Isolement et caractérisation des

microorganismes à
 Introduction
• L’eau est un élément essentiel pour le développement de la vie. Le
corps d’un être humain adulte est composé de 60% d’eau et une
consommation minimale de 1,5 litre d’eau par jour lui est
nécessaire (France, 2005).
• En raison de son caractère vital, l’eau doit être mise à la disposition
des populations sous forme potable et donc de bonne qualité
sanitaire.
• Le manque d’hygiène et la qualité douteuse constatés autour de la
vente de ces eaux font que les risques d’infections d’origine
hydrique sont graves et demeurent fréquents.
• Selon l’OMS prés de 25 millions de personnes décèdent chaque
année du fait de la consommation d’eau contaminée dans les pays
en voie de développement (Gret, 1994).
 Introduction

• Les eaux destinées à l'alimentation humaine (mais aussi

celles qui sont destinées à l'alimentation animale, à
l'arrosage des légumes et des fruits, à la baignade,
…) doivent être exemptes de tout organisme pathogène
ou opportuniste susceptible de provoquer des troubles de
la santé chez ceux qui les consommeraient ou les
utiliseraient.
 Objectif de l’analyse microbiologique
• L’analyse microbiologique d’une eau débute :
1-en premier lieu par un bon prélèvement qui doit mettre en œuvre des
méthodes assurant l’absence de contamination et la survie
bactérienne.
2-en second lieu, les méthodes générales d’examen bactériologique des
eaux suivies des recherches de bactéries indicatrices de pollution et
d’efficacités de traitement puis des bactéries spécifiques pathogènes
seront appliquées .
• L’objectif de l’analyse bactériologique d’une eau n’est pas
d’effectuer un inventaire de toutes les espèces présentes, mais de
rechercher soit celles qui sont susceptibles d’être pathogènes, soit
celles qui sont indicatrices de contamination fécales.
• Germes recherchés sont :

• germes aérobies revivifiables à 22 °C et à 37 °C

(également appelé flore aérobie mésophile totale : FAMT)

• coliformes (totaux, thermotolérants

(=fécaux) et Escherichia coli)

• entérocoques (streptocoques fécaux)

• spores de Clostridium sulfitoréducteurs (témoin peu

spécifique de contamination fécale ancienne car certains
sont saprophytes du sol) ou de Clostridium
perfringens (témoin plus spécifique de contamination
fécale ancienne)
 Méthode de prélèvement
• Matériel de prélèvement :
- flacon en verre de 250 à 1000 ml stérile.
-flacon en plastique à usage unique stérilisés
par le fabriquant.
• Appareils de prélèvement :
- Plongeur et canne à prélèvement : utilisé en
cas de prélèvement d’une eau d’un puits, au
centre d’un cours d’eau, en profondeur dans
un lac.
 Appareils de prélèvement

plongeur Canne à prélèvement

 Méthodes de prélèvement
• I.2 Mode de prélèvement
• En fonction de la nature des eaux analysées et celle des
micro-organismes recherchés, les normes fixent des
conditions à respecter (volume de l’échantillon, agent
neutralisant, qualité du matériel d’échantillonnage…..)

• L’objectif est d’obtenir un échantillon aussi représentatif

que possible de l’eau à examiner, sans contaminer ni
modifié l’échantillon.
• Des précautions doivent être prises à trois niveaux:
-Le matériel de prélèvement
-Le mode de prélèvement
-Le transport et la conservation des échantillons
 Méthodes générales de dénombrement

en milieu solide En milieu liquide

Méthode de
Méthode par incorporation détermination du
nombre le plus
Méthode par étalement
probable (NPP)
Méthode par filtration
 Méthodes générales de dénombrement
• 2) Méthodes de dénombrement en milieu liquide
Les prises d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses dilutions sont
incorporées dans un milieu de culture liquide conçu pour permettre la
croissance d’un micro-organisme ou de groupe de microorganismes. La
croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et,
éventuellement, une modification visible (virage d’un indicateur de pH
coloré).
• 2.1) Méthode du nombre le plus probable :
• Principe :
• Cette méthode est une estimation statistique du nombre de
micro-organisme supposés distribués dans l’eau de manière
parfaitement aléatoire. L’estimation de la densité bactérienne
est obtenue à partir de réponses positives observées pour une
ou plusieurs dilution successives de la suspension bactérienne
originelle. Il s’agit d’une méthode quantique et non pas
énumérative.
• 2.1) Méthode du nombre le plus probable :
• On ensemence des dilutions successives de l’eau à analyser
(par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de
culture liquide par dilution (jusqu’à 96 puits en cas de
manipulation en micro plaque).
• On notera le nombre de tubes inoculés présentant une
culture visible indiquant la présence d’au moins d’un micro-
organisme.
• Il doit être tenu compte que si l’absence de culture
correspond à l’absence de micro-organisme, plus d’un micro-
organisme peut être responsable d’une culture positive.
• Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de
puits positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur
statistiquement la plus probable et son intervalle de
confiance).
Evaluation du nombre de bactéries par mL

Nombre de colonies compté

n
dilution de l’échantillon
N = ——————
Vd
UFC/ml

Volume de l’inoculum ml
 Analyse
microbiologique
 Dénombrement des micro-organismes
revivifiables

Le principe consiste à mettre en évidence les bactéries

• Qui se développent à 22°C favorisant ainsi les germes
spécifiques de l’eau.
• Et celles qui se développent à 37°C favorisant ainsi les germes
issus de l’homme et des animaux à sang chaud.
 Recherche et dénombrement des Coliformes
totaux et fécaux

• Les coliformes totaux :

• Ce sont des bâtonnets aéro-anaérobies facultatifs, Gram
négatif, non sporulant, oxydases négatifs, capables de se
multiplier en présence de sels biliaires et capables de
fermenter le lactose avec production de gaz à 35-37°c.
• Ils sont présents en grand nombre dans les excréments
humains et animaux, mais peuvent proliférer dans les sols et
les milieux aquatiques.
• Si l’analyse d’eau d’un puits détecte la présence de coliformes
totaux dans une concentration de plus de 10 UFC/100ml, il
faut le désinfecter.
• Les Coliformes thermotolérants (ou fécaux) :
• Ils proviennent des intestins et des excréments des
humains et des animaux à sang chaud.
• Escherichia coli est de loin la plus fréquente de ce groupe
qui comprend également des espèces des genres :
Citrobacter, Yersinia, klebsiella, et Enterobacter .
• L’absorption d’une eau infectée de coliformes fécaux peut
entraîner des maladies très graves et, dans certains cas,
peut causer la mort.
Intérêt:
• La recherche et le dénombrement des coliformes totaux à
37°C :intéressant pour juger de l’efficacité de la désinfection
d’une eau est d’un intérêt moindre pour déceler une
contamination fécale sure.
• Les coliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C : la présence
signe l’existence quasi certaine de la contamination fécale.
• La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli
ou présumés : parmi les coliformes thermotolérants,
Escherichia coli est l’espèce la plus représentée dans la flore
intestinale de l’homme et des animaux.
 Recherche et dénombrement des
Streptocoques fécaux ou entérocoque
• Les Entérocoques intestinaux (ou Streptocoques
fécaux):
• Ce sont des bactéries sphériques groupées en paires ou
en chaînes, Gram positif, catalase négatif et anaérobies
facultatives. Elles ne forment pas d’endospores et
certaines espèces font preuve de mobilité. Se cultivant
à 44° C.
Ils se répartissent en deux genres :
 Streptococcus
 Enterococcus
Intérêt:

• les entéroques sont plus résistant que les coliformes dans

les eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe d’une
contamination fécale de l’eau plus ancienne.

• Les streptocoques fécaux résistent à la dessiccation et aux

substances aseptiques qui devraient empêcher leur
croissance.

• Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des
contaminations fécales. On retrouve par exemple
Streptococcus feacalis var liquefaciens dans
l’environnement, sur les végétaux ou sur des sols non
contaminés.
 Recherche et dénombrement des spores des
bactéries sulfito-réductrices et Clostridium
sulfito-réducteurs
Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices :
formes de résistance de micro-organismes se développant en
anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou 48h en gélose viande foie et
donnant des colonies typiques réduisant le sulfite de sodium.
Spores de Clostridium sulfitoréducteurs : même définition que la
précédente pour des bacilles à Gram positif, ne possédant pas de
catalase et ayant l’aspect morphologique des Clostridium.
Intérêt:
• Ils ne sont pas tous des indicateurs de contamination fécale.
Clostridium perfringens bien qu’effectivement présent dans les
matières fécales, est un germe assez ubiquiste.

• L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la propriété

de sporulation, ce qui les rend particulièrement résistant aux
traitements de désinfection.

• Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de

l’efficacité des traitements.
 Recherche des germes pathogènes
• La plupart de ceux qui sont ingérés font courir un risque sérieux de
maladies dés qu’ils sont présents dans l’eau de boisson et leur
élimination doit être prioritaire.
• Parmi eux:
• E. coli, Salmonella, Vibrion cholerae, Yersinia enterocolilica,
Campylobacter jejuni,
• les virus (virus de l’hépatite A, Entérovirus, Rotavirus, virus de
Norwalk..)
• et des parasites (Giardia lamblia, Cryptosporidium pavum,
Entamoeba hystolitica, et Dracunculus medinensis) .
• Lorsque la défense est affaiblie des germes habituellement inoffensifs
tels que Pseudomonas, Flaviobactérium, Acinétobacter, klebsiella et
Serratia peuvent devenir pathogènes.
 Maladies véhiculées par l’eau et ses agents
Les micro-organismes pathogènes incluent notamment les virus, les
bactéries, les protozoaires les parasites.
Maladies Agents pathogènes
D’origine bactérienne
la Typhoïde et la paratyphoïde Salmonelle typhique
La dysenterie bacillaire Salmonelle parathyphique A et B
le choléra Shigella sp
la Gastro-entérite aiguë et la diarrhée Vibrio cholerae
Escherichia coli Entérotoxique, Campylobacter
Yersinia enterocolitica, Salmonelle, Shigella sp
D’origine virale
L'hépatite A et E Virus de l’hépatite A et E
La polio Virus de la poliomiélite
La Gastro-entérite aiguë et chronique Virus Norwalk
Rotavirus
Enterovirus
Adenovirus
D’origine parasitaire
dysenterie amibienne Entamoeba histolytica
parasite gastro-entérite Giárdia lâmblia
Cryptosporidium
Recherche des germes pathogènes
1. Recherche de salmonella

– Des bacille Gram négatifs

– (x) à la température de 36 ± 2°C en 24 à 48
h, sur milieu Hektoen, formant de petites
colonies, lisses à contours réguliers,
pigmentées en vert ou en bleu vert à centre
noir.
• Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes :
les typhoidiques (Hautement pathogènes) et les non
typhoidiques.
Méthode de recherche

RV: Bouillon Rappaport Vassiliadis

Soja
Pep Tamp: Eau Peptonée Tamponnée

Pré-enrichissement

Enrichissement secondaire

Isolement
 2) Recherche de Staphylocoques à coagulase
positive :

– Cocci à Gram (+)

– Isolées ou en grappes de raisin,
– Catalase (+) et coagulase (+)
– (x) en 24 à 48 h à 36 ± 2°C sur un milieu
sélectif Chapman au mannitol.
• L’espèce type du genre est
Staphylococcus aureus. Elle est
pathogène et très redoutée.
Méthode de recherche
3) Recherche de Pseudomonas aeruginosa

– Un bacille Gram négatif

– Oxydase (+)
– Capable de produire de l’ammoniac à partir de
l’acétamide.
• Pseudomonas aeruginosa, est également
une bactérie hautement pathogène et
résistante à plusieurs antibiotiques.
Méthode de recherche
Gélose cétrimide:
Milieu d’isolement sélectif

Bouillon acétamide:
milieux de confirmation
4) Recherche de vibrion cholérique

– Bacille Gram négatif droits ou incurvés,

– Très mobiles,
– Oxydase (+),
– AAF,
– Fermentant le glucose sans production de gaz
ni d'H2S, Hautement pathogènes.
Méthode de recherche

EPA: milieu d’enrichissement (Eau

Peptonée Alcaline
GNAB: milieu sélectif(Gélose Nutritive
Alcaline Biliée)
Critères microbiologiques d’une eau
potable
Pourquoi rechercher les germes test????

Afin d’évaluer:

• La potabilité des eaux d’alimentation;

• Le degré de pollution des eaux de surface,..;
• L’efficacité des traitements utilisés pour
décontaminer ces eaux
 Procédés de désinfection
• Parmi ceux-ci, la chloration est un des premiers
procédés à avoir été utilisé à grande échelle et reste
aujourd'hui le procédé le plus couramment utilisé.
• Les produits chlorés sont efficaces, faciles à utiliser, et
demeurent actifs jusqu'au robinet du consommateur.
• la chloration peut être à l'origine de la formation de
sous-produits de désinfection tels que les
trihalométhanes (THM), dont les effets sur la santé sont
encore mal caractérisés. La Directive européenne a
abaissé la norme en matière de THM à 100 ng/l
• Parmi les autres procédés, l'ozonation est
extrêmement efficace.
• Elle ne produit pas de THM, mais cette technique ne
peut assurer la désinfection de l'ensemble du réseau
de distribution en raison de la grande instabilité de
l'ozone. De même, certains producteurs d'eau
utilisent des lampes à Ultraviolets comme procédé de
désinfection. Ce procédé est très efficace et n'influe
pas sur la qualité organoleptique de l'eau. Le
problème est qu'il ne peut prévenir une dégradation
microbiologique qui surviendrait par la suite dans le
réseau de distribution
 Conclusion
• L'efficacité de la désinfection est démontrée
par le taux de conformité très élevé des
échantillons analysés pour les paramètres
microbiologiques : il devrait atteindre les
98,5 %