La Réplication

Chapitre II

1
Le «Dogme Central Simplifié» de
la Biologie Moléculaire

Transcription Translation
Réplication ADN ARN Protéine
Rétro-Transcription

2
 Objectifs du cours
• Comprendre la réplication chez les procaryotes et les eucaryotes

• Comprendre et décrire les étapes clés de la réplication de l’ADN

• Comprendre la structure et la fonction des ADN polymérases et des

Télomèrases

• Comprendre la structure des Télomères des eucaryotes

• Comprendre la réplication chez les rétroviruses

• Décrire une technique conventionnelle d’amplification du matériel

génétique (ADN) au Laboratoire.

3
Procaryotes versus Eucaryotes

Procaryote Eucaryote
Pas de Noyau Existence d’un Noyau

Division cellulaire par Division cellulaire par mitose ou

scissiparité méiose

Pas d’organites intracellulaires Plusieurs organites intracellulaires

Pas de cytosquelette Cytosquelette (actines et

microtubules, etc…)

4
Procaryotes vs. Eucaryotes: En Image

5
 Définition
• Reproduction ou synthèse de l’ADN à l’identique au cours du cycle
cellulaire

• Le dédoublement de l’ADN lors de la division cellulaire permet à

chaque cellule fille de recevoir un génome complet dans son noyau
(donc aucune information n’est perdu)

• La réplication se produit à la phase S (milieu du cycle cellulaire: entre

G1 et G2) grâce à l’action d’enzymes appelés ADN polymérases.

• Polymérisation: synthèse de brin d’acides nucléiques

• La réplication doit respecter deux règles:

– La totalité du génome doit être reproduit à chaque division
cellulaire
– Chaque molécule d’ADN n’est répliquée qu’une seule fois par cycle
cellulaire
6
Cycle Cellulaire Simplifié

7
Réplication en Image

Les deux brins de la double

hélice parentale se séparent
et chacun spécifie un
nouveau brin en suivant la
règle de la complémentarité
des bases: A-T ou C-G

8
La réplication est semi-conservative

Historique: Démontrée 1958 par Meselson et Stahl:

- Les deux brins parentaux servent de modèle pour la synthèse du nouveau brin
- Les deux brins néoformés se séparent à chaque cycle
- A la première réplication: un brin de chaque double hélice provient de la cellule mère (50%)
- A la deuxième réplication: on a deux brins d’ADN de la cellule mère sur les 4 double hélices (50%)
 Synthèse d’un nouveau brin d’ADN
A B A B
• Synthèse de la nouvelle copie de l’ADN est
faite dans le sens 5’ vers 3’
– Les dNTPs sont ajoutés à l’extrémité
3’OH du dernier nucléotide de
l’amorce
– Le choix parmi les 4 dNTPs (dATPs,
dTTPs, dCTPs, dGTPs) est basé sur la
complémentarité avec les bases du
brin matriciel

• La lecture du brin matriciel se fait selon une

directionnalité 3’ vers 5’ (antiparallèle à la
synthèse du nouveau brin)

• Hybridation correcte de l’amorce à la

C matrice d’ADN est une étape nécessaire
amorcer: commencer

• Formation de liaison phosphodiester entre

le dNTP et l’amorce en voie d’élongation

Légende: • Formation de pyrophosphates (PPi) qui

A: amorce résultent de l’hydrolyse de la fonction
B: matrice d’ADN triphosphate.
10
C: Direction de l’élongation
 Les ADN polymérases
• Enzymes responsables de la polymérisation des nucléotides lors de la réplication de
l’ADN: sont des catalyseurs de la synthèses de l’ADN

• ADN-dépendantes: leur fonction dépend de la présence d’une matrice d’ADN pour

synthétiser un nouveau brin (ne peuvent pas effectuer une synthèse de novo)

• Leur activités dépendent de la présence:

- Une matrice d’ADN
- Une amorce (petit fragment d’ADN) avec une extrémité 3’OH libre
- Des substrats (Desoxyribonucléotides 5’ triphosphates: dNTPs)
- Des ions magnésiums (Mg2+) pour stabiliser le complexe ADN-protéines

• Les types d’ADN polymérases:

- Procaryotes: 3 types d’ADN polymérases: ADN Pol I, II et III
- Eucaryotes: 5 types d’ADN polymérases: ADN Pol α, β, δ, ε et γ

11
 Les activités des ADN polymérases
Les ADN polymérases ont deux activités principales lors de la réplication de l’ADN:

1. Activité polymérasique 5’ vers 3’:

synthèse/extension du nouveau brin d’ADN

2. Activité exo-nucléasique: dégradation de l’une des

extrémités du brin synthétisé
2.1. Exonucléase 3’ vers 5’: Hydrolyse le 3’ OH
du dernier nucléotide du brin néoformé si celui-ci
ne s’apparie pas correctement avec le nucléotide
complémentaire du brin matriciel. Elle assure une
fonction d’édition: Proofreading
2.2. Exonucléase 5’ vers 3’: Hydrolyse
l’extrémité 5’OH lors de la jonction des
segments d’ADN synthétisés sur le brin retardé

12
 Les ADN polymérases des procaryotes
Les procaryotes ont 3 types de polymérases dont deux sont principalement utilisées
lors de la réplication:

• Les ADN polymérases I (Pol I ): Elles sont nombreuses ~400 molécules/cellule.

Pol I est impliquée dans la réparation et la réplication de l’ADN. Pol I n’est pas assez
processive (10-20 nt/événement) et elle se dissocie de l’ADN matriciel après ajout de
~20 nucléotides. Elle possède:
- une activité polymérasique 5’-3’: responsable de la synthèse de fragments
courts d’ADN pour combler les brèches laissées par Pol III lors de la réplication .
- une activité exonucléasique 5’-3’: pour la dégradation des amorces d’ARN
- une activité exonucléasique 3’-5’: pour la relecture lors de la réparation

• Les ADN polymérases III (Pol III): Sont des complexes de protéines (multimères)
responsables de la synthèse de fragments longs d’ADN lors de la réplication. Pol lll a
une vitesse de synthèse rapide (˜1000 nt insérées/s). La molécule est aussi très
processive (105 nt/événement). C’est la polymérase majeure des bactéries. Elle
possède:
- une activité polymérasique 5’-3’
- une activité exonucléasique 3’-5’ 13
 Structure de Pol III
• Pol III est une holoenzyme formée de 3 sous unités:
- La sous unité α (alpha): activité polymérasique 5’-3’
- La sous unité ε (epsilon): activité exonucléasique 3’-5’
- La sous unité θ (thêta): maintien la structure du complexe

• Pol III fait partie du réplisome qui est un multimère

- Deux molécules de Pol III
- Deux unités Ϯ (tau): servent à doubler/dimériser Pol III
- Un complexe γ (gamma)
. Une unité γ
. des sous-unités δ (delta) et δ’ (delta prime)
. Une unité χ (Khi)
. Une unité ψ (Psi)
- Deux unités β (beta): utilisées comme pince (clamp) à ADN

14
 Mécanismes d’édition/proofreading par Pol III

Position catalytique Position d’édition

Absence d’erreur lors de Présence d’erreur lors de
l’incorporation du l’incorporation du
nucléotide sur le bout 3’ nucléotide sur le bout 3’

Exemple: Le taux d’erreur de - Dégradation du

Pol III chez E. Coli est de 1 bp nucléotide mal apparié
pour chaque 107 nt ajoutés et la réplication continue
15
Réplication: Les protéines majeures
La réplication se fait en trois étapes majeures: Initiation, elongation, et
terminaison
1. Les Hélicases: Déroulent la double hélice en cassant les liaisons
hydrogènes entre les deux brins d’ADN en utilisant l’énergie
d’hydrolyse de l’ATP ou du GTP
2. Les Protéines SSB (single Strand Binding Protein): se fixent sur
l’ADN simple brin pour l’empêcher de se réenrouler lors de la
réplication
3. La Primase: ARN polymérase ADN-dépendante responsable de
la synthèse de l’amorce d’ARN
4. Les Topo-isomérases: régulent la structure topologique de
l’ADN en démêlant les nœuds (surenroulement) d’ADN
5. Les ADN ligases: reconstituent la liaison phosphodiester entre
deus nucléotides juxtaposés sur un brin d’ADN. Elles lient les
Fragments d’Okazaki synthétisés par Pol I lors de la réplication.
Cette réaction a besoin d’une consommation d’ATP.
 Les séquences de reconnaissance
chez les procaryotes
Origines et terminaisons chez E. Coli
• Origine de réplication: site d’initiation
d’environ 240 bp. Elle est constituée de
séquences répétées flanquées de
séquences riche en A et T. La réplication
commence à ce point dans les deux sens
(bidirectionnelle) jusqu’à la fin.

• Le Terminateur: site de terminaison. Il est

plus long et est composé de séquences
quasi identiques de 23bp

• Protéines de reconnaissance:
reconnaissent les sites d’initiation et de
terminaison.
Etapes de la réplication procaryotes (1)
A. Initiation: Elle aboutie à l’ouverture de la double hélice et à la formation
de la fourche de réplication
• Ouverture de la double hélice sur 40 bp suite à
la reconnaissance de l’origine de réplication

Bulle de replication • Les Topo-isomerases relâchent les contraintes

topologiques qui surviennent lors de
l’ouverture de la double hélice

• Formation d’une bulle/oeil de réplication et de

deux fourches de réplication

• Une fourche de réplication est l’endroit où

l’hélice est déroulée et où les nouveaux brins
se développent. Il y a une fourche de
réplication à chaque coté d’une bulle de
réplication

• Séparation des deux brins par les helicases

• Stabilisation de chaque brin par les protéines

SSB pour les empêcher de se ré-enrouler.
 Etapes de la réplication procaryotes (2)
B.1. Extension du brin direct/précoce/continue (Leading Strand):

• Elle se fait dans le sens du déplacement

de la fourche

• L’amorce à ARN (rouge; 10-50nt) est

synthétisée et mise en place au niveau
de l’origine de réplication par les
Primases

• Pol III est responsable de l’élongation du

brin précoce en ajoutant des dNTPs à
l’extremité 3’OH libre de l’amorce
Parental DNA duplex: ADN matriciel
Daughter duplex: ADN fille • Formation d’une nouvelle double hélice
Point of joining: Point de junction
entre le brin matriciel et le nouveau brin
Leading strand: brin direct/précoce/continue
Lagging strand: brin indirect/retardé/discontinue synthétisé.
Short RNA primer: Amorce à ARN
Direction of fork movement: Direction du
mouvement de la fourche
Etapes de la réplication procaryotes (3)
B.2. Extension du brin indirect/retardé/discontinue (Lagging Strand):
• Elle se fait dans le sens inverse du
déplacement de la fourche
• La synthèse du brin retardé se fait de manière
discontinue par petit fragments à chaque fois
que le brin matriciel est détaché du brin
précoce
• Ces fragments sont appelés fragments
d’Okazaki. Pour former chaque segment il y a
synthèse d’amorces ARN assez rapprochées sur
le brin parental par les Primases
• Les amorces ARNs vont être détruites par les
RNAses qui sont des enzymes qui ont une
activité ribonucléasique
Parental DNA duplex: ADN matriciel • Pol I intervient en comblant les brèches
Daughter duplex: ADN fille • L’ ADN Ligase va ensuite lier la liaison
Point of joining: Point de junction phosphodiester entre les bouts 5’ du premier
Leading strand: brin direct/précoce/continue fragments et 3’ du second fragment
Lagging strand: brin indirect/retardé/discontinue • Formation d’une nouvelle double hélice.
Short RNA primer: Amorce à ARN
Direction of fork movement: Direction du
mouvement de la fourche
 Résumé de l’Extension en Image

DNA unzips: ADN deroulé/ouvert

Continuous: Continue
Discontinuous: Discontinue
Leading strand: brin direct/précoce/continue
Lagging strand: brin indirect/retardé/discontinue
Okazaki fragment: Fragment d’Okazaki
DNA replication fork: La fourche de replication de l’ ADN
21
Etapes de la réplication procaryotes (4)
C. Terminaison
• Mécanismes n’est pas très bien connu
• Signal ou régions de terminaisons (Ter) au niveau de l’ADN
• Sont des sites de fixation de protéines tel que Tus
• Tus reconnait ces régions et met fin à la réplication.
 Réplication chez les Eucaryotes
Mécanismes de réplication similaires à ceux des procaryotes…mais les eucaryotes utilisent
les ADN polymérases différentes

Pol α: Primase ou ARN Pol. Elle synthétise les amorces ARN

Pol β: Réparation de l’ADN. Elle correspond au Pol I chez les bactéries

Pol δ: Réplication du brin précoce/direct/continue et des fragments d’Okazaki avec l’aide de

Pol ε et du PCNA. C’est la polymérase principale des eucaryotes (correspond à Pol III)

Pol ε: Réplication et Réparation de l’ADN. Responsable de la synthèse des bouts d’ADN

(Télomères)

Pol γ: Réplication de l’ADN mitochondrial

PCNA: Proliferating cell nuclear antigen. PCNA est un trimer qui augmente la processivité
de Pol δ. Elle a une forme de collier coulissant qui s’associe à Pol δ donc correspond aux
sous unités β (clamp) de Pol III

Structure du PCNA
Réplication chez les Eucaryotes (2)
Problème avec les fragments d’Okazaki

Le brin retardé n’est pas

synthétisé jusqu'à la fin du brin
parental (3’ overhang)

La fourche de réplication
s’approchant de la fin du
chromosome Le brin précoce est
synthétisé jusqu'à la fin
du brin parental

…Donc sans un mécanisme de protection endogène/naturelle, les

chromosomes se raccourciront à chaque cycle de réplication de l’ADN.
 Les Télomères
• Les Télomères sont des séquences répétitives non codantes à l’extrémité des
chromosomes: Bonnets
• 5’-TTAGGG-3’ répétée quelques centaines de fois avant le 3’ OH final (chez l’homme)
• Rôles principales:
- Maintenir l’intégrité de l’information génétique: la taille des chromosomes diminue
à chaque division cellulaire. Si les extrémités des chromosomes étaient libres il y
aurait une perte des chromosomes.
Structure du
- Protéger l’ADN contre l’effet des exo-nucléases
télomère en boucle
- Inhiber la fusion des chromosomes au niveau des extrémités

• Télomèrases: ADN polymérases qui synthétisent les télomères

 Les Télomèrases
• Ribonucléoprotéines formées de deux unités:
1. Unité d’ARN (TERC: Telomerase RNA
component) sert de matrice pour la
formation des telomères
2. Unité protéique (TERT: Telomerase
Reverse Transcriptase) qui a une activité de
transcriptase inverse ou ADN polymérase
ARN-dépendente

• L’ extrémité 5’ terminal du TERC sert de

modèle/matrice pour le TERT lors de la
synthèse des unités de répétitions

• Formation des ces unités de répétitions

permet d’allonger le bout 3’OH du brin
modèle (neo-synthetisé)

• Cet allongement sert à la fixation d’une

nouvelle amorce pour continuer la
réplication avec l’aide de l’ADN polymérase
 Réplication chez les rétrovirus
• Les rétrovirus sont des virus à ARN dont le génome est intégré dans le
génome du sujet infecté sous la forme ADN au cours du cycle viral (Virus
du SIDA)

• Passage de l’ARN simple brin à l’ADN double brin se fait grâce à 3

enzymes:
- ADN polymérase ARN dépendante (Transcriptase inverse)
- RNAse
- ADN polymérase ADN dépendante
Réplication de L’ADN au Laboratoire
• Polymerase Chain Reaction (PCR): Réaction en Chaine par Polymérase est une
technique de réplication ciblée in vitro

• Elle permet d’obtenir à partir d’un échantillon particulier contenant très peu d’ADN, une
quantité importante d’un fragment d’ADN de taille bien définie

• Elle a été décrite par Karry Mullis en 1985 (Prix Nobel de Chimie en1993)

• Le tube qui contient l’échantillon est placé dans un appareil appelé ThermoCycler.
Cette machine permet de faire changer la température pendant des cycles bien
déterminés

• Les réactifs/molécules nécessaires pour faire une PCR sont:

• L’ADN à amplifier
• Les amorces
• L’ADN polymérase (Thermophilus aquaticus (Taq) qui est thermorésistante)
• Les 4 desoxyribonucleotides (dNTPs)

• Les étapes de la PCR:

- Dénaturation
- Hybridation/Appariement des amorces
- Elongation
Les Etapes de la PCR en Image

Thermocycler 30
 Résumé
• La réplication consiste à la duplication du génome

• La réplication est semi-conservative

• La synthèse du nouveau brin se fait dans le sens 5’ vers 3’

• La réplication est initiée a une séquence spécifique appelé Origine

• La réplication est bidirectionnelle (en général) aboutissant à la formation de deux

fourches de réplications qui se déplacent dans le sens opposé

• L’ADN polymérase ne peu pas dérouler les brins de l’hélice, ni initier la synthèse d’un
nouveau brin sans l’aide d’autres protéines majeures

• A la fourche de réplication, un brin est étendue continuellement et l’autre brin sera

synthétisé de manière discontinue (fragments d’Okazaki et amorces à ARN)

31
• La PCR est la technique de base pour amplifier l’ADN au laboratoire.
Questions?

32