AFLP : UNE NOUVELLE TECHNIQUE D'EMPREINTE ADN

Pieter Vos*, Rene Hogers, Marjo Bleeker, Martin Reijans, Theo van de Lee, Miranda Homes,
Adrie Frijters, Jerina Pot, Johan Peleman, Martin Kuiper and Marc Zabeau
ABSTRAIT

Une nouvelle technique d’empreinte ADN appelée AFLP est décrit. La technique AFLP est basée sur la

amplification PCR sélective de fragments de restriction à partir d'une digestion totale de l'ADN
génomique. La technique comporte trois étapes: (i) la restriction de l’ADN et

ligature d'adaptateurs d'oligonucléotides, (ii) sélectif

amplification d'ensembles de fragments de restriction, et (iii)

analyse sur gel des fragments amplifiés. L’amplification par PCR des fragments de restriction est
obtenue en utilisant le

adaptateur et séquence de sites de restriction en tant que sites cibles pour

amorce recuit. L'amplification sélective est

réalisé par l’utilisation d’amorces qui s’étendent dans la

fragments de restriction, n'amplifiant que ces fragments

dans lequel les extensions d'amorce correspondent aux nucléotides

encadrant les sites de restriction. En utilisant cette méthode, les ensembles

des fragments de restriction peuvent être visualisés par PCR

sans connaissance de la séquence nucléotidique. le

Cette méthode permet la co-amplification spécifique de

nombre de fragments de restriction. Le nombre de

fragments qui peuvent être analysés simultanément, cependant, dépend de la résolution de la

détection

système. Typiquement 50-100 fragments de restriction sont

amplifié et détecté sur du Polyacrylamide dénaturant

des gels. La technique AFLP fournit un roman et très

puissante technique d'empreinte génétique pour les ADN de tout

origine ou complexité.
INTRODUCTION

Les empreintes génétiques impliquent l'affichage d'un ensemble d'ADN

des fragments d'un échantillon d'ADN spécifique. Une variété d'ADN

techniques de prise d'empreintes digitales est actuellement disponible (1-11), la plupart des

qui utilisent la PCR pour la détection de fragments. Le choix dont

technique d'empreinte digitale à utiliser, dépend de l'application

par exemple. Typage de l’ADN, cartographie des marqueurs d’ADN et organisme sous

enquête par exemple procaryotes, plantes, animaux, humains. Idéalement,

une technique d'empreinte digitale ne devrait nécessiter aucun investissement préalable en termes
d'analyse de séquence, de synthèse d'amorces ou de caractérisation de sondes ADN. Un certain
nombre de méthodes d’empreinte digitale répondant à ces exigences ont été développées au cours
des dernières années, notamment l’ADN polymorphe amplifié de manière aléatoire (RAPD; 8),
l’empreinte digitale d’amplification de l’ADN (DAF; 9) et la PCR amorcée de façon arbitraire (AP-PCR;
10,11). . Ces méthodes sont toutes basées sur l’amplification de fragments d’ADN génomique
aléatoires par des amorces de PCR choisies arbitrairement. Des motifs de fragments d’ADN peuvent
être générés de ADN sans connaissance préalable de la séquence. Les motifs générés dépendent de
la séquence des amorces de PCR et de la nature de l'ADN matrice. La PCR est effectuée à des
températures de recuit basses pour permettre aux amorces de se recoller en plusieurs loci sur l'ADN.
Des fragments d'ADN sont générés lorsque les sites de liaison de l'amorce se trouvent dans une
résistance permettant une amplification. En principe, une seule amorce suffit pour générer des
motifs de bande. Ces nouvelles méthodes d’empreinte reposant sur la PCR présentent l’inconvénient
majeur d’être très sensibles aux conditions de réaction, à la qualité de l’ADN et aux profils de
température de la PCR (12-16), ce qui limite leur application. Cet article décrit une nouvelle
technique d'empreinte ADN, appelée AFLP. La technique AFLP est basée sur la détection de
fragments de restriction génomique par amplification PCR et peut être utilisée pour des ADN de
toute origine ou complexité. Les empreintes digitales sont produites sans connaissance préalable de
la séquence à l'aide d'un ensemble limité d'amorces génériques. Le nombre de fragments détectés
dans un seul

La réaction peut être «réglée» en sélectionnant des jeux d’amorces spécifiques. le

La technique AFLP est robuste et fiable car des conditions de réaction rigoureuses sont utilisées pour
le recuit des amorces: la fiabilité de la technique RFLP (17,18) est combinée à la puissance de la
technique PCR (19-21). Cet article décrit plusieurs caractéristiques de la technique AFLP et montre
comment cette technique peut être utilisée au mieux pour la prise d'empreintes digitales d'ADN
génomique.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

ADN, enzymes et matériaux

L’ADN lambda a été acheté chez Pharmacia (Pharmacia LKB

Biotechnology AB, Uppsala, Suède). Autographa californica

L’ADN du virus de la polyhédrose nucléaire (AcNPV) était un gentil cadeau de

Dr Just Vlak, Département de virologie, Université agricole de

Wageningen, aux Pays-Bas, et a été isolée comme décrit

auparavant (22). L’ADN d’Acinetobacter était un cadeau du Dr Paul

Jansen, département de microbiologie, université de Gent, Belgique, et a été isolé de la souche LMG
10554 selon la procédure de Pitcher et al. (23). L'ADN de levure a été isolé de la souche AB1380
comme décrit par Green et Olson avec des modifications mineures (24). ADN de tomate (variété de
culture [cv] Moneymaker, obtenu du Dr Maarten Koornneef, Université de Wageningen, Pays-Bas),
ADN d'Arabidopsis (lignée recombinante 240, obtenue du Dr Caroline Dean, John Innes Centre,
Norwich, Royaume-Uni), ADN de maïs ( souche B73, obtenue du Dr Mario Motto, Instituto
Sperimentale per La, Bergame, Italie), ADN de concombre (cv Primera, obtenu de De Ruiter

Seeds CV, Bleiswijk, Pays-Bas), ADN d'orge (cv Ingrid, obtenu du Dr Paul Schulze-Lefert, Université
d'Aachen, Allemagne), ADN de laitue (cv Calmar, obtenu du Dr Richard Michelmore, UC Davis, Davis,
Californie, États-Unis ) et de l'ADN de brassica (colza, cv Major, obtenu du Dr Thomas Osborn,
Université du Wisconsin, Madison, WI, États-Unis) ont été isolés à l'aide d'une procédure CTAB
modifiée décrite par Stewart et Via (25). L'ADN humain a été préparé comme décrit par Miller et al.
(26) sur un échantillon de sang de 100 ml de Mme Marjo Bleeker, l'un des coauteurs de cet article.
Toutes les enzymes de restriction ont été achetées chez Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology
AB, Uppsala, Suède), à l'exception de l'enzyme de restriction Msel, qui a été achetée auprès de New
England Biolabs Inc. (Beverly, MA, USA). L'ADN ligase T4 et la polynucléotide kinase T4 ont également
été obtenues auprès de Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suède). Tous les
réactifs et consommables de PCR ont été obtenus auprès de Perkin Elmer Corp. (Norwalk, CT, USA).
Tous les réactifs radioactifs ont été achetés chez Amersham (Amersham International pic, Little
Chalfont, Buckinghamshire, Royaume-Uni) ou Isotopchim (Isotopchim SA, Ganagobie, France).

Amorces et adaptateurs AFLP

Tous les oligonucléotides ont été préparés sur un synthétiseur d'ADN Biotronic Synostat D
(Eppendorf Gmbh, Maintal, Allemagne) ou sur un synthétiseur d'ADN Milligen Expedite 8909
(Millipore Corp. Bedford, MA, États-Unis). La qualité des oligonucléotides bruts a été déterminée par
marquage terminal avec une polynucléotide kinase et du [y-32P] ATP, puis une électrophorèse
ultérieure sur des gels de Polyacrylamide dénaturant à 18% (27). Les oligonucléotides étaient
généralement utilisés comme adaptateurs et amorces pour l'analyse AFLP sans purification
supplémentaire. Les adaptateurs AFLP consistent en une séquence principale et une séquence
spécifique à une enzyme (28). La structure de l'adaptateur £ coRI est la suivante:

5-CTCGTAGACTGCGTACC

CATCTGACGCATGGTTAA-5

La structure de l'adaptateur Afsel est la suivante:

5-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5

Les adaptateurs pour les autres enzymes «rares» étaient identiques à l'adaptateur £ coRI, à
l'exception de l'utilisation d'extrémités cohésives compatibles avec ces autres enzymes. L'adaptateur
7a <7l était identique à l'adaptateur Afsel, à l'exception du fait qu'une extrémité cohésive compatible
était utilisée avec Taq \.
Les amorces AFLP sont constituées de trois parties: une séquence principale, une séquence
spécifique à une enzyme (ENZ) et une extension sélective (EXT) (28). Ceci est illustré ci-dessous pour
EcoRl et Msel-pnmcr avec trois nucléotides sélectifs (nucléotides sélectifs représentés par NNN):

CORE ENZ EXT

EcoKl 5-GACTGCGTACC AATTC NNN-3

Msel 5-GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3

Les amorces AFLP pour d'autres enzymes «rares» étaient similaires aux amorces £ c <? RI, et les
amorces 7agl étaient similaires aux amorces Msel, mais avaient des parties spécifiques à l'enzyme
correspondant aux enzymes respectives.

Modification de l'ADN et préparation de la matrice

Le protocole ci-dessous décrit la génération de matrices pour les réactions AFLP en utilisant la
combinaison d'enzymes EcoRUMsel. Des matrices d'ADN avec d'autres enzymes de restriction ont
été préparées en utilisant essentiellement le même protocole, à l'exception de l'utilisation d'enzymes
de restriction différentes et d'adaptateurs double brin correspondants. L'ADN génomique (0,5 ng) a
été incubé pendant 1 heure à 37 ° C avec 5 UI coRI et 5 U Msel dans 40 ^ 1 Tris-HAc 10 mM pH 7,5,
MgAc 10 mM, KAc 50 mM, DTT 5 mM, 50 ng. / | il BSA. Ensuite, 10 nl d'une solution contenant 5
pMol d'adaptateurs ZscoRI, 50 pMol de Mseladapters, 1 U ADN-ligase T4, 1 mM d'ATP dans du Tris-
HAc 10 mM, pH 7,5, 10 mM de MgAc, 50 mM de KAc, 5 mM de DTT, 50 Du BSA ng / | il a été ajouté
et l'incubation a été poursuivie pendant 3 h à 37 ° C. Les adaptateurs ont été préparés en ajoutant
des quantités équimolaires des deux brins; les adaptateurs n'étaient pas phosphorylés. Après
ligation, le mélange réactionnel a été dilué à 500 ml avec du Tris-HCl 10 mM, de l'EDTA 0,1 mM, pH
8,0, et stocké à -20 ° C.

Réactions AFLP

Les réactions d'amplification sont décrites à l'aide de matrices d'ADN pour la combinaison d'enzymes
EcoRUMsel. Les empreintes AFLP avec d'autres combinaisons d'enzymes ont été réalisées avec des
amorces appropriées.

Les réactions AFLP utilisaient généralement deux amorces oligonucléotidiques, une correspondant
aux extrémités £ c <? RI et une correspondant aux extrémités Afsel. L'une des deux amorces a été
marquée par radioactivité, de préférence l'amorce .EcoRI. Les amorces ont été marquées aux
extrémités à l'aide de [Y-33P] ATP et de polynucléotide kinase T4. Les réactions de marquage ont été
effectuées dans du Tris-HCl 50 m, 25 mM pH 7,5,10 mM, DTT, 0,5 mM, de la spermidine-3HCl 0,5 mM
en utilisant une amorce oligonucléotidique, 100 | iCi [y-33P] et 10 U T4. la polynucléotide kinase.
Vingt fxl PCR ont été effectuées contenant une amorce EcoRI marquée (0,5 mg du mélange de
réaction de marquage), une amorce Afsel de 30 ng, 5 (ADN matrice, 0,4 U Ta polymerase, 0 mM de
Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM de KC1, 0,2 mM des quatre dNTP.

Les conditions de la PCR différaient selon la nature des extensions sélectives des amorces AFLP
utilisées pour l’amplification. Des réactions AFLP avec des amorces n’ayant pas ou un seul nucléotide
sélectif ont été réalisées pendant 20 cycles avec le profil de cycle suivant: une étape de dénaturation
de l’ADN de 30 s à 94 ° C, une étape de recuit d’une minute à 56 ° C et une étape d’extension d’une
minute à 72 ° C. Des réactions AFLP avec des amorces ayant deux ou trois nucléotides sélectifs ont
été effectuées pendant 36 cycles avec le profil de cycle suivant: une étape de dénaturation de l'ADN
à 30 ° C à 94 ° C, une étape d'annelage à 30 secondes (voir ci-dessous) et une étape d'extension de 1
minute à 72 ° C. ° C La température de recuit du premier cycle était de 65 ° C, puis réduite chaque
cycle de 0,7 ° C pendant les 12 cycles suivants et maintenue à 56 ° C pendant les 23 cycles restants.
Toutes les réactions d'amplification ont été réalisées dans un thermocycleur PE-9600 (Perkin Elmer
Corp., Norwalk, CT, USA).

Les empreintes AFLP des génomes complexes impliquaient généralement une amplification en deux
étapes. La première étape de cette procédure d'amplification, appelée préamplification, a été
réalisée avec deux amorces AFLP ayant un seul nucléotide sélectif tel que décrit ci-dessus, à la
différence que 30 ng des deux amorces AFLP ont été utilisés et que ces amorces n'étaient pas
marquées de manière radioactive. Après cette étape de préamplification, les mélanges réactionnels
ont été dilués 10 fois avec du Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0, et utilisés comme matrices pour
la seconde réaction d'amplification. La deuxième réaction d'amplification a été effectuée comme
décrit ci-dessus pour les réactions AFLP avec des amorces ayant des extensions sélectives plus
longues.

Analyse sur gel

Après l'amplification, les produits de la réaction ont été mélangés à un volume égal (20 ^ 1) de
colorant formamide (formamide à 98%, EDTA 10 mM, pH 8,0, et bleu de bromo phénol et xylène
cyanol en tant que colorants de suivi). Les mélanges résultants ont été chauffés pendant 3 minutes à
90 ° C, puis rapidement refroidis sur de la glace. Chaque échantillon (2 | il) a été chargé sur un gel de
Polyacrylamide dénaturant (séquençage) à 5% (27). La matrice de gel a été préparée en utilisant de
l'acrylamide à 5%, du méthylène bisacryl à 0,25%, de l'urée à 7,5 M dans du Tris à 50 mM / acide
borique à 50 mM / EDTA à 1 mM. A 100 ml de solution de gel, 500 JJ.1 de APS à 10% et 100 mg de
TEMED ont été ajoutés et les gels ont été coulés en utilisant un appareil à gel SequiGen 38 x 50 cm
(BioRad Laboratories Inc., Hercules, Californie, USA). Tris 100 mM. L'électrophorèse a été réalisée à
puissance constante, 110 W, pendant -2 h. Après l'électrophorèse, les gels ont été fixés pendant 30
min dans de l'acide acétique à 10%, séché sur des plaques de verre et exposés à des écrans
phosphoimage Fuji pendant 16 h Les motifs d'empreinte digitale ont été visualisés à l'aide d'un
système d'analyse phosphoimage Fuji BAS-2000 (Fuji Photo Film Company Ltd, Japon).

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Principe de la méthode

La technique AFLP est basée sur l'amplification de sous-ensembles de fragments de restriction

génomique par PCR. L'ADN est coupé avec des enzymes de restriction et des adaptateurs double brin
(ds) sont ligaturés aux extrémités des fragments d'ADN pour générer l'ADN matrice en vue de son
amplification. La séquence des adaptateurs et le site de restriction adjacent servent de sites de
liaison d'amorce pour une amplification ultérieure des fragments de restriction (figure 1). Des
nucléotides sélectifs sont inclus aux extrémités 3 'des amorces de PCR, qui ne peuvent donc initier
que la synthèse de l'ADN à partir d'un sous-ensemble des sites de restriction. Seuls les fragments de
restriction dans lesquels les nucléotides adjacents au site de restriction correspondent aux
nucléotides sélectifs seront amplifiés (Fig. 1).
Figure 1. Représentation schématique de la technique AFLP. En haut: fragment de restriction Eco91-Mse \ avec ses
extrémités saillantes en 5 '. Centrer le même fragment après ligature des adaptateurs EcoRI et Msel. En bas: les deux brins
du fragment avec leurs amorces AFLP correspondantes. L'extrémité 3 'des amorces et leur séquence de reconnaissance
dans le fragment EcoRI-Msel sont mises en évidence.

Les fragments de restriction pour l'amplification sont générés par deux enzymes de restriction, un
cutter rare et un cutter fréquent. La procédure AFLP aboutit à une amplification prédominante de ces
fragments de restriction, qui ont une séquence de coupe rare à une extrémité et une séquence de
coupe fréquente à l'autre extrémité (ceci sera expliqué ci-dessous, voir également la figure 3). La
justification de l’utilisation de deux enzymes de restriction est la suivante: (i) Le cutter fréquent
génère de petits fragments d’ADN, qui s’amplifient bien et se situent dans la plage de taille optimale
pour la séparation sur gels dénaturant (gels de séquence), (ii) les fragments à amplifier sont réduits
en utilisant le cutter rare, puisque seuls les fragments rares de cutter / cutter fréquents sont
amplifiés. Cela limite le nombre de nucléotides sélectifs nécessaires à l’amplification sélective. (Iii)
L’utilisation de deux enzymes de restriction permet de marquer un brin des produits de PCR ds, ce
qui évite la présence de «doublets» sur les gels en raison de la mobilité inégale des les deux brins des
fragments amplifiés, (iv) L'utilisation de deux enzymes de restriction différentes donne la plus grande
souplesse pour «ajuster» le nombre de fragments à amplifier (v) Un grand nombre d'empreintes
digitales différentes peuvent être générées par les diverses combinaisons d'un faible nombre des
amorces.

AFLP empreinte de génomes simples

La technique AFLP utilise des adaptateurs ds ligaturés aux extrémités des fragments de restriction
pour créer des sites cibles pour l'annelage de l'amorce lors de l'amplification de fragments. Un sous-
ensemble des fragments de restriction est spécifiquement amplifié par l'utilisation de nucléotides
sélectifs aux extrémités 3 'des amorces AFLP. Ce principe a été démontré par la prise d'empreinte de
quatre ADN génomiques simples différents, dont la taille du génome variait de 48,5 à 16 000 kb. Les
ADN génomiques suivants ont été sélectionnés et soumis à une empreinte digitale en utilisant la
combinaison enzymatique EcoRllMsel: ADN du phage X. (48 451 pb) (29), ADN AcNPV (Autographa
californica Nuclear Virus, 129 981 pb) (30), ADN Acinetobacter (taille estimée du génome). 3000 kb)
(31) et ADN de levure (taille du génome estimée à 16 000 kb) (32) (Fig. 2).

Pour les ADN du phage A. et de l'AcNPV, la séquence nucléotidique complète est connue et, par
conséquent, tous les fragments d'EcoRUMsel pourraient être prédits avec précision. En effet, tous les
fragments prédits ont été détectés. De plus, pour l'ADN d'Acinetobacter et de levure, le nombre de
fragments correspond bien à la taille du génome de ces organismes. L'ajout de nucléotides sélectifs
aux amorces AFLP a réduit le nombre de bandes - 4 fois avec chaque base sélective supplémentaire.
De plus, l'ajout d'un nucléotide supplémentaire sélectif a toujours donné une empreinte digitale, qui
était un sous-ensemble de l'empreinte d'origine. Cela indique que les nucléotides sélectifs sont un
moyen précis et efficace de sélectionner un ensemble spécifique de fragments de restriction pour
l'amplification. Les empreintes AFLP ont montré qu'un grand nombre de fragments de restriction
étaient amplifiés simultanément et que, en principe, le nombre de bandes détectées n'était limité
que par la puissance du système de détection, c'est-à-dire des gels de Polyacrylamide. En général,
l'amplification simultanée de fragments d'ADN à l'aide d'ensembles d'amorces spécifiques pour
chaque fragment de PCR (PCR multiplex) semble être plutôt gênante (33-35). Nos résultats suggèrent
que l’amplification multi-fragments est efficace à condition que tous les fragments utilisent le même
ensemble d’amorces pour leur amplification. Cela implique que les différences d'efficacité
d'amplification des fragments d'ADN en PCR (33-35) sont principalement associées à l'amorce et non
spécifiques à un fragment.

Les adaptateurs ds utilisés pour la ligature aux fragments de restriction ne sont pas phosphorylés, ce
qui entraîne la ligature d'un seul brin aux extrémités des fragments de restriction. Les fragments
n'étaient donc pas amplifiés si les ADN de matrice étaient dénaturés avant l'amplification par PCR
(résultats non présentés), sauf lorsque la Taq polymérase et les dNTP étaient présents avant la
dénaturation. L'introduction des renfoncements en 3 'par la Taq polymérase après la dissociation des
brins non ligaturés au cours de l'étape de chauffage ne semble nécessiter que quelques secondes ou
moins. En variante, la Taq polymérase peut déplacer immédiatement les brins non ligaturés à basses
températures au cours du processus d'assemblage des mélanges réactionnels.

Ces résultats démontrent que: (i) la technique AFLP fournit un moyen efficace d’amplifier
simultanément un grand nombre de fragments, (ii) les fragments amplifiés sont des fragments de
restriction, (iii) le nombre de fragments obtenus augmente avec l’augmentation de la taille du
génome et correspond bien avec ce qui était théoriquement attendu, (iv) les nucléotides sélectifs aux
extrémités des amorces AFLP ont réduit le nombre de bandes avec précision, comme on pouvait s'y
attendre.

La restriction de l'ADN génomique avec EcoRI et Msel entraînera trois classes de fragments de
restriction, les fragments Msel-Msel, les fragments EcoRI-Msel et les fragments EcoRI-EcoRI. La
grande majorité (> 90%) devraient être des fragments Msel-Msel, les fragments EcoRI-Msel
représenteront environ le double du nombre de sites de restriction £ coRI et un petit nombre de
fragments seront des fragments EcoRI-EcoRI. Dans les expériences précédentes, l'amorce EcoRI était
marquée et, par conséquent, seuls les fragments de restriction comportant un site EcoRI pouvaient
être détectés. Pour étudier l'amplification des fragments Msel-Msel, un ensemble de réactions AFLP
sur l'ADN de levure a été réalisé avec l'amorce Msel marquée à la place de l'amorce EcoRI (Fig. 3):
elle devrait montrer les fragments EcoRI-Msel ainsi que le Fragments de Msel-Msel.

Des empreintes de levure similaires ont été obtenues avec les amorces EcoRl ou Msel marquées
(figure 3, lignes de comparaison A et B). Cependant, la plupart des bandes ont montré un
déplacement significatif de la mobilité, du fait que l’autre brin des fragments a été détecté. Il était
surprenant de constater que presque aucun fragment supplémentaire, c'est-à-dire des fragments de
Msel-Msel, n'a été détecté lors du marquage de l'amorce Msel au lieu de l'amorce EcoRI. Par
conséquent, des réactions supplémentaires ont été effectuées auxquelles seule l’amorce Msel a été
ajoutée, ce qui théoriquement ne permet que l’amplification de fragments Msel-Msel (figure 3, voies
C). En effet, ces réactions ont montré des produits d'amplification non observés en présence des
amorces £ coRI. Ces observations impliquent que l'amplification des fragments Msel-Msel est
inefficace en présence de l'amorce EcoRI, c'est-à-dire qu'il existe une amplification préférentielle des
fragments EcoRI-Msel par rapport aux fragments Msel-Msel dans la réaction AFLP. Ceci peut être
expliqué de deux manières: (i)

L'amorce Msel a une température d'annelage plus basse que l'amorce EcoRI, ce qui rend
l'amplification des fragments Msel-Mse \ moins efficace que celle des fragments EcoRI-Msel dans les
conditions utilisées.

Nous avons en effet observé une amplification plus forte des fragments de Msel-Msel en utilisant des
amorces et des adaptateurs de Msel plus longs ou alternatifs. (Ii) Les fragments de Msel-Msel ont
une répétition inversée aux extrémités, car ils sont amplifiés par une seule amorce. Par conséquent,
une structure tige-boucle peut être formée par appariement de bases des extrémités des fragments,
ce qui concurrencera le recuit de l'amorce. Ceci est également confirmé par l'observation selon
laquelle seuls les plus gros fragments ont été amplifiés dans les réactions AFLP lorsque seul l'amorce
Msel a été ajoutée. La formation d'une structure tige-boucle sera plus difficile dans ces plus gros
fragments. Nous avons en effet démontré que l’amplification de gros fragments (> 1 kb) avec une
seule amorce est assez efficace (résultats non présentés).

Une conception minutieuse des amorces est cruciale pour une amplification PCR réussie. Les amorces
AFLP se composent de trois parties: la partie 5 'correspondant à l'adaptateur, la séquence du site de
restriction et les nucléotides sélectifs 3'. Par conséquent, la conception des amorces AFLP est
principalement déterminée par la conception des adaptateurs, qui sont liés aux fragments de
restriction. Différents modèles d'adaptateurs ont été testés (résultats non montrés), tous avec de
bons résultats, à condition que les règles générales d'un «bon modèle d'amorce PCR» soient suivies
(36,37). Une conception d'adaptateur différente nécessitera des conditions de PCR différentes. Il est
donc important de sélectionner une conception spécifique pour les adaptateurs et d'optimiser les
conditions de cette conception.

Une caractéristique importante des amorces AFLP est que toutes les amorces commencent par un
résidu de guanine (G) en 5 '. Nous avons constaté qu'un résidu de G en 5 dans l'apprêt non marqué
est crucial pour prévenir le phénomène des bandes doubles. Les doubles bandes semblent résulter
de l'addition incomplète d'un nucléotide supplémentaire aux brins synthétisés (résultats non
présentés). Cette activité terminale transférase de la Tag polymerase est assez forte et a été
fréquemment rapportée (38-40). Nous avons également constaté que les additions de nucléotides 3
'étaient influencées par la concentration de dNTP et que des bandes doubles se produisaient à de
faibles concentrations de dNTP, quel que soit le résidu 5' dans les amorces de PCR (résultats non
montrés). Nous concluons de nos résultats que cette activité transférase terminale est la plus forte
(presque 100% des brins synthétisés) lorsque le nucléotide en 3 'du brin synthétisé est une cytidine
(C).

Dans les expériences décrites jusqu'à présent, des amorces AFLP ont été utilisées avec un ou deux
nucléotides 3 'sélectifs. Il a été démontré que ce faible nombre de nucléotides sélectifs constituait un
moyen efficace de sélectionner le nombre souhaité de fragments à amplifier. Ensuite, des amorces
avec des extensions 3 'plus longues ont été testées pour déterminer le nombre maximum de
nucléotides sélectifs 3' qui conserveraient une sélectivité élevée dans les réactions AFLP. À cette fin,
des empreintes digitales d'ADN de levure ont été générées à l'aide d'amorces contenant jusqu'à
quatre nucléotides sélectifs. Une seule amorce EcoRI a été sélectionnée avec un nucléotide sélectif et
combinée avec quatre amorces Msel différentes avec un, deux, trois ou quatre nucléotides sélectifs,
respectivement. Les extensions sélectives Msel ont été choisies de manière à générer avec chaque
nucléotide sélectif supplémentaire une empreinte digitale constituant le sous-ensemble des
empreintes digitales précédentes, par ex. extensions + C, + CT, + CTC, + CTCA. L'apparition de bandes
n'apparaissant pas dans les empreintes digitales précédentes indique que des fragments sont
amplifiés qui ne correspondent pas à la séquence des bases sélectives et que, par conséquent, la
sélectivité est incomplète (Fig. 4).

Les empreintes représentées à la figure 4 et les empreintes d'expériences précédentes ont démontré
que la sélectivité de l'amorce est bonne pour les amorces avec un ou deux nucléotides sélectifs. La
sélectivité est toujours acceptable avec les amorces ayant trois nucléotides sélectifs, mais elle est
perdue avec l’ajout du quatrième nucléotide. La perte de sélectivité avec des amorces ayant quatre
bases sélectives est illustrée par l'amplification de nombreuses bandes non détectées dans les
empreintes digitales correspondantes avec des amorces ayant trois bases sélectives (comparez les
pistes D aux pistes C). Cela indique la tolérance de mésappariements dans l'amplification des
fragments en utilisant des amorces AFLP à quatre extensions de base. Il est fort probable que les
mésappariements seront tolérés à la première base sélective, car ce nucléotide est le plus éloigné de
l'extrémité 3 'et que la sélectivité des extensions sélectives à trois bases était toujours suffisante.
D'autres chercheurs ont également étudié la sélectivité des nucléotides en 3 'des amorces de PCR
(41,42). Ils ont constaté que les inadéquations étaient tolérées au niveau des nucléotides ultime 3 et
3 en avant des amorces de PCR, ce qui est en contradiction avec nos résultats. Dans d'autres
expériences, nous avons constaté que la sélectivité de l'amorce est relative et dépend également du
nombre de fragments amplifiés dans une seule réaction, des conditions de la PCR et de la conception
de l'amorce (résultats non présentés). Nous pensons qu'il y aura toujours un certain niveau
d'amplification de mésappariement, mais que les conditions de réaction peuvent empêcher ces
bandes de mésappariement d'atteindre le niveau de détection. C'est sans doute la principale
différence avec les expériences précédemment rapportées (41,42).

AFLP empreintes de génomes complexes

Les expériences initiales avec l'empreinte AFLP d'un certain nombre d'ADN végétaux et animaux ont
indiqué que des amorces AFLP avec au moins trois nucléotides sélectifs au niveau des amorces EcoRI
et Mse \ étaient nécessaires pour générer des profils de bande utiles. Parce que les amorces à trois
bases sélectives tolèrent un faible niveau d'amplification de mésappariement, une stratégie
d'amplification en deux étapes a été développée pour l'empreinte AFLP d'ADN complexes. Dans la
première étape, appelée préamplification, les ADN génomiques ont été amplifiés avec des amorces
AFLP ayant toutes deux un seul nucléotide sélectif. Ensuite, les produits de PCR de la réaction de
préamplification ont été dilués et utilisés comme matrice pour la seconde réaction AFLP en utilisant
des amorces ayant toutes deux trois nucléotides sélectifs. Nous avons comparé cette stratégie
d'amplification à une amplification directe d'ADN génomiques complexes sans recourir à l'étape de
préamplification. La stratégie d'amplification en deux étapes a entraîné deux différences importantes
par rapport à l'amplification directe AFLP: (i) les frottis de fond dans les empreintes digitales ont été
réduits, et (ii) les empreintes digitales avec des combinaisons d'amorces particulières ne
comportaient pas une ou plusieurs bandes par rapport aux empreintes générées. sans
préamplification. Cela s’explique mieux en supposant que l’amplification directe avec les amorces
AFLP ayant trois nucléotides sélectifs aboutissait à un faible niveau de produits d’amplification
mismatch, ce qui provoquait des frottis de fond et donnait des fragments discrets amplifiés
correspondant à des fragments de restriction répétés. Un autre avantage de la stratégie
d'amplification en deux étapes est qu'elle fournit une quantité pratiquement illimitée d'ADN matrice
pour les réactions AFLP. La figure 5 montre un certain nombre d'empreintes AFLP typiques obtenues
avec la stratégie d'amplification en deux étapes utilisant les ADN de trois espèces de plantes,
Arabidopsis thaliana, la tomate (Lycopersicon esculentum) et le maïs {Zea mays) et l'ADN humain.
Pour Arabidopsis, des combinaisons d’amorces d’ADN comprenant au total cinq nucléotides sélectifs
ont été utilisées en raison du petit génome de cette espèce végétale (145 Mo, 43). Pour les ADN de la
tomate, du maïs et de l’homme, six nucléotides sélectifs ont été utilisés, trois bases sélectives pour
l’amorce EcoR \ et Afyel.

Les méthodes de prise d'empreintes génétiques basées sur l'amplification de fragments d'ADN
génomique par des amorces aléatoires se sont révélées très sensibles à la concentration en ADN
matrice (13, 14). Les quantités d'ADN peuvent varier considérablement entre les échantillons
individuels isolés par les procédures standard d'isolement de l'ADN. De préférence, une technique
d'empreinte génétique devrait être insensible aux variations de concentration de matrice d'ADN. Par
conséquent, la sensibilité de la technique AFLP aux concentrations d’ADN matrice a été étudiée

Les empreintes AFLP ont été réalisées à l'aide d'ADN de tomate et de la combinaison d'enzymes
EcoRI / Msel. Les quantités d'ADN de matrice variaient de 2,5 pg à 25 ng. Le protocole standard
d'amplification en deux étapes a été utilisé, à l'exception d'une étape de préamplification étendue
pour les échantillons de matrice d'ADN de 2,5 et 25 pg. Dans la tomate, 2,5 pg d’ADN matrice
correspondent à environ quatre molécules de chaque fragment d’ADN au début de la réaction AFLP.
Les modèles d'empreintes digitales AFLP étaient très similaires en utilisant des quantités de modèles
qui allaient 1000 fois, c'est-à-dire allant de 25 ng à 25 pg (figure 6). Les empreintes digitales générées
avec seulement 2,5 pg d'ADN matrice étaient similaires aux autres empreintes digitales, bien que
l'intensité des bandes varie de manière significative et que certaines bandes soient absentes.

Ces résultats démontrent que la procédure AFLP est insensible à la concentration en ADN de la
matrice, bien que des empreintes digitales aberrantes soient observées à des dilutions de matrice
très élevées ne donnant que quelques molécules de matrice au début de la réaction. Très
probablement, les fragments de restriction individuels ne sont pas distribués de manière aléatoire à
des concentrations d'ADN aussi basses, ce qui explique les différences observées dans les intensités
des bandes. Notre hypothèse est corroborée par notre constatation selon laquelle la comparaison
d'un certain nombre d'empreintes AFLP individuelles obtenues avec seulement 2,5 pg d'ADN matrice
a montré une variation importante de l'intensité des bandes individuelles (résultats non présentés).

Une caractéristique remarquable de la réaction AFLP est que, généralement, l’amorce marquée est
complètement consommée (l’amorce non marquée est en excès) et que, par conséquent, la réaction
d’amplification s’arrête lorsque l’amorce marquée est épuisée. Nous avons également constaté que
le thermocyclage en continu n’affecte pas la tracés de bandes une fois l’amorce étiquetée
consommée (résultats non affichés). Cette caractéristique est élégamment décrite dans le protocole
AFLP, qui utilise un nombre excessif de cycles de PCR, ce qui donnera des empreintes digitales
d’intensité égale, malgré les variations de la concentration en matrice. Nous avons également noté
que les empreintes ADN ont tendance à ne pas être fiables si la concentration en matrice était
inférieure à une certaine concentration absolue (-1 pg), quelle que soit la complexité de l'ADN
(résultats non présentés). Dans ce dernier cas, on a observé des bandes indépendantes de la matrice
et également présentes si aucun ADN n'était ajouté.

L'utilisation d'autres combinaisons d'enzymes de restriction pour la détermination par empreinte

AFLP de génomes complexes a également été étudiée (résultats non présentés). Ces combinaisons
d'enzymes comprenaient EcoRl, HindIII, Pstl, BgM, Xbal et Sse8387 (coupe huit bases) en
combinaison avec Msel ou Taq \. Des empreintes digitales ont été générées sur divers ADN de
plantes et d’animaux. L'utilisation de Taql en tant que couteau de quatre bases au lieu de Msel a
entraîné une distribution inégale des fragments amplifiés, qui étaient principalement présents dans
la partie supérieure du gel. La plupart des ADN eucaryotes sont riches en AT et, par conséquent, Msel
(séquence de reconnaissance TTAA) produira généralement des fragments de restriction beaucoup
plus petits que le Taql (séquence de reconnaissance TCGA). Msel est donc préférable pour les
empreintes AFLP car il coupe très fréquemment dans la plupart des génomes eucaryotes, ce qui
donne des fragments qui se situent dans la plage de taille optimale pour l'amplification par PCR et la
séparation sur gels de Polyacrylamide dénaturant. D’autres enzymes de coupage rares ont
généralement obtenu des performances égales à EcoRI en AFLP, et le nombre de bandes obtenues
reflétait la fréquence de clivage des diverses enzymes de restriction. Cependant, £ coRI est préféré
car il s'agit d'une enzyme fiable à six coupures (peu coûteuse), qui limite les problèmes liés à la
restriction partielle de la détermination de l'empreinte AFLP (voir ci-dessous).

Une restriction incomplète de l'ADN posera des problèmes d'empreinte AFLP, car des fragments
partiels seront générés, lesquels seront détectés par la procédure AFLP. Lorsque divers échantillons
d’ADN sont comparés aux empreintes AFLP, une restriction incomplète aura pour résultat la
détection de différences dans les profils de bandes, qui ne reflètent pas les vrais polymorphismes de
l’ADN, c’est-à-dire quand un échantillon est partiellement restreint et que les autres ne le sont pas.
Une restriction incomplète n'apparaîtra que lorsque différents échantillons d'ADN d'un même
organisme seront comparés. Il se caractérise par la présence de bandes supplémentaires dans les
pistes, principalement de poids moléculaire élevé.
CONCLUSIONS

L'AFLP est une technique d'empreinte ADN qui détecte les fragments de restriction génomiques et
ressemble à cet égard à la technique RFLP (polymorphisme de la longueur des fragments de
restriction), à la différence majeure que l'amplification par PCR au lieu de l'hybridation de Southern
est utilisée pour la détection des fragments de restriction. La ressemblance avec la technique RFLP a
été la base pour choisir le nom AFLP. Cependant, le nom AFLP ne doit pas être utilisé comme un
acronyme, car la technique affichera la présence ou l'absence de fragments de restriction plutôt que
des différences de longueur.

Dans nos protocoles initiaux AFLP, une étape de purification supplémentaire est incorporée à la
préparation de matrice (28). Des adaptateurs £ coRI biotinylés ont été utilisés pour la ligature, puis
les fragments d'ADN biotinylés (fragments EcoRI-Msel et fragments EcoRI-EcoRI) ont été soustraits
du mélange de ligature en utilisant des billes de streptavidine (28, 44). Cette étape a permis de
réduire la complexité de la matrice d’ADN en supprimant tous les fragments de Msel-Msel, ce qui
s’est révélé important pour la génération d’empreintes de haute qualité d’ADN complexes. Le
protocole décrit dans cet article omet cette étape de purification, car des conditions d'amplification
qui entraînent une amplification préférentielle des fragments EcoRI-Msel par rapport aux fragments
Msel-Msel (figure 3). Cela résulte de la conception soigneuse de l'adaptateur et de l'amorce et des
caractéristiques inhérentes à la réaction d'amplification AFLP.

La technique AFLP générera les empreintes de n'importe quel ADN, quelle que soit leur origine ou
leur complexité. Dans cet article, nous avons présenté les empreintes AFLP des ADN dont la taille du
génome variait jusqu'à 100 000 fois. Nous avons décrit le fait que le nombre de fragments amplifiés
peut être contrôlé par la fréquence de clivage de l’enzyme de coupe rare et le nombre de bases
sélectives. De plus, le nombre de bandes amplifiées peut être contrôlé par la nature des bases
sélectives; des extensions sélectives avec des di- ou trinucléotides rares conduiront à la réduction des
fragments amplifiés. En général, il existe une corrélation presque linéaire entre le nombre de
fragments amplifiés et la taille du génome. Cette corrélation linéaire est perdue dans les génomes
complexes des plantes supérieures, qui contiennent un grand nombre de séquences répétées et, par
conséquent, de fragments de restriction multicopies. Les empreintes digitales de ces ADN complexes
consistent principalement en des fragments AFLP uniques, mais sont caractérisées par la présence
d'un petit nombre de fragments répétés plus intenses.

Dans les génomes complexes, le nombre de fragments de restriction pouvant être détectés par la
technique AFLP est pratiquement illimité. Une seule combinaison d'enzymes (une combinaison d'une
enzyme de restriction spécifique à six bases et à quatre bases) permettra déjà l'amplification de 100
000 fragments AFLP uniques, dont généralement 50 à 100 sont sélectionnés pour chaque réaction
AFLP. La plupart des fragments AFLP correspondent à des positions uniques sur le génome et
peuvent donc être exploités comme points de repère sur des cartes génétiques et physiques, chaque
fragment étant caractérisé par sa taille et par ses amorces nécessaires à l'amplification. En outre, la
technique AFLP permet la détection de fragments de restriction dans n'importe quel contexte ou
complexité, y compris les échantillons d'ADN regroupés et les segments d'ADN clonés (et regroupés).
Par conséquent, la technique AFLP n'est pas simplement une technique d'empreinte digitale, c'est
une technologie habilitante dans la recherche sur le génome, car elle peut combler le fossé entre les
cartes génétiques et physiques. Premièrement, la technique AFLP est un outil très efficace pour
révéler les polymorphismes des fragments de restriction. Ces polymorphismes de fragments, à savoir
les marqueurs AFLP, peuvent être utilisés pour construire des cartes génétiques à haute densité de
génomes ou de segments de génomes. Dans la plupart des organismes, AFLP s'avérera le moyen le
plus efficace de construire des cartes d'ADN génétique par rapport aux autres technologies de
marqueur existantes. Deuxièmement, les marqueurs AFLP peuvent être utilisés pour détecter des
clones génomiques correspondants, par ex. chromosomes artificiels de levure (YAC). Ceci est le plus
efficacement possible en travaillant avec des bibliothèques, qui sont regroupées pour permettre un
criblage rapide de la PCR et l'identification ultérieure des clones. Un marqueur AFLP détectera un
seul clone correspondant de YAC dans des ensembles pouvant contenir jusqu'à 100 clones de YAC
(M. Zabeau, M. Kuiper et P. Vos., Manuscrit en préparation). Enfin, la technique AFLP peut être
utilisée pour la prise d'empreintes digitales de segments d'ADN clonés tels que les cosmides, les
clones PI, les chromosomes artificiels bactériens (BAC) ou les YAC (résultats non présentés). En
utilisant simplement peu ou pas de nucléotides sélectifs, des empreintes de fragments de restriction
seront produites, qui pourront ensuite être utilisées pour aligner des clones individuels et créer des
contigs.