Les anticorps monoclonaux : Applications

Prof RAACHE . R
Alger 1/(USTHB)/IPA
Introduction

Grande hétérogénéité (spécificité)

les anticorps contenus dans:
• les sérums humains
• Les sérums animaux Manque de sensibilité, manque de
spécificité
(techniques immunochimiques)
 Phage Display

Transgenic Mice

Humanization
1992
Chimérization 1996
1986
EBV
1985
Human MAbs
1980 Humanized MAbs

1975 Human MAbs

Murine Mabs (Köhler and Milstein)
 1) Définition

• Molécules sécrétées par une cellule immortalisée:

Hybridome

• Identiques aux anticorps naturels (plan structural)

• Originalité: homogénéité
2) Les différents types d’hybridomes

• Hybridome: une cellule hybride née de la fusion d’une cellule issue d’une
lignée continue myélomateuse et un lymphocyte B différencié sécrétant des
anticorps d’une seule spécificité

• Hybrides stables: fusion entre cellules de la même espèce

2) Les différents types d’hybridomes

Les différents types d’hybridomes

Les hybridomes animaux

Les hybridomes humains

2) Les différents types d’hybridomes

III.2.1. Les hybridomes animaux:

Les hybridomes murins: le plus couramment produits, premier type

d’hybridome obtenu pour la première fois par KOHLER et MILSTEIN

 La souris: la lignée BALB/c est la plus fréquemment utilisée

 Le rat: meilleur rendement en hybrides

Hybridomes murin

Ag

SELECTION TEST
DES DES
HYBRIDOMES HYBRIDOMES

Cellules B activées
(HGPRT+, Ig+,
« mortelles »°

FUSION
DES
CELLULES

Cellules de
myélome (HGPRT-,
Ig-, « ISOLEMENT
immortelles ») DES
HYBRIDOMES PRODUCTION
OBTENTION
DES
DES Procédé de production d’anticorps monoclonaux
HYBRIDOMES
CELLULES spécifique d’un Ag donné
2) Les différents types d’hybridomes

III.2.2. Les hybridomes humains:

 1980: OLSSON et coll.
 Fusion des cellules myélomateuses
Hybride homme-homme humaines avec des lymphocytes humains.
Quatre approches


méthodologiques

1980: NOWINSKI et coll.

 Fusion des cellules myélomateuses de
Hétérohybride homme-souris souris ou de rat avec des lymphocytes
humains.

 Immortalisation des lymphocytes B par le

Utilisation du virus virus EBV
d’Epstein-Barr  Faible sécrétion d’anticorps.

 Construire un gène chimère: partie

Hybridomes murins humanisés variable, Ac murin et parties constantes
par d’Ig humaine
 Gène chimère+ vecteur: est transfecté dans
géni-génétique une cellule myélomateuse non sécrétante
3) Mode d’obtention des hybridomes
III.3.1. Les partenaires de la fusion :

Les partenaires de fusion

Les lymphocytes B
Les cellules myélomateuses
la rate d’animaux (souris)

Sang périphérique de Sujets humains hyperimmunisés

Lymphocytes humains: transformation par le virus EPSTEIN-B

3) Mode d’obtention des hybridomes

III.3.1. Les partenaires de la fusion :

Les lignées myélomateuses

Les myélomes: tumeurs malignes du système immunitaire, capacité de synthèse

de grande quantités d’immunoglobulines monoclonales

Origine: animale ou humaine

Sont non sécrétantes D’anticorps

3) Mode d’obtention des hybridomes
III.3.1. Les partenaires de la fusion :
Les lignées myélomateuses
Lignée cellulaire référence Dérivée de
A. Lignées de souris
- X63Ag8, 653 Keamy et coll. (1979) P3-X63 Ag8
- Sp2/0-Ag14 Köhler et Milstein (1976) P3X-63Ag8
- FO Shulman et coll. (1978) Xbalb/c
- NSI / I- Ag 4-1 De St.Grith et scheidegger (1980) Sp2/O-Ag14
- NSO / 1 Kohler et coll. 1976 P3-X63Ag8
- FOX-NY Galfre et Milstein (1981) NSI/1-Ag4-1
Taggart et samloff (1984) NSI/1-Ag4-1

A. Lignées de rat
- YB2/0 Galfre et coll. (1979) YB2/3HL
- IR983F Kilmartin et coll. (1982) Rats LOU/c
Bazin (1982)

A. Lignées humaines
- LICR- LON/HMY2 Edwards et coll. (1982) ARH-77
- KR4 (6-Thg- Oua) Kozbor et coll. (1982) Lignée
lymphoblastoide
3) Mode d’obtention des hybridomes

III.3.2. Les techniques de fusion :

Fusion

Virus de SANDAI Le poly-éthylène-glycol Technique

(1965) (PEG) (1975) d’électrofusion

Évite l’emploi des

Le plus
Le premier agent Délaissé: plusieurs lignées
HO(C2H4O) nH fréquemment
de fusion inconvénients myélomateuses
utilisé
déficientes
3) Mode d’obtention des hybridomes
Les techniques de sélection des hybrides :

Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine

TK- TK +
HGPRT- HGPRT+

Culture sur milieu HAT

Cellule de myélome Lymphocyte B
HGPRT⁻

1%

Mort cellulaire Hybride Mort cellulaire

Impossibilité de sélectionné Disparition après
se diviser quelques divisions
3) Mode d’obtention des hybridomes

III.3.3. Les techniques de sélection des hybrides :

Voie principale Voie de récupération
endogène (Exogène)
Phosphoribosyl pyrophosphate
+ Thymidine hypoxanthine
Uridylate
TK+ (thymidine HGPRT +
kinase (hypxanthine guanine
phosphoribosyl
transférase)

Aminoptérine

Nucléotides
DNA
L’aminoptérine bloque la synthèse de ADN par la voie de novo. Elle agit comme analogue de l’acide dihydro-
folique et se lie avec une forte affinité à la dihydrofolate réductase, inhibant ainsi la synthèse des purines.
En présence d’aminoptérine, les cellules doivent impérativement utiliser la voie de récupération pour
produire du DNA
3) Mode d’obtention des hybridomes

III.3.3. Les techniques de sélection des hybrides :

III. 3. 3. 2. CAS DES HETEROHYBRIDES:

 La sélection des hétérohybrides provenant de la fusion de cellules myélomateuses

HGPRT- avec des lymphocytes B humains normaux se fait en utilisant le milieu HAT

 Lymphocytes B humains transformés par l’EBV: la fusion doit se faire avec des
cellules myélomateuses HGPRT- rendues résistantes à l’ouabaïne.

 La sélection de ce type d’hybrides se fait alors par culture dans un milieu HAT
contenant également de l’ouabaïne.
 Culture des hybridomes

4) Production d’anticorps monoclonaux

Amplification Production par

des hybridomes cultures cellulaires

OBTENTION DES
ANTICORPS MONOCLONAUX

Production dans
les liquides d'ascites
CONSERVATION
DES HYBRIDOMES
4) Production d’anticorps monoclonaux

III.4.1. La production in vitro :

À l’échelle du laboratoire: Dans des flacons

À l’échelle industrielle: Des réacteurs à cellules libres

ou immobiles

La production in vivo :

 Pour la production in vivo, une ascite (épanchement péritonéal) est créée.

V. Les solutions moléculaires

Ac murins Ac humains
1975 1994-1999
…momab …mumab

Ac chimériques Ac « humanisés »
1984 1988- 1991
…ximab …zumab

Humanisation Moins
Immunogènes immunogènes
V. Les solutions moléculaires :
1) La construction d’anticorps chimériques

Isoler l’ADN codant pour le domaine VH et le domaine VL d’un AcM murin et à le lier à l’ADN
codant les domaines constants H et L d’une immunoglobuline humaine
IgG1 humaines (γ1) et de la région constante κ (Cκ) humaine
2) La construction d’anticorps humanisés

par greffe de régions hypervariables d’AcM de souris sur des régions charpentes
(Frameworks, FR) VH et VL humaines (Complementarity Determining Regions –CDRs –
grafting).

La construction d’anticorps humanisés

3) La technologie du phage display
4) Les souris transgéniques obtention d’anticorps à partir de souris transgénique
IV. Les systèmes de production industrielle

Les bactéries

Les levures et champignons

filamenteux

Les cellules d’insectes et le

système baculovirus

Les cellules de mammifères

Les plantes transgéniques

Les animaux transgéniques

Avantages et inconvénients

Avantages Inconvénients

Spécificité restreinte à un épitope donné

Spécificité de liaison
Délétions chromosomiques au niveau des
hybridomes: altération de leur reproductibilité

Homogénéité Le Coût de leur production

 Produire en quantité illimitée

 In vitro In vivo

Étude des Ac et des auto Ac

 caractérisation et purification des
Ag et auto Ag Utilisation diagnostique en
Utilisation diagnostique imagerie médicale

Immunohistochimie
Utilisation thérapeutique *
Cytologie

 sérodiagnostics
Applications: utilisation thérapeutique

Pathologies
inflammatoires

Maladies
Maladies tumorales
allergiques

Anticorps
monoclonaux

Maladies Pathologies
infectieuses cardiovasculaires

Transplantation
d’organe
Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique sur le marché (FDA)
(décembre 2008)
Les anticorps monoclonaux
en thérapeutique.
Mécanismes d’action
Les anticorps monoclonaux peuvent fonctionner selon trois
principaux modes d’action :

 Bloquant l’action de molécules ou de récepteurs spécifiques,

 Ciblant des cellules spécifiques

 Fonctionnant comme des molécules de signalisation

• 1- Blocage :
• Les anticorps monoclonaux sont utilisés pour bloquer de façon spécifique, la fonction de
facteurs de croissance, cytokines ou autres médiateurs solubles.
• Ce blocage se fait par liaison directe au facteur lui-même ou à son récepteur.

Ac m 1 anti-ligand

Ac m 2 anti-receptur
ligand

récepteur
Infliximab*
Adalimumab*
Golimumab
Certolizumab pegol
Canakinumab
Briakinumab
Ustekinumab
Omalizumab*

39
2- Cytotoxicité :

• En oncologie: cible les cellules tumorales.

• Deux mécanismes :

cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC)

Cytotoxicité dépendante du complément (CDC)

40
2-1 (ADCC) :

-
+
+
cellules NK,

Récepteur,
CD

ADCC

Cellule cible

41
• 2-2 Cytotoxicité dépendante du complément ou
CDC :

complément

C2 C3
C1q C5 MAC
Rituximab* (anti-CD20)
Ofatumumab (anti-CD20)
Ocrelizumab (anti-CD20)
Alemtuzumab (anti-CD52)
Muromonab* (anti-CD3)
Epratuzumab* (anti-CD22)
lyse cellulaire
Cellule cible

Régulation: CD35(CR1) , CD55(DAF)

42
• 3- Signalisation :

Ac m anti-CD3
Infliximab* (anti-TNF)
Complexe TCR-CD3 Rituximab (anti-CD20)
Otelixizumab* (anti-CD3)
Teplizumab* (anti-CD3)
Muromonab* (anti-CD3)
Adalimumab* (anti-TNF)

Lymphocyte T

43
B- NOUVELLES APPROCHES D’UTILISATION DES ANTICORPS
MONOCLONAUX EN THERAPEUTIQUE

• génie génétique
• meilleure compréhension des mécanismes cellulaires

nouvelles possibilités
1-Anticorps conjugués
2- Anticorps bi spécifiques
3- Anticorps intracellulaires :"Intrabodies’’
4- Fragments d’anticorps recombinants

44
1-Anticorps conjugués :
isotope radioactif,une toxine, un médicament (immunoliposomes) ou une enzyme
la cancérologie , maladies infectieuses , maladies parasitaires

Téchnologie ADEPT

Substance
cytotoxique enzyme
inactive
Toxine
Radio-isotope

Substance
cytotoxique
active

Cellule cible Cellule cible

Cellule cible

90 Y-Ibritumomab tiuxetan

ADEPT (antibody directed enzyme prodrug therapy)

45 45
2- Anticorps bi spécifiques:

Spécificité A Spécificité B

Anticorps bi-spécifique
(reconnai 2 antigènes)

Substance
cytotoxique Cellule
effectrice
Cellule cible
Cellule cible

46

46
- Anticorps intracellulaires :"Intrabodies":

• Les anticorps agissent normalement dans le milieu extracellulaire: après leur synthèse,
ils sont sécrétés dans les liquides extracellulaires ou restent liés à la surface des cellules
B comme récepteurs de l'antigène.

• Récemment des gènes codant des anticorps intracellulaires ont été conçus par génie
génétique.

• Ceci permettrait d'utiliser des anticorps dans les cellules pour bloquer la construction
des virus ou des protéines nocives, telles que les oncoprotéines.

• Le premier exemple de cette approche a consisté à créer l'anticorps F 105 qui se lie à gp
120 ( VIH).

47
4- Fragments d’anticorps recombinants :

• des fragments d’anticorps, en particulier les fragments Fab et scFv (single chain Fv)
produits par la technique du "phage-display".

• Les fragments possèdent de nombreux avantages par rapport aux Ig complètes:

- ils ont un volume de distribution plus élevé,
- une efficacité plus rapide,
- un risque plus faible de réactions secondaires d'origine immune,
- et une élimination plus rapide.

• Ces propriétés font d'eux des molécules adéquates pour la détoxification des substances
hautement diffusibles ou de toxines de faible poids moléculaire

• en plus, leur intérêt s'est amplifié pour une utilisation en cancérologie, par la possibilité
de les conjuguer à des toxines, enzymes ou autres substances, ou d'obtenir des
fragments bispécifiques voire trispécifiques (Multimères de fragments de scFv).

48
•CD20: cible antigénique
 Phosphoprotéine trans membranaire
de 297 acides aminés
 Canal calcique ?

 Expression quasi exclusive sur les

lymphocytes B

 Pas de libération dans les milieux

extra cellulaires

 Expression sur le lymphocyte B sauf:

 Les cellules souches
 les plasmocytes

49
 Thérapeutique Mab

Voies d’activation de l’apoptose induite par le rituximab

50
Anti-TNF alpha

Anti-TNF alpha

51
Amc en cancérologie
• Tumeurs solides
Principe de la thérapie ciblé en cancerologie : Augmenter l’index de selectivité pour
maitenir une activite anti-tumorale et limiter la toxicité

Action sur les cellules tumorales Action sur les cellules endothéliales participant a la
vascularisation

Cibles démontrées
Cibles démontrées:
kiT (+++) VEGF(+++)
HER2(+++) VEGFR(+++)
EGFR(+++) PDGFR(+/-)
Mtor (+++)
PDGFR(+/-)

52
ANTI-VEGF Thérapeutique Mab

• Avastin® (bevacizumab) VEGF

Avastin

• Développé en 1997

• recombinant humanisé anti-VEGF

•􀂉 93 % humain, 7 % murin
•􀂉 demi-vie terminale : environ 20 jours X
•􀂉 se lie à tous les isoformes de VEGF
Croissance
Prolifération
Migration
Cellule endothéliale

53
ANTI-VGEF
• Action d’Avastin® sur la vascularisation tumorale

• Réduction de la taille tumorale

• Amélioration de la délivrance de la chimiothérapie
• Prévention de l’apparition des métastases

54
Amc en cancerologie

• 2- Les inhibiteurs de HER

 HER2 (ou HER2 Neu ou ErbB-2)
 HER1

• Trastuzumab (Herceptin ) ANTI-HER2

®

anticorps monoclonal recombinant dirigé contre HER2

15 à 25% des cancers du sein
Un facteur de mauvais pronostic
Monothérapie dans les cancers du sein en situation métastatique

55
Amc en cancerologie
• Trastuzumab (Herceptin ) ANTI-HER2 ®

Diminution
de l’expréssion
du récepteur

Blocage et inhibition de la signalisation

56
Ac m en transplantation

Science /medecine décembre2009

57
ANTICORPS MONOCLONAUX EN ALLERGOLOGIE

• Anticorps monoclonaux utilisés en allergologie

• L’omalizumab:
• un nouvel anti-IgE pour le traitement de l’asthme sévère
• IgG1 anti- IgE humanisée
• contre la partie Fc des IgE
IgE empêchant ainsi leur fixation sur le récepteur FcRI.

Omalizumab

58
Ac m en infectiologie

• PALIVIZUMAB : SYNAGIS*:
• En 1999, des infections respiratoires
• humanisé de type IgG ,1κ

• dirigé contre un épitope du site antigénique A de la protéine de fusion du

virus respiratoire syncytial (VRS).
• composé de séquences d’anticorps humains (95%) et murins (5%).
• exerce une puissante activité neutralisante et d'inhibition de fusion vis-à-vis
des variétés des sous-types des chaînes A et B du VRS.

• TUVIRUZUMAB : OSTAVIR*
• anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène HBS chez les
sujets atteints d'hépatite B chronique en association avec la
lamivudine.
59