav3.2-/- est affectée

lors de la réaction acrosomique
La signalisation calcique des spermatozoïdes Cav3.1-/- et Cav3.2-/- a été induite soit par une
forte concentration de chlorure de potassium (KCl) extracellulaire, soit par la Zone Pellucide
solubilisée. La dépolarisation par le KCl a produit une augmentation calcique biphasée,
constituée d’un pic calcique suivi d'un plateau calcique. La signalisation calcique biphasée
induite par le KCl dans les spermatozoïdes Cav3.2-/- est moins importante que dans les
spermatozoïdes contrôles : le pic calcique est réduit de 30% et la signalisation calcique est
devenue plus transitoire.
Ces résultats prouvent clairement que les canaux Cav3.2 contribuent de manière significative à
la signalisation calcique qui initie la réaction acrosomique. Cependant, le fait que la
signalisation calcique n'est pas supprimée dans les spermatozoïdes Cav3.2-/- suggère que
d'autres canaux calciques dépendants du voltage soient présents et fonctionnels dans la tête de
spermatozoïde. Puisque la signalisation calcique n'est pas affectée dans les spermatozoïdes
Cav3.1-/-, il est peu probable que l'augmentation calcique dépendante du voltage restant des
spermatozoïdes Cav3.2-/- soit due à l’ouverture des canaux Cav3.1.
Lors de l’induction de la RA dans des conditions physiologiques (ZP solubilisé), est observée
une augmentation calcique dans la tête des spermatozoïdes Cav3.2-/-, suggérant que
l'amplitude de la dépolarisation induite par la liaison de la ZP au spermatozoïde est suffisante
pour activer les canaux HVA.

Les canaux Cav3.2 ne sont pas les seuls canaux calciques impliqués dans
la signalisation de la RA
Lors des RA in vitro nous observons que le taux de RA réalisés par les spermatozoïdes Cav3.2
-/-
est identique au contrôle. Ces résultats nous suggèrent donc que l’influx calcique dépendant
du voltage restant est suffisant pour déclencher la RA et que les canaux Cav3.2 contribuent
seulement à la bonne mise en place de la réaction acrosomique.

Toutes ces données démontrent clairement que l'influx de calcium nécessaire lors de la
réaction acrosomique est contrôlé en premier lieu par les deux familles de VDCC, les canaux
dépendants du voltage à bas seuil d’activation (LVA) et les canaux dépendants du voltage à
haut seuil d’activation (HVA).

102
 Résultats

Afin de poursuivre cette étude sur les mécanismes d’activation de la réaction acrosomique, il
faudrait évaluer le rôle des canaux HVA dans le contrôle de la RA. Certains auteurs ont
montré par des techniques immuno-histochimiques qu'il existait une grande variété de canaux
calciques dépendants du voltage, à haut seuil d’activation (CCDV-HS), dans le
spermatozoïde mature (Wennemuth, Westenbroek et al. 2000). L’expression ou la traduction
des canaux calciques à haut seuil d’activation doivent se réaliser dans les étapes ultimes de la
spermatogenèse, stades auxquels nous n’avons pas accès par les techniques
d’électrophysiologie. Puisque dans les spermatocytes, il n’existe qu'un seul type de courant
calcique dépendant du voltage, dit de type T.

103
Conclusion générale

et perspectives
 Conclusion générale et perspectives

Le développement de nouvelles stratégies expérimentales pour comprendre les mécanismes

de régulation du pouvoir fécondant du spermatozoïde a été la base de ce travail de thèse. Le
but de ce travail de thèse a été d’élucider les voies de signalisations qui régulent la
physiologie spermatique à l’aide de nouveaux outils pharmacologiques découverts dans les
venins d’animaux.
Ainsi, nous avons pu caractériser une nouvelle voie de régulation de la physiologie
spermatique : la voie des phospholipases A2 sécrétées et nous avons aussi caractérisé
l’implication des canaux calciques de type T dans la régulation d’une des étapes de la
physiologie spermatique : la réaction acrosomique.

Régulation de la physiologie spermatique par les phospholipases A2

secrétées
La recherche de nouveaux outils pharmacologiques dans les venins par des tests d’activités
biologiques nous a permis de mettre en évidence la voie de régulation de la physiologie
spermatique par les phospholipases A2 secrétées. Plusieurs études ont suggéré un rôle pour
une ou plusieurs phospholipases A2 secrétées au niveau de la capacitation, de la réaction
acrosomique (RA) et de la fécondation, mais la nature moléculaire de ces enzymes et leurs
rôles spécifiques restaient encore inconnus (Roldan and Fragio 1993 ; Garde and Roldan
1996) ;(Lui and Meizel 1979; Ono, R. Yanagimachi et al. 1982 ; Llanos, Morales et al.
1993 );(Singleton and Killian 1983) ; (Fry, Ghosh et al. 1992) ; (Riffo and Parraga 1996).

À partir de nos résultats, nous avons pu établir un modèle de régulation de la physiologie

spermatique par la sPLA2 mGX. Les connaissances actuelles ont permis de déterminer qu’in
vivo la population de spermatozoïdes est très hétérogène et qu’une fraction importante (20-
30%) présente des défauts morphologiques ou fonctionnels compromettant ainsi le
développement de l’embryon.

Les spermatozoïdes sont exposés à mGX (et éventuellement à d'autres activités sPLA2) lors
de leur mélange avec le liquide séminal (Masuda, Murakami et al. 2004) mais aussi lors de
leur ascension dans les voies féminines (capacitation) (Valentin, Ghomashchi et al. 1999).

Nos données appuient l'idée que mGX induit des réactions acrosomiques prématurées et
réduit la mobilité spermatique d’une sous-population de spermatozoïdes dite sous-fertile afin
d’écarter les spermatozoïdes qui sont incapables d'assurer le développement normal de
107
 Conclusion générale et perspectives

l'embryon du processus de fécondation. Et ce, lors de leur mélange avec le liquide séminal et
lors de leur ascension dans les voies féminines (capacitation). Par conséquent, la réaction
acrosomique qu’on appelle « réaction acrosomique spontanée » correspondrait en partie à la
réaction acrosomique déclenchée par mGX et pourrait représenter un mécanisme
physiologique de tri des spermatozoïdes dans les organes génitaux mâles et femelles, qui
compense le manque de fiabilité de la production des spermatozoïdes (Figure 40).

Ces données renforcent l’hypothèse selon laquelle la sPLA2 mGX sécrétés lors de la réaction
acrosomique induite par la zone pellucide serait impliquée dans le mécanisme d’interaction
gamétique via ses métabolites lipidiques. Notamment l’addition des métabolites des sPLA2
(lysoPC) au moment de la fécondation, ont permis de rétablir le pouvoir fécondant des
spermatozoïdes mGX-/-.

Une étude récente montre que l'élimination de la population des spermatozoïdes qui présente
une externalisation des phosphatidylsérines permettait d’améliorer le taux de fécondation lors
de procréation médicale assistée (Upreti, Hall et al. 1999). mGX pourrait être utile pour
éliminer cette population in vitro. Ainsi, mGX est une sPLA2 particulière qui représente un
espoir pour de nouvelles stratégies thérapeutiques de lutte contre l'infertilité masculine. Elle
pourrait être utilisée dans les techniques de reproduction assistée, pour améliorer les résultats
des FIV ou pour sélectionner les spermatozoïdes pour les ICSI (Intra-Cytoplasmic Sperm
Injection) sur leur statut acrosomique.

108
 Avant capacitation Capacitation
mGX
mGX , Hyaluronidase
mGX

Population
hétérogène

Fertilité
0 1
Spermatozoïdes

Figure 40: Modèle de la régulation de la physiologie spermatique par la phospholipase A2 secrétée mGX.
Les spermatozoïdes vont être exposés à mGX lors de leur ascension dans les voies féminines (capacitation).
mGX va induire des réactions acrosomiques spontanées et réduire la mobilité spermatique de la sous-population de spermatozoïdes
dite sous-fertile afin de les écarter du processus de fécondation.
Les réactions acrosomique spontanées et les réactions acrosomique induites par la zone pellucide vont permettre la libération du
contenu acrosomique et augmenter la concentration extracellulaire de mGX et de hyaluronidase. L’augmentation de la
concentration extracellulaire de mGX et de hyaluronidase va favoriser l’interaction gamétique et permettre la fécondation.
Conclusion générale et perspectives

109
 Conclusion générale et perspectives

En conclusion, nous avons montré pour la première fois que la phospholipase A2 secrétée
mGX régule différentes étapes clefs de la fécondation : la mobilité spermatique, la réaction
acrosomique et l’interaction gamétique. Afin de poursuivre cette étude, il faudrait s’attacher à
comprendre les mécanismes moléculaires à la base de ces différentes régulations
physiologiques spermatiques.

Les objectifs seront de caractériser : 1) les phospholipides spermatiques impliqués et ciblés

par la sPLA2 mGX, 2) les métabolites importants issus du métabolisme des phospholipides
spermatique 3) les cibles moléculaires des métabolites produits et 4) les cascades de
signalisation cellulaire induite par des métabolites produits.

Identifications des cibles de la sPLA2-mGX

L’identification des cibles phospholipidiques et des métabolites produits par la sPLA2 mGX
pourra s’effectuer selon deux méthodes. La première consistera par une analyse des
phospholipides membranaires par TLC-FID (flame-ionization detection). La deuxième
consistera en une analyse lipidomique par HPLC couplée à la spectrométrie de masse afin
d’identifier les métabolites produits. Ces analyses sont très sensibles, elles permettent une
analyse complète de la composition lipidique des membranes (Guiraud, de Lorgeril et al.
2008) ainsi qu’une analyse globale de l’ensemble des lipides produits sur une cellule donnée
(Bollinger, Ii et al. 2009). Nous traiterons les spermatozoïdes purifiés avec la sPLA2 mGX et
identifierons les cibles phospholipidiques spermatiques de mGX ainsi que les différents types
d’acides gras, d’éicosanoïdes et de lysophospholipides produits. L’identification et la
purification de ces métabolites nous permettront par la suite d’établir leurs cibles moléculaires
et leurs mécanismes d’action.

Évaluation des mécanismes moléculaires de régulation de deux étapes

la physiologie spermatique : la mobilité spermatique et la réaction
acrosomique par les métabolites lipidiques produits par mGX

Comme je l’ai expliqué dans la partie introduction, les canaux ioniques sont importants dans
la physiologie du spermatozoïde et contrôlent chaque étape clé : les canaux potassiques, la
capacitation et les canaux calciques, la RA et le battement flagellaire. Ainsi, nous pouvons
envisager que la phospholipase A2 mGX régule la mobilité spermatique via une modification
de la signalisation calcique spermatique par ses métabolites lipidiques.

110
 Conclusion générale et perspectives

Bien que le mécanisme de la motilité des spermatozoïdes soit peu connu, il a été montré que
la modification de la balance du calcium par différents mécanismes était très importante. Les
canaux CatSper sont à l’heure actuelle, les acteurs principaux de la signalisation calcique qui
régule la mobilité spermatique. En effet, l’invalidation d’un des 4 gènes de CatSper (CatSper
1, 2, 3 ou 4) chez la souris mâle induit une immobilité flagellaire et une infertilité (Ren,
Navarro et al. 2001; Avidan, Tamary et al. 2003; Carlson, Westenbroek et al. 2003; Lobley,
Pierron et al. 2003; Carlson, Quill et al. 2005; Qi, Moran et al. 2007; Navarro, Kirichok et al.
2008; Carlson, Burnett et al. 2009).

La caractérisation de l’action des métabolites lipidiques de mGX sur le flux calcique Catsper
dépendant est difficile. En effet, les canaux CatSper, bien que clonés, ne permettent pas des
études pharmacologiques par des techniques de réexpression dans des systèmes hétérologues.
De ce fait, il semblerait que des sous-unités essentielles de régulation seraient manquantes
pour que leur expression membranaire soit possible. Seule la technique d’imagerie calcique
sur des spermatozoïdes matures nous permettra de visualiser les vagues calciques induites par
l’activation de ce type de canaux (Ren, Navarro et al. 2001). Ainsi, dans cette optique nous
envisageons de prétraiter les spermatozoïdes matures avec les métabolites lipidiques purifiés
de la sPLA2 mGX et regarder leurs effets sur la vague calcique de CatSper induit par de
l’AMPc (Ren, Navarro et al. 2001).

Cependant, malgré le rôle principal de Catsper dans la mobilité spermatique, on peut aussi
envisager que ces métabolites réguleraient d’autres canaux calciques. Des études
d’immunolocalisations situent les canaux TRPC1, 3, 4 et 6 dans le flagelle du spermatozoïde
(Castellano, Trevino et al. 2003) et l’utilisation d’antagonistes des canaux TRPCs montre que
ces protéines pourraient jouer un rôle dans le contrôle du mouvement flagellaire humain.
Ainsi, il serait intéressant de caractériser l’effet des métabolites lipidiques de mGX sur les
courants calciques des canaux TRPC par la technique de patch clamp et d’imagerie calcique.

L’utilisation de la technique du patch clamp en configuration « cellule entière » nous

permettra de perfuser la cellule avec les métabolites identifiés précédemment et de tester leurs
effets sur les flux ioniques. Les différents canaux TRPC seront sur-exprimés dans des cellules
HEK de telle manière que l’immense majorité du courant mesurée corresponde au canal
introduit dans la cellule.
111
 Conclusion générale et perspectives

L’utilisation de l’imagerie calcique est plus difficile, car on mesure la variation de calcium sur
les spermatozoïdes entiers. Ainsi, nous prétraiterons les spermatozoïdes matures avec les
métabolites lipidiques purifiés de la sPLA2 mGX et regarderons leurs effets sur la vague
calcique de TRPC activée par un outil pharmacologique qui entraîne une vidange des stocks
calciques : la thapsigargine. La thapsigargine, alcaloïde de plante, est un inhibiteur des
pompes Ca2+-ATPases de type SERCA. Ce type de pompe se localise au niveau de la
membrane du réticulum. Le blocage de ces pompes entraîne une fuite passive de calcium hors
du réticulum (le stock calcique est poreux) et aboutit in fine à l’activation des canaux
calciques sensibles à la vidange des stocks (TRPC). Cette activation se traduit par un influx de
calcium dans la cellule. La thapsigargine est appliquée en absence de calcium externe, afin de
mesurer dans un premier temps l’augmentation de calcium cytoplasmique induite par la
vidange du stock. Lorsque la vidange est terminée et que le calcium est retourné à son niveau
basal dans la cellule, le calcium est réintroduit dans le milieu externe. Le signal d’ouverture
des canaux TRPC étant toujours présent (stocks calciques vides), l’influx de calcium est alors
enregistré.

En ce qui concerne la modulation de la réaction acrosomique par les métabolites lipidiques de

la sPLA2 mGX, nos résultats nous ont permis d’établir qu’elle ne passait pas par une
régulation des canaux calciques. Car, l’ajout de BAPTA-AM n’empêchait pas la modulation
de la réaction acrosomique par mGX.

La réaction acrosomique est un processus très régulé, composée de plusieurs étapes. Les
protéines SNAREs y jouent un rôle primordial, elles constituent des étiquettes qui permettent
la reconnaissance mutuelle et le déclenchement de la fusion entre la vésicule acrosomique et
la membrane plasmique du spermatozoïde (Tomes, Michaut et al. 2002; Tomes 2007).
Certaines études ont montré que l’exocytose des vésicules synaptiques pouvait être induite par
l’ajout d’acide gras (De Blas, Michaut et al. 2002; De Blas, Roggero et al. 2005; Darios,
Connell et al. 2007; Davletov, Connell et al. 2007). Ces acides gras permettraient la régulation
d’une protéine SNARE : la syntaxine.

Il existe différentes isoformes de la syntaxine. Une isoforme : la syntaxine 1, est présente dans
les complexes SNAREs spermatiques qui sont impliqués dans la mise en place de la réaction
acrosomique (Tomes, Michaut et al. 2002; Tomes 2007). Nous pouvons, envisager

112
 Conclusion générale et perspectives

que les métabolites lipidiques spermatiques produits par la sPLA2 mGX régulent la réaction
acrosomique par une modulation de l’activité des protéines SNAREs spermatiques.

L’utilisation d’une combinaison de neurotoxines, d’anticorps anti-SNAREs, des métabolites

lipidiques produits par mGX et de chélateur de Ca2+ photosensible (De Blas, Roggero et al.
2005) nous permettra de déterminer in vitro la modulation de l’activité des protéines
SNAREs.

Évaluation de l’implication de la sPLA2-mGX dans l’interaction

gamétique

L’étude des voies moléculaires de régulation de l’interaction gamétique par la sPLA2 mGX est
plus difficile à mettre en place. En effet, cette interaction fait intervenir deux cellules
distinctes. De plus, les mécanismes moléculaires impliqués dans l’interaction gamétique sont
peu connus. Les connaissances actuelles permettent de savoir qu’ils existent différents
partenaires protéiques tels que : la famille des protéines ADAM, l’intégrine α6β1, la protéine
CD9 et la protéine Izumo.
Pour caractériser les voies moléculaires de régulation de l’interaction gamétique par la sPLA2
mGX, nous envisageons dans un premier temps de confirmer son implication par des
expériences in vitro en évaluant le pourcentage de spermatozoïdes accrochés à la zone
pellucide de l’ovocyte après pré-traitement avec la sPLA2 mGX ou ses métabolites lipidiques.
Et dans un deuxième temps, de regarder si la sPLA2 mGX ou ses métabolites sont capables ou
non de réguler l’interaction gamétique par une interaction directe avec un des partenaires
protéiques, par exemple Izumo par la technique de Pull-Down.

Évaluation du rôle des autres sPLA2 de mammifères

Il existe in vivo un grand nombre de sPLA2 qui pourraient potentiellement moduler la

physiologie des spermatozoïdes. Il sera intéressant de tester ces différentes sPLA2 humaines
ou de souris seules ou en présence de la sPLA2 de groupe X. De plus, plusieurs peptides
antimicrobiens, présent naturellement dans le liquide séminal, sont co-sécrétés avec certaines
sPLA2 et sont connus pour moduler l’activité enzymatique des sPLA2 ou bien agissent en
synergie avec ces dernières (Pruzanski, de Beer et al. 1995; Muller, Autenrieth et al. 2005). Il
sera donc important de tester l’effet des sPLA2 en présence des peptides antimicrobiens
naturellement présents dans le liquide séminal (Moura, Chapman et al. 2007) au niveau des
différentes étapes clés de la physiologie spermatique. Nous envisageons dans un premier
113
 Conclusion générale et perspectives

temps de mesurer l’activité des onze sPLA2 présentes, soit au niveau des spermatozoïdes (au
niveau de l’épididyme), soit dans le liquide séminal (avant éjaculation), par une technique
particulièrement sensible d’immuno-essai qu’est la technique TRFIA (Time-Resolved
Fluorescence Immunoassay). Et dans un deuxième temps de tester les sPLA2 les plus
représentatives sur les étapes clés de la physiologie spermatique : La mobilité, la réaction
acrosomique et la fécondation in vitro.

Si les rôles joués par les autres sPLA2 présentes dans le liquide séminal dans la physiologie
spermatique s’avèrent indispensables, une étude du polymorphisme de leur gène au niveau de
patients recrutés dans les laboratoires médicaux de procréation assistée, permettra de mieux
comprendre les causes de l’infertilité masculine et peut-être de pouvoir les traiter.

Implication des canaux calciques de type T dans la régulation de la réaction

acrosomique
Le développement des souris Cav3.1 − / − et Cav3.2 − / − nous a donné l’opportunité d’évaluer
l’implication des canaux Cav3.1 et Cav3.2 dans la réaction acrosomique.

Nos données démontrent clairement que l'influx de calcium nécessaire lors de la réaction
acrosomique est contrôlé en premier lieu par les deux familles de VDCC, les canaux
dépendants du voltage à bas seuil d’activation Cav3.2 et les canaux dépendants du voltage à
haut seuil d’activation (HVA).

Afin de poursuivre cette étude sur les mécanismes d’activation de la réaction acrosomique, il
faudrait évaluer le rôle des canaux HVA dans le contrôle de la RA. Certains auteurs ont
montré par des techniques immuno-histochimiques qu'il existait une grande variété de canaux
calciques dépendants du voltage, à haut seuil d’activation (CCDV-HS), dans le
spermatozoïde mature, (Wennemuth, Westenbroek et al. 2000). Ainsi, on retrouve au niveau
de la tête du spermatozoïde les canaux Cav1.2, Cav2.1, 2.2 et 2.3. Ces résultats, obtenus par
immuno-histochimie, ne sont pas supportés par l’enregistrement de ces types de canaux
calciques par électrophysiologie. En effet, l’étude des canaux ioniques du spermatozoïde est
rendue complexe par le fait que la technique du patch-clamp n’est pas possible sur les
spermatozoïdes à l’heure actuelle. Une technique alternative consiste à enregistrer les
courants dans les cellules spermatogéniques des testicules. Cette expérience n’a révélé la

114
 Conclusion générale et perspectives

présence que de courants T. Ainsi, l’expression ou la traduction de ces canaux calciques à

haut seuil d’activation doivent se réaliser dans les étapes ultimes de la spermatogenèse, stades
auxquels nous n’avons pas accès par les techniques classiques d’électrophysiologie. Puisque
dans les spermatocytes, il n’existe qu'un seul type de courant calcique dépendant du voltage,
dit de type T.

Dans l’optique de déterminer l’implication des canaux HVA dans la physiologie spermatique,
des souris ko de Cav1.2 ; Cav2.1, 2.2 et 2.3 ont été élaborées (Jun, Piedras-Renteria et al.
1999; Kim, Jun et al. 2001; Sakata, Saegusa et al. 2001). Ces souris ont permis de mettre en
évidence que les canaux Cav2.1, 2.2 et 2.3 n’étaient pas impliqués dans les mécanismes de
régulation de la physiologie spermatique (Jun, Piedras-Renteria et al. 1999; Kim, Jun et al.
2001; Sakata, Saegusa et al. 2001). Aucune donnée sur l’implication de Cav1.2 dans la
physiologie spermatique n’a pu être obtenue, car le KO Cav1.2 est létal.

Cependant, le rôle putatif de ce canal est renforcé par les résultats qui montrent l’existence
d’une délétion dans les transcrits pour les canaux calciques de type Cav1.x dans les testicules
d’homme infertile avec varicocèles (Benoff, Goodwin et al. 2005).

Il serait souhaitable de mieux appréhender le rôle de ce canal calcique HVA Cav1.2 dans la
physiologie spermatique. Pour cela, nous envisageons une stratégie originale qui consiste à
invalider le gène Cav1.2 dans le temps et dans l’espace avec un système de recombinaison
Cre/Lox P (Barrionuevo, Bagheri-Fam et al. 2006).

Dans un premier temps, on élaborera des souris transgéniques où deux sites lox P seront
insérés de part et d’autre de l’exon du gène de Cav1.2. Dans un second temps, des souris
transgéniques où la Cre recombinase sera placée sous la dépendance d’un promoteur testicule
spécifique de la protamine. Le croisement des souris transgéniques Lox P/ Cav1.2 et
Cre/protamine nous permettra de crée des souris saines où les canaux Cav1.2 seront invalidés
seulement dans les testicules. Ces souris nous permettront d’évaluer l’implication des canaux
Cav1.2 dans le mécanisme de spermatogénèse et la physiologie spermatique.

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146
 Résumé

Des sPLA2 de venins de serpents à leurs homologues de Mammifères:

Rôles de ces enzymes dans la fécondation.
La baisse de la fertilité masculine mondiale ces dernières décennies est devenue
préoccupante. Ainsi, un homme sur quinze est subfertile. Si les causes de la baisse de la
fertilité semblent être essentiellement liés à l'environnement et au mode de vie, il est
essentiel de comprendre tous les mécanismes qui régulent le pouvoir fécondant du
spermatozoïde afin d’optimiser les techniques de procréation médicalement assistée. Le
développement de nouveaux axes de recherche, expérimentaux et théoriques, pour
identifier les mécanismes sous-jacents de l’infertilité masculine est indispensable. C’est
dans ce contexte, de développement de nouvelles stratégies expérimentales que se situe ce
travail de thèse. La stratégie que j’ai employée ici est la recherche de nouveaux outils
pharmacologiques à partir de venin d’animaux par des tests d’activités biologiques. Cette
recherche nous a permis de mettre en évidence une nouvelle voie de régulation de la
physiologie spermatique : la voie des phospholipases A2 secrétées. Ainsi, nous avons
montré pour la première fois que les phospholipases A2 secrétées, régulent 4 étapes clé de
la fécondation : la capacitation, la mobilité spermatique, la réaction acrosomique et
l’interaction gamétique.

Mots clefs : Spermatozoïde - réaction acrosomique - mobilité spermatique - fécondation in

vitro - phospholipases A2 – fertilité – capacitation

From SPLA2 of snake venoms to their mammal homologues: Roles of these

enzymes in mouse fertilization

The fall of the world male fertility these last decades became alarming. Thus, a man on
fifteen is subfertile. If the causes of the fall of fertility seem to be mainly related on the
environment and the lifestyle, it is essential to understand all the mechanisms which control
the fertilizing ability of spermatozoon in order to optimize the techniques of procreation
medically assisted. The development of new research orientations, experimental and
theoretical, to identify the subjacent mechanisms of male infertility is essential. In this
context, development of new experimental strategies that is situated this work of thesis.
The strategy that I employed here is research new pharmacological tools starting from
venom of animals by tests of biological activities. This research allowed us to discover a
new regulatory pathway of sperm physiology involving secreted phospholipases A2. Thus,
we showed for the first time that secreted phospholipases A2 regulate four key events of
sperm physiology: Capacitation Acrosome reaction, sperm motility and gamete interaction.

Key words : Spermatozoa - acrosome reaction- sperm motility - in vitro fertilization-

phospholipase A2- fertility - capacitation