Les anticorps monoclonaux

Les anticorps monoclonaux Définition

Un anticrops monoclonal est une immunoglobuline de type

IgG qui ne reconnait qu’un seul épitope sur un antigène
donné.
Les anticorps monoclonaux sont issus d’un seul et unique
clone de plasmocytes.

Leurs avantages sont :

-Spécificité
-Affinité
- Production massive et constante
Les anticorps monoclonaux

Anticorps polyclonaux Anticorps monoclonaux

Les anticorps monoclonaux
Prix Nobel Médecine et de Physiologie en 1984
G.Köhler, C.Milstein et N.Jerne
Les anticorps monoclonaux
Les premiers anticorps monoclonaux ont été fabriqués par la fusion
d’une cellule B produisant des anticorps et d’une lignée de cellules
myélomateuses (formation d’hybridomes).
Le principe général de la
Ce sont des anticorps de première
production d’hybridome repose sur
génération d’origine murine.
la fusion de lymphocytes B,
secrétant des anticorps mais ne se
multipliant pas indéfiniment in
vitro, avec des cellules de myélome
lymphoïde, ayant la capacité de se
multiplier rapidement et
indéfiniment in vitro dans un milieu
de culture
 Production des anticorps par la technique des
hybridomes

La production se fait en trois étapes

1 ère étape In vivo immunisation

Elle consiste en l’injection de l’antigène d’intérêt (avec ou sans adjuvent) à l’animal.

Après rappels et vérification de la production des anticorps spécifiques.

2 ème étape In vitro obtention et sélection des hybridomes

Les cellules lymphoïdes de la rate sont isolées et fusionnées avec des cellules
myélomateuses HGPRT- (enzyme impliquée dans la synthèse des nucléotides par voie de
sauvetage) et Ig-.
Sélection des hybridomes (clones +) sur milieux HAT ( hypoxanthine, aminopterine,
thymidine).
3 ème étape mise en culture et production des anticorps d’intérêt
In vitro ou in vivo
 les cellules hypoxanthine - guanine -
phosphoribosyl - transférase (HGRPT)
negatives sont incapables de survivre dans un
milieu HAT (hypoxanthine aminoptérine
thymidine).
Polyéthylène glycol
Etape 1

HGPRT+, Ig+ HGPRT-, Ig-

Etape 2

Sélection des clones +

sur milieu HAT
Etape 3
Les anticorps monoclonaux et recombinants
La sélection par le milieu HAT dépend du fait que les cellules de
mammifères peuvent synthétiser les nucléotides par deux voies
différentes : la voie de novo et la voie de récupération (sauvetage).
L’enzyme qui catalyse la voie de récupération est la HGPRT
(hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transférase). L’addition de
l’aminoptérine bloque la synthèse endogène des bases puriques et
pyrimidiques. En l’absence de l’enzyme HGPRT, les cellules de
myélome ne peuvent utiliser l’hypoxanthine exogène pour
synthétiser les purines, donc elles meurent, alors que les
hybridomes, non déficitaires en cette enzyme qui est apportée par
les lymphocytes B sensibilisés, peuvent utiliser l’hypoxanthine et la
thymidine dans la voie de récupération afin de synthétiser l’ADN et
l’ARN nécessaires à la vie et à la multiplication des cellules
d’hybridome.
Les anticorps monoclonaux et recombinants
De même, les cellules immunocompétentes sont incapables de se
multiplier indéfiniment en culture et meurent rapidement.

Les cellules de myélome utilisées n’apportent que leur propriété

d’immortalité aux cellules résultant de la fusion. Les cellules B
HGPRT+ activées par l’antigène (Ig+) utilisées contribuent à la
capacité des hybridomes à utiliser la voie de récupération, ce qui
rend ainsi possible leur survie dans le milieu HAT.
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les clones positifs sélectionnés peuvent être cultivés in vitro ou in vivo
en utilisant un animal (même souche) pour une production in vivo.

A- La méthode in vivo de l’ascite:

Les hybridomes sont injectés dans la cavité abdominale des animaux, quelques jours
plus tard, ces cellules commencent à former des masses tumorales diffuses, capables de
secréter les anticorps d’intérêts. Le liquide d’ascite qui s’accumule dans l’abdomen des
animaux est riche en anticorps monoclonaux est récupéré par plusieurs ponctions avant
le sacrifice des animaux.
L’anticorps peut être purifié par chromatographie du liquide d’ascite.

Avantages Inconvénients

Récupération d’une concentration Sacrifice d’un nombre important

élevée d’anticorps; d’animaux (souffrance et douleurs);
Rendement élevé 20 g/l Présence de protéines murines et
contaminants ;
 stress (l’animal régule les conditions
de culture)
Les anticorps monoclonaux et recombinants

Les clones positifs sélectionnés peuvent être cultivés in vitro

A- Les méthodes in vitro (en bioréacteurs) :
Ces méthodes offrent l’avantage d’épargner de nombreux animaux tout
en garantissant la production. Toutefois les anticorps possèdent une
affinité inferieure et le coût de production est très élevé.
 Production des anticorps par la technique des
hybridomes

L’anticorps anti-CD3 (Orthoclone OKT3®, muromonab-CD3) est un

représentant de la première génération. Il est utilisé dans le traitement
du rejet aigu après greffe d’organe et a été le premier anticorps
monoclonal admis pour l’usage thérapeutique chez l’Homme. (1981)

Inconvénients des premiers anticorps monoclonaux produits par des

hybridomes murins:
- une demi-vie courte
-immunogènes:
Comme la plupart des anticorps monoclonaux sont produits dans des
cellules de rongeurs, il y a une réaction immunitaire lors de leur
injection chez un patient. En effet il y a production d’anticorps anti-
souris (HAMA, Human Anti-Mouse Antibody) Cette imunité inactive
progressivement l'action bénéfique de l'anticorps monoclonal.
Les anticorps monoclonaux et recombinants

La manipulation des anticorps monoclonaux par génie génétique a

commencé au début des années 1980. Les principaux objectifs de ces
manipulations ont été alors l’obtention d’anticorps chimériques,
humanisés ou humains, et ce dans le but d’obtenir des anticorps
capables de reconnaître un antigène donné chez l’homme, sans
provoquer de réactions immunogènes dues à la présence de structures
murines.
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Dénomination Commune Internationale des anticorps
monoclonaux (DCI)

Mab: Monocolonal Anti Body

A ce préfixe viennent s’ajouter 2 syllabes.

La 1 ère syllabe précise la source de l’anticorps :

O-mab: murin
Xi-mab: chimérique
Zu-mab: humanisé
U-mab: humain

La 2 ème syllabe indique la cible visée:

Exp: pali-vi-zumab--------vi (r)--------cible virale
Tras-tu-zumab-------- tu (m)------cible tumorale
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps chimériques: « 2eme génération »
En 1984, il y a eu la production d’une nouvelle génération d’anticorps,
les anticorps chimériques, désignés par le suffixe «-ximab».

Dans ce cas, les domaines constants de l’anticorps murin sont

substitués par les domaines constants humains équivalents. Ils sont
obtenus par greffage des parties constantes d'immunoglobuline humaine
sur les parties variables d'un anticorps de souris.

Par conséquent, le caractère immunogène est diminué mais, néanmoins,

reste toujours présent.

Le rituximab (Mabthera®) et le cétuximab (Erbitux®) n’induisent que

rarement la formation d’anti-anticorps. L’incidence des HAMA atteint en
revanche 61% avec l’infliximab (Remicade®).
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps chimériques: « 2eme génération »
La construction d’un anticorps chimérique
nécessite, dans un premier temps,
l’isolement de l’ADN codant pour le
domaine VH et le domaine VL d’un
anticorps monoclonal de souris ou de rat.
Ces fragments sont ensuite liés à l’ADN
codant les domaines constants H
(d’isotype γ (IgG) dans la majeure partie
des cas) et L d’une immunoglobuline
humaine.
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps humanisés: « 3eme génération »

En 1997, le Zenapax® (daclizumab) a été le premier anticorps humanisé utilisé en

clinique. Cet anticorps bloque l’interaction de l’IL-2 avec son récepteur et prévient
l’activation des cellules T. Il a été utilisé pour la prévention des rejets de greffe rénale.
Le trastuzumab (Herceptin®) est utilisé dans le traitement du cancer du sein.

10% souris

90% homme
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps humanisés: « 3eme génération »

Ces anticorps dont moins de 10% de la séquence peptidique est d’origine murine. ont
été développés entre 1988 et 1991 et désignés par le suffixe «-zumab».

Cette troisième génération d’Ac monoclonaux est constituée d’immunoglobulines

humaines dont seules les parties hypervariables (CDR, Complementary Determining
Regions) sont d’origine murine conférant ainsi à l’IgG humaine la spécificité de l’Ac
murin parental.
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps humanisés: « 3eme génération »

Cependant en raison du rôle important de certains acides

aminés des régions adjacentes aux CDR (régions charpentes
ou FR, framework) dans la structure du site de liaison de
l’antigène il est également nécessaire de greffer dans
l’anticorps humain les acides aminés de la région charpente de
l’anticorps murin .

Certains de ces acides aminés sont potentiellement

immunogéniques.
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps humains:
En 1994 à 1999, une dernière génération d’anticorps entièrement humain a vu le jour.
Ces anticorps ont été conçus afin de diminuer encore plus l’immunogénécité des
anticorps monoclonaux thérapeutiques . Ils portent le suffixe «-mumab» .
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps humains: exp Humira ® adalimumab (Anti-TNF)
La technique de l’hybridome étant difficile à mettre en œuvre dans le cas
de cellules humaines, d’autres techniques ont été introduites telles que :
le « phage display » et les souris transgéniques.
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps humains:

Les souris transgéniques humanisées :

Des anticorps monoclonaux humains sont produits en transférant des
gènes d'immunoglobulines humains dans le génome murin.

la souris transgénique est vaccinée contre l'antigène souhaité, conduisant

à la production d'anticorps monoclonaux
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les anticorps monoclonaux et recombinants

Les anticorps chimériques et humanisés font toujours appel à la

technique des hibridomes afin de produire des anticorps dirigés
contre l’antigène ciblé. Par la suite, on isole les parties de gènes
qui nous intéresse de l’Ac murin qu’on greffe aux parties de
gènes de l’Ac humain. Cette construction de gènes va être par la
suite introduite dans une cellules procaryote afin d’exprimer et de
produire l’Ac désiré.
La production des Ac humains fait appel à l’utilisation de souris
transgéniques afin de produire un anticorps 100% humain. Le
gène de ce dernier sera par la suite cloné dans une cellule
procaryote afin de le produire massivement.
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les nouveaux formats d’anticorps

L’ingénierie des anticorps a permis de modifier et d’optimiser les

anticorps humanisés.

Des fragments d’anticorps ont été développés. Ils sont dépourvus de la

région Fc mais capables de lier l’antigène.

L’objectif étant d’obtenir des petites molécules qui vont plus facilement
accéder et pénétrer à l’intérieur des tumeurs solides.

L’absence de la région Fc pour ces anticorps permet d’éviter une fixation

aspécifique sur les tissus sains et diminue les réactions immunitaires de
l’organisme.
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Les nouveaux formats d’anticorps

single-chain variable sdAb (single domain Ab-bs (Bispecific

fragment (scFv): de 25 kDa antibody):Un seul domaine Antibodies):anticorps
est constitué par les variable (12 à 15 kDa) pour bispécifiques capables
domaines variables de la générer une bonne affinité de lier fortement deux
chaîne lourde et de la et spécificité. cibles différentes.
chaîne légère reliés par un
peptide de liaison.

Anticorps bispécifiques
simple liaison de deux Les anticorps
scFv par un peptide de
fusionnés
liaison (tandem scFv)
Les anticorps monoclonaux et recombinants
Mécanismes d’action des anticorps monoclonaux
thérapeutiques

Immunoconjugués:
les anticorps sont utilisés comme porteurs de substances actives.
L’activité immunologique de ces anticorps est alors sans importance. Les
effets qu’ils développent sont ceux de la substance qu’ils transportent.

-Immunotoxines
-Immunoconjugés de cytokines