THESE DE DOCTORAT DE

L'UNIVERSITE DE NANTES
COMUE UNIVERSITE BRETAGNE LOIRE

ECOLE DOCTORALE N° 605

Biologie Santé
Spécialité : « Biologie des organismes »

Par
Christelle DARRIEUTORT-LAFFITE

Etude de la composition et des mécanismes de

constitution des dépôts calciques dans la tendinopathie
calcifiante de la coiffe des rotateurs.

Thèse présentée et soutenue à Nantes, le 3 octobre 2019

Unité de recherche : Laboratoire Phy-Os, INSERM UMR 1238, Faculté de Médecine de Nantes
Thèse N° :

Rapporteurs avant soutenance :

Pr David MAGNE, Professeur des Universités, Université Lyon 1

Pr Hang Korng EA, Professeur des Universités-Praticien hospitalier, Université Paris 7

Composition du Jury :

Président : Pr Béatrice Bouvard

Examinateurs : Béatrice Bouvard, Professeur des Universités-Praticien hospitalier, Université d’Angers
Gaetane Nocturne, Maître de Conférence Universitaire-Praticien hospitalier, Université Paris-Sud

Dir. de thèse : Benoit Le Goff, Professeur des Universités-Praticien hospitalier, Université de Nantes
Co-dir. de thèse : Frédéric Blanchard, Directeur de Recherche INSERM, Université de Nantes

Invité(s)
Yves Maugars, Professeur des Universités-Praticien hospitalier, Université de Nantes
 Sommaire

Sommaire

LISTE DES ABREVIATIONS ......................................................................................................... 4

REMERCIEMENTS ...................................................................................................................... 5
INTRODUCTION GENERALE ...................................................................................................... 6
A. La coiffe des rotateurs ..................................................................................................... 7
1. Anatomie de la coiffe des rotateurs ........................................................................ 7
2. Composition et physiologie du tendon ................................................................... 8
3. Biologie et biomécanique de la coiffe des rotateurs ............................................ 11
4. Modifications de la coiffe en réponse au stress mécanique ................................. 12
B. La tendinopathie calcifiante : épidémiologie, présentation clinique et prise en charge
thérapeutique ................................................................................................................ 13
1. Définition et épidémiologie .................................................................................. 13
2. Présentation clinique ............................................................................................. 14
3. Hypothèses physiopathologiques dans la tendinopathie calcifiante .................... 15
4. Modèles de tendinopathies ................................................................................... 17
5. Prise en charge thérapeutique ............................................................................. 18
OBJECTIFS ................................................................................................................................ 21
RESULTATS / PARTIE I ............................................................................................................. 23
Etude de l’organisation des calcifications tendineuses et de la capacité des ténocytes
humains issus de la coiffe à induire une minéralisation in vitro.
A. Résumé de l’article ................................................................................................... 24
B. Article soumis Journal of Clinical Medicine .............................................................. 26
C. Résultats complémentaires ..................................................................................... 73
D. Discussion complémentaire...................................................................................... 77
RESULTATS / PARTIE II ............................................................................................................ 80
Recherche de facteurs régulateurs de la tendinopathie calcifiante
A. Introduction complémentaire ..................................................................................... 81
B. Matériels et Méthodes ................................................................................................ 81
1. Extraction et dosage des protéines présentes dans les calcifications ................. 83
2. Dosage des protéines d’intérêt par ELISA ............................................................ 86

2
 Sommaire

3. Etude du PEDF en immunohistochimie dans les tendons .................................... 86

4. Etude de l’effet du PEDF sur la minéralisation in vitro ......................................... 87
C. Résultats ...................................................................................................................... 88
1. Quantification des différentes protéines et recherche de corrélations avec les
éléments cliniques ................................................................................................ 88
2. Expression de PEDF au sein des tendons calcifiés ................................................ 94
3. Effet du PEDF sur la minéralisation in vitro .......................................................... 95
4. Expression et sécrétion du PEDF par les ténocytes en culture ............................ 96
D. Discussion .................................................................................................................... 98
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ........................................................................................... 102
PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS ................................................................................ 106
FINANCEMENTS .................................................................................................................... 108
LISTE DES FIGURES ................................................................................................................ 109
LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................................. 112
ANNEXES ............................................................................................................................... 112
Annexe 1. Darrieutort-Laffite C et al, Calcific tendonitis of the rotator cuff: from
formation to resorption. Joint Bone Spine. 2018 Dec;85(6):687-692 ........................... 112
Annexe 2. Darrieutort-Laffite C et al. Treatment strategy in calcific tendonitis of the
rotator cuff. J.monrhu.2018.01.002 .............................................................................. 119
Annexe 3. Darrieutort-Laffite C et al. Are Corticosteroid Injections Needed After
Needling and Lavage of Calcific Tendinitis: A Randomized, Double-Blind, Non-Inferiority
Trial. Ann Rheum Dis. 2019 Jun;78(6):837-843 ............................................................. 125
REFERENCES .......................................................................................................................... 132

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 Liste des abréviations

Liste des abréviations

ACAN : aggrécane MMP13 : matrix metallopeptidase 13

ADN : acide désoxyribonucléique MO : milieu ostéogénique

ARN: acide ribonucléique OPG : ostéoprotégérine

ATP: Adénosine TriPhosphate OPN: ostéopontine

BCA: Bicinchoninic acid Assay PCR : polymerase chain reaction

BSA: Bovin serum albumin PFL : ponction-fragmentation-lavage

BMP-2: Bone Morphogenic Protein 2 PEDF: pigment epithelium-derived factor

BSP : bone sialoprotein PPi : pyrophosphate inorganique

CCL : cellules chondrocyte-like Pi : phosphate inorganique

COL : collagène POSTN : périostine

COMP : cartilage oligomeric matrix protein RT-qPCR : reverse transcription-

quantitative polymerase chain reaction
CH : milieu à différenciation
chondrocytaire RUNX2: runt related transcription factor 2

CT : milieu contrôle SCX: scléraxis

DAB : diaminobenzidine SERPIN: serine protease inhibitor

DC : dépôt calcique SOFG: Safranine O Fast Green

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid SOX 9: SRY box 9

ENPP1 : Ectonucleotide SVF : sérum de veau fœtal

pyrophosphatase/phosphodiesterase 1
TNAP:tissu-nonspecific alkaline
HE : hématoxyline et éosine phosphatase

ITNAP : inhibiteur de la TNAP TNMD: ténomoduline

MF : métaplasie fibrocartilagineuse TRAP: Tartrate-resistant acid phosphatase

MKX : Mohawk

4
 Remerciements

Remerciements

Je tiens à remercier,

Benoit Le Goff pour m’avoir proposé de travailler sur cette thématique, pour son
investissement quotidien pour le dynamisme du service et pour m’accompagner dans ce
double cursus.

Frédéric Blanchard pour sa présence au quotidien et son aide aux manipulations (y compris
le 24 décembre !) et pour nous faire partager ses expériences lors de nos discussions entre
médecins et scientifiques. J’espère que notre collaboration restera toujours aussi
enrichissante.

Les Professeurs David Magne et Hang Korng Ea pour avoir accepté d’être les rapporteurs de
mon travail.

Les Professeurs Béatrice Bouvard et Yves Maugars pour avoir accepté de participer aux
différents comités de suivi de thèse et au jury.

L’équipe du laboratoire Phy-Os pour sa disponibilité et l’aide précieuse qu’elle m’a apportée
et en particulier, Paul et Eva qui m’ont aidé au cours de leurs stages.

Enfin, je remercie mon mari Didier pour son soutien durant toutes ces années dans tous mes
projets professionnels et pour m’apporter la motivation à poursuivre dans les moments
difficiles.

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 Introduction

INTRODUCTION

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 Introduction

Introduction

A. La coiffe des rotateurs

1. Anatomie de la coiffe des rotateurs

La coiffe des rotateurs est composée de 4 muscles : le supra-épineux, l’infra-épineux,

le sub-scapulaire et le petit rond. Un autre tendon participe dans la même région à la
stabilisation de l’épaule : le chef long de biceps brachial. La coiffe des rotateurs a une
organisation unique car ses tendons s’unissent pour former une structure continue qui
enveloppe la tête humérale (Figure 1) (1). A sa surface se situe la bourse sous-acromio-
deltoidienne qui est une interface de glissement sous l’acromion et le ligament acromio-
coracoïdien.

Figure 1. Anatomie de l’épaule et des muscles de la coiffe des rotateurs. On peut voir qu’il existe une
continuité entre les tendons qui coiffent la tête humérale. La bourse sous-acromiale non représentée
se situe entre les tendons (en-dessous) et le ligament acromio-coracoïdien et l’acromion (au-dessus)
et permet le glissement des tendons lors des mouvements.

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 Introduction

2. Composition et physiologie du tendon

Le tendon est la structure interposée entre le muscle et l’os dont le rôle principal est
de transmettre la force produite par le muscle à l’os pour permettre le mouvement. Le
tendon est constitué en majorité de collagène de type I (65 à 80 % du poids sec) dont les
fibrilles s’assemblent pour former des unités de taille croissante (Figure 2) (2) : les fibrilles de
collagène s’organisent en triple hélice et les hélices vont s’assembler de manière
longitudinale et latérale pour former les fibres. Les fibres s’assemblent ensuite entre elles
pour former des unités plus grandes appelées fascicules. Le collagène de type I est
majoritaire mais d’autres types sont présents (type III, IV, VI) dont certains sont spécialisés
dans l’assemblage du collagène (type VI, XII, XIV et XXII) (3,4).

Figure 2. Schéma de l’organisation des fibres tendineuses au sein des différentes unités constituant
l’ensemble du corps tendineux. Schéma issu de la référence (2).

L’organisation fibrillaire du tendon est essentielle pour assurer sa résistance au stress

mécanique engendré par la contraction musculaire et résister aux forces longitudinales,
transversales ou horizontales ou rotatoires qu’il subit.

La matrice du tendon est également composée d’élastine et de protéoglycanes. Les

protéoglycanes principales sont les suivantes : décorine, fibromoduline, biglycane et
lumicane. Elles participent à l’oganisation du réseau collagénique et à la lubrification du
tendon. Les fibres élastiques, quant à elle, représentent 1-2% du poids sec du tendon et sont
présentes principalement à la jonction os-tendon (enthèse). Enfin, la matrice extra-cellulaire

8
 Introduction

est composée de glycosaminoglycanes, de glycoprotéines structurelles et de substances

anorganiques telles que le calcium, le magnésium, le cuivre, le zinc, le phosphore ou le
cobalt. Ces éléments sont impliqués dans la croissance et le métabolisme normal des
structures musculaires (2). Au total, cette matrice extra-cellulaire constitue un gel hydrophile
ayant une capacité de rétention d’eau importante et a un rôle important pour la stabilisation
de la structure collagénique, le maintien de l’homéostasie ionique et la synthèse des fibres
de collagène.

Enfin, les cellules du tendon sont les ténoblastes et les ténocytes. A la naissance, il
existe un ratio élévé de cellules par rapport à la matrice. A cette période, ces cellules ont des
morphologies et tailles différentes (allongées, arrondies ou polygonales). Au cours de la
croissance, il existe une réduction de ce ratio en faveur de la matrice et les ténoblastes
adoptent une morphologie similaire, allongée. A l’âge adulte, les ténoblastes deviennent des
ténocytes qui sont des cellules fusiformes avec un cytoplasme peu abondant. La fonction des
ténocytes est de synthétiser le collagène et les autres composants de la matrice. Cette
capacité de synthèse est élévée pendant la croissance et diminue avec l’âge (2). Les
ténocytes, comme les chondrocytes et les ostéoblastes se différencient à partir des cellules
souches mésenchymateuses avec un rôle primordial des facteurs de transcription Scléraxis
(Scx) et Mohawk Homeobox (Mkx) (3,5,6). Les différentes voies de différenciation de la
cellule souche mésenchymateuse sont reprises dans la figure 3 ci-dessous.

9
 Introduction

Figure 3. Voies de différenciation de l’ostéoblaste, du chondrocyte et du ténocyte à partir de la cellule

souche mésenchymateuse et facteurs de transcription impliqués. SCX : Scléraxis ; MKX : Mohawk
Homeobox ; ALP : phosphatase alcaline ; COL1 : collagène de type I; BSP : Bone SialoProtein ; OPN :
ostéopontine ; COMP : Cartilage Oligomeric Matrix Protein ; COL2 : collagène de type II, ACAN :
aggrécane ; COL3 : Collagène de type III ; COL10 : Collagène de type X.

Les ténocytes sont caractérisés par l’expression de ténomoduline. La ténomoduline

est une glycoprotéine transmembranaire qui est fortement exprimée par les tendons et les
ligaments. Les souris déficientes en ténomoduline ont une densité réduite en ténocytes et
des fibrilles de collagène de diamètre anormal (6) ce qui suggère son rôle fondamental dans
la prolifération des ténocytes et la fibrillation du collagène. L‘expression des marqueurs
spécifiques du ténocyte est sous le contrôle du facteur de transcription Scx (3). Scx régule
également la transcription de Col1a1 et Col1a2. Le rôle primordial de Scx pour le
dévelopement tendineux est illustré par l’aspect défectueux des tendons des souris Scx-
déficientes dont la matrice extra-cellulaire est appauvrie et désorganisée. Mkx est
également impliqué dans la prolifération des ténocytes et la régulation de la matrice extra-
cellulaire puisque les souris Mkx-/- ont des tendons de petite taille avec un nombre diminué
de ténocytes (5). Par ailleurs, Mkx inhibe la différenciation chondrocytaire comme
schématisé ci-dessous (Figure 4).

10
 Introduction

Figure 4. Rôle de Mohawk Homeobox (Mkx) dans la différenciation et le maintien du phénotype

ténocytaire. Mkx a un effet inhibiteur de l’expression de Sox9 pour éviter l’orientation vers un
phénotype chondrocytaire.

3. Biologie et biomécanique de la coiffe des rotateurs

La coiffe des rotateurs a une organisation unique car ses tendons s’unissent pour
former une structure continue qui enveloppe la tête humérale (1). La zone de jonction à l’os
est divisée en 4 parties : tendon, fibrocartilage, fibrocartilage calcifié et os. Le tendon est
principalement composé de collagène de type I, de décorine, de biglycanes et de cellules
fusiformes. En s’approchant de l’insertion osseuse, les cellules de l’enthèse ont une
morphologie plus ronde et la zone est riche en collagènes de type II, IX et X et en aggrécane.
Ces cellules expriment Sox9 et ont la capacité de minéraliser (3).

Sur le plan biomécanique, l’épaule est une articulation instable compte tenu de la
faible congruence des surfaces articulaires (tête humérale et glène de l’omoplate). Le labrum
(cartilage fibreux), la capsule et les ligaments gléno-huméraux améliorent en partie la
stabilité de l’épaule. Les tendons de la coiffe vont également participer à la stabilisation de
l’articulation : le sub-scapulaire de 0 à 90° d’abduction ou en rotation externe et le supra-
épineux et le long biceps ont une action de stabilisation vers le bas (7). La position
anatomique des muscles de la coiffe et du chef long du biceps brachial crée la configuration
11
 Introduction

idéale pour comprimer activement la tête humérale dans la cavité glénoïdienne. De manière
individuelle, il a été mis en évidence que certains facteurs anatomiques, notamment la
longueur de l’acromion et l’orientation de la glène, favorisent la survenue soit de lésions de
la coiffe soit d’une omarthrose (8).

4. Modifications de la coiffe en réponse au stress mécanique

Le tissu tendineux est capable de s’adapter à une surcharge mécanique via une
augmentation temporaire de son activité métabolique (augmentation de la synthèse du
collagène). Les ténocytes réagissent au stress mécanique en se multipliant et en régulant la
synthèse et le turn-over de la matrice extra-cellulaire. Mais il existe également lors du stress
mécanique une augmentation de l’expression des matrix métalloprotéinases qui dégradent
le collagène. Une période de repos est donc nécessaire pour que la balance soit positive
pour la synthèse sans laquelle il existe une perte de collagène. A ce moment-là, le tendon
produit un tissu conjonctif de qualité biomécanique inférieure avec une perte d’organisation
de la matrice collagènique et des modifications de type cartilagineuse (sur-expression de
marqueurs tels que les protéoglycanes, les glycosaminoglycanes et SOX9) (9,10). Cependant,
ces anomalies décrites dans les lésions tendineuses entraînées par une sur-utilisation
n’aboutissent pas à un dépôt de cristaux et nous allons voir dans la partie suivante les
caractéristiques de la tendinopathie calcifiante.

12
 Introduction

B. La tendinopathie calcifiante : épidémiologie, présentation

clinique et prise en charge thérapeutique

1. Définition et épidémiologie

La tendinopathie calcifiante est une cause fréquente de douleurs de l’épaule

puisqu’elle représente entre 10 et 42 % des épaules douloureuses chroniques (11–14). Elle
est due à des dépôts de cristaux d’apatite au sein des fibres des tendons de la coiffe des
rotateurs (Figure 5). Ces dépôts peuvent être complètement asymptomatiques, retrouvés
sur 3 à 10 % des épaules non douloureuses (15,16).

Elle touche préférentiellement des sujets âgés de 30 à 60 ans avec une prédominance
féminine. Les dépôts d’apatite peuvent être observés au niveau d’autres localisations
(hanches, mains et pieds, rachis cervical) mais l’épaule est la localisation la plus fréquente et
la plus étudiée (17). A ce niveau, les dépôts se forment majoritairement au sein du supra-
épineux puis de l’infra-épineux et une atteinte bilatérale est possible (18).

Figure 5. A: Représentation des dépôts calciques au sein des tendons de la coiffe. B: Radiographie de
face d’un patient atteint d’une tendinopathie calcifiante de la coiffe. On voit une image dense et
homogène de tonalité calcique située dans l’espace sous-acromial qui se projette en regard de
l’insertion du supra-épineux.

Parmi les facteurs généraux associés, il a été montré qu’il n’y avait pas de lien avec le
travail manuel ou le coté dominant, ceci suggérant des phénomènes pathologiques
différents de la tendinopathie induite par le stress mécanique. Il a été noté, par certains

13
 Introduction

auteurs, l’association avec des pathologies endocriniennes telles que l’hypothyroïdie ou le

diabète sans qu’il n’y ait de lien bien établi sur la plan physiopathologique (19). Une étude
de 2015 a mis en évidence un taux inférieur de phytates urinaires chez les patients porteurs
de calcifications de la coiffe, les phytates étant issus de l’alimentation (céréales et légumes)
et connus pour être des inhibiteurs de la formation des cristaux d’apatite (20).

2. Présentation clinique

Chez les patients symptomatiques, deux présentations cliniques existent:

- Soit un tableau douloureux chronique de l’épaule, volontiers nocturnes et survenant

par poussées, sur un fond de douleurs mécaniques quotidiennes secondaires à un
conflit sous-acromial. Concernant l’apparition des symptômes, il a été démontré que
la taille de la calcification était associée aux douleurs notamment au-delà d’1,5 cm en
radiographie (14). En échographie, la taille de la calcification, la présence d’un signal
doppler autour de la calcification et la présence d’une bursite sont associées au
développement des douleurs (21).

- Soit des douleurs aiguës d’apparition brutale, intenses et insomniantes. Ce tableau

correspond à la résorption de la calcification. Au cours de ce phénomène, la
calcification se rompt et les cristaux se déversent dans la bourse sous-acromiale
située juste au-dessus des tendons (Figure 5) créant une bursite inflammatoire. Cette
résorption survient de manière spontanée, après une période plus ou moins longue
de douleurs chroniques mais peut également survenir chez des patients
asymptomatiques jusque-là. La radiographie permet de faire le diagnostic montrant
une calcification d’aspect flou, hétérogène et fragmenté.

14
 Introduction

3. Hypothèses physiopathologiques dans la tendinopathie calcifiante

En ce qui concerne les mécanismes d’apparition des calcifications au sein des

tendons, quelques éléments sont disponibles dans la littérature. Ils ont été repris dans une
revue jointe en annexe (Annexe n°1) (22).

D’après l’hypothèse d’Uhthoff, la plus reprise, les cellules impliquées dans

l’apparition de la minéralisation sont des cellules de type chondrocytaire (23). En effet, il a
été observé dans plusieurs études histologiques la présence autour des dépôts de cellules au
noyau arrondi dans une lacune péricellulaire ressemblant à des chondrocytes (23–25), le
dépôt, lui, étant amorphe. Cette zone périphérique est positive en toluidine blue et Azur A
suggérant une métaplasie fibrocartilagineuse. Cependant, il n’y a pas de collagène II dans
cette zone (25,26). Dans les lésions dégénératives du tendon, il a aussi été décrit la présence
de cellules chondroïdes et l’augmentation d’expression de Sox9, ainsi qu’une expession de
collagène II, sans pour autant qu’une minéralisation y soit associée.

Cette minéralisation pourrait se faire via la formation de vésicules matricielles car il

en a été observé au niveau du tendon (25,27). Ces vésicules matricielles contiennent le
matériel nécessaire à la formation de cristaux d’apatite : tissue non specific alkaline
phosphatase (TNAP), ectonucleotide pyrophosphate phosphodiestérase 1 (ENPP1) et
Phospho-1 ainsi que des transporteurs du calcium (annexines) et du phosphore (Pit-1/2).
Cependant, la densité en vésicules matricielles ne semble pas plus importante dans les
régions calcifiées par rapport aux régions non calcifiées (25). Par ailleurs, la présence d’une
expression de TNAP qui induirait la minéralisation par les cellules de type chondrocytaire
n’est pas clairement établie puisque les données sont contradictoires à ce sujet (23,25).

Une autre possibilité serait que les calcifications soient induites par des complexes
phospholipidiques comme suggéré par Boskey et al. (28). En effet, ces complexes associant
calcium, phospholipides et phosphate (Ca-PL-P) ont été retrouvés de manière abondante
dans des tissus calcifiés de diverses origines (artère, peau, tendon, rein) et sont capables
d’induire in vitro et in vivo des dépôts d’apatite (28,29). Ces complexes sont issus de débris
cellulaires ou membranaires. Dans les calcifications du cartilage, il a été montré que les
cristaux engendraient une apoptose des chondrocytes pourvoyeuse de débris membranaires

15
 Introduction

qui seraient une source de nouvelles calcifications. Au niveau du tendon, un mécanisme

équivalent n’a pour l’instant pas été démontré.

Une autre question demeure sur l’origine des cellules de type chondrocytaire, à
savoir si elles sont dérivées des ténocytes ou si elles proviennent de la différenciation de
cellules souches tendineuses (30,31). Ces cellules souches tendineuses ont été identifiées à
partir de tendons de souris, de rats et de tendons humains. Elles se différenciaient au
moment de l’extraction par leur capacité à former des colonies et à se multiplier
rapidement. Elles possèdent une expression plus importante de ténomoduline, un marqueur
spécifique du tendon, que les cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle
osseuse (30). Concernant les marqueurs de surface, elles sont positives comme les MSC pour
CD146, CD90 et CD44 et négatives pour CD34, CD45 et CD106. En conditions de culture
adaptées, ces cellules étaient capables de se différencier vers la lignée ostéoblastique,
chondrocytaire et adipocytaire et avaient un potentiel d’auto-renouvellement, ce qui a
permis de valider leur caractère de « cellules souches ».

Enfin, il a été suggéré que les lésions pourraient être induites par l’hypoxie. Une
publication récente a montré que des ténocytes prélevés sur des patients agés étaient
capables de produire des dépôts minéraux en condition d’hypoxie après 8 semaines de
culture. Dans cette étude, les tendons utilisés étaient des tendons fléchisseurs des doigts
avec trois tranches d’âge de donneurs (jeunes asymptomatiques, tendinose (entre 35 et 44
ans), et sujets agés (plus de 65 ans)). Les ténocytes maintenus en hypoxie (1% d’O2) sur-
exprimaient les collagènes de type II et X mais l’apparition de dépôts n’était observée que
pour les sujets de plus de 65 ans (32).

Concernant les phénomènes impliqués dans la disparition des calcifications, ceux-ci

ne sont pas connus pour le moment. Pourtant, cette phase de résorption est la phase
terminale de l’évolution naturelle. Il a été montré que des cellules multinucléées CD68
positives et TRAP positives étaient présentes autour des dépôts suggérant qu’elles
pourraient participer à la résorption (33). Cependant, aucun élément n’est connu sur
l’origine de ces cellules et les facteurs régulant leur apparition.

16
 Introduction

4. Modèles de tendinopathies

Les modèles de tendinopathie sont aujourd’hui la plupart du temps chez le rat car il
possède une anatomie articulaire proche de celle de l’homme et que la taille de ses
structures tendineuses est plus adaptée à la réalisation d’expérimentations que celles de la
souris. De plus, il a été montré que les modifications induites par le stress mécanique y
étaient proches de celles rencontrées chez l’homme : désorganisation de la matrice,
augmentation du nombre de cellules et apparition de cellules chondroïdes associées à une
altération des propriétés biomécaniques (moins bonne résistance à la traction) (10). Dans
ces modèles de stress mécanique, il n’est pas décrit de calcification.

Dans les modèles par injection de collagénase, Lui et al. ont observé l’apparition de
calcifications 12 semaines après l’injection dans le tendon patellaire. A ce niveau, il était
observé une métaplasie chondrocytaire (34) avec une sur-expression de collagène II par les
cellules de type chondrocytaire ainsi que de collagène de type X et de Sox9. Par contre, en
micro-scanner, les structures étaient semblables à de l’os avec un aspect poreux au centre
du dépôt. Enfin, il existait une sur-expression de BMP-2 au sein de l’ossification et des
cellules. L’apparition de calcifications n’est pas décrite par les autres auteurs utilisant ce
modèle mais les animaux étaient sacrifiés plus tôt, à 8 semaines, alors que les calcifications
apparaissaient après 12 semaines dans le modèle précédemment décrit (35).

Il existe également des modèles par lésions tendineuses directes du tendon achiléen
chez la souris qui induisent l’apparition d’une minéralisation (36,37). Ici également, il s’agit
d’une ossification (37).

Concernant les modèles mutés, les souris Mkx-déficientes développent

spontanément des ossifications tendineuses au niveau des tendons achilléens. A ce niveau, il
s’agit bien d’ossification et non de calcification via un mécanisme endochondral (38). La
perte de fonction de Mkx sur la différenciation ténocytaire contribue donc à l’apparition
d’ossifications tendineuses. Chez les rats Mkx-/-, il a été mis en évidence que l’inactivation de
Mkx favorise la différenciation chondrogénique et ostéogénique des ténocytes (39).
Concernant les souris Scx-déficientes, il est décrit une hypoplasie des tendons mais pas de
calcification ou d’ossification (40). Par contre, en cas de lésion tendineuse chez des souris

17
 Introduction

Scx-/-, il a été observé 15 semaines après le traumatisme des foyers d’ossification ectopique
(41).

Les modèles de tendinopathie existants reproduisent donc une ossification ce qui

n’est pas ce que l’on observe dans les calcifications de l’épaule. Au niveau de l’épaule, il n’y a
pas de modèle de calcification induite connu. Il est possible que cette localisation ait une
particularité par rapport à la minéralisation. En effet, chez l’homme, au niveau du tendon
achiléen ou patellaire, on observe plutôt des ossifications en cas de lésions tendineuses
chroniques ou de traumatisme et de chirurgie mais rarement des dépôts d’apatite (42). Les
contraintes mécaniques n’y sont bien sûr pas les mêmes (membre inférieur versus membre
supérieur) et il n’y a pas la même organisation sur le plan anatomique qu’au niveau de la
coiffe des rotateurs où il existe une connection de plusieurs tendons.

5. Prise en charge thérapeutique

Les moyens thérapeutiques utilisés ont été repris dans une monographie publiée en
2018 dans le Revue du Rhumatisme jointe en annexe 2 (43). Les points principaux sont
résumés ici.

Dans les tableaux aigus, le traitement symptomatique par anti-inflammatoires non

stéroïdiens est généralement rapidement efficace et ce stade de la maladie ne pose pas de
problème de prise en charge.

En cas de douleurs chroniques, plusieurs techniques ont été évaluées pour soulager
les douleurs pour certaines et/ou extraire la calcification : infiltration de corticoïdes, ondes
de choc, ponction-fragmentation-lavage (PFL) et chirurgie. L’infiltration de corticoïdes est en
général proposée en première intention après échec de la kinésithérapie et des traitements
symptomatiques. Dans une étude effectuée dans le service sur 102 patients, l’infiltration de
corticoïdes en sous-acromial avait permis une amélioration significative et l’absence de
recours à un traitement complémentaireau cours des deux années suivantes pour un patient
sur 3 (37%) (44).

18
 Introduction

Les ondes de choc de haute énergie ont également montré leur efficacité malgré
l’hétérogénéité des protocoles utilisés (45). Elles permettent de réduire la douleur et
d’améliorer la fonction de l’épaule de manière significative par rapport au placebo.

En ce qui concerne les techniques visant à extraire la calcification, La PFL a montré

son efficacité. Elle est actuellement réalisée principalement sous échographie avec une
technique à une ou deux aiguilles. Elle nécessite une anesthésie locale, puis l’aiguille est
positionnée au centre de la calcification et le lavage effectué à l’aide de sérum physiologique
et complété par une fragmentation de la coque périphérique. Elle se termine généralement
par une infiltration sous-acromiale de corticoïdes. Dans certains cas, un deuxième geste de
lavage est nécessaire notamment en cas de calcifications denses avec cône d’ombre
postérieur (46). Dans un essai clinique éffectué dans notre service de rhumatologie (47),
nous avons également constaté que la calcification n’était pas toujours accessible à un
lavage avec 22 patients sur 136 (16%) ayant dû subir une deuxième PFL (N=7) ou une
exérèse chirurgicale (N=15). Par ailleurs, nous avons observé que, même en cas d’évacuation
de la calcification, les patients pouvaient rester douloureux plusieurs semaines car le
phénomène de résorption est long.

Ainsi, nous avons testé d’ajouter le thiosulfate de sodium, un chélateur du calcium,

lors du geste de PFL, pour essayer de dissoudre les calcifications d’aspect dense (étude en
cours de publication (NCT 02538939, ClinicalTrials.gov)). Le thiosulfate est actuellement déjà
utilisé en intra-veineux pour le traitement des calciphylaxies de l’insuffisant rénal.
Malheureusement, le thiosulfate injecté localement autour et dans la calcification n’a pas
permis d’obtenir une meilleure extraction de la calcification que la PFL standard.

Concernant la chirurgie, 3 options sont possibles : évacuation seule de la calcification,

acromioplastie ou les deux combinées. Les trois méthodes semblent efficaces selon les
revues systématiques mais il n’existe pas d’essai comparatif de puissance suffisante pour
conclure si l’une d’elle est supérieure aux autres (48). Sur le plan fonctionnel, il semble tout
de même que la récupération et le retour aux activités normales soient plus rapides dans les
cas où il n’y a pas d’acromioplastie (49). En outre, il ne semble pas y avoir de différence
entre l’extraction de la calcification par arthroscopie ou par PFL (44). La stratégie de prise en
charge thérapeutique est récapitulée dans la figure ci-dessous (Figure 6).

19
 Introduction

Figure 6. Résumé de la stratégie de prise en charge thérapeutique de la tendinopathie calcifiante de

l’épaule.

20
 Objectifs

Objectifs

L’objectif de ce travail de thèse était d’apporter de nouvelles données dans la

physiopathologie des calcifications de l’épaule (Figure 7).

La première étape était d’étudier l’organisation des dépôts au sein du tendon et de

caractériser les cellules présentes en périphérie de ces dépôts. En effet, comme indiqué en
introduction, des cellules de type chondrocytaire ont été mises en évidence mais leur
participation aux dépôts d’apatite n’est pas claire. Pour cela, nous avons utlisé des tendons
calcifiés issus de cadavres. Ceci nous a permis d’avoir de larges échantillons, ce qui n’aurait
pas été possible sur des patients.

Dans une deuxième partie, nous avons utilisé des ténocytes issus de la coiffe des
rotateurs pour mettre en place des modèles de minéralisation in vitro (culture 2D et 3D).
Dans ces modèles in vitro, le phénotype des cellules a été caractérisé et leur capacité
minéralisante quantifiée.

Dans une troisième étape, nous avons étudié la composition protéique des
calcifications. En effet, il est possible que les protéines associées expliquent la constitution
du dépôt et sa croissance. Parmi, les protéines retrouvées, nous faisons l’hypothèse que
certaines pourraient avoir un rôle régulateur dans le déclenchement du phénomène et
d’autres un rôle de maintien de la calcification. L’identification de ces protéines pourrait
nous permettre de proposer de nouvelles thérapeutiques pour permettre une meilleure
extraction des dépôts, notamment dans le cas de calcifications dures.

21
 Objectifs

Figure 7. Synthèse des objectifs de la thèse à partir des différents échantillons humains disponibles.
qPCR : quantitative plymerase chain reaction.

22
 Partie I

PARTIE I

23
 Partie I

Résultats/Partie I
A. Résumé de l’article
La tendinopathie calcifiante est une cause fréquente de douleur chronique de l’épaule et
est liée à des dépôts d’apatite au sein des tendons de la coiffe des rotateurs. Son origine est
actuellement peu élucidée. Les objectifs de l’étude était de mieux caractériser les cellules et
les mécanismes à l’origine des dépôts d’apatite dans les tendons. Des coupes histologiques
de tendons humains calcifiés ont été recueillis afin d’étudier l’organisation des dépôts et le
phénotype des cellules présentes autour. La capacité de minéralisation de ténocytes
humains issus de la coiffe a été étudiée in vitro en 2 dimensions en utilisant un milieu
ostéogénique et en 3 dimensions en utilisant un milieu mixte chondrogénique et
ostéogénique. Enfin, des calcifications extraites de patients souffrant de tendinopathie ont
été collectées suite à un geste de lavage percutané sous échographie. Une analyse par
spectroscopie infra-rouge a été effectuée ainsi qu’une caractérisation de la composition
protéique par spectrométrie de masse.

En histologie, la calcification apparaissait comme une zone amorphe entourée par une
métaplasie fibrocartilagineuse contenant des cellules de type chondrocytaire. Ces cellules
exprimaient la Tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP) et l’Ectonucleotide
pyrophohatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1), deux enzymes-clé de la minéralisation. In
vitro, les ténocytes humains issues de la coiffe étaient capables d’induire une minéraisation
en culture 2D et les cellules exprimaient de manière significative la TNAP, le collagène de
type X et la MMP13, qui sont des marqueurs de chondrocytes hypertrophiques. L’utilisation
d’un inhibiteur de TNAP a permis de réduire drastiquement la minéralisation. En culture 3D,
malgré une plus forte expression des marqueurs chondrocytaires, l’obtention d’une
minéralisation était inconstante. L’étude des dépôts calciques issus de patients a montré une
sur-représentation des protéines impliquées dans le développement de l’os et du cartilage.

En conclusion, nous avons pu montrer que les ténocytes humains avaient la faculté de se
différencier en cellules ayant les caractéristiques de chondrocytes hypertrophiques et la
capacité de produire des dépôts calciques via l’action de la TNAP. L’analyse protéomique a
identifié des protéines impliquées dans le développement de l’os et du cartilage qui

24
 Partie I

pourraient être pour certaines des facteurs régulateurs du phénomène. Nous pensons que
ces données vont permettre par la suite d’identifier des éléments de régulation pouvant
représenter des cibles thérapeutiques dans la pathologie.

25
 Partie I

B. Article soumis Journal of Clinical Medicine

Rotator cuff tenocytes differentiate into hypertrophic chondrocyte-like cells to produce

calcium deposits in an alkaline phosphatase-dependent manner.

C Darrieutort-Laffite (1,2), P Arnolfo (1,2), T Garraud (1,2), A Adrait (3), Y Couté (3), G

Louarn (4), V Trichet (1), P Layrolle (1), B Le Goff#(1,2),F Blanchard#(1)

(1) INSERM UMR1238, Bone Sarcoma and remodeling of calcified tissue, Nantes

University, Nantes, France

(2) Rheumatology department, CHU Nantes, Nantes, France

(3) UnivGrenobleAlpes, CEA and INSERM, BIG-BGE, F-38000 Grenoble, France

(4) Institut des Matériaux Jean Rouxel (IMN) - UMR CNRS 6502, Nantes University,

Nantes, France
#
Co-senior authors.

Corresponding author:

Christelle Darrieutort-Laffite

Rheumatology Department, Nantes University Hospital

1 Place Alexis Ricordeau

44000 NANTES, FRANCE

Phone number: +33 2 40 08 48 01

Email address: [email protected]

26
 Partie I

ABSTRACT

Calcific tendonitis is a frequent cause of chronic shoulder pain caused by apatite deposits

within the rotator cuff tendons. Its cause is currently poorly known. The objectives of this

study were to better characterize the cells and mechanisms involved in depositing apatite

crystals in human tendons. Histologic sections of cadaveric calcified tendons showed that

calcifications were amorphous areas surrounded by a fibrocartilaginous metaplasia containing

hypertrophic chondrocyte-like cells that expressed Tissue Non-specific Alkaline Phosphatase

(TNAP) and Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 1 (ENPP1), two key

enzymes of the mineralization process. In vitro, tenocyte-like cells extracted from the rotator

cuff were able to mineralize in osteogenic two-dimensional cultures, and expressed TNAP,

type X COLLAGEN and MMP13, hypertrophic chondrocytes markers. The use of a TNAP

inhibitor significantly prevented mineral deposits. The mineralization ability of human rotator

cuff tenocyte-like cells was also assessed in three-dimensional cultures using a mixture of

chondrogenic and osteogenic media. In this condition, despite a higher expression of

chondrogenic markers, cells were inconstantly able to mineralize. Finally, human calcific

deposits were obtained from patients undergoing an ultrasound-guided percutaneous lavage of

their calcification. Infra-red spectroscopy of human calcific deposits showed that apatite

crystals are associated with groups of proteins. Mass spectrometry-based proteomic

characterizations showed a significant enrichment of proteins involved in bone and cartilage

development and extracellular matrix (for example ENPP1, NT5E (CD73), SERPINF1 or

periostin). In this study, we provide evidences that tenocytes have a propensity to differentiate

into hypertrophic chondrocyte-like cells to form fibrocartilaginous tissue and to produce

TNAP-dependent calcium deposits. Proteomic analyses identified proteins involved in bone

and cartilage metabolism that might be regulating factors of the phenomenon. We believe

27
 Partie I

these results may pave the way to identifying regulating factors that might represent valuable

targets in calcific tendonitis.

Keywords: calcific tendonitis, rotator cuff, apatite, hypertrophic chondrocytes, tissue non-

specific alkaline phosphatase

28
 Partie I

INTRODUCTION

Calcific tendonitis is a frequent cause of chronic shoulder pain. Apatite deposits

present within the rotator cuff tendons lead to sub-acromial impingement. Although frequent,

with 10 to 42% cases of chronic shoulder pain (1), its etiology remains unknown and only little

data is available on the mechanisms leading to calcium deposits. Histological analysis showed

the presence of a fibrocartilaginous metaplasia around the deposits containing chondrocyte-

like cells.(2) However, the role these cells play in mineralization has not been clearly

determined. Uhthoff et al. observed alkaline phosphatase activity in chondrocyte-like cells

and in the surrounding matrix, suggesting that the phenomenon could be incomplete

endochondral ossification through the coalescence of calcium crystals present in matrix

vesicles.(2) In contrast, Archer et al. did not detect any alkaline phosphatase enzymatic activity

in areas containing the rounded cells and refuted the previous hypothesis.(3)

Tenocytes are highly specialized mesenchyme-derived cells responsible for the

synthesis and maintenance of connective tissue. They are embedded in a three-dimensional

network of extracellular matrix components composed of type I collagen (60–85% of the dry

weight), other collagen subtypes (III and V), proteoglycans, glycosaminoglycans and

glycoproteins.(4) When isolated and expanded in vitro, these cells are named tenocyte-like

cells (TLC). They are characterized by the expression of a combination of markers: collagens

I and III, decorin, tenomodulin, scleraxis, and tenascin-C.(5) TLC also express mesenchymal

stem cell surface markers and have the ability to differentiate into adipogenic, osteogenic and

chondrogenic phenotypes.(6) Some data suggested that multipotential stem/progenitor cells are

present in tendons and are implicated in tendon regeneration.(7,8) It has not yet been

determined which cells may be responsible for the calcific deposits.

29
 Partie I

The objectives of this study were, in the first section, to describe the organization of

the calcium deposits within the tendon and to characterize the cells observed around them,

and in the second, to study the ability of cells extracted from the rotator cuff to induce

mineralization in vitro, the phenotype of these cells, and the mechanisms involved. In the last

section, we analyzed the composition of calcium deposits extracted from patients suffering of

calcific tendonitis.

30
 Partie I

MATERIALS AND METHODS

Histology and immunochemistry

Rotator cuff tendons were collected at the Nantes anatomical facilities from fresh and non-

embalmed cadaveric subjects kept at +4°C. Approval was obtained from the local Institutional

Review Board and Ethics Committee for the use of human anatomical specimens. Ultrasound

(US) was first used to detect calcified tendons. Tendons were considered as normal when they

had a continuous, fibrillary and hyperechoic structure on US. One normal and five calcified

tendons were collected from 5 subjects (median age 82 years [54-88 years]). Of the 5

calcifications, 3 had an arc-shaped morphology and 2 were fragmented without acoustic

(9) (10)
shadowing. After fixation, they were scanned , decalcified and embedded. Three μm-

thick sections were stained with hematoxylin and eosin (HE), Alcian Blue, Safranin O/Fast

Green (SOFG) and Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP).(11,12) Von Kossa was

performed on no decalcified portions of the samples.

Sections were incubated with primary antibodies targeting RUNX2 (Novus Biologicals

NBP1-77461, 1/200), SOX9 (ab3697, 1/400, Abcam, UK), Type II collagen (COL2A1)(sc-

52658, 1/1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), Type X collagen (COL10)(ab49945,

1/1000, Abcam), Tissue Non-specific Alkaline phosphatase (TNAP) (ab108337, 1/1000,

Abcam), Ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 1 (ENPP1) (ab40003, 1/2000,

Abcam), Mohawk Homeobox (MKX) (NBP2-45863, 1/400, Novus Biologicals, USA), CD31

(ab28364, 1/100, Abcam), CD68 (M0876, 1/400, Dako, USA), and cleaved Caspase-3 (9664,

1/400, Cell Signaling, Netherlands). Secondary antibodies at 1:400 dilutions were incubated

for 2 hours and streptavidin-HRP (P0397, Dako) for 1 hour, both at room temperature.

Staining was achieved with DAB (TA-125-QHDX, Thermo Scientific) and counterstaining

with hematoxylin. Cells were considered positive when stained in brown.

31
 Partie I

Cell culture

Tenocyte-like cells (TLC). Rotator cuff tendon samples (biceps or supra-spinatus) from 11

donors were obtained surgically at the time of shoulder replacement surgery for osteoarthritis.

All donors enrolled gave their formal consent. The study was approved by the local ethics

committee and by the French Research Ministry (DC-2011-1399) in accordance with the

Declaration of Helsinki. Mean age was 72.1 years (± 6.5). Tendons were digested in

collagenase A (1mg/ml).(5,6,13) Cells were cultured in RPMI medium (Lonza, Switzerland)

supplemented with 10% of fetal bovine serum (ThermoScientific), essential and non-essential

amino acids (Sigma-Aldrich, Germany) and used until passage 2. TLC were characterized by

flow cytometry (supplemental methods).

Osteogenic medium. TLC were incubated in osteogenic medium containing dexamethasone

10-7M, β-glycerophosphate 10mM and ascorbic acid 2P 250µM.(14) A Tissue Non-Specific

Alkaline Phosphatase inhibitor (TNAPi) was used at 20 µM (EMD Millipore Corp, USA, ref
(14)
613810-10MG). Alizarin red S staining was performed and TNAP activity quantified

using an ALP Colorimetric Assay Kit (Abcam) after cell lysis.(15)

Chondrogenic three-dimensional culture. Cell pellets were obtained following the

manufacturer’s instructions (70,000 cells in 24-well plates) and cultured in StemPro

chondrogenic medium for 7 days (A10064-01, Gibco, USA).For the 3 following weeks, the

pellets were maintained in the chondrogenic medium (CH condition) or received a mixed

chondrogenic/osteogenic medium (chondrogenic medium with dexamethasone 10-7M, β-

glycerophosphate10mM and ascorbic acid 2P 250µM (CH-OM condition)).

RT-qPCR analysis

32
 Partie I

Tenocyte total RNA was extracted using mini spin columns (NucleoSpin® RNA, Macherey

Nagel,France). The reverse transcription (RT)-qPCR was carried out as described.(16) The

primers used are reported in supplemental Table S1. Resultant cycle threshold (Ct) values

were normalized to the invariant control, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase) and expressed as 2-ΔCt.

Scanning Electron Microscopy (SEM) and FTIR (Fourier-Transformed Infrared)-

Spectroscopy

Calcifications were extracted from 14 patients undergoing an ultrasound-guided percutaneous

lavage in our Rheumatology department (mean age 52.4 years (+/-12.3), 7 men). All patients

enrolled gave their formal consent. Calcific deposits were collected in saline, washed in

phosphate-buffered saline (PBS) and dehydrated in ethanol 70°. SEM was performed with a

TM300 microscope (Hitachi, Japan) and FTIR-spectroscopy was performed using a Bruker

VERTEX 70 spectrometer with an ATR accessory equipped with a diamond crystal and using

a range of 400-4000 cm-1.

Proteomic and bioinformatics analysis

Calcifications from 5 patients were incubated for 2 hours in RIPA buffer, protease inhibitors

(leucopeptine (0.4µg/ml), aprotinine (0.4µg/ml)), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)

(5µM) and NaVO4 (0.5 mM). Extracted proteins were solubilized in Laemmli buffer, heated

for 5min at 95°C, before being stacked at the top of a SDS-PAGE gel (4-12% NuPAGE, Life

Technologies), stained with Coomassie blue R-250 and in-gel digested using modified trypsin

(Promega, sequencing grade) as previously described.(17) The resulting peptides were

analyzed by online nanoliquid chromatography coupled with tandem MS (UltiMate 3000 and

33
 Partie I

LTQ-Orbitrap Velos Pro, Thermo Scientific, USA). Peptides were sampled on a 300 µm x 5

mm PepMap C18 precolumn and separated on a 75 µm x 250 mm C18 column (PepMap,

Thermo Scientific) using a 120-min gradient. MS and MS/MS data were acquired using

Xcalibur (Thermo Scientific). Peptides and proteins were identified using Mascot (version

2.6) through concomitant searches against Uniprot (Homo sapiens taxonomy, December 2018

version), a classical contaminants database (homemade) and the corresponding reversed

databases. The Proline software (http://proline.profiproteomics.fr) was used to filter the

results: conservation of rank 1peptides, peptide identification false discovery rate< 1% as

calculated on peptide scores by employing the reverse database strategy, minimum peptide

score of 25, and minimum of 1 specific peptide per identified protein group. Proline was then

used to perform a compilation, grouping and spectral counting-based comparison of the

protein groups identified in the different samples. Proteins from the contaminant database and

keratins were discarded from the final list of identified proteins. Only protein groups

identified with a total of at least 2 specific spectral counts in total were retained.

The proteins identified in our proteomic analysis of calcifications were subjected to functional

classifications using PANTHER v.14.0.(18)

Statistics

Results were analyzed with the Mann-Whitney test using GraphPad8 software. Data are given

as mean ± SEM and results with p < 0.05 were considered significant. For proteomic analyses,

the protein list was explored for statistical over-representation of GO (Gene Ontology)

biological process and cellular component terms using Fisher's exact test and the Bonferroni

correction for multiple testing. Only GO terms with an adjusted p-value < 0.05 were

considered as significant hits.

34
 Partie I

RESULTS

Histological characterization of calcific tendonitis

To characterize the cell and tissue organization around calcific deposits, we analyzed

samples collected from cadaveric supraspinatus tendons. Micro-Computed Tomography (CT)

images showed that the calcifications were composed of multiple adjacent deposits. Their

density was higher when an arc-shaped morphology was observed with ultrasound (donors 3,

4, 5) (Figure 1A). Von Kossa staining confirmed the presence of small micrometric and large

millimetric, calcified areas in the 5 donors (Figure 1C: example of a large calcification) but

not in the normal tendon (Supplemental figure S1). In the decalcified samples, mineral deposit

sites appeared as areas containing an amorphous acellular material that remained after

decalcification (Figure 1B). Four donors had small (vesicular, sub-cellular sized)

calcifications disseminated between tendinous fibers in association with nearby voluminous

ones encapsulated by a tissue. In one sample (donor 5), an intra-tendinous osseous metaplasia

with osteoblasts, osteocytes and bone marrow was observed adjacent to the large encapsulated

calcium deposits (Figure 1B). The capsule presented a red coloration after SOFG staining

(proteoglycan specific) and a blue coloration with alcian blue staining (mucopolysaccharides

specific), indicative of fibrocartilaginous tissue. However, this tissue was COL2 negative on

immunohistochemistry whereas the fibrocartilage at the enthesis was strongly positive, as

expected (Figure 1C).

Within the fibrocartilaginous area surrounding the deposits, cells with rounded nuclei

and pericellular lacunae were observed suggesting chondrocyte differentiation. These cells

expressed the master transcription factors RUNX2 and SOX9, the enzymes ENPP1 and

TNAP and eventually type X collagen (COL10), indicative of hypertrophic chondrocyte

differentiation (Figure 1D and E). Interestingly, extracellular TNAP staining was also present

35
 Partie I

at the interface between the calcium deposits and the fibrocartilaginous metaplasia, suggesting

an active role of this enzyme in apatite deposition.

We also identified blood vessels (CD31+) surrounding the deposits in 4 of the 5

calcified samples. The median of the smallest distance was 56.5µm (Figure 1E). In the non-

calcified portion of the samples, we did not observe such vascularization, with normal

vascularization being located in the sub-acromial bursae.

We did not observe CD68+ macrophages, multinucleated giant cells or TRAP positive

cells (i.e. osteoclasts) around the deposits (data not shown). Pathological calcification in
(19)
cartilage can be associated with chondrocytes apoptosis but none of the chondrocyte-like

cells expressed cleaved Caspase-3 (data not shown).

Characterization of tendon cells and assessment of their mineralization ability

Cells isolated from rotator cuff tendons had a spindle shape and expressed COL1A1,

COL3A1, MKX and SCLERAXIS as expected. However, TENOMODULIN was very weakly

expressed and lost after passage 1 (Supplemental figure S2). The majority of cells expressed

CD44, CD73, CD90 and CD105 and were negative for CD45, CD133 and CD146

(Supplemental figure S2). These cells were thus termed tenocyte-like cells (TLC).(13)

After 21 days of TLC culture in the osteogenic medium, we obtained significant

mineral deposits compared to the control medium (Figure 2A, N=5). Mineral deposits

occupied 15.48% (±2.57) of the surface of the well for the osteogenic condition versus 0.50%

(±0.4) for the control medium. As a positive control, human mesenchymal stem cells

mineralized 53.33% (±7.07) of the total surface of the well (data not shown).

Phenotype of the mineralizing TLC

36
 Partie I

Total RNA was extracted from TLC after 21 days of culture and the expression of

several genes was measured (Figure 2B). In osteogenic medium, we observed significantly

increased expression of TNAP and ENPP1, which are both implicated in the mineralization

process. We also observed increased expression of several chondrocyte markers: COL10A1,

MMP13 and COMP, which are especially expressed by hypertrophic chondrocytes, but

COL2A1 was not detected and the expression of ACAN was significantly reduced. The

osteogenic medium did not have any incidence on the expression of the other genes related to

osteoblast or tenocyte differentiation.

TNAP involvement in TLC-induced mineralization

We observed a significant increase in TNAP activity from day 14 onward in

osteogenic medium (Figure 3A). The use of a TNAP inhibitor showed a significant reduction

in the mineral deposits induced by the osteogenic medium (Figure 3B-C), suggesting a critical

role of TNAP in the process. The TNAPi modified the phenotype of the cells and induced a

decrease in expression of COL10 and MMP13, usually expressed by hypertrophic

chondrocytes (Figure 3D). However, it did not affect the expression of the other genes

studied: TNAP, ENPP1, ACAN and COMP. We did not observe any effect on the expression

of SOX9, RUNX2, SPP1, COL1A1, COL2A1or SCX (data not shown).

Mineralization ability of TLC in 3D chondrogenic culture

We next wondered whether a direct chondrogenic stimulation of TLC would also

favor mineral deposits. First, TLC 3D pellets cultured in a chondrogenic medium for 4 weeks

were able to produce peripheral fibrocartilaginous tissue with an abundant matrix positive for

Alcian blue staining, but negative for COL2 (Figure 4A). The center of the pellets was much
37
 Partie I

less structured, with poor extracellular matrix. The cells observed in the fibrocartilaginous

tissue had an elongated fibroblastic shape. By immunohistochemistry, these cells expressed

osteoblast and chondrocyte markers such as SOX9, RUNX2, COL10, TNAP and ENPP1.

They also expressed MKX, a tenocyte marker. RT-qPCR performed on the whole pellets

confirmed the expression of RUNX2, TNAP, ENPP1, COL10A1 and MKX and the absence of

expression of COL2A1 (Figure 4B). TLC in chondrogenic pellets expressed higher levels of

chondrocyte markers COL10A1 and MMP13 than TLC in 2D cultures. We also observed the

re-expression of the tenocyte marker TNMD in chondrogenic pellets, although it remained

undetected in the control 2D condition.

Next, TLC 3D pellets were cultured for one week in chondrogenic medium followed

by 3 weeks in a mixed medium composed of the chondrogenic medium supplemented with

osteogenic molecules (CH-OM). In this condition, we observed strong mineral deposits in the

fibrocartilaginous peripheral tissue as well as in the poorly-organized center of the pellets for

only one in three donors (Figure 5A, donor 1). Calcium deposits appeared as small

micrometric vesicles that eventually aggregated to form larger, amorphous deposits. No

mineralization was observed for donors 2 and 3 despite the presence of osteogenic molecules

(Figure 5A). When adding the TNAPi to the mixed medium (CH-OM + TNAPi),

mineralization was totally prevented for donor 1 (Figure 5A). Cells located within the

fibrocartilaginous alcian blue positive area were positive for TNAP in the chondrogenic and

chondrogenic/osteogenic medium, but its expression was reduced in the presence of the

TNAPi (Figure 5C).

38
 Partie I

Histological and 2D in vitro experiments showed us that a chondrocyte transition of

TLC was associated with apatite deposition. In the last part, we studied the composition of

calcifications extracted from patients to identify which components, possibly regulatory, were

associated with crystals.

Composition of calcium deposits

Electron microscopy performed on the calcifications extracted from patients with

calcific tendonitis showed a powder composed of ellipsoidal objects ranging from 3 to 300

µm (Figure 6A). FTIR-spectroscopy found the spectrum of apatite and additional peaks were

observed between 1400 and 1700 cm-1 and between 2900 and 3500 cm-1 (Figure 6B). They

were linked to the presence of proteins.

Following extraction, 348 proteins were reliably identified by mass spectrometry-based

proteomic analyses. Bioinformatic analysis indicated that the majority of proteins belong to

the extracellular space and many have been described as components of extracellular vesicles

(Figure 6C). Considering the involvement in biological processes, we observed a significant

enrichment of proteins involved in extracellular matrix organization, but also, more

interestingly, of proteins involved in ossification, bone growth and cartilage development

(Figure 6C). This prompted us to compare our list of calcification-contained proteins to those

reported to be present in connective tissues. For this, we compiled proteomic datasets

(20-24) (25-26)
previously reported to produce 3 lists of entries for i) tendon , ii) bone and iii)

cartilage.(27-28) As the compiled and compared datasets were acquired from samples of
(29)
different species, we relied on the gene names extracted from Uniprot to perform the

comparison between sample types. This analysis confirmed the presence of proteins already

found in tendon, but also in bone and/or cartilage (some of them are reported in Figure 6D).

39
 Partie I

Interestingly, we identified several proteins, such as ENPP1, NT5E (CD73), SERPINF1

(PEDF) or POSTN, which are known enzymes or regulating factors implicated in the

mineralization process.(30-32)

40
 Partie I

DISCUSSION

To explore the mechanisms involved in the pathogenesis of calcific tendonitis, we

collected three types of human samples: calcified tendon samples from cadaveric subjects,

tenocyte-like cells from donors and calcifications from patients with shoulder pain. The

histological analysis of calcified tendons showed a fibrocartilaginous metaplasia containing

chondrocyte-like cells around the deposits. This metaplasia has been previously described by

Uhthoff.(33) This “fibrocartilaginous area” did not contain type II collagen. This lack of

collagen II has already been observed in calcific tendonitis.(3) While fibrocartilage is typically

characterized by the presence of type II collagen, Benjamin et al. (34) reported that some types

of fibrocartilage contain only a small quantity of type II collagen and mainly type I collagen

(knee joint menisci). Cells within these areas expressed RUNX2 and SOX9, which are

transcription factors involved in chondrocyte differentiation. Some of them also expressed

COL10, suggesting a hypertrophic phenotype, which is consistent with their expression of

RUNX2 and TNAP.(35) In the growth plate, the downregulation of SOX9 is essential for

allowing endochondral ossification. However, in the case of calcific tendonitis, we usually did

not observed ossification suggesting that these hypertrophic chondrocytes did not reach their

terminal differentiation.(36)

We next showed that cells extracted from rotator cuff tendons, called TLC, were able

to induce mineral deposits in vitro. Our TLC had a fibroblastic morphology, and expressed

tendon-specific and MSC markers as previously reported.(5,13) The cells were used until

passage 2 because multiple passaging of TLC leads to phenotypic drift.(37) In previous studies,

mineralization was relatively weak with TLC.(13,38) Interestingly, when using DMEM to

expend TLC, we similarly did not observe any significant mineralization in osteogenic

medium (data not shown). Therefore, expansion of TLC in RPMI medium with low glucose

appears to be a key step for obtaining cells with significant mineral deposit ability.

41
 Partie I

Interestingly, the phenotype of the mineral-forming cells showed characteristics of

hypertrophic chondrocytes, such as increased expression of TNAP, COMP, COL10 and

MMP13. MMP-13 plays a key role in chondrocyte hypertrophy and mineralization. Its

transcription is regulated by RUNX2, and inhibiting MMP13 can suppress hypertrophy and

expression of COL10. In addition, the inhibition of MMP-13 inhibits calcium incorporation in

the extracellular matrix.(39)

To explore whether or not cells with a cartilaginous phenotype were also able to

mineralize, we cultured TLC in chondrogenic 3D pellets and exposed them to an osteogenic

medium. These cultures led to inconstant mineral deposits. For donor 1 (Figure 5), striking

similarities were noted with histological images obtained from calcified tendons, such as

micrometric calcified vesicles and the presence of hypertrophic chondrocytes expressing

TNAP. However, culturing TLC in chondrogenic/osteogenic medium cannot be a valuable

culture model for calcific tendonitis.

We have shown the key role played by TNAP in calcification formation. TNAP is a

key enzyme involved in the physiological mineralization process: extracellular inorganic

pyrophosphates are provided by ENPP1 and then hydrolyzed by TNAP to promote

mineralization. These two enzymes were expressed by the hypertrophic chondrocyte-like cells

in situ. In addition, we observed extra-cellular TNAP on the surface of the calcium deposits.

We can speculate that TNAP is present in matrix vesicles derived from the hypertrophic

chondrocyte-like cells, and that mineral deposits occur in these matrix vesicles. The presence

of matrix vesicles has previously been observed in tendons by electron microscopy(3) and their

potential implication in other pathological calcifications (vascular and cartilage calcifications)

has been suggested.(40) In addition, TNAP expression was increased in TLC after 21 days in

the osteogenic medium. Importantly, the inhibition of TNAP was able to decrease mineral

deposits in vitro in 2D cultures. The TNAP inhibitor also reduced expression of the

42
 Partie I

hypertrophic chondrocyte markers COL10 and MMP13. This suggests that the TNAPi acted

in part on mineralization by modifying the phenotype of the cells. We still need to determine

whether TNAP inhibitors will be useful in the treatment of calcifying tendonitis, as suggested

previously for vascular calcifications.(41)

Finally, identification by mass spectrometry-based proteomics of the proteins

associated with apatite crystals revealed an enrichment in cartilage-associated protein and the

enzymes involved in cartilage metabolism that corroborates the previous results. It will be

interesting in the future to study the role of these elements in the pathogenesis of the disease.

In conclusion, we provide here evidence that tenocytes have a propensity to

differentiate or transdifferentiate into hypertrophic chondrocyte-like cells to form

fibrocartilaginous tissue, and to produce TNAP-dependent calcium deposits. We believe these

results may pave the way for further studies to identify the regulating factors that may

represent valuable targets for treating calcific tendonitis.

Acknowledgements

We would like to thank Dr Marc Cappelli for giving us the surgical samples and the Nantes

anatomical facilities for making cadaveric subjects available for our study. Proteomic

experiments were partly supported by ProFI (ANR-10-INBS-08-01 grant) and the Labex

GRAL (ANR-10-LABX-49-01 grant). This work was supported by grants from the French

Society for Rheumatology.

Authors’ roles: CDL, PA, TG, VT, AA, YC and GL conceived and carried out experiments

and were involved in the acquisition and analysis of data. CDL, YC, BLG and FB interpreted
43
 Partie I

the data and wrote the manuscript. All authors critically revised the manuscript and approved

its submission.

44
 Partie I

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49
 Partie I

Figure legends

Figure 1. Histological characterization of rotator cuff calcifications (N=5). A: calcific

deposits assessed by micro-computed Tomography. B: HE (haematoxylin and eosin) staining

of decalcified samples (1 image for each patient). C: Von Kossa staining on no decalcified

samples and characterization of the fibrocartilaginous area with Alcian Blue staining, SO/FG

(Safranin O Fast Green) staining and immunohistochemical staining for COL2 (brown) with

Gill haematoxylin counterstain. D and E: Representative immunohistochemical staining for

ENPP1 (Ectonucleotidepyrophosphatase/phosphodiesterase 1), TNAP (Tissue nonspecific

alkaline phosphatase), Runx2, Sox9, Col10 and CD31 (brown). TF: tendon fibers; CD:

calcium deposits, FM: fibrocartilaginous metaplasia; OM: osseous metaplasia; CT: connective

tissue; V: vessels. Scale bar = 200µM.

50
Partie I

51
 Partie I

Figure 2. Assessment of mineral deposition induced by TLC after 21 days in the

osteogenic medium and characterization of mineralizing cells. A: Assessment of mineral

deposition by alizarin red S staining after 21 days (N=5). Quantification of the bound stain

after solubilization with formic acid for the two conditions (reading at 450 nm) and

representative images of the wells. CT: control medium; TLC: tenocyte-like cells; OM:

osteogenic medium. Scale bar = 1mm. B: Gene expression by TLC cultured 21 days in the

osteogenic medium or in the control medium (N=3 to 5).1: Study of TNAP (tissue nonspecific

alkaline phosphatase) and ENPP1 (Ectonucleotidepyrophosphatase/phosphodiesterase 1)

levels of expression. 2: Study of osteoblast markers: RUNX2, BGLAP (Bone Gamma-

Carboxyglutamate Protein), BSP (Bone SialoProtein) and SPP1 (Secreted PhosphoProtein 1).

3: Study of chondrocyte markers: SOX9, COL2A1, ACAN (aggrecan), COMP (Cartilage

Oligomeric Matrix Protein), COL10A1 and MMP13 (Matrix Metallopeptidase 13). 4: Study

of tenocyte markers: SCX (Scleraxis), MKX (Mohawk Homeobox), TNMD (Tenomodulin),

COL1A1 and COL3A1. * = p < 0.05.

52
Partie I

53
 Partie I

Figure 3. Study of TNAP involvement in the mineralization process. A: TNAP enzymatic

activity over time for the two conditions (N=3). B: Effects of a TNAP inhibitor on the mineral

deposition (N=3) assessed by the colorimetric method after solubilization of alizarin red. C:

Representative images of alizarin red staining of wells of one patient. CT: control medium;

OM: osteogenic medium; TNAPi: TNAP inhibitor. D: Gene expression by TLC after

treatment with a TNAP inhibitor (N=3). TNAP: tissue nonspecific alkaline phosphatase;

ENPP1: Ectonucleotidepyrophosphatase/ phosphodiesterase; ACAN: aggrecan; COMP:

Cartilage Oligomeric Matrix Protein; COL10: type X collagen; MMP13: Matrix

Metallopeptidase 13; CT: control; OM: osteogenic medium; TNAPi: TNAP inhibitor; ND:

not detected. * = p < 0.05.

54
Partie I

55
 Partie I

Figure 4. Characterization of TLC cultured in chondrogenic pellets. A: Representative

images of histological and immunohistochemical staining of TLC pellets (CH medium) for

COL2, SOX9, COL10, RUNX2, MKX, TNAP and ENPP1. COL2 positive control was

obtained with a chondrosarcoma sample. HE: Hematoxylin and eosin. Scale bar 100µm. B:

Gene expression of TLC cultured 4 weeks in chondrogenic pellets or in cell monolayer in

control medium: levels of expression of osteoblast markers (1), chondrocyte markers (2) and

tenocyte markers (3) (N=3) assessed by qPCR.* = p < 0.05.

56
 Partie I

Figure 5. Mineralization ability of TLC in 3-D pellets and effects of a TNAP inhibitor

(N=3). A: Representative images of Von Kossa staining of TLC pellets for two patients:

mineralization was observed with donor 1 contrary to donors 2 and 3. B: Alcian blue staining.

C: TNAP staining. CH = Chondrogenic medium for 4 weeks; CH-OM = chondrogenic

medium for 1 week followed by 3 weeks in mixed chondrogenic/osteogenic medium; TNAPi

= Tissue nonspecific alkaline phosphatase inhibitor, added for the last 3 weeks. Scale bar =

100 µm.

57
 Partie I

Figure 6. Analysis of the composition of calcifications extracted from patients. A:

Electron Microscopy (SEM) of the calcic powder extracted from a representative patient.

Scale bar 200µm. B: Fourier-Transformed Infrared (FTIR)-Spectroscopy of the patients’

calcifications (N=14). SHA = synthetic hydroxyapatite. C: Bioinformatic analyses of the

protein list identified in calcifications by mass spectrometry-based proteomic analyses (N=5).

Percentage of genes classified in selected statistically significant GO terms in the total human

proteome (blue bars) and in calcifications (orange bars) for biological process (upper panel)

and cellular component (lower panel). Enrichment is indicated for each term. D: Comparison

of the protein lists compiled for calcifications, bone, tendon and cartilage using Venn diagram

(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/). Selected proteins of interest are

presented.

58
Partie I

59
 Partie I

Supplemental material

Supplemental methods

Characterization of tenocytes like cells

Surface markers of TLC were determined at passage 2 by flow cytometry (FACS). The cells

were incubated with antibodies against CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD133 and

CD146 for 20 minutes at room temperature. Unstained cells were used as controls (CT). After

fixation, cells were analyzed with the BD-Accuri C6 Cytometer (BD Biosciences, Germany)

and with BD-Accuri C6 Plus Software.

60
 Partie I

Table S1. Primers used for quantitative PCR.

GENE Forward Reverse

RUNT-RELATED TRANSCRIPTION FACTOR gcctaggcgcatttcaga gctcttcttactgagagtggaagg

2 (RUNX2)

SOX9 gtacccgcacttgcacaac tcgctctcgttcagaagtctc

TYPE I COLLAGEN (COL1A1) ctggacctaaaggtgctgct gctccagcctctccatcttt

TYPE II COLLAGEN (COL2A1) tggtgctaatggcgagaag cccagtctctccacgttcac

TYPE III COLLAGEN (COL 3A1) agggaaagatggcccaag gcaccaccttcacccttatc

TYPE X COLLAGEN (COL10A1) caccttctgcactgctcatc ggcagcatattctcagatgga

SECRETED PHOSPHOPROTEIN 1 (SPP1) gagggcttggttgtcagc caattctcatggtagtgagttttcc

BONE GAMMA-CARBOXYGLUTAMATE ggcgctacctgtatcaatgg tcagccaactcgtcacagtc

PROTEIN (BGLAP)

BONE SIALOPROTEIN (BSP) cgaatacacgggcgtcaatg gtagctgtactcatcttcataggc

TISSUE NON-SPECIFIC ALKALINE aacaccacccaggggaac ggtcacaatgcccacagatt

PHOPHATASE (TNAP)

ECTONUCLEOTIDE gaaagaccacacttttacactctg ggctttgatgacttcactgct

PYROPHOSPHATE/PHOPHODIESTERASE 1
(ENPP1)

MOHAWK HOMEOBOX (MKX) gctcgcagatgacgctagt tctggctgtcgaacggtatt

SCLERAXIS (SCX) accttctgcctcagcaacca ggccacctcctaactgcgaat

TENOMODULIN (TNMD) gccagacaagcaagtgagga ttgcctcgacggcagtaaat

CARTILAGE OLIGOMERIC MATRIX PROTEIN gacatcaggactctcgggacaac tcgtcgtcgcaggcatcac

(COMP)

AGGRECAN (ACAN) cccctgctatttcatcgaccc gacacacggctccacttgat

MATRIX METALLOPEPTIDASE 13 (MMP13) cctggacaagtagttccaaagg gccggtgtaggtgtagatagga

GLYCERALDEHYDE-3-PHOSPHATE tgggtgtgaaccatgagaagtatg ggtgcaggaggcattgct

dehydrogenase (GAPDH)

61
 Partie I

Supplemental figure S1. Histology and immunohistochemistry of a normal tendon

(representative images). HE: haematoxylin and eosin; SO/FG: Safranin O Fast Green; COL2:

type II collagen; ENPP1: Ectonucleotidepyrophosphatase/phosphodiesterase 1; TNAP: Tissue

non-specific alkaline phosphatase; COL10: type X collagen. Scale bar = 200µM.

62
 Partie I

Supplemental figure S2. Characterization of tenocyte-like cells. A: Gene expression of

tenocyte markers at different passages assessed by quantitative PCR (N=1). B: Surface
markers of tenocyte-like cells assessed by Flow Cytometry (N=1). COL: collagen; MKX:
Mohawk homeobox; SCX: scleraxis; TNMD: Tenomodulin; P: passage; ND: not detected;
CT: control with unstained cells.

63
 Partie I

Supplementary Table S2. Proteomic analysis of calcium deposits from 5 patients.

P: peptides; SC: Spectral Count; BSC : Basic Spectral Count; SSC: Specific Spectral Count.
Tot
Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 al
Gene
Accession Description SSC
name
BS SS BS SS BS SS BS SS BS SS
P P P P P
C C C C C C C C C C
A0A024R 7 13 13 6 11 11 7 13 13 8 22 22 7 16 16
Fibronectin 1, isoform CRA_n FN1 2 6 6 3 0 0 4 2 2 7 1 1 5 9 9
768
462
7 13 13 4 5 8 18 18 4
CO3 Complement C3 C3 6 8 8 4
73 73
2
80 80
6 3 3 9
80 80 554
2 2 11 10 2 10 10 2 3 13 12
APOA1 Apolipoprotein A-I APOA1 5
84 78
8 0 1 9 7 0 8
88 82
1 6 5
486

SERPIN 2 2 2 2 2
ANT3 Antithrombin-III 7
60 60
1
38 38
6
53 53
6
68 68
4
49 49 268
C1
3 2 2 3 3
PLMN Plasminogen PLG 2
40 40
4
29 29
9
38 38
9
64 64
8
63 63 234

COL6A 3 1 2 5 3
CO6A3 Collagen alpha-3(VI) chain 0
36 36
9
22 22
7
39 39
0
64 64
2
39 39 200
3
1 2 2 2 2
APOA4 Apolipoprotein A-IV APOA4 5
24 24
4
46 46
2
29 29
1
25 25
0
33 33 157
1 1 1 2 1
CLUS Clusterin CLU 2
21 21
2
27 27
3
28 28
1
42 42
9
36 36 154
2 1 2 1 2
GELS Gelsolin GSN 0
38 38
5
26 26
0
29 29
3
18 18
4
39 39 150
2 1 1 3 2
COMP Cartilage oligomeric matrix protein COMP 2
35 33
1
19 16
4
19 16
0
60 57
0
27 25 147
1 1 1 2 1
PRG4 Proteoglycan 4 PRG4 4
30 30
0
13 12
1
13 12
6
75 71
2
21 21 146

SERPIN 1 1 1
PEDF Pigment epithelium-derived factor 3
36 36 8 16 16
3
38 38 8 23 23
1
30 30 143
F1
6 77 6 67 6 82 5 39 6 65
ALBU Serum albumin ALB 9 5
40
0 2
15
6 3
40
6 5
8
6 9
27 130
1 1 6
APOB Apolipoprotein B-100 APOB 4
14 14
9
26 26 5 5 5
2
73 73 3 3 3 121

A0A024R 1 1 3 2
Tenascin C (Hexabrachion), isoform CRA_a TNC 7
20 20 8 10 10
3
14 14
9
47 47
1
25 25 116
884
SERPIN 1 1 1 1 1
AACT Alpha-1-antichymotrypsin 3
23 23
3
22 22
5
27 27
1
17 17
2
22 22 111
A3
PCOLC 1 1 1 1 1
PCOC1 Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 2
20 20
2
18 18
4
21 21
3
25 25
3
25 25 109
E
1 1 1 1
B4DPP8 cDNA FLJ53075, highly similar to Kininogen-1 2
15 15 9 13 13
3
21 21
9
29 29
6
27 27 105

A0A384M 3 3 11 3 10 2 3
Epididymis secretory sperm binding protein 2
87 22
7 1
28
2 7
14
4
59 11
3
97 16 91
DQ7
cDNA FLJ55673, highly similar to 1 1 1 1 1
B4E1Z4 5
19 19
2
13 13
4
16 16
5
19 19
3
18 18 85
Complement factor B
2 1 1
CERU Ceruloplasmin CP 1
29 29 5 6 6
0
11 11
9
24 24 8 12 12 82

FGFBP 1 1 1
FGFP2 Fibroblast growth factor-binding protein 2 1
16 16 9 16 16 9 16 16
1
17 17
2
16 16 81
2
1
VTNC Vitronectin VTN 5 10 10 7 9 9 5 8 8
4
41 41 6 11 11 79
1 1 2 1
CILP1 Cartilage intermediate layer protein 1 CILP 0
11 11
0
12 12 8 10 10
4
29 29
5
16 16 78
1 1
CO9 Complement component C9 C9 0
13 13 5 5 5 8 10 10
9
38 38 7 11 11 77
1 1
VTDB Vitamin D-binding protein GC 9 13 13 9 13 13 9 16 16
3
17 17
4
18 18 77
1 1 1
APOE Apolipoprotein E APOE 6 7 7
0
11 11 8 9 9
8
32 32
4
17 17 76
1 1 2
FIBB Fibrinogen beta chain FGB 1
13 13 8 11 11
1
13 13
8
35 35 3 3 3 75
1 2
THRB Prothrombin F2 2
15 15 3 5 5 5 8 8
1
37 37 6 9 9 74
1 1 1
F5GY80 Complement component C8 beta chain C8B 1
17 17 6 10 10 6 8 8
6
19 19
1
12 12 66
1
FETUA Alpha-2-HS-glycoprotein AHSG 7 14 14 6 9 9 5 7 7
0
24 24 8 12 12 66
1 1 1 1
TENX Tenascin-X TNXB 8 8 8
4
15 15
2
13 13
4
14 14
2
12 12 62

64
 Partie I

A0A024R SERPIN 2 3 3 11 2 3 10
Alpha-1-antitrypsin 9
69 4
3
87 4
1 2
19
5
59 11
5 1
20 58
6I7 A1
CRTAC 1 1
CRAC1 Cartilage acidic protein 1 0
12 12 7 7 7 5 5 5
4
21 21 8 10 10 55
1
Q6PIL8 IGK@ protein IGK@ 5 19 11 6 24 13 6 23 11 6 22 12 5 17 7 54
Insulin-like growth factor-binding protein 1
ALS IGFALS 9 12 12 5 5 5 7 7 7
2
17 17 7 12 12 53
complex acid labile subunit
LBP Lipopolysaccharide-binding protein LBP 9 12 12 2 3 3 5 6 6 8 17 17 7 13 13 51
1 1
HTRA1 Serine protease HTRA1 HTRA1 2
14 14 4 6 6 6 8 8
0
16 16 4 5 5 49

ANGT Angiotensinogen AGT 7 8 8 7 11 11 6 7 7 7 11 11 8 11 11 48

cDNA FLJ53691, highly similar to 1 1
B4E1B2 4 5 5 8 8 8
0
12 12
0
13 13 9 10 10 48
Serotransferrin
TTHY Transthyretin TTR 8 12 12 4 5 5 8 14 14 9 9 9 8 8 8 48
1
CO8A Complement component C8 alpha chain C8A 8 10 10 4 5 5 5 5 5
6
18 18 8 9 9 47

CO8G Complement component C8 gamma chain C8G 4 10 10 2 5 5 3 6 6 8 15 15 6 11 11 47

1
FIBG Fibrinogen gamma chain FGG 8 8 8 5 6 6 7 7 7
7
20 20 3 3 3 44

COL1A
CO1A2 Collagen alpha-2(I) chain 9 10 10 5 5 5 9 9 9 7 7 7 9 11 11 42
2
1
FIBA Fibrinogen alpha chain FGA 4 4 4 3 4 4 6 8 8
6
21 21 5 5 5 42

SERPIN
IPSP Plasma serine protease inhibitor 7 8 8 8 11 11 7 9 9 6 7 7 7 7 7 42
A5
SERPIN
KAIN Kallistatin 8 11 11 5 6 6 6 7 7 7 9 9 7 9 9 42
A4
1
SPRC SPARC SPARC 7 10 10 6 7 7 7 8 8 1 1 1
0
14 14 40
1
CO5 Complement C5 C5 5 5 5 6 7 7 1 1 1
9
22 22 4 4 4 39
1
ITIH4 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 ITIH4 4 4 4 5 7 7 2 2 2
4
18 18 6 6 6 37

COL3A 1
CO3A1 Collagen alpha-1(III) chain 4 4 4 5 6 6 6 9 9 5 6 6
0
11 11 36
1
SERPIN 1
HEP2 Heparin cofactor 2 7 7 7 3 4 4 4 6 6
1
13 13 5 6 6 36
D1
1
INHBA Inhibin beta A chain INHBA 3 3 3 3 4 4 6 6 6 8 9 9
1
14 14 36

DKFZp
Uncharacterized protein DKFZp686I04196 1 1 1 1
Q6N093 686I04 0
18 10 7 10 2
3
25 9
2
25 10
0
18 5 36
(Fragment)
196
APOA2 Apolipoprotein A-II APOA2 3 7 7 5 7 7 5 7 7 4 8 8 3 6 6 35
DKFZp
1 1 1 1 1
Q6MZQ6 Uncharacterized protein DKFZp686G11190 686G1 2
25 5
1
22 7
3
31 7
2
32 8
3
31 7 34
1190
APOC1 Apolipoprotein C-I APOC1 3 3 3 4 9 9 4 6 6 5 8 8 3 6 6 32
Transforming growth factor-beta-induced
BGH3 TGFBI 7 8 8 4 4 4 3 3 3 8 10 10 7 7 7 32
protein ig-h3
CCDC8 1
CCD80 Coiled-coil domain-containing protein 80 5 6 6 1 1 1 2 2 2
0
16 16 4 6 6 31
0
CD14 Monocyte differentiation antigen CD14 CD14 5 9 9 2 2 2 4 5 5 4 6 6 7 9 9 31
Q8NEJ1 Uncharacterized protein 3 7 4 4 9 4 5 16 9 5 9 6 4 11 8 31
CHAD Chondroadherin CHAD 6 10 10 4 5 5 1 1 1 6 10 10 3 4 4 30
HABP2 Hyaluronan-binding protein 2 HABP2 1 1 1 2 3 3 5 8 8 9 13 13 5 5 5 30
TSP1 Thrombospondin-1 THBS1 6 7 7 3 3 3 5 5 5 6 7 7 8 8 8 30
PRELP Prolargin PRELP 5 6 6 2 2 2 4 5 5 9 12 12 4 4 4 29
APOL1 Apolipoprotein L1 APOL1 2 2 2 3 4 4 4 4 4 8 10 10 7 8 8 28
1
CO7 Complement component C7 C7 3 3 3 3 3 3
4
18 18 4 4 4 28

LUM Lumican LUM 4 6 6 1 1 1 6 9 9 5 6 6 4 5 5 27

SAMP Serum amyloid P-component APCS 5 6 6 3 4 4 4 5 5 6 8 8 4 4 4 27
SERPIN
A2AP Alpha-2-antiplasmin 7 7 7 3 3 3 5 5 5 4 5 5 6 6 6 26
F2
AMBP Protein AMBP AMBP 4 5 5 1 1 1 4 5 5 5 8 8 5 7 7 26
CO6A1 Collagen alpha-1(VI) chain COL6A 3 4 4 2 2 2 4 5 5 6 9 9 6 6 6 26

65
 Partie I

1
ENOA Alpha-enolase ENO1 5 6 6 3 3 3 4 4 4 9 10 10 2 3 3 26
1
MXRA5 Matrix-remodeling-associated protein 5 MXRA5 2 2 2
7
22 22 2 2 2 26

SODE Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] SOD3 5 6 6 3 3 3 3 3 3 4 7 7 5 7 7 26

PGS2 Decorin DCN 5 6 6 4 5 5 2 2 2 8 11 11 1 1 1 25
PON1 Serum paraoxonase/arylesterase 1 PON1 1 1 1 1 4 4 2 3 3 5 12 12 2 5 5 25
1
VIME Vimentin VIM 1 1 1 1 1 1
2
15 15 7 8 8 25

1
HBB Hemoglobin subunit beta HBB 7 12 4 3 4 2 7 11 4 5 6 2
1
22 12 24

G3P Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH 3 4 4 3 3 3 8 9 9 5 7 7 23

1
FBLN1 Fibulin-1 FBLN1 2 2 2 1 1 1
2
16 16 3 3 3 22

ANXA1 Annexin A1 ANXA1 1 1 1 2 2 2 4 5 5 7 8 8 5 5 5 21

HIST1H
H14 Histone H1.4 4 5 5 2 3 3 2 3 3 3 4 4 4 6 6 21
1E
HBA Hemoglobin subunit alpha HBA1 4 6 6 2 3 3 2 2 2 3 3 3 6 7 7 21
HPT Haptoglobin HP 5 6 4 3 4 3 9 11 7 5 7 6 2 3 1 21
IBP5 Insulin-like growth factor-binding protein 5 IGFBP5 3 3 3 1 3 3 3 4 4 6 7 7 4 4 4 21
1
LDHA L-lactate dehydrogenase A chain LDHA 3 3 3 1 1 1 1 1 1
0
14 14 2 2 2 21

PGLYR
PGRP2 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase 2 2 2 8 13 13 5 6 6 21
P2
TARSH Target of Nesh-SH3 ABI3BP 2 3 3 1 1 1 2 2 2 9 13 13 1 2 2 21
1
AEBP1 Adipocyte enhancer-binding protein 1 AEBP1 2 2 2
1
16 16 2 2 2 20
1
FHR1 Complement factor H-related protein 1 CFHR1 6 6 2 5 7 1 9 13 4 8 9 3
0
19 9 19

Serpin peptidase inhibitor, clade E (Nexin,

A0A024R SERPIN 1
plasminogen activator inhibitor type 1), 2 2 2
1
13 13 3 3 3 18
498 E2
member 2, isoform CRA_b
ANXA5 Annexin A5 ANXA5 4 4 4 1 1 1 4 4 4 7 7 7 2 2 2 18
CBPB2 Carboxypeptidase B2 CPB2 3 3 3 3 3 3 1 1 1 6 9 9 2 2 2 18
MMP3 Stromelysin-1 MMP3 1 1 1 1 1 1 4 4 4 7 8 8 4 4 4 18
APOD Apolipoprotein D APOD 1 1 1 3 4 4 2 2 2 6 6 6 4 4 4 17
COL6A
CO6A2 Collagen alpha-2(VI) chain 2 2 2 1 1 1 3 3 3 7 9 9 2 2 2 17
2
FHR2 Complement factor H-related protein 2 CFHR2 5 5 3 4 5 2 7 11 6 4 5 2 7 8 4 17
PGK1 Phosphoglycerate kinase 1 PGK1 4 5 5 9 11 11 1 1 1 17
ANXA2 Annexin A2 ANXA2 3 3 3 1 2 2 6 7 7 4 4 4 16
CH3L1 Chitinase-3-like protein 1 CHI3L1 7 7 7 1 1 1 1 1 1 5 5 5 2 2 2 16
SERPIN
IC1 Plasma protease C1 inhibitor 3 5 5 2 2 2 7 7 7 2 2 2 16
G1
IGK Immunoglobulin kappa light chain 6 11 3 7 14 4 7 15 4 7 12 2 7 13 3 16
ITIH2 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 ITIH2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 8 10 10 2 2 2 16
MIME Mimecan OGN 4 6 6 2 2 2 2 3 3 2 3 3 2 2 2 16
Tumor necrosis factor receptor superfamily TNFRS
TR11B 3 4 4 1 1 1 3 3 3 2 3 3 5 5 5 16
member 11B F11B
A0A075B
T cell receptor alpha joining 56 (Fragment) TRAJ56 1 4 4 1 5 5 1 3 3 1 2 2 1 1 1 15
6Z2
B2R5G8 Serum amyloid A protein 4 4 1 4 5 1 3 3 1 5 15 8 5 9 4 15
TRFM Melanotransferrin MELTF 2 2 2 1 1 1 3 3 3 9 9 9 15
APOC3 Apolipoprotein C-III APOC3 1 1 1 2 5 5 2 3 3 2 2 2 2 3 3 14
CILP2 Cartilage intermediate layer protein 2 CILP2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 6 7 7 3 3 3 14
1 1
IGHG3 Immunoglobulin heavy constant gamma 3 IGHG3 8 15 3 9 11 2
2
21 4
1
22 3 9 18 2 14

LYSC Lysozyme C LYZ 2 2 2 3 3 3 3 4 4 5 5 5 14

MMP2 72 kDa type IV collagenase MMP2 1 1 1 8 11 11 2 2 2 14
QSOX1 Sulfhydryl oxidase 1 QSOX1 2 2 2 1 1 1 6 6 6 5 5 5 14
A0A0X9U
GCT-A5 light chain variable region (Fragment) 1 1 1 2 3 3 3 4 4 2 3 3 2 2 2 13
WL5
Fibronectin type III domain-containing
FNDC1 FNDC1 1 1 1 3 3 3 5 6 6 3 3 3 13
protein 1

66
 Partie I

1
KPYM Pyruvate kinase PKM PKM 1
13 13 13

A0A0G2J 2 1 4 1
Complement C4-A C4A 9
37 3
2
15 1 6 7
5
71 5
7
20 3 12
PR0
A0A0X9U GCT-A4 heavy chain variable region
2 3 3 3 4 3 2 3 2 3 3 1 4 5 3 12
SM3 (Fragment)
FMOD Fibromodulin FMOD 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 5 5 2 3 3 12
RNASE
RNAS4 Ribonuclease 4 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 5 5 12
4
APOH Beta-2-glycoprotein 1 APOH 1 1 1 1 1 1 3 5 5 4 4 4 11
2 1
B1ALD9 Periostin POSTN 8 8
6
37 7
3
17 4 11
3 1 4 1
CO4B Complement C4-B C4B 0
36 2
1
14 7 8 1
6
73 7
6
18 1 11

GPX3 Glutathione peroxidase 3 GPX3 1 1 1 6 8 8 2 2 2 11

ITIH1 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 ITIH1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 5 5 3 3 3 11
Basement membrane-specific heparan 1
PGBM HSPG2 6 7 1 2 2 1 7 10 1
4
14 7 7 12 1 11
sulfate proteoglycan core protein
SERPIN
THBG Thyroxine-binding globulin 2 2 2 3 3 3 3 3 3 1 1 1 2 2 2 11
A7
V-
A0N5G3 Rheumatoid factor G9 light chain (Fragment) lambd 1 1 1 3 5 5 1 1 1 2 3 3 10
a-3
A2MG Alpha-2-macroglobulin A2M 3 3 3 7 7 7 10
Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATP2A 1
AT2A2 2 2
3
16 10 10
ATPase 2 2
CCL18 C-C motif chemokine 18 CCL18 1 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 10
COL5A
CO5A1 Collagen alpha-1(V) chain 7 9 9 1 1 1 10
1
CSPG2 Versican core protein VCAN 1 1 1 2 2 2 1 1 1 5 6 6 10
TIMP2 Metalloproteinase inhibitor 2 TIMP2 3 3 3 2 2 2 3 5 5 10
ABCF1 ATP-binding cassette sub-family F member 1 ABCF1 1 3 3 1 2 2 1 2 2 1 1 1 1 1 1 9
ATP5F
ATPB ATP synthase subunit beta, mitochondrial 2 2 2 7 7 7 9
1B
6 73 5 66 6 78 5 38 6 63
F6KPG5 Albumin (Fragment) 8 7
2
9 0
3
5 6
3
3 7 3 3
1 9

KLKB1 Plasma kallikrein KLKB1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 5 5 5 9

CSF2R
L0R5A1 Alternative protein CSF2RB 1 1 1 1 3 3 1 2 2 1 1 1 1 2 2 9
B
PCOLC
PCOC2 Procollagen C-endopeptidase enhancer 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 5 5 5 9
E2
Q6NS95 IGL@ protein IGL@ 3 4 1 3 6 1 5 11 4 3 4 1 4 5 2 9
cDNA FLJ14473 fis, clone MAMMA1001080,
Q96K68 highly similar to Homo sapiens SNC73 protein 3 6 2 3 4 2 4 6 2 6 6 2 4 4 1 9
(SNC73) mRNA
SAA4 Serum amyloid A-4 protein SAA4 4 4 1 3 4 3 3 1 6 10 3 6 9 4 9
A0A125Q IBM-B2 heavy chain variable region
1 1 1 1 1 1 2 4 4 1 1 1 1 1 1 8
YY9 (Fragment)
A2KBB9 Anti-(ED-B) scFV (Fragment) 3 4 2 4 4 1 4 4 1 5 6 2 5 6 2 8
1
ACTS Actin, alpha skeletal muscle ACTA1 2 2 4 4 1 4 4 6 11 2
0
13 5 8

AMPN Aminopeptidase N ANPEP 7 8 8 8

Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATP2A
AT2A1 5 5 3 9 11 5 8
ATPase 1 1
cDNA FLJ50830, highly similar to Serum 5 62 4 55 4 66 3 31 4 52
B4DPR2 3 6
7
2 2 8 0 8 5 7 3
1 8
albumin
Ectonucleotide
ENPP1 pyrophosphatase/phosphodiesterase family ENPP1 8 8 8 8
member 1
HEMO Hemopexin HPX 1 1 1 1 1 1 3 3 3 2 3 3 8
PGS1 Biglycan BGN 1 1 1 6 6 6 1 1 1 8
PLTP Phospholipid transfer protein PLTP 1 1 1 1 1 1 4 4 4 2 2 2 8
SERPIN
ZPI Protein Z-dependent protease inhibitor 2 2 2 1 1 1 3 5 5 8
A10
YWHA
1433Z 14-3-3 protein zeta/delta 1 1 1 1 1 1 1 1 5 6 4 1 1 1 7
Z

67
 Partie I

A0A0X9T
MS-D1 light chain variable region (Fragment) 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 2 2 1 1 1 7
D47
C1S Complement C1s subcomponent C1S 5 5 5 1 2 2 7
COL2A
CO2A1 Collagen alpha-1(II) chain 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 4 4 7
1
COL5A
CO5A2 Collagen alpha-2(V) chain 5 6 6 1 1 1 7
2
COL1A
D3DTX7 Collagen, type I, alpha 1, isoform CRA_a 3 5 5 1 1 1 1 1 1 7
1
MOES Moesin MSN 1 1 1 5 5 5 1 1 1 7
NUCB1 Nucleobindin-1 NUCB1 1 1 1 1 1 1 3 3 3 2 2 2 7
SELEN
SEPP1 Selenoprotein P 3 3 3 2 2 2 2 2 2 7
OP
CLEC3
TETN Tetranectin 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 1 1 2 2 2 7
B
TPIS Triosephosphate isomerase TPI1 1 1 1 3 6 6 7
APOF Apolipoprotein F APOF 1 1 1 2 3 3 1 2 2 6
CFAD Complement factor D CFD 2 2 2 1 1 1 2 3 3 6
COL15
COFA1 Collagen alpha-1(XV) chain 4 6 6 6
A1
FA9 Coagulation factor IX F9 2 2 2 1 1 1 2 2 2 1 1 1 6
IGD Immunoglobulin delta heavy chain 4 4 4 2 2 2 6
IL11 Interleukin-11 IL11 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 6
Latent-transforming growth factor beta-
LTBP1 LTBP1 4 5 5 1 1 1 6
binding protein 1
MATN
MATN2 Matrilin-2 1 1 1 3 4 4 1 1 1 6
2
SERPIN
PAI1 Plasminogen activator inhibitor 1 3 3 3 3 3 3 6
E1
Procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-
PLOD1 PLOD1 5 6 6 6
dioxygenase 1
PRDX1 Peroxiredoxin-1 PRDX1 1 1 1 1 1 1 3 3 3 1 1 1 6
Myosin-reactive immunoglobulin light chain
Q9UL78 2 2 1 3 3 1 3 3 1 2 3 2 2 2 1 6
variable region (Fragment)
RET4 Retinol-binding protein 4 RBP4 1 1 1 2 2 2 2 3 3 6
TUBA1
TBA1A Tubulin alpha-1A chain 1 1 1 1 1 1 3 3 3 1 1 1 6
A
Tumor necrosis factor-inducible gene 6 TNFAIP
TSG6 1 1 1 3 3 3 2 2 2 6
protein 6
TSP4 Thrombospondin-4 THBS4 2 2 3 3 1 3 8 9 5 3 3 1 6
Voltage-dependent anion-selective channel
VDAC1 VDAC1 1 1 1 1 1 1 4 4 4 6
protein 1
5NTD 5'-nucleotidase NT5E 5 5 5 5
A0A1B1C
Vitamin D binding protein (Fragment) Gc 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 5
YC8
1
ACTN4 Alpha-actinin-4 ACTN4 1 1
1
11 5 5

ANGI Angiogenin ANG 1 1 1 2 2 2 2 2 2 5

C1R Complement C1r subcomponent C1R 5 5 5 5
CADH1 Cadherin-1 CDH1 1 1 1 3 3 3 1 1 1 5
CAMP Cathelicidin antimicrobial peptide CAMP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 5
CD109 CD109 antigen CD109 5 5 5 5
DAF Complement decay-accelerating factor CD55 1 1 1 2 2 2 2 2 2 5
DKK3 Dickkopf-related protein 3 DKK3 1 1 1 1 1 1 3 3 3 5
EEF1A
EF1A1 Elongation factor 1-alpha 1 1 1 1 3 3 3 1 1 1 5
1
HIST1H
H4 Histone H4 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 1 1 5
4A
IGHV3-
HV349 Immunoglobulin heavy variable 3-49 1 1 1 1 1 1 2 3 3 5
49
IGHG4 Immunoglobulin heavy constant gamma 4 IGHG4 6 11 5 6 9 16 3 8 14 2 6 12 5
ITB1 Integrin beta-1 ITGB1 5 5 5 5
LTBP2 Latent-transforming growth factor beta- LTBP2 4 5 5 5

68
 Partie I

binding protein 2
SAP Prosaposin PSAP 2 3 3 1 2 2 5
THY1 Thy-1 membrane glycoprotein THY1 2 2 2 1 1 1 2 2 2 5
TIMP1 Metalloproteinase inhibitor 1 TIMP1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5
TIMP3 Metalloproteinase inhibitor 3 TIMP3 5 5 5 5
TMEM
TM198 Transmembrane protein 198 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 1 1 5
198
A0A120H GCT-A10 heavy chain variable region
2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 4
G46 (Fragment)
BQ848
A0A2P9A
ATP-dependent DNA ligase 2_110 1 1 1 1 1 1 1 2 2 4
AK1
076
1
ACTG Actin, cytoplasmic 2 ACTG1 5 5 3 3 4 4
3
20 4 7 10 4

SLC25A
ADT1 ADP/ATP translocase 1 2 4 4 4
4
C1QC Complement C1q subcomponent subunit C C1QC 1 2 2 2 2 2 4
CATD Cathepsin D CTSD 4 4 4 4
2 2 3 3 3
CFAH Complement factor H CFH 9
34
9
35
6
46 2
0
34
6
48 2 4
1 1 1
CO6 Complement component C6 C6 9 10 6 6
3
15 1
0
14 2
0
12 1 4

COL12
COCA1 Collagen alpha-1(XII) chain 1 1 1 3 3 3 4
A1
COL14
COEA1 Collagen alpha-1(XIV) chain 3 4 4 4
A1
COL18
COIA1 Collagen alpha-1(XVIII) chain 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4
A1
CRP C-reactive protein CRP 1 1 1 1 1 1 2 2 2 4
FSTL1 Follistatin-related protein 1 FSTL1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4
ARHGD
GDIR1 Rho GDP-dissociation inhibitor 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4
IA
GSTP1 Glutathione S-transferase P GSTP1 1 1 1 2 2 2 1 1 1 4
Solute carrier family 2, facilitated glucose
GTR1 SLC2A1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 4
transporter member 1
HBD Hemoglobin subunit delta HBD 2 3 1 1 1 1 7 10 4 4
HPTR Haptoglobin-related protein HPR 2 2 1 1 4 4 3 3 2 3 4 2 4
IGHM Immunoglobulin heavy constant mu IGHM 1 1 1 1 1 1 3 3 1 5 5 1 4
LEG1 Galectin-1 LGALS1 4 4 4 4
SPON1 Spondin-1 SPON1 3 3 3 1 1 1 4
UGDH UDP-glucose 6-dehydrogenase UGDH 4 4 4 4
YWHA
1433G 14-3-3 protein gamma 1 1 4 5 3 3
G
A0A024R Milk fat globule-EGF factor 8 protein, isoform 1
MFGE8 5 6 4 5 5 5
5
21 3 7 10 3
C55 CRA_a
A0A024R Periostin, osteoblast specific factor, isoform 2 1
POSTN 8 8
3
32 2
0
14 1 3
DT5 CRA_a
A0A193C
10E8 heavy chain variable region (Fragment) 1 1 1 1 1 1 3 3 1 4 4 2 3
HR0
A0A2U8J
Ig heavy chain variable region (Fragment) IgH 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
8J2
A1AG1 Alpha-1-acid glycoprotein 1 ORM1 1 1 1 2 2 2 3
A1BG Alpha-1B-glycoprotein A1BG 2 3 3 3
A2J1M8 Rheumatoid factor RF-IP12 (Fragment) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
AFAM Afamin AFM 2 2 2 1 1 1 3
ANXA4 Annexin A4 ANXA4 3 3 3 3
APOM Apolipoprotein M APOM 4 4 2 1 1 2 2 4 7 3 4 1 3
ASPN Asporin ASPN 3 3 3 3
ATP5F
ATPA ATP synthase subunit alpha, mitochondrial 1 1 1 2 2 2 3
1A
BASI Basigin BSG 3 3 3 3
CALM1 Calmodulin-1 CALM1 1 1 1 1 2 2 3
CD5L CD5 antigen-like CD5L 2 2 2 1 1 1 3

69
 Partie I

CD81 CD81 antigen CD81 3 3 3 3

CFAI Complement factor I CFI 1 1 1 1 2 2 3
CH3L2 Chitinase-3-like protein 2 CHI3L2 3 3 3 3
CXL13 C-X-C motif chemokine 13 CXCL13 2 3 3 3
DSG1 Desmoglein-1 DSG1 2 2 2 1 1 1 3
EGF-containing fibulin-like extracellular EFEMP
FBLN3 2 2 2 1 1 1 3
matrix protein 1 1
IGHV3-
HV374 Immunoglobulin heavy variable 3-74 2 2 1 1 1 1 1 3 3 1 3 3 1 3
74
IBP3 Insulin-like growth factor-binding protein 3 IGFBP3 1 2 2 1 1 1 3
IQGAP
IQGA1 Ras GTPase-activating-like protein IQGAP1 3 3 3 3
1
ITA5 Integrin alpha-5 ITGA5 3 3 3 3
ITAV Integrin alpha-V ITGAV 2 3 3 3
KAD1 Adenylate kinase isoenzyme 1 AK1 2 3 3 3
OAF Out at first protein homolog OAF 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
PLAK Junction plakoglobin JUP 3 3 3 3
PPIC Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase C PPIC 1 2 2 1 1 1 3
Basement membrane-specific heparan
Q59EG0 sulfate proteoglycan core protein variant 6 7 1 1 1 7 10 1 7 7 7 12 1 3
(Fragment)
Myosin-reactive immunoglobulin light chain
Q9UL83 3 4 1 1 2 2 1 1 1 2 3
variable region (Fragment)
RL40 Ubiquitin-60S ribosomal protein L40 UBA52 1 2 2 1 1 1 3
S100A
S10A7 Protein S100-A7 2 3 3 3
7
SLC29A
S29A1 Equilibrative nucleoside transporter 1 3 3 3 3
1
S6BGE0 IgG H chain 8 16 1 6 12 1 6 16 6 19 8 19 1 3
SRPX2 Sushi repeat-containing protein SRPX2 SRPX2 1 1 1 2 2 2 3
TRY1 Trypsin-1 PRSS1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
TRY3 Trypsin-3 PRSS3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
A0A0X9U MS-D4 heavy chain variable region
2 2 1 1 1 1 2
WK7 (Fragment)
A0A0X9V
MS-F1 light chain variable region (Fragment) 1 1 1 1 1 1 2
9B3
A0A1L2B Anti-staphylococcal enterotoxin E variable
1 2 2 2
U40 region lambda chain (Fragment)
BQ848
A0A2P9A
3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase 2_903 1 1 1 1 1 1 2
XT4
44
A0A2R8Y Required for meiotic nuclear division protein RMND
1 2 2 2
4P5 1 homolog (Fragment) 1
A0A2U8J
Ig heavy chain variable region (Fragment) IgH 1 1 1 1 1 1 2
8Q6
A0A2U8J
Ig heavy chain variable region (Fragment) IgH 1 1 1 2 2 1 1 1 2
8T1
A0A2U8J
Ig heavy chain variable region (Fragment) IgH 1 1 1 1 1 1 2
936
A2NB45 Cold agglutinin FS-1 L-chain (Fragment) 2 2 2 2
cDNA FLJ75416, highly similar to Homo 2 3 3 3 3
A8K5T0 9
34
1
37 2
5
44
0
34
4
46 2
sapiens complement factor H (CFH), mRNA
cDNA FLJ78071, highly similar to Human MHC 1 1 1
A8K8Z4 0
11 1 6 6
2
14 9 12
0
12 1 2
class III complement component C6 mRNA
AAAT Neutral amino acid transporter B(0) SLC1A5 1 2 2 2
1
ACTB Actin, cytoplasmic 1 ACTB 5 5 3 3 4 4
2
17 1 8 11 1 2

ACTN1 Alpha-actinin-1 ACTN1 1 1 8 8 2 2

ANGPT
ANGL2 Angiopoietin-related protein 2 2 2 2 2
L2
ANXA6 Annexin A6 ANXA6 2 2 2 2
AQP1 Aquaporin-1 AQP1 2 2 2 2
ARF1 ADP-ribosylation factor 1 ARF1 2 2 1 1 1 1 2

70
 Partie I

B2MG Beta-2-microglobulin B2M 1 2 2 2

cDNA, FLJ93914, highly similar to Homo
1 1 1
B2R8I2 sapiens histidine-rich glycoprotein (HRG), 0
20 1 6 6 1 8 15
3
22
1
21 2
mRNA
Phosphoribosylformylglycinamidine synthase
B4DJ26 PFAS 1 2 2 2
(FGAR amidotransferase), isoform CRA_c
C1QB Complement C1q subcomponent subunit B C1QB 1 1 1 1 1 1 2
C4BPA C4b-binding protein alpha chain C4BPA 2 2 2 2
CD9 CD9 antigen CD9 2 2 2 2
CLEC11
CLC11 C-type lectin domain family 11 member A 2 2 2 2
A
CLIC1 Chloride intracellular channel protein 1 CLIC1 2 2 2 2
CLIC4 Chloride intracellular channel protein 4 CLIC4 2 2 2 2
CNTRL Centriolin CNTRL 1 1 1 1 1 1 2
COF1 Cofilin-1 CFL1 1 1 1 1 1 1 2
CSPG4 Chondroitin sulfate proteoglycan 4 CSPG4 2 2 2 2
CYC Cytochrome c CYCS 1 1 1 1 1 1 2
CYTC Cystatin-C CST3 1 1 1 1 1 1 2
EF2 Elongation factor 2 EEF2 2 2 2 2
FA10 Coagulation factor X F10 1 1 1 1 1 1 2
FABPH Fatty acid-binding protein, heart FABP3 1 1 1 1 1 1 2
FBN1 Fibrillin-1 FBN1 1 1 1 1 1 1 2
FHR3 Complement factor H-related protein 3 CFHR3 2 2 1 1 1 1 1 1 1 3 3 1 2
FILA2 Filaggrin-2 FLG2 1 2 2 2
GDIB Rab GDP dissociation inhibitor beta GDI2 2 2 2 2
HIST1H
H2B1B Histone H2B type 1-B 1 1 1 1 1 1 2
2BB
1 1 1
HRG Histidine-rich glycoprotein HRG 0
20 1 5 5 8 15
4
23 1
1
21 2

HSPB1 Heat shock protein beta-1 HSPB1 1 1 1 1 1 1 2

IGF2 Insulin-like growth factor II IGF2 2 2 2 2
ISK5 Serine protease inhibitor Kazal-type 5 SPINK5 1 2 2 2
KPRP Keratinocyte proline-rich protein KPRP 1 1 1 1 1 1 2
Mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha- MAN1
MA1A1 2 2 2 2
mannosidase IA A1
MAMD
MAMC2 MAM domain-containing protein 2 1 2 2 2
C2
Mediator of RNA polymerase II transcription
MED30 MED30 1 1 1 1 1 1 2
subunit 30
MGST3 Microsomal glutathione S-transferase 3 MGST3 1 1 1 1 1 1 2
MMRN
MMRN2 Multimerin-2 1 1 1 1 1 1 2
2
CDC42
MRCKB Serine/threonine-protein kinase MRCK beta 1 1 1 1 1 1 2
BPB
CYB5R
NB5R3 NADH-cytochrome b5 reductase 3 2 2 2 2
3
Neuroblastoma suppressor of tumorigenicity
NBL1 NBL1 1 2 2 2
1
SERPIN
NEUS Neuroserpin 2 2 2 2
I1
PLA2G
PA2GA Phospholipase A2, membrane associated 1 1 1 1 1 1 2
2A
PGCA Aggrecan core protein ACAN 2 2 2 2
Procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-
PLOD2 PLOD2 2 2 2 2
dioxygenase 2
PLSL Plastin-2 LCP1 1 1 1 3 3 1 2
PLST Plastin-3 PLS3 4 4 2 2
PPIB Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B PPIB 1 1 1 1 1 1 2
Q6U2L6 C4B (Fragment) C4B 1 1 1 1 1 1 2
Myosin-reactive immunoglobulin kappa chain
Q9UL85 2 3 2 2 1 2 3 1 2
variable region (Fragment)
Q9Y355 Apolipoprotein A1 (Fragment) 4 6 6 10 1 4 7 6 7 1 4 11 2

71
 Partie I

Cytochrome b-c1 complex subunit 2, UQCRC

QCR2 1 2 2 2
mitochondrial 2
S100A
S10A8 Protein S100-A8 2 2 2 2
8
S6BAM6 IgG H chain 7 15 5 11 6 16 7 20 1 8 19 1 2
SEMA3
SEM3C Semaphorin-3C 1 1 1 1 1 1 2
C
SFRP2 Secreted frizzled-related protein 2 SFRP2 2 2 2 2
SIL1 Nucleotide exchange factor SIL1 SIL1 2 2 2 2
Soluble scavenger receptor cysteine-rich
SRCRL SSC5D 1 1 1 1 1 1 2
domain-containing protein SSC5D
SRPX Sushi repeat-containing protein SRPX SRPX 2 2 2 2
TAGLN
TAGL2 Transgelin-2 2 2 2 2
2
TUBB2
TBB2A Tubulin beta-2A chain 2 2 2 2
A
TITIN Titin TTN 1 1 1 1 1 1 2
TLN1 Talin-1 TLN1 2 2 2 2
TMEM
TM109 Transmembrane protein 109 1 1 1 1 1 1 2
109
TUT7 Terminal uridylyltransferase 7 TUT7 1 1 1 1 1 1 2
Synaptic vesicle membrane protein VAT-1
VAT1 VAT1 2 2 2 2
homolog
VINC Vinculin VCL 2 2 2 2
WISP2 WNT1-inducible-signaling pathway protein 2 WISP2 2 2 2 2

72
 Partie I

C. Résultats complémentaires

En microscopie électronique, nous avons observé que la poudre calcique extraite de

l’épaule des patients était constituée d’éléments sphériques associées à une gangue (Figure
8A). Pour l’apatite de synthèse, on ne retrouvait pas ces éléments sphériques (Figure 8B). On
peut supposer que cette différence de morphologie est liée à l’ensemble des protéines
associées aux cristaux d’apatite.

Figure 8. A: Aspect d’une calcification de patient (image représentative) en microscopie électronique

à balayage. B: Aspect en microscopie électronique de l’apatite de synthèse.

Les deux tableaux suivants reprennent des résultats plus complets de l’analyse par
spectrométrie de masse que ceux intégrés dans l’article (Figure 7C de l’article) en ce qui
concerne les processus biologiques ou les groupes de composants cellulaires. Nous les avons
classés par groupes fonctionnels.

73
 Partie I

Tableau 1. Résultats sélectionnés de l’analyse des processus biologiques selon la Gene

Ontology (GO).
PANTHER Overrepresentation Test
Analysis Type:
(Released 20181113)
Annotation Version and Release Date: GO Ontology database Released 2019-01-01
Analyzed List: Client Text Box Input (Homo sapiens)
Reference List: Homo sapiens (all genes in database)
Test Type: FISHER
Correction: BONFERRONI
Bonferroni count: 8749

fold
GO biological process complete Enrichment p-value
Extracellular structure organization (GO:0043062) 12,96 5,69E-51
Extracellular matrix organization (GO:0030198) 12,13 1,77E-39
Regulated exocytosis (GO:0045055) 7,09 1,13E-34
Exocytosis (GO:0006887) 6,29 1,67E-31
Secretion by cell (GO:0032940) 5,46 5,23E-31
Vesicle-mediated transport (GO:0016192) 3,76 5,81E-30
Wound healing (GO:0042060) 7,32 1,85E-23
Response to wounding (GO:0009611) 6,49 1,00E-22
Collagen fibril organization (GO:0030199) 26,33 1,01E-14
Acute inflammatory response (GO:0002526) 16,59 9,24E-12
Regulation of response to wounding (GO:1903034) 9,99 1,64E-11
Inflammatory response (GO:0006954) 4,91 3,96E-10
Regulation of anatomical structure morphogenesis (GO:0022603) 3,31 7,51E-10
Supramolecular fiber organization (GO:0097435) 4,98 1,51E-09
Skeletal system development (GO:0001501) 4,64 4,12E-09
Anatomical structure morphogenesis (GO:0009653) 2,41 9,02E-09
Tissue development (GO:0009888) 2,54 5,16E-08
Cartilage development (GO:0051216) 6,57 3,02E-05
high-density lipoprotein particle remodeling (GO:0034375) 35,63 6,06E-07
Cartilage development involved in endochondral bone morphogenesis
(GO:0060351) 15,65 3,84E-05
Glycosaminoglycan catabolic process (GO:0006027) 12,14 6,65E-05
Extracellular matrix disassembly (GO:0022617) 11,57 1,04E-04
Chondrocyte differentiation (GO:0002062) 9,5 1,62E-04
Connective tissue development (GO:0061448) 5,43 1,66E-04
Positive regulation of wound healing (GO:0090303) 12,94 1,88E-04
Glycosaminoglycan metabolic process (GO:0030203) 6,68 2,09E-04
Regulation of inflammatory response (GO:0050727) 4,39 3,51E-04
Regulation of vesicle-mediated transport (GO:0060627) 3,48 3,99E-04
Chondrocyte development (GO:0002063) 14,08 5,11E-04
Positive regulation of response to wounding (GO:1903036) 11,22 6,26E-04
Regulation of phosphate metabolic process (GO:0019220) 2,15 8,19E-04
Regulation of phosphorus metabolic process (GO:0051174) 2,14 8,35E-04
Growth plate cartilage development (GO:0003417) 16,82 8,65E-04

74
 Partie I

Endochondral bone morphogenesis (GO:0060350) 9,61 2,28E-03

Growth plate cartilage chondrocyte differentiation (GO:0003418) 19,63 2,30E-03
Endochondral bone growth (GO:0003416) 13,46 3,83E-03
Bone development (GO:0060348) 5,23 4,05E-03
Ossification (GO:0001503) 4,56 4,31E-03
Bone growth (GO:0098868) 12,52 6,23E-03
Glycosaminoglycan biosynthetic process (GO:0006024) 7,4 6,28E-03
Chondrocyte differentiation involved in endochondral bone morphogenesis
(GO:0003413) 16,24 6,85E-03
Chondrocyte morphogenesis (GO:0090171) 22,43 8,86E-03
Growth plate cartilage chondrocyte morphogenesis (GO:0003429) 22,43 8,86E-03
Chondrocyte morphogenesis involved in endochondral bone morphogenesis
(GO:0003414) 22,43 8,86E-03
Collagen metabolic process (GO:0032963) 9,61 9,14E-03
Growth plate cartilage morphogenesis (GO:0003422) 21,25 1,15E-02
Regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway (GO:2001236) 5,54 1,32E-02
Bone morphogenesis (GO:0060349) 6,61 1,75E-02
Tissue remodeling (GO:0048771) 7,08 2,90E-02
Chondrocyte development involved in endochondral bone morphogenesis
(GO:0003433) 17,56 2,94E-02
Regulation of apoptotic signaling pathway (GO:2001233) 3,36 3,79E-02
Processus biologiques en lien avec le maintien de la matrice extracellulaire
(collagènes, glycosaminoglycanes et autres)
Processus biologiques en lien avec l’exocytose et la synthèse de vésicules
Processus biologiques en lien avec la réponse inflammatoire
Processus biologiques en lien avec le chondrocyte et le cartilage
Processus biologiques en lien avec l’os et l’ossification endochondrale
Processus biologiques en lien avec l’apoptose et les lipoprotéines
Processus biologiques en rapport avec la cicatrisation et la réparation tissulaire
Processus biologiques en lien avec le métabolisme du phosphore
Autres processus biologiques

75
 Partie I

Tableau 2.Résultats sélectionnés de l’analyse des composants cellulaires selon la Gene

Ontology (GO).
PANTHER Overrepresentation Test (Released
Analysis Type:
20181113)
Annotation Version and Release Date: GO Ontology database Released 2019-01-01
Analyzed List: Client Text Box Input (Homo sapiens)
Reference List: Homo sapiens (all genes in database)
Test Type: FISHER
Correction: BONFERRONI
Bonferroni count: 1423

fold
GO cellular components complete Enrichment P-value
Extracellular region part (GO:0044421) 5,17 9,69E-156
Extracellular space (GO:0005615) 5,37 1,47E-154
Extracellular region (GO:0005576) 4,34 7,36E-146
Extracellular vesicle (GO:1903561) 6,45 3,00E-115
Extracellular exosome (GO:0070062) 6,49 7,49E-115
Collagen-containing extracellular matrix (GO:0062023) 19,02 1,72E-93
Extracellular matrix (GO:0031012) 14,98 1,62E-89
Vesicle (GO:0031982) 3,92 6,77E-88
Vecretory vesicle (GO:0099503) 5,28 6,39E-30
High-density lipoprotein particle (GO:0034364) 39,88 8,03E-16
Lipoprotein particle (GO:1990777) 27,61 7,69E-14
Extracellular matrix component (GO:0044420) 20,6 2,59E-11
Collagen trimer (GO:0005581) 12,57 4,99E-10
Triglyceride-rich plasma lipoprotein particle (GO:0034385) 33,65 1,29E-08
Very-low-density lipoprotein particle (GO:0034361) 33,65 1,29E-08
Fibrillar collagen trimer (GO:0005583) 42,82 5,32E-06
Complex of collagen trimers (GO:0098644) 24,79 9,95E-05
Intermediate-density lipoprotein particle (GO:0034363) 53,84 7,63E-03
Low-density lipoprotein particle (GO:0034362) 24,03 9,11E-03
Integral component of membrane (GO:0016021) 0,58 3,71E-03
Intrinsic component of membrane (GO:0031224) 0,64 4,90E-02
Composants cellulaires en lien avec la matrice extra-cellulaire
Composants cellulaires des vésicules sécrétées
Composants cellulaires lipidiques (lipoprotéines)

76
 Partie I

D. Discussion complémentaire

Une analyse complémentaire des résultats du screening par protéomique est fournie
dans les Tableaux 1 et 2. On y retrouve un enrichissement significatif en protéines du
métabolisme osseux et du cartilage et en particulier des voies de l’ossification
endochondrale et du cartilage de croissance comme rapporté dans l’article. On retrouve
également, de manière attendue, une large proportion de protéines entrant dans la
constitution de la matrice extra-cellulaire. Cependant, il est intéresant de noter d’autres
processus biologiques sur-représentés concernant notamment l’exocytose et le transport de
vésicules mais également l’apoptose ou la réponse inflammatoire.

Concernant l’enrichissement en protéines associées aux vésicules, ceci suggère peut-

être la présence de vésicules matricielles dans le phénomène de calcification tendineuse.
Ces vésicules matricielles représentent un site de nucléation des cristaux d’apatite et
participent à la minéralisation de l’os, du cartilage et de la dentine. Elles concentrent en leur
sein le calcium et le phosphore issus du milieu extracellulaire et possèdent des enzymes-clés
de la minéralisation (TNAP, ENPP1 et Phospho-1) (50,51). Leur présence a été démontrée
dans le tendon bien que leur densité n’était pas plus importante dans les zones calcifiées par
rapport au reste du tendon (25). Dans les calcifications vasculaires, il a été mis en évidence
des particules ressemblant à des vésicules matricielles qui pourraient participer au
phénomène de minéralisation pathologique (50,51). De même, dans le cartilage, il existe des
petites vesicules extracellulaires produites par les chondrocytes qui sont le site de formation
de cristaux de calcium pathologiques qui vont se déposer dans le matrice cartilagineuse (52).

Un autre élément intéressant est la présence d’un enrichissement en protéines

associées à l’apoptose et en lipoprotéines et composants de la membrane cellulaire. En
effet, il a été suggéré que les phospholipides issus de débris cellulaires pourraient avoir un
rôle dans les calcifications pathologiques (28). En effet, des complexes comprenant calcium,
phosphate et phospholipides sont capables d’induire des dépôts d’apatite à la fois in vitro et
in vivo (28,29). Dans le cartilage, il est établi que les calcifications proviennent en partie de
corps apoptotiques issus des chondrocytes dont la composition est proche des vésicles
matricielles avec une acticité enzymatique TNAP et ENPP1 (53). En outre, les cristaux eux-

77
 Partie I

mêmes peuvent induire l’apoptose des chondrocytes (54) qui est alors pourvoyeuse de corps
apoptotiques qui peuvent être le site de formation de nouveaux cristaux.

Enfin, il existait également un enrichissement en protéines associées à

l’inflammation. Dans le tendinopathie calcifiante, la phase finale de la pathologie est
intensément inflammatoire, les cristaux étant capable d’induire une inflammation bursale
lors de la rupture de la calcification. Cependant, dans les études histologiques, dont la nôtre,
aucune cellule inflammatoire n’est observée autour des dépôts. Cependant, il est possible
que certaines cytokines pro-inflammatoires puissent avoir un rôle dans la minéralisation. En
effet, il a été montré que les cellules souches mésenchymateuses étaint capables de
produire des cristaux d’apatite lorsqu’elles étaient exposées à l’IL1β sans pour autant
qu’elles se différencient en ostéoblastes (55). Il existe également un rôle établi du TNFα et
de l’IL1β dans l’apparition des calcifications vasculaires via une stimulation de l’expression
de TNAP par les cellules musculaires lisses des vaisseaux (55). Il n’y a pas de données
disponibles dans la littérature sur l’effet de la stimulation IL-1 ou TNF sur la minéralisation
des ténocytes. Il a cependant été montré que la stimulation par l’IL1β des cellules souches
tendineuses altérait leur capacité de différenciation en ténocytes réduisant le niveau
d’expression de Scleraxis, ténomoduline, collagène de type I et collagène de type III (56).

Au total, nous pouvons synthétiser les résultats de cette partie et les éléments qui
restent à clarifier selon le schéma suivant (Figure 9).

78
 Partie I

Figure 9. Schéma de synthèse des données obtenues dans la première partie en histologie,
immunohistologie, in vitro et par spectrométrie de masse. ATP : adénosine triphosphate, PPi :
pyrophosphate inorganique, Pi : phosphate inorganique.

La partie suivante concernera la recherche de facteurs régulateurs pouvant être

impliqués dans la constitution des dépôts. Pour cela, nous avons sélectionné dans l’analyse
protéomique et la bibliographie des candidats à étudier et faisant partie des facteurs
impliqués dans la minéralisation osseuse pour savoir quels rôles ils pouvaient avoir dans
cette minéralisation pathologique.

79
 Partie II

Partie II

80
 Partie II

Résultats/Partie II

A. Introduction complémentaire

Comme indiqué dans l’introduction, peu de choses ont été décrites concernant les
protéines associées aux calcifications. Pourtant, il y a probablement parmi ces protéines des
éléments essentiels pour expliquer l’apparition, la croissance ou le maintien de la
calcification. Parmi elles, on peut identifier des protéines appartenant à différents processus
biologiques comme le suggère l’analyse en protéomique précedemment décrite.

Parmi ces protéines, nous avons identifié des éléments favorisants la

minéralisation comme le Pigment Epithelium-Derived Factor (PEDF ou Serpine F1) par
exemple. En effet, le PEDF est impliqué dans la minéralisation de la matrice osseuse puisque
la mutation de son gène est responsable de l’ostéogénèse imparfaite de type VI. Il a
également été montré qu’il pouvait augmenter la minéralisation des cellules souches
mésenchymateuses humaines in vitro (57).

Par opposition, on note également la présence de facteurs connus comme étant des
inhibiteurs de la minéralisation comme l’activine A ou l’ostéoprotégérine. Les activines sont
des membres de la super-famille du TGFβ. L’activine A, composé de deux sous-unités
inhibine βA, est capable d’inhiber la minéralisation des ostéoblastes humains in vitro (58).
En outre, l’ostéoprotégérine (OPG) qui a un rôle déterminant dans le remodelage osseux par
sa balance avec RANK-Ligand a montré qu’elle était un facteur protecteur de l’apparition des
calcifications vasculaires (59).

De plus, des éléments de la matrice extra-cellulaire pouvant favoriser la fixation du

calcium sur les fibres tendineuses ont été identifiés comme par exemple l’ostéonectine
(SPARC), ou la périostine (POSTN) (60).

Enfin, d’autres éléments non présents dans l’analyse protéomique nous ont paru
intéressants à étudier tels que l’ostéopontine puisqu’elle a été décrite par d’autres équipes
dans la tendinopathie calcifiante (20,33). La Bone Morphogenic protein-2 (BMP-2), elle, a

81
 Partie II

montré dans une étude qu’elle était capable d’induire une différenciation ostéoblastique des
cellules souches dérivées du tendon (46).

L’objectif de cette deuxième partie était, dans un premier temps, de quantifier par
technique ELISA plusieurs protéines issues des résultats de protéomique (PEDF, OPG,
Activine A, POSTN) ou issues de la littérature (BMP-2 et ostéopontine). Une fois ces
protéines dosées, nous avons regardé si leurs quantités étaient associées à certaines
caractéristiques cliniques. Pour terminer, nous avons étudié de manière plus approfondie le
PEDF qui est présent en grande quantité dans les calcifications et qui est décrit comme un
facteur pro-minéralisant.

82
 Partie II

B. Matériels et Méthodes

1. Extraction et dosage des protéines présentes dans les calcifications

Soixante-six calcifications de patients ont été étudiées. Ces patients faisaient partie
de l’étude CALCECHO publiée en 2019 dans Annals of Rheumatic diseases ajoutée en annexe
(Annexe 3). Dans cet essai clinique, tous les patients ont bénéficié d’un lavage percutané de
leur calcification sous échographie et ont donné leur consentement pour la conservation et
l’étude du matériel calcique retiré. Ils ont été randomisés en deux groupes qui se
différenciaient par le traitement reçu à la fin du geste (infiltration de méthylprednisolone ou
de placebo (sérum physiologique)).

L’extraction des protéines a été effectuée de la même manière que décrite dans
l’article de la partie I dans une solution contenant les éléments rapportés dans le Tableau 3
sous agitation à 4°C pendant 2 heures.

Composants Concentration
Chlorure de sodium 150 mM
Tris pH 7,4 1%
RIPA buffer Nonidet P-40 1%
Sodium déoxychloate 0,25%
Sodium fluoride 1 mM
Leucopeptine 0,4 µg/ml
Aprotinine 0,4 µg/ml
Inhibiteurs de
Phénylméthylsulfonylfluoride 5 µM
protéases et
(PMSF)
phosphatases
Sodium orthovanadate 0,5 mM
(Na3VO4)

Tableau 3. Protocole d’extraction des protéines associées aux cristaux d’apatite au sein des
calcifications de patients.

83
 Partie II

Après cette étape, les protéines totales ont été dosées par méthode BCA
(Bicinchoninic Acid Assay). Les échantillons ont été dilués au 1/5 et au 1/10 dans du RIPA
buffer avant d’ajouter 200µl d’acide bicinchoninique au 1/50. Après 30 minutes d’incubation
à 37°C, la densité optique était lue à 570nm et les résultats étaient rapportés à une gamme
de BSA (Bovine Serum Albumine).

Concernant les principales caractéristiques de ces patients, elles sont reprises dans le
Tableau 4.

Caractéristiques des patients (N=66)

Age, moyenne +/- écart-type 48,9 ans +/- 9,7

Sexe féminin, N (%) 45 (68%)
Atteinte du côté dominant 39 (59%)
Profession impliquant des mouvements répétitifs 31 (47%)
Durée des douleurs, moyenne 30 mois
Douleur au repos, moyenne +/- écart-type (EVA/100) 28,5 +/- 24,5
Douleur lors des activités, moyenne +/- écart-type 68 +/- 14
(EVA/100)
Score fonctionnel DASH/100, moyenne +/- écart-type 45 +/- 14
Taille de la calcification, moyenne +/- écart-type 18,2 mm +/- 5,9
Type de calcification à la radiographie, N (%) N=64
Type A 26 (40%)
Type B 38 (60%)
Type de calcification à l’échographie, N (%) N=65
Nodulaire 4 (6%)
Homogène 35 (54%)
Fragmentée 26 (40%)
Présence d’une bursite à l’échographie, N (%) 18 (27%)

Tableau 4. Principales caractéristiques des patients dont les calcifications ont été étudiées. EVA:
Echelle visuelle Analogique; questionnaire DASH: Disabilities of the Arm, Shoulder and Hand. Les
aspects radiographiques et échographiques sont illustrés dans les Figures 10 et 11.

84
 Partie II

Figure 10. Classification radiographique des calcifications selon la société française d’arthroscopie :
type A= dense, homogène à contours nets et type B : dense, cloisonnée à contours nets.

Figure 11. Aspects des calcifications en échographie.

85
 Partie II

2. Dosage des protéines d’intérêt par ELISA

Les échantillons ont été dilués au 1/10 pour le dosage de l’OPG, de la périostine, de
l’activine A et de l’ostéopontine et au 1/250 pour le PEDF pour le dosage ELISA (R&D
systems). La quantité obtenue a été rapportée à la quantité totale de protéines extraites et
exprimée en pg par µg de protéines totales.

Des corrélations ont été recherchées entre les valeurs des dosages et l’intensité des
douleurs et la taille de la calcification par un test de Pearson. Les valeurs des dosages ont été
comparées en fonction de l’aspect radiographique, de l’aspect échographique, de la durété
de la calcification, de la présence d’une bursite associée et de la réponse au traitement par
un test de Mann-Whitney. Une corrélation entre l’EVA et le DASH à M3 et les dosages
protéiques a également été recherchée dans les deux groupes de patients (Test de Pearson).
Un p inférieur à 0,05 a été considéré significatif.

Pour évaluer la réponse au traitement par ponction-fragmentation-lavage (PFL), les

dossiers ont été repris et les patients ont été considérés en échec de la PFL lorsqu’ils
gardaient à 12 mois des douleurs intenses, ou lorsqu’une deuxième PFL ou une chirurgie de
l’épaule avaient été nécessaires.

3. Etude du PEDF en immunohistochimie dans les tendons calcifiés

Les tendons calcifiés étudiés antérieurement ont été marqués en IHC avec un
anticorps anti-PEDF humain (Hôte : lapin ; Abcam 180711). Les étapes de marquage étaient
les suivantes :

- Démasquage antigénique : EDTA à 60° pendant 20 heures

- Inhibition des peroxydases endogènes par H2O2 pendant 25 minutes
- Blocage des sites aspécifiques par Goat serum 2%, BSA 1%
- Incubation de l’anticorps anti-PEDF (dilution de 1/10000) pendant 2 heures à
température ambiante
- Incubation de l’anticorps secondaire Goat anti-rabbit (Dako, E0432) au 1/400
pendant 1 heure à température ambiante

86
 Partie II

- Incubation de la streptavidine-HRP (Dabo, P0397) au 1/800 pendant 1 heure à

température ambiante.
- Révélation par de la DAB (ThermoScientific, TA-125-QHDX).
- Contre-coloration à l’hématoxyline

4. Etude de l’effet du PEDF sur la minéralisation in vitro

Pour ces expérimentations, le modèle de minéralisation 2D décrit dans l’article a été

utilisé avec le milieu associant dexaméthasone, β-glycérophosphate et acide ascorbique 2P
pendant 21 jours. Du PEDF recombinant humain (R&D, réf 1177-SF) a été ajouté dès le
premier jour de culture à des concentrations croissantes allant de 250 à 1000 ng/ml. La
minéralisation a ensuite été quantifiée par coloration au rouge alizarine. L’expression de
PEDF au niveau ARN et au niveau protéique par les ténocytes en culture a également été
étudiée pour rechercher une induction de son expression par le milieu ostéogénique.
L’expression au niveau génique a été évaluée par RT-qPCR (Forward :
TGTGCAGGCTTAGAGGGACT ; reverse : GGCTCCAATGCAGAGGAGTAG) comme décrit
précédemment et le PEDF a été dosé par ELISA (Human Serpin F1/PEDF Duoset ELISA, R&D)
dans les surnageants de culture à différents temps (J9, J16 et J21).

87
 Partie II

C. Résultats

1. Quantification des différentes protéines et recherche de corrélation avec les

éléments cliniques

L’extraction protéique a permis d’obtenir des concentrations totales entre 31 µg/ml

et 730 µg/ml (en moyenne, 266 µg/ml). Les concentrations des 6 protéines ont été les
suivantes (moyenne [écart-type]): PEDF = 245 ng/ml [387] ; OPG = 29ng/ml [29] ; POSTN =
899 pg/ml [240] ; Activine A = 4 332 pg/ml [9 998] et OPN 4509 pg/ml [15 640]. Nous les
avons rapportées à la concentration protéique totale et exprimées en pg/µg de protéines
totales (Tableau 5). Le PEDF était la protéine la plus retrouvée parmi celles étudiées et
représentait en moyenne 0,1% des protéines totales extraites des calcifications. La BMP2 n’a
pas été retrouvée malgré plusieurs dilutions sur 5 échantillons différents. Il est possible que
sa concentration soit inférieure au seuil de détection de l’ELISA (46,9 pg/mL). Ainsi, elle ne
sera pas étudiée par la suite. Il est intéressant de noter la présence d’ostéopontine alors que
celle-ci n’avait pas été détectée dans l’analyse protéomique.

PEDF OPG POSTN ACTIVINE A OPN BMP-2

(pg/µg (pg/µg (pg/µg (pg/µg (pg/µg (pg/µg
protéines protéines protéines protéines protéines protéines
totales) totales) totales) totales) totales) totales)

1097,4 135 6,9 19,6 49,6 ND

+/- 1100 +/- 115 +/- 12 +/- 45,2 +/- 223,1

Tableau 5. Moyenne des concentrations des protéines d’intérêt rapportée à la quantité totales de
protéines présentes dans les échantillons. N=66 pour toutes les protéines sauf BMP-2 (N=5). ND: non
détectée.

88
 Partie II

Concernant la présentation clinique, il n’y avait pas de corrélation retrouvée entre

l’intensité des douleurs et le taux des différentes protéines (résultats non présentés).

Concernant les caractéristiques à l’imagerie, le type A ou B en radiographie n’était

pas associé à des concentrations différentes des 5 protéines étudiées (Figure 12) et il n’y
avait pas non plus de corrélation avec la taille de la calcification (résultats non présentés).

Figure 12. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction du type de calcification en
radiographie (type A et type B illustrés en figure 10). Protéines exprimées en pourcentage des
protéines totales.

89
 Partie II

Par contre, on retrouvait des différences lors de l’analyse des différents aspects en
échographie. En effet, les calcifications d’aspect nodulaire donc moins denses étaient
significativement plus enrichies en POSTN que les calcifications fragmentées (p=0,03) ou
homogènes (p=0,003) et plus enrichies également en OPN que les calcifications fragmentées
(p=0,04) ou homogènes (p=0,01) (Figure 13).

Figure 13. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction du type de calcification en
échographie (aspects illustrés en figure 11). Protéines exprimées pg/µg de protéines totales. *=p<0,05

90
 Partie II

On retrouve la même notion avec les calcifications sans cône d’ombre qui sont plus
riches en POSTN (p=0,04) et en OPN bien que l’on n’atteigne pas la significativité pour cette
dernière (p=0,09). On retrouve également les mêmes tendances si on prend en compte la
durété de la calcification même si la significativité n’est pas obtenue (Figure 14).

Figure 14. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction de la présence ou non d’un cône
d’ombre en échographie et de la consistance de la calcification perçue par l’opérateur lors du geste de
ponction-fragmentation-lavage. Protéines exprimées pg/µg de protéines totales. *=p<0,05

91
 Partie II

Concernant la bursite, les taux d’OPG (p=0,02) et d’activine A (p=0,04) étaient plus
faibles lorqu’une bursite était présente à la surface de la calcification (Figure 15).

Figure 15. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction de la présence ou non d’une bursite
en échographie. Protéines exprimées pg/µg de protéines totales. *=p<0,05

92
 Partie II

Par rapport à la réponse au traitement, les calcifications ayant bien répondu à la PFL
sous échographie étaient significativement plus enrichies en POSTN (p=0,02) (Figure 16). La
réponse clinique a été évaluée à M12 car ceci permettait d’évaluer l’ensemble des patients
sans tenir compte du traitement reçu à la fin du geste (corticoïdes ou placebo). En effet, 6 et
12 mois après la PFL, le niveau de douleur et de gêne fonctionnelle étaient similaires dans les
2 groupes (cf Annexe 3). A M3, il existait une corrélation négative entre le taux de POSTN
(r=-0,38, p=0,04) et le DASH uniquement dans le groupe corticoïdes ; c’est-à-dire qu’un score
fonctionnel plus bas (donc un meilleur résultat clinique) était associé à un taux plus élevé de
POSTN.

Figure 16. A. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction du résultat du lavage et de
l’évolution clinique. L’échec au traitement était défini par la persistance de douleurs intenses ou la
nécessité d’un deuxième geste sur la calcification que ce soit un deuxième lavage ou une chirurgie. B.
Corrélation entre le DASH à M3 et le taux de périostine dans le groupe corticoïdes. Protéines
exprimées pg/µg de protéines totales. *=p<0,05.

93
 Partie II

2. Expression de PEDF au sein des tendons calcifiés

Anti-PEDF Hématoxyline et éosine

DC
DC

MF
MF

Figure 17. Marquage par anticorps anti-PEDF à gauche d’un tendon calcifié (image représentative).
Flèche : dépôt calcique (DC). Après révélation, les structures marquées sont de couleur marron. MF :
métaplasie fibrocartilagineuse.

L’analyse en immunohistochimie a retrouvé une fixation de l’anticorps anti-PEDF au sein de

la calcification (Figure 17) et également au niveau des cellules de type chondrocytaire alors
qu’il n’y avait pas de marquage PEDF au niveau des ténocytes présents entre les fibres
tendineuses (Figure 18).

94
 Partie II

Hématoxyline et éosine Anti-PEDF

MF
MF

DC DC

Anti-PEDF

DC

Figure 18. Marquage par anticorps anti-PEDF d’un tendon calcifié (images représentatives centrées
sur la zone de type fibrocartilagineuse autour des dépôts). Après révélation, les structures marquées
sont de couleur marron. Flèches noires: cellules de type chondrocytaire ; flèches rouges :
ténocytes.DC : dépôts calciques, MF : métaplasie fibrocartilagineuse.

3. Effet du PEDF sur la minéralisation in vitro

L’ajout de PEDF humain recombinant à nos conditions de minéralisation in vitro n’a

pas eu d’effet sur la minéralisation obtenue qui est restée équivalente à celle observée en
milieu ostéogénique seul. La manipulation a été réalisée avec 3 patients différents (Figure
19).

95
 Partie II

Figure 19. Evaluation de la minéralisation des ténocytes humains induite en milieu contrôle (CT) et
ostéogénique (MO) en présence de PEDF à des concentrations croissantes. PEDF en ng/ml.
Quantification du dépôt après solubilisation du rouge alizarine à l’acide formique et lecture de la
densité optique à 450 nm.

4. Expression et sécrétion du PEDF par les ténocytes en culture

Nous avons constaté que la quantité de PEDF sécrétée dans le milieu de culture était
croissante au cours des 21 jours, et significativement plus importante dans le milieu
ostéogénique avec des concentrations allant jusqu’à 200 ng/ml. Il n’y avait pas de différence
entre les deux milieux à J9 (Figure 20 A). Par contre, en qPCR, nous n’avons pas constaté de
régulation du PEDF au niveau de l’expression génique (Figure 20 B). Il est possible que
l’augmentation du PEDF sécrété soit uniquement en rapport avec la prolifération des cellules
qui était plus importante dans le milieu ostéogénique ou qu’un mécanisme post-
transcriptionnel soit impliqué.

96
 Partie II

Figure 19. A : Quantification par ELISA du PEDF dans les surnageants de culture au cours des
21 jours. Expression en Fold Change par rapport à J9 de culture. B : Expression du PEDF au
niveau génique quantifié par qPCR à J21. CT = milieu contrôle ; MO = milieu ostéogénique.
N=3. *=p<0,05.

97
 Partie II

D. Discussion

L’analyse des protéines en ELISA nous a permis de quantifier les protéines dans nos
échantillons. La BMP-2 n’a pas été détectée alors que l’ostéopontine était présente bien que
non identifiée dans le screening par spectrométrie de masse.

Concernant la présence d’associations entre dosages protéiques et caractéristiques

cliniques des patients, cette étude exploratoire a mis en évidence quelques éléments qui
nécessitent d’être explorés de manière plus approfondie. Le premier élément est la mise en
évidence d’un enrichissement en périostine et ostéopontine des calcifications les moins
denses et l’observation qu’un enrichissement en POSTN semblait associé à une meilleure
réponse clinique. La périostine, d’abord découverte dans l’os, est également présente dans
les tissus riches en collagène et soumis en permanence aux contraintes mécaniques :
ligament parodontal, valves cardiaques et tendons (52). Au cours du développement osseux,
la périostine est exprimée dans les cellules souches mésenchymateuses et les cellules
exprimant la phosphatase alcaline. Puis, son expression décroit à l’âge adulte mais elle est
réexprimée après les lésions myocardiques, musculaire ou les fractures. Il est intéressant de
noter que les souris déficientes en périostine ont une corticale osseuse amincie (avec un
mauvais assemblage des fibres de collagène) mais également, des dépôts minéraux
ectopiques (53), suggérant donc un rôle inhibiteur de cette protéine sur la minéralisation
extra-osseuse. Il sera intéressant par la suite de la tester sur nos cultures de ténocytes pour
voir s’il existe un rôle inhibiteur dans ce contexte.

Concernant l’ostéopontine, c’est une glycoprotéine fortement exprimée dans les

tissus minéralisés. Dans l’os, elle est parmi les protéines non collagéniques les plus
abondantes. Elle possède des sites de fixation du calcium et intergit avec les cristaux
d’apatite avec une haute affinité (61). Dans le métabolisme osseux, l’ostéopontine a un rôle
de régulation des ostéoclastes et un rôle d’inhibition de la formation et de la croissance des
cristaux d’apatite in vitro (61). Cependant, il a été montré que selon son degré de
phosphorylation, elle pouvait au contraire augmenter la nucléation de l’apatite in vitro (62).
Dans les cas des calcifications pathologiques, l’ostéopontine aurait également un rôle
notamment au niveau des calcifications artérielles avec un marquage au sein des dépôts et à

98
 Partie II

leur périphérie (63), ou encore au niveau des calcifications rénales ou des valves cardiaques.
Dans les calcifications tendineuses, elle a été identifiée par deux équipes (20,33). Dans le
premier article (20), les auteurs suggèrent que l’ostéopontine pourrait avoir un rôle dans le
déclenchement de la résorption en recrutant des cellules multinucléées ressemblant à des
ostéoclastes. Cette hypothèse est également étayée par l’étude de Takeuchi et al. qui a
montré la présence d’ostéopontine dans des cellules multinucléées présentes autour des
dépôts, ces cellules étant également TRAP positives (33). Nous pourrons donc étudier si elle
peut avoir un rôle direct de régulation de la minéralisation des ténocytes, l’effet sur les
cellules potentiellement résorptrices étant plus difficile à explorer.

Concernant la bursite, nous avons retrouvé cette fois-ci une association avec une
présence moins importante d’activine A et d’ostéoprotégérine. L’Activine A fait partie de la
voie des activines/inhibines. Les activines font partie de la super-famille du TGFβ associant
diverses sous-unités. Les activines ont des fonctions biologiques diverses et sont impliquées
dans la différenciation neuronale, le remodelage osseux, l’hématopoïèse et la reproduction.
Les activines et inhibines sont composées de sous-unités inhibine α, βA et βB.
L’homodimérisation des sous unités βA résulte en la formation d’activine A (58). In vitro, il a
été montré que l’activine A était capable d’inhiber fortement la minéralisation des
ostéoblastes humains (58). Elle était également capable d’inhiber la minéralisation des
cellules musculaires lisses vasculaires. Cette inhibition de la minéralisation était restaurée
par l’adjonction de follistatine, inhibiteur de l’Activine A. L’activine A n’avait pas d’impact sur
l’expression des marqueurs ostéoblastiques au sein des MSC (Runx2, OPN, COL1 et
ostéocalcine) mais réduisait l’expression de TNAP et modifiait la matrice extra-cellulaire
expliquant la réduction de la minéralisation (64). Cet effet inhibiteur de la minéralisation est
également étayé par la présence d’une masse osseuse augmentée chez la souris et le singe
en cas de bloquage de l’Activine A (64). Concernant le rôle de l’activine A dans la régulation
de l’inflammation, des effets pro- ou au contraire anti-inflammatoires ont été rapportés (65).
L’hypothèse retenue est que, selon le stade de l’inflammation, son rôle est différent avec un
rôle promoteur lors de l’initiation de l’inflammation et un rôle inhibiteur une fois
l’inflammation établie. Dans le cadre de la tendinopathie calcifiante, il n’y a aucune donnée

99
 Partie II

la concernant mais on voit que les pistes, à la fois d’action sur la minéralisation et de
régulation de l’inflammation, seront intéressantes à explorer.

L’OPG appartient au système OPG/RANK/RANK-L qui détermine le remodelage et la

masse osseuse. L’OPG est un inhibiteur de la résorption osseuse via son action régulatrice
sur les ostéoclastes en prévenant l’intéraction RANK/RANK-L qui est responsable de la
différenciation et de l’activation des ostéoclastes (66). Les souris déficientes en OPG
présente une ostéoporose et il est intéressant de noter qu’elles présentent également des
cacifications vaculaires, suggérant un rôle inhibiteur de la minéralisation ectopique et donc
protecteur de l’apparition de calcifications vasculaires (67). Ce rôle inhibiteur pourrait être
en partie expliqué par sa capacité d’inhiber l’activité de la phosphatase alcaline (68).
Cependant, les données chez l’homme retrouvent au contraire une association entre taux
d’OPG élevés et apparition de calcifications vasculaires et mortalité par évènements cardio-
vasculaires. L’hypothèse possible est que le taux soit augmenté par mécanisme d’auto-
défense contre le processus de calcification vasculaire (66). Il n’y a pas de donnée sur le rôle
de l’OPG dans les calcifications d’autres natures.

Enfin, concernant le PEDF, bien qu’il n’y ait pas d’association avec les différentes
données cliniques, il était la protéine en quantité la plus abondante parmi celles que nous
avons étudiées. De plus, il joue un rôle important dans la minéralisation osseuse en la
favorisant. Sa présence dans le tendon avait été retrouvée dans une étude protéomique
précédente (4). Par contre, il n’y a que très peu de données sur son rôle au sein du tendon
(69). Son rôle essentiel dans la minéralisation osseuse est illustré par l’apparition d’une
ostéopathie fragilisante en cas de mutation de son gène. Il s’agit d’une ostéogenèse
imparfaite de type VI caractérisée par une anomalie de minéralisation alors que le matrice
collagénique est normale (70,71). Au niveau du cartilage de croissance, son expression par
les chondrocytes est d’autant plus forte que l’on s’approche de la zone d’ossification (72). In
vitro, son rôle pro-minéralisant a été montré sur des cellules souches mésenchymateuses
humaines (57) via une augmentation d’activité de la phosphatase alcaline. L’expression de
phosphatase alcaline est au contraire réduite dans les cellules souches isolées des souris
déficientes en PEDF (73). Il a également un rôle de facteur pro-minéralisant sur les
myoblastes humains entrainant l’apparition de foyers de minéralisation ectopique lors de

100
 Partie II

son injection intra-musculaire chez la souris (74). Compte tenu de ces éléments, nous avons
étudié sa présence au niveau des tendons calcifiés qui a bien été confirmée à la fois au
niveau des dépôts calciques et au niveau des cellules de type chondrocytaire. Cependant, la
stratégie d’adjonction de PEDF recombinant à nos cultures n’a pas eu d’effet significatif sur
la minéralisation obtenue. Après l’avoir dosé dans nos surnageants de culture, nous avons
constaté qu’il était déjà présent à des concentrations de l’ordre de 200 ng/ml. De ce fait, il
est possible que le PEDF rajouté en surplus n’ait eu aucun effet compte tenu de sa présence
déjà abondante dans le milieu. Pour explorer son rôle, la stratégie suivante sera de l’inhiber
tout au long de la culture en milieu ostéogénique. Pour cela, des anticorps neutralisants
pourront être utilisés (75,76) ou des techniques d’ARN interférence.

101
 Conclusion et perspectives

Conclusion et perspectives
Au total, cette étude nous a permis de confirmer l’hypothèse que les calcifications se
forment après une étape de métaplasie de type chondrocytaire au sein du tendon avec une
expression par les cellules d’enzymes impliquées dans la minéralisation (TNAP et ENPP1). In
vitro, les ténocytes extraits de la coiffe était capable dans un milieu de différenciation
ostéogénique de se dédifférencier en cellules minéralisantes avec un phénotype de
chondrocyte hypertrophique. Comme dans les autres phénomènes de minéralisation, nous
avons observé que la phophatase alcaline était indispensable à ce phénomène de
minéralisation. Concernant les facteurs de régulation du phénomène, le screening par
spectrométrie de masse des poudres calciques extraites des patients nous donnent des axes
de recherche à approfondir. Dans un premier temps, nous avons porté notre intérêt sur les
protéines appartenant aux mécanismes de minéralisation dans l’os. Parmi-celles-ci, certaines
sont connues comme étant stimulatrices de la minéralisation comme le PEDF, et d’autres
comme étant inhibitrices comme la périostine ou l’activine A. Concenant le PEDF, son
utilisation dans notre modèle de minéralisation in vitro n’a pas montré d’effet pro-
minéralisant mais nous allons maintenant utiliser une stratégie d’inhibition de son effet par
anticorps bloquants. Pour les autres protéines étudiées, notre modèle de minéralisation 2D
des ténocytes humains in vitro nous permettra de pouvoir rechercher leurs effets
biologiques dans ce contexte puisque celui-ci a une bonne reproductibilité et a permis
d’induire une minéralisation constante.

D’autres mécanismes que ceux impliqués dans la minéralisation osseuse seront

également intéressants à explorer comme l’apoptose ou l’inflammation comme suggéré par
l’analyse en protéomique puisqu’il existe un enrichissement significatif en protéines
appartenant à ces axes. Dans ce cadre, nous pourrons tester l’effet de l’induction de
l’apoptose des ténocytes sur la minéralisation ou l’effet d’une stimulation par des cytokines
pro-inflammatoires.

Un autre axe d’études ultérieures serait la mise en place d’un modèle animal de
tendinopathie calcifiante ce qui manque à l’heure actuelle. Comme indiqué précédemment,
les modèles disponibles concernent le tendon patellaire ou achilléen et engendrent des
ossifications tendineuses, suggérant des mécanismes sous-jacents différents de ceux des

102
 Conclusion et perpectives

calcifications de l’épaule. Pour cela, l’étude des facteurs régulateurs pourrait nous apporter
des pistes intéressantes.

Enfin, il reste à explorer les phénomènes inflammatoires induits par les cristaux au
moment de la résorption. Pour cela, l’effet des cristaux d’apatite humains sur les monocytes-
macrophages ainsi que sur les ténocytes seront intéressants à étudier. Pour le moment les
données disponibles dans la littérature concernent l’effet des cristaux d’apatite de synthèse
mais nous avons pu constater qu’ils étaient différents des cristaux humains de part leur
composition protéique ainsi que leur taille. Nous avons effectué des manipulations
préliminaires dans cette optique. Pour cela, des monocytes CD14+ et des macrophages M-
CSF ont été stimulés pendant 24 heures par des cristaux de patients (Figure 21A et 21B).
Nous avons observé que seuls les macrophages sécrétaient de l’IL-6 et du TNFα et
uniquement après traitement au LPS (100ng/ml) avec une augmentation d’un facteur 2.

Figure 21. A. Effets in vitro des cristaux d’apatite humains sur la production d’IL-6 et de TNFα par des
macrophages humains différenciés par le M-CSF. Dosage des cytokines par ELISA après 24 heures de
stimulation par les cristaux (1 mg/ml) en présence ou non de LPS (100 ng/ml). B. Effets in vitro des
cristaux d’apatite humains sur la production d’IL-6 par des monocytes humains CD14+ après 24
heures de stimulation (1 mg/ml) en présence ou non de LPS (100 ng/ml). M MCSF : macrophages
différenciés en M-CSF.

103
 Conclusion et perpectives

Par ailleurs, pour l’étude des effets pro-inflammatoires des cristaux, un modèle de
« air pouch » sera adéquat puiqu’il a été largement utilisé pour explorer les phénomènes
inflammatoires induits par les cristaux d’acide urique dans la goutte. Ici aussi, une première
expérimentation a été réalisée avec l’injection de cristaux d’apatite humains (2 mg/ml), de
cristaux de synthèse (2 mg/ml) ou de PBS pour le groupe contrôle. Pour permettre une
injection facile des cristaux en suspension, ils ont été soniqués. Après 6 heures ou 24 heures,
les souris ont été euthanasiées et les exsudats de la poche ainsi que les membranes ont été
recueillies (pour histologie et extraction d’ARN). Les résultats n’ont pas encore été analysés
en dehors d’une première analyse en histologie à 24 heures. Nous avons observé que dans
les groupes apatite, l’épaisseur de la membrane était épaissie mais n’avons pas encore
étudiée les caractéristiques de l’infiltrat inflammatoire ni les cytokines sur-exprimées dans la
membrane.

Figure 22. A. Schéma de l’expérimentation « air pouch » avec injection des cristaux d’hydroxyapatite
(HA) à J7 après 2 injections d’air à J0 et J3 pour créer la poche. B. image de « air pouch » au moment
de la dissection. C. Image en histologie des premières coupes montrant un épaississement de la
membrane de la poche dans le groupe injectée avec des cristaux d’apatite humains (hAP) par rapport
au groupe contrôle (PBS). D. Analyse de l’épaisseur des membranes 24 heures après l’injection. sHA :
cristaux d’hydroxyapatite de synthése, hAp : cristaux d’apatite humains.

104
 Conclusion et perpectives

En conclusion, cette thèse nous a permis d’avancer dans la compréhension de la

tendinopathie calcifiante et ouvre de nouvelles pistes de recherche en ce qui concerne les
mécanismes régulateurs de la pathologie.

105
 Publications et communications

Publications et communications

Publications

C Darrieutort-Laffite, P Arnolfo, T Garraud, A Adrait, Y Couté, G Louarn, V Trichet, P Layrolle,

B Le Goff, F Blanchard. Rotator cuff tenocytes differentiate into hypertrophic chondrocyte-
like cells to produce calcium deposits in an alkaline phosphatase-dependent manner. Under
review Journal of Clinical Medicine.

Communications
Internationales

Congrès EULAR 2017 (European League Against Rheumatism), Madrid, 14-17 Juin:
Histological characterization of rotator cuff calcific tendinopathy. C Darrieutort-Laffite, A
Najm, T Garraud, P Layrolle, F Blanchard, B Le Goff. Communication orale.

2017 ACR/ARHP Annual Meeting, San Diego, CA, November 3-8: Rotator cuff calcific
tendinopathy: chondrocyte-like cells surrounding calcific deposits express TNAP and ENPP1,
two key enzymes of the mineralization process. C Darrieutort-Laffite, A Najm, T Garraud, P
Layrolle, F Blanchard, B Le Goff. Communication affichée.

2018 ACR/ARHP Annual Meeting, Chicago, CA, October 19-24: Tenocytes extracted from
rotator cuff tendons are able to induce mineral deposition in vitro and express genes related
to a chondrocyte differentiation. C Darrieutort-Laffite, P Arnolfo, B Le Goff, F Blanchard.
Communication affichée.

Nationales

Congrès 2017 de la Société Française de Rhumatologie, Décembre 2017 : Tendinopathies

calcifiantes de la coiffe des rotateurs : les cellules chondrocytaires présentes autour des

106
 Publications et communications

dépôts sont-elles responsables de la minéralisation au sein du tendon ? C Darrieutort-Laffite,

A Najm, T Garraud, P Layrolle, F Blanchard, B Le Goff. Communication orale.

19ème Congrès de la Société Française de Biologie des Tissus Minéralisés, Lyon, 18-20 mai
2017 : Caractérisation histologique et étude de la composition minérale et protéique de
calcifications de la coiffe des rotateurs. C Darrieutort-Laffite, A Najm, T Garraud, P Layrolle,
Guy Louarn, Y Couté, F Blanchard, B Le Goff. Communication affichée.

Congrès 2018 de la Société Française de Rhumatologie, Décembre 2018 : Les ténocytes issus
de tendons de la coiffe des rotaeurs sont capables d’induire une minéralisation in vitro via
une différenciation de type chondrocyte hypertrophique. C Darrieutort-Laffite, P Arnolfo, B
Le Goff, F Blanchard. Poster commenté.

107
 Financements

Financements

- Bourse de la Société Française de Rhumatologie pour financement d’un projet

individuel « Etude du Pigment Epithelium-Derived Factor (PEDF) dans les
tendinopathies de la coiffe des rotateurs : expression et effet sur la minéralisation »:
20 000 €

108
 Liste des figures

Liste des figures

Figure 1. Anatomie de l’épaule et des muscles de la coiffe des rotateurs. On peut voir qu’il
existe une continuité entre les tendons qui coiffent la tête humérale. La bourse sous-
acromiale non représentée se situe entre les tendons (en-dessous) et le ligament acromio-
coracoïdien et l’acromion (au-dessus) et permet le glissement des tendons lors des
mouvements…………………………………………………………………………………………..…………………………… 7

Figure 2. Schéma de l’organisation des fibres tendineuses au sein des différentes unités
constituant l’ensemble du corps tendineux. Schéma issu de la référence (2)……………………… 8

Figure 3. Voies de différenciation de l’ostéoblaste, du chondrocyte et du ténocyte à partir de

la cellule souche mésenchymateuse et facteurs de transcription impliqués. SCX : Scléraxis ;
MKX : Mohawk Homeobox ; ALP : phosphatase alcaline ; COL1 : collagène de type I; BSP :
Bone SialoProtein ; OPN : ostéopontine ; COMP : Cartilage Oligomeric Matrix Protein ; COL2 :
collagène de type II, ACAN : aggrécane ; COL3 : Collagène de type III ; COL10 : Collagène de
type X………………………………………………………………………………………………………………………………… 10

Figure 4. Rôle de Mohawk Homeobox (Mkx) dans la différenciation et le maintien du

phénotype ténocytaire………………………………………………………………………………………………………. 11

Figure 5. A: Représentation des dépôts calciques au sein des tendons de la coiffe. B:

Radiographie de face d’un patient atteint d’une tendinopathie calcifiante de la coiffe. On voit
une image dense et homogène de tonalité calcique située dans l’espace sous-acromial qui se
projette en regard de l’insertion du supra-épineux……………………………………………………………. 13

Figure 6. Résumé de la stratégie de prise en charge thérapeutique de la tendinopathie

calcifiante de l’épaule………………………………………………………………………………………………………… 20

Figure 7. Synthèse des objectifs de la thèse à partir des différents échantillons humains
disponibles. qPCR : quantitative polymerase chain reaction………………………………………………. 22

Figure 8. A: Aspect d’une calcification de patient (image représentative) en microscopie

électronique à balayage. B: Aspect en microscopie électronique de l’apatite de synthèse... 73

109
 Listes des figures

Figure 9. Schéma de synthèse des données obtenues dans la première partie en histologie,
immunohistochimie, in vitro et en spectrométrie de masse. ATP : adénosine triphosphate,
PPi : pyrophosphate inorganique, Pi : phosphate inorganique…………………………………………… 79

Figure 10. Classification radiographique des calcifications selon la société française

d’arthroscopie : type A= dense, homogène à contours nets et type B : dense, cloisonnée à
contours nets…………………………………………………………………………………………………………………….. 85

Figure 11. Aspects des calcifications en échographie………………………………………………………… 85

Figure 12. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction du type de calcification
en radiographie (type A et type B illustrés en figure 10). Protéines exprimées pg/µg de
protéines totales……………………………………………………………………………………………………………….. 89

Figure 13. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction du type de calcification
en échographie (aspects illustrés en figure 11). Protéines exprimées pg/µg de protéines
totales. *=p<0,05………………………………………………………………………………………………………….…… 90

Figure 14. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction de la présence ou non
d’un cône d’ombre en échographie et de la consistance de la calcification perçue par
l’opérateur lors du geste de ponction-fragmentation-lavage. Protéines exprimées pg/µg de
protéines totales. *=p<0,05……………………………………………………………………………………………….. 91

Figure 15. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction de la présence ou non
d’une bursite en échographie. Protéines exprimées pg/µg de protéines totales. *=p<0,05..92

Figure 16. Quantité des différentes protéines d’intérêt en fonction du résultat du lavage et
de l’évolution clinique. L’échec au traitement était défini par la persistance de douleurs
intenses ou la nécessité d’un deuxième geste sur la calcification que ce soit un deuxième
lavage ou une chirurgie. B. Corrélation entre le DASH à M3 et le taux de périostine dans le
groupe corticoïdes. Protéines exprimées pg/µg de protéines totales. *=p<0,05 ……….………. 93

Figure 17. Marquage par anticorps anti-PEDF à gauche d’un tendon calcifié (image
représentative). Flèche : dépôt calcique (DC). Après révélation, les structures marquées sont
de couleur marron. MF : métaplasie fibrocartilagineuse……………………………………………………. 94

110
 Listes des figures

Figure 18. Marquage par anticorps anti-PEDF d’un tendon calcifié (images représentatives
centrées sur la zone de type fibrocartilagineuse autour des dépôts). Après révélation, les
structures marquées sont de couleur marron. Flèches noires: cellules de type
chondrocytaire ; flèches rouges : ténocytes.DC : dépôts calciques, MF : métaplasie
fibrocartilagineuse…………………………………………………………………………………………………………….. 95

Figure 19. Evaluation de la minéralisation des ténocytes humains induite en milieu contrôle
(CT) et ostéogénique (MO) en présence de PEDF à des concentrations croissantes. PEDF en
ng/ml. Quantification du dépôt après solubilisation du rouge alizarine à l’acide formique et
lecture de la densité optique à 450 nm……………………………………………………………………………… 96

Figure 20. A : Quantification par ELISA du PEDF dans les surnageants de culture au cours des
21 jours. B : Expression du PEDF au niveau génique quantifié par qPCR à J21. CT = milieu
contrôle ; MO = milieu ostéogénique. N=3. *=p<0,05……………………………………………………….. 97

Figure 21. A. Effets in vitro des cristaux d’apatite humains sur la production d’IL-6 et de TNFα
par des macrophages humains différenciés par le M-CSF. Dosage des cytokines par ELISA
après 24 heures de stimulation par les cristaux (1 mg/ml) en présence ou non de LPS (100
ng/ml). B. Effets in vitro des cristaux d’apatite humains sur la production d’IL-6 par des
monocytes humains CD14+ après 24 heures de stimulation (1 mg/ml) en présence ou non de
LPS (100 ng/ml). M MCSF : macrophages différenciés en M-CSF……………………………………… 103

Figure 22. A. Schéma de l’expérimentation « air pouch » avec injection des cristaux
d’hydroxyapatite (HA) à J7 après 2 injections d’air à J0 et J3 pour créer la poche. B. image de
« air pouch » au moment de la dissection. C. Image en histologie des premières coupes
montrant un épaississement de la membrane de la poche dans le groupe injectée avec des
cristaux d’apatite humains (hAP) par rapport au groupe contrôle (PBS). D. Analyse de
l’épaisseur des membranes 24 heures après l’injection. sHA : cristaux d’hydroxyapatite de
synthése, hAp : cristaux d’apatite humains……………………………………………………………………… 104

111
 Liste des tableaux

Liste des tableaux

Tableau 1. Résultats sélectionnés de l’analyse des processus biologiques selon la Gene
Ontology (GO)……………………………………………………………………………………………………………………. 74

Tableau 2. Résultats sélectionnés de l’analyse des composants cellulaires selon la Gene

Ontology (GO)……………………………………………………………………………………………………………………. 76

Tableau 3. Protocole d’extraction des protéines associées aux cristaux d’apatite au sein des
calcifications de patients……………………………………………………………………………………………………. 83

Tableau 4. Principales caractéristiques des patients dont les calcifications ont été étudiées.
EVA: Echelle visuelle Analogique; questionnaire DASH: Disabilities of the Arm, Shoulder and
Hand. Les aspects radiographiques et échographiques sont illustrés dans les figures 10 et
11………………………………………………………………………………………………………………………………………. 84

Tableau 5. Moyenne des concentrations des protéines d’intérêt rapportée à la quantité

totales de protéines présentes dans les échantillons. N=66 pour toutes les protéines sauf
BMP-2 (N=5)………………………………………………………………………………………………………………………. 88

112
 Annexes

Annexes
A. Annexe 1

113
Annexes

114
Annexes

115
Annexes

116
Annexes

117
Annexes

118
 Annexes

B. Annexe 2

119
Annexes

120
Annexes

121
Annexes

122
Annexes

123
Annexes

124
 Annexes

C. Annexe 3

125
Annexes

126
Annexes

127
Annexes

128
Annexes

129
Annexes

130
Annexes

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Titre: Etude de la composition et des mécanismes de constitution des dépôts
calciques dans la tendinopathie calcifiante de la coiffe des rotateurs.
Mots clés : tendinopathie calcifiante, apatite, phosphatase alcaline, chondrocytes
hypertrophiques, PEDF
Résumé : La tendinopathie calcifiante est une ceci de manière dépendante de la
cause fréquente de douleurs d’épaule. Elle est phosphatase alcaline. Ces cellules sur-
due à des dépôts d’apatite au sein des exprimaient alors des marqueurs spécifiques
tendons de la coiffe. Sa physiopathologie est des chondrocytes hypertophiques (Collagène
actuellement peu connue. de type X, MMP13). L’analyse de poudres
L’objectif de cette thèse était de déterminer les calciques prélévées sur des patients
mécanismes impliqués dans la constitution souffrant de tendinopathie calcifiante a
des dépôts et les facteurs régulant cette montré un enrichissement significatif en
minéralisation pathologique. protéines associées au développement de
L’étude de tondons calcifiés prélevés sur l’os et du cartilage. Parmi celles-ci, nous
cadavres a montré la présence d’une avons identifié le Pigment Epithelium Derived
métaplasie fibro-cartilagineuse autour des Factor (PEDF), connue pour favoriser la
dépôts contenant des cellules de type minéralisation osseuse. Bien qu’il ait été
chondrocytaire produisant de la phosphatase identifié dans les poudres calciques et les
alcaline et de l’ENPP1, deux enzymes clé de cellules chondrocytaires présentes autour
la minéralisation. In vitro, les ténocytes des dépôts, il n’a pas montré d’effet pro-
humains issues de la coiffe des rotateurs ont minéralisant in vitro sur les ténocytes
la capacité de produire des dépôts d’apatite et humains.

Title: Study of the composition of the calcific deposits and mechanisms leading to
them in the calcific tendonitis of the rotator cuff.
Keywords: calcific tendonitis, apatite, alkaline phosphatase, hypertrophic chondrocytes, PEDF

Abstract: Calcific tendonitis is a frequent phosphatase-dependent manner. These cells

cause of shoulder pain. It is due to apatite expressed type X COLLAGEN and MMP13,
deposits within the rotator cuff tendons. Its hypertrophic chondrocytes markers. Finally,
cause is currently poorly known. analysis of calcific powders extracted from
The objectives of this thesis were to better patients suffering from calcific tendonitis
characterize the cells and mechanisms showed a significant enrichment of proteins
involved in depositing apatite crystals in human involved in bone and cartilage development.
tendons. Histologic sections of cadaveric Among them, we identified Pigment Epithelium
calcified tendons showed that calcifications Derived Factor (PEDF). PEDF is able to
were amorphous areas surrounded by a promote bone mineralization. While it was
fibrocartilaginous metaplasia containing identified in calcific powders and chondrocyte-
hypertrophic chondrocyte-like cells that like cells surrounding the deposits, it was not
expressed alkaline phosphatase and ENPP1, able to increase the mineralisation of human
two key enzymes of the mineralization process. tenocytes in vitro.
In vitro, tenocytes extracted from human rotator
cuff were able to mineralize in an alkaline