CHAPITRE V

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS

I. Caractéristiques de l’analyse microbiologique d’un produit alimentaire

1. But
2. Méthodes
3. Niveaux d’analyse
4. Fréquence des analyses
5. Microorganismes à contrôler

II. Démarche d’une analyse microbiologique d’un produit alimentaire

1. Echantillonnage et technique de prélèvement
2. Conditionnement et transport des échantillons
3. Réception, entreposage et décongélation des échantillons
4. Traitement des échantillons pour analyse
5. Ensemencement des microorganismes
6. Incubation des boîtes de Pétri
7. Méthode de dénombrement
8. Expression et interprétation des résultats

III. Exercices

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 I. Caractéristiques de l’analyse microbiologique d’un produit alimentaire

1. But

Les analyses microbiologiques alimentaires sont indispensables pour vérifier la ..1.. des produits par
rapport à la réglementation en vigueur. Elles ont pour but, de déceler et de ..2.. l’altération de la
qualité des aliments et de minimiser les pertes. Une altération de la qualité hygiénique met en cause la
santé du consommateur, tandis qu’une altération de la qualité marchande rend le produit non ..3… .
Les denrées alimentaires ne doivent pas contenir de microorganismes ni leurs toxines ou métabolites
dans des quantités qui présentent un risque inacceptable pour la santé humaine.

2. Méthodes

Une analyse microbiologique des aliments est réalisée par évaluation des flores ..4.. et d'altération
présentes dans les aliments. Elle consiste en une ..5.. et/ou un dénombrement de ces microorganismes,
afin d’en maîtriser leur présence ou absence (dans le cas des µorgs pathogènes) et leur ..6.. (dans le
cas des µorgs peu dangereux, contaminants ou hôtes normaux des matières premières composant la
denrée). Autrement dit, l’analyse microbiologique doit permettre d'isoler et d'identifier un
microorganisme spécifique (méthode …7..) ou de quantifier le nombre de colonies d’une flore
particulière dans un échantillon (méthode quantitative).

3. Niveaux d’analyse

 Avant la fabrication du produit : elle porte sur les matières premières et les adjuvants.
 En cours de fabrication du produit : elle à un but ..8.. comme le précédent. Il s’agit
d’un contrôle de BPF ou BPH : elle est effectuée sur le produit lui-même, mais aussi sur
les facteurs ayant une influence sur la qualité du produit comme l’hygiène des matériels,
des locaux et du personnel.
 Après la fabrication du produit : on détermine la qualité microbiologique du produit
…9… et sa conformité aux normes officielles ou aux normes établies par l’usine.

Quel que soit le type d’analyse, l’analyse microbiologique peut être complète ou partielle en fonction
de la demande du client ou du contenu des cahiers des charges.

4. Fréquence (ou périodicité) des analyses

La périodicité des contrôles peut être quotidienne, hebdomadaire, mensuelle … . Elle dépend au fait de
plusieurs facteurs : la nature du produit, son degré initial de …10… , sa destinée, les moyens
disponibles et la réglementation en vigueur. Un contrôle répété permet de déterminer les points
critiques.

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 5. Microorganismes à contrôler

Au cours d’un contrôle, il n’est pas nécessaire de rechercher, de compter et d’identifier

systématiquement tous les microorganismes présents dans le produit. En outre, les microorganismes
cibles varient suivant la ..11..technologie et les caractéristiques physicochimiques du produit en cours
de fabrication et du produit fini. Il n’est donc pas possible de donner une liste des microorganismes à
rechercher, chaque fabrication étant un cas particulier.

Il suffit souvent d’effectuer :

 une étude quantitative de la flore microbienne

- soit par dénombrement d’une flore microbienne donnée caractérisée par un ensemble de
propriétés physiologiques communes. exp. La FMAT et la flore fongique.
- soit par dénombrement d’un groupe bactérien pouvant correspondre à une contamination
déterminée. exp. Coliformes thermo-résistantes

 une recherche orientée de certaines bactéries pathogènes.

Exemples de paramètres à contrôler pour quelques aliments

Staphylococcus

Flore fongique
Streptocoques
fécaux (44°C)

Anaérobies
Coliformes

Coliformes

Salmonella
réducteurs
sulfito-
FMAT

fécaux
totaux

E. coli

Yaourt - 10 1 1 - - - 0 pour 25 g 10
Jambon cuit entier 10 10 0 - - 0 0 0 pour 1 g -
plats cuisinés à l'avance 5.10 5 103 10 - - 100 30 0 pour 25 g -

Quatre type de microorganismes sont conventionnellement rechechés et/ou dénombrés lors d’une
analyse microbiologique des denrées alimentaires :

 µorgs d’altération de la qualité marchande de l’aliment

Les levures dans les produits sucrés ou les produits acides ; les moisissures dans les produits peu
hydratés et les bactéries lactiques et acétiques dans les produits acides ou la Flore Mésophile Aérobie
Totale. Dans les Conserves, l’on a plutôt les Clostridium (bombage des boîtes) et les Bacillus.

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  µorgs potentiellement pathogènes

Salmonella spp., Shigella, Listeria monocytogenes, E. coli entéropathogènes, Campylobacter jejuni,

Staphylococcus aureus entérotoxinogènes, Yersinia entrolitica, Bacillus cereus, Anaérobies sulfito-
réducteurs (Clostridium perfringens et C. botulinum), etc…

 µorg témoins de contamination fécale et cutanée

Contamination cutanéo-muqueuse (S. aureus) et contamination fécale (Coliformes, Escherichia coli,

Entérobactéries, Streptocoques fécaux, Bactéries anaérobies sulfito-réductrices, etc.).

La présence de ces µorg en nombre supérieur aux valeurs définies indique la présence possible d’un
..12.. d’écologie similaire.

 µorg indicateurs technologique

µorg dont la présence en nombre supérieur aux valeurs définies indique un défaut d’adhésion aux
bonnes ..13… de fabrications reconnues. exp. Les Coliformes à 30°C.

La notice sur l’interprétation des résultats relatifs aux microorganismes importants en microbiologie
est illustrée par le tableau ci-dessous :

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 Mesures de prévention
Microorganismes Définition et signification des microorganismes Principaux points d’hygiène ou
d’organisation à vérifier

FMAT C'est l'ensemble des microorganismes ( ) aptes à se multiplier en présence d'air  Organisation du travail et marche en
aux températures ..14.. (25 à 40 °C). Indicateur du niveau général d’hygiène avant des matières premières.
et/ou flore d’altération, elle renseigne sur : la propreté des manipulations ; les  Qualité et efficacité du nettoyage de la
conditions de conservation ; la fraîcheur du produit et l’efficacité des procédés vaisselle.
de traitement. Donc, un excès de FAMT est la conséquence d’une pollution  Fonctionnement et entretien des
(malpropreté générale) ou d’une mauvaise conservation (température de enceintes et des appareils à froid.
conservation trop élevée ou durée de conservation trop longue).  Qualité de la liaison chaude (Bain-marie
à 63°C).
Une FMAT peu élevé peut ne pas correspondre à un produit sain ; par ailleurs  Renouvellement et port des vêtements
une FMAT très élevé peut correspondre à un produit sain (laits fermentés, de travail.
choucroute, etc...). On n’admet généralement qu’une concentration de FMAT  Entretien et nettoyage des surfaces de
> 3.108 par g (exceptions faites des produits fermentés) caractérise un produit travail, des outils et des appareils de
dégradé et impropre à la consommation. Dans le cas des produits acides, le tranchage et de broyage
groupe constitué par les levures et les moisissures est généralement dénombrer  Régularité et efficacité des nettoyages.
pour apprécier l’hygiène générale du produit.  Qualité des revêtements sol et mur.
 Ventilation des locaux et extraction des
vapeurs

Entérobactéries Ils regroupent de nombreuses espèces dont la plupart sont des commensaux de l’intestin de l’homme et de l’animal. Cette flore
constitue plus de 10% de l’ensemble des bactéries présentes dans l’intestin. Ce sont des contaminants alimentaires très fréquents
(dû essentiellement à un contact direct ou indirect avec les déchets fécaux). Ces bactéries peuvent provoquer des intoxications ou
des infections ou des toxi-infections. Les entérobactéries rencontrées en industrie alimentaire sont : Salmonella, Citrobacter,
Escherichia, Shigella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Yersinia, etc.

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 Coliformes Entérobactéries capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de  Renouvellement et port des vêtements
totaux fermenter le lactose avec production d’acide et de gaz à 30 °C en 48 h. On de travail.
les retrouve également dans le milieu extérieur (eau, sol, végétaux, poils,  Utilisation et organisation des vestiaires
 Lavage des mains
plumes). La presque totalité de ces bactéries sont non-pathogènes et ne
 Nettoyage des légumes
présentent pas de risque direct pour la santé. Cependant, lorsqu’ils sont en  Evacuation des eaux usées, des déchets
nombre très élevé, les coliformes peuvent provoquer des intoxications et des emballages. (sacs poubelles).
alimentaires. Habituellement, ils sont considérés comme étant des indicateurs  Nettoyage des enceintes froides.
de contamination fécale, mais il s’agit d’un mauvais critère, ce sont plutôt des  Qualité et efficacité de la plonge.
marqueurs de qualité hygiénique fécale. En effet, ils renseignent sur : la  Nettoyage des sols.
propreté des manipulations ; l’efficacité des procédés de traitement  Présence des plantes vertes ou de fleurs.
(Pasteurisation) et la propreté des locaux et du matériel.
Sensibles à la chaleur, leur présence dans les aliments cuits indique une
contamination après traitement thermique.

E. coli Entérobactéries capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de  Lavage des mains
Coliformes fermenter le lactose avec production d’acide et de gaz à 44°C en 48 h. Très  Equipement et entretien des lavabos et
thermotolérants abondante dans les matières fécales (106) par gramme. Ils permettent de suivre WC.
(autrefois  Hygiène du personnel
l’hygiène des manipulations ainsi que l’efficacité des process utilisés. Les
nommés  Fonctionnement des enceintes froides.
Coliformes thermotolérants sont plus spécifiques de la contamination fécale  Respect de la chaîne du froid.
coliformes
fécaux) récente ou constante.  Qualité de la liaison chaude.
 Présence d’animaux vivants.
Ces germes sont capables de provoquer des diarrhées graves, en particulier
chez les jeunes enfants avec des syndrômes ressemblant au choléra. Le
sérotype O157 d'Escherichia coli est une souche entérohémorragique qui
provoque une intoxication alimentaire due à la production d'une entérotoxine
cytotoxique appelée vérotoxine.

Staphylocoques Ce sont des bactéries commensales de la peau des animaux et de l’homme, qui  Protection des plaies des mains.
contaminent fréquemment les aliments. Leur caractère saprophyte de la peau  Port du masque bucco-nasal pour les

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 et des muqueuses des êtres vivants en fait des agents de contamination par personnes atteintes de rhino-pharyngites
manipulation. Staphylococcus aureus est donc un indicateur de contamination bénignes.
humaine (ou animale) dans les aliments (aliments crus en particulier).  Hygiène et surveillance médicale du
personnel
 Fonctionnement des appareils
La croissance de S.aureus dans les aliments constitue un risque pour la santé producteurs de froid.
publique parce qu’elle produit des entérotoxines thermostables dont l'ingestion  Qualité de la cuisson et de la liaison
provoque une toxi-infection alimentaire. Un traitement thermique de type chaude
pasteurisation (60°C pendant 30 minutes) permet de détruire les
microorganismes, mais pas les toxines staphylococciques qui résistent
beaucoup à des températures élevées (30 minutes à 100 °C).

ASR Très largement répandu dans l’environnement et est responsable de toxi-  Refroidissement mal effectué.
(Clostridium infections. Ils témoignent d’une contamination tellurique non maîtrisée par les  Fonctionnement des appareils
perfringens) traitements technologiques. Ce germe ne présente dans la plupart des cas de producteurs
 de froid.
risques pour le consommateur qu’après mauvaise manutention/gestion d’un
 Qualité de la cuisson et de la liaison
aliment après cuisson. Ce germe produit au cours de sa sporulation une chaude.
entérotoxine qui est libérée au moment de sa germination.  Surveillance des approvisionnements en
denrées d’origine animale.
 Utilisation des restes de cuisines.
 Hygiène et surveillance médicale du
 personnel.
 Lavage des mains.
 Equipement et entretien des lavabos et
WC.
 Lutte contre les insectes et les rongeurs.

Bacillus cereus Bactéries sporulée responsable de toxi-infections caractérisées par des  Contamination anormale de la matière
symptômes diarrhéiques, ainsi que d'intoxinations se traduisant par des première : denrées amylacées à base de
céréales (pâtes, semoule, riz), légumes,
symptômes émétiques. Cette bactérie est une hôte normal du sol, si elle
épices, purée …
contamine un aliment, elle doit se multiplier abondamment pour être  Stockage séparé des aliments crus/cuits.
dangereuse, elle est souvent recherchée dans le cas des plats préparés à

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 l'avance et conditionnés. Ses spores résistent aux procédés de fabrication et  Nettoyage des légumes élimination terre
ses toxines sont thermostables.  Exposition du produit à des températures
inappropriées : mauvais maintien de la
liaison chaude à 63°C, refroidissement
mal effectué.
 Nettoyage et décontamination des
équipements.

Salmonella Les salmonelles sont présentes dans l’intestin de l’homme et des animaux. La  Nettoyage des sols et surfaces de travail.
contamination des produits alimentaires peut provenir des animaux malades  Qualité de la cuisson et de la liaison
chaude
ou par manipulateurs malades ou porteurs asymptomatiques de germesza.
 Surveillance des approvisionnements en
Plusieurs sérovars comme S.typhi et S.paratyphi A, B, C, provoquent des denrées d’origine animale.
maladies infectieuses appelées respectivement fièvres typhoïdes ou  Hygiène et surveillance médicale du
paratyphoïdes. D’autres sérovars sont plus fréquemment impliqués dans des personnel.
infections généralement plus bénignes et des intoxications appelées  Lutte contre les insectes et les rongeurs.
salmonellose comme S.typhimurium, S. dublin, S.panama ou autres. Certains
produisent des toxines (entérotoxines). Les salmonella sont dangereuses et ne
doivent pas être présentes dans un aliment.

Listeria Listeria monocytogenes est capable de survivre longtemps dans des conditions  Renouvellement et port des vêtements
monocytogenes défavorables et son caractère psychrotrophe le rend particulièrement de
travail.
dangereux dans les produits réfrigérés. Il est responsable d'une maladie
 Utilisation et organisation des vestiaires
touchant l'Homme et les animaux (zoonose) appelée la listériose. La listériose  Nettoyage des légumes
humaine atteint préférentiellement la femme enceinte chez qui elle peut  Evacuation des eaux usées, des déchets
provoquer l'interruption de la grossesse, le nouveau-né chez qui elle constitue et
une infection grave, fatale dans un tiers des cas, ainsi que l'adulte immuno- des emballages. (sacs poubelles).
déprimé chez qui elle se traduit le plus fréquemment par des méningites, des  Nettoyage des enceintes froides.
encéphalites et septicémies.  Qualité et efficacité de la plonge.
 Nettoyage des sols.

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  Présence des plantes vertes ou de fleurs.

Flore lactique Bactéries non pathogènes utilisées dans de nombreux procédés de fabrication agroalimentaires afin d’augmenter la conservation
des produits et de participer aux caractéristiques organoleptiques de ceux-ci.
Présentes également dans la flore intestinale de l’homme et des animaux.

Levures et Les moisissures sont en majorité aérobies généralement acidophiles, mésophiles avec certaines espèces psychrophiles. Ils ont un
moisissures besoin faible en eaux par rapport aux autres microorganismes. Elles sont souvent cellulotiques, pectinolytique, amylolytique,
etc.….. C’est pour ces raisons qu’elles sont considérées comme des agents de dégradation utiles ou nuisibles. En alimentation, les
moisissures sont considérées comme étant des agents pathogènes qui attaquent les fruits et les légumes, les saprophytes
contaminent les aliments et les dégradent au point de vue qualitatif et certaines espèces sont toxinogènes, libérant des
mycotoxines graves.
Les levures sont acidophiles et mésophiles. Parmi les levures, seuls quelques rares espèces (Candida albicans, Cryptococcus
neoformans et Candida tropicalis) sont pathogènes, mais elles ne causent pas d’intoxications alimentaires. Les levures ne causent
aucun problème d’aspect sanitaire dans l’alimentation, elles interviennent par contre fréquemment comme contaminants et agents
de dégradation surtout dans les produits acides, sucrés ou alcoolisés.

Autres Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolytica et Streptocoques fécaux ou streptocoques du groupe D

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 II. Démarche d’une analyse microbiologique d’un produit alimentaire

Avant d’envisager la recherche ou le …15… des µorgs, il est indispensable de réaliser rigoureusement
les opérations préliminaires (échantillonnage, prélevement, transport, etc…) à l’analyse proprement
dite de l’aliment. En effet ces dernières ont un grand impact sur la …16…des résultats d’analyse.

1. Echantillonnage et technique de prélèvement

o Produit : la matière qu’on veut analyser.
o Lot : l'ensemble d'individus d'un produit de caractéristiques uniformes.
o Échantillon : une ou plusieurs unités d'échantillonnage prélevées.
o Échantillon global : l’ensemble des unités d’échantillons prélevés du même lot.
o Échantillon pour laboratoire : nombre réduit d’unités de l’échantillon global, de quantité
représentative nécessaire pour analyse au laboratoire (5 unités pour l’analyse microbiologique,
3 unités pour l’analyse physicochimique).

Le prélèvement est une étape fondamentale : si les échantillons ne sont pas correctement prélevés et
manipulés ou ne sont pas représentatifs d’un lot ou d’une production, les résultats d’analyse n’auront
aucune signification.

Le prélèvement se fera alors avec un double souci :

o le souci statistique de faire un prélèvement …17… du produit étudié, c.-à-d. qui est une
image fidèle de l’ensemble d’un lot homogène ou hétérogène, afin de conclure sur ce lot ;
o le souci bactériologique de ne pas modifier la microflore du produit : obtenir un
échantillon intègre afin de stabiliser qualitativement et quantitativement la flore
microbienne présente au moment du ..18… .

On distingue différents modes de prélèvement selon la nature du produit:

 Ecouvillonnage (en surface)

Un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une solution stérile de Bouillon tryptone-sel
additionné de Tween (0,5°/°°). Le prélèvement est effectué par frottement sur la surface du produit;
l’écouvillon est alors immergé dans 10ml de bouillon tryptone-sel. L’analyse est réalisée à partir de la
suspension ainsi obtenue.

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  Rinçage (en surface)

Cette méthode est utilisée dans le cas de récipients ou de tuyauteries; un volume connu de solution
stérile est introduit dans le matériel à analyser. Après agitation, le liquide est récupéré et soumis à
l’analyse.

 Méthode des empreintes (en surface)

Un ruban adhésif préalablement stérilisé par les UV est appliqué sur la surface à étudier. Après
quelques secondes de contact il est retiré et appliqué sur la surface d’un milieu gélosé approprié .Après
quelques heures de contact à la température d’incubation désirée il est retiré et la boîte est incubée
jusqu’à apparition des colonies

 Méthode du cylindre (en surface)

Un cylindre creux de section connue est appliqué sur la surface à analyser; on y introduit alors
quelques ml de diluant stérile et après quelques secondes de contact, le diluant est retiré et analysé.

 Prélèvement de produits liquides

La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut toujours s’assurer de la
parfaite homogénéisation du liquide (agitateurs) avant de prélever à la pipette (ou avec un flacon lesté
stérile ou autre) le volume nécessaire à l’analyse.

 Prélèvement de produits solides

Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde (fromages et produits mous) ou à
la pipette harpon. La surface est souvent éliminée avant de procéder au prélèvement. Si le produit est
hétérogène (plats cuisinés, conserves etc.) il faut s’assurer de la bonne représentativité du prélèvement.

2. Conditionnement et transport des échantillons

Il est indispensable qu’aucun ..19.. extérieur ne vienne fausser la composition de la flore

microbiologique à étudier. Pour cela, chaque échantillon prélevé aseptiquement doit être conditionné
dans des sachets stériles soigneusement fermés et étiquetés avec mention du code de l’échantillon, la
date, l’heure, le lieu de ..20.. , la température initiale et la température de transport.
Les échantillons du produit à analyser doivent être transportés rapidement au laboratoire dans leur
conditionnement d’origine, ce qui évite certaines contaminations. Les températures ci-dessous sont
recommandées durant le transport :

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 o Produits stables (boîtes de conserve et produits secs) : température ambiante (inférieure à
40°C) ;
o Produits congelés ou surgelés : de préférence inférieure à -18 °C, afin de s’assurer qu’il
n’y ait pas de décongélation pendant le transport ;
o Produits facilement altérables : de 1 °C à 8 °C, donc les placés dans un coffre isotherme
(glacière) muni de plaques eutectiques.

3. Réception, entreposage et décongélation des échantillons

o Enregistrer l’échantillon. ;
o Vérifier l’intégrité des contenants ;
o les échantillons d’aliments périssables doivent être analysés dans un délai maximal de 36
heures entre le ..21.. et l’analyse au laboratoire.
o Les échantillons congelés sont décongelés dans le contenant d’origine, au réfrigérateur
pendant 18h ou à l’air ambiant à température voisine de 20°C pendant un temps inférieur à 3
heures, temps suffisant pour atteindre une texture qui permette le ..22.. .

Si exceptionnellement l'analyse doit être reportée, entreposer les échantillons (à l’abri de toute
contamination extérieure) au congélateur, à la température de la pièce, ou au ..23.. , selon la nature de
l’échantillon. L'interprétation des résultats devra tenir compte de cette période d’entreposage.

4. Traitement des échantillons pour analyse

Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique s’effectue toujours à partir
d’une ..24.. . Après ouverture aseptique, l’échantillon sera “homogénéisé” (liquide) ou broyé dans un
volume connu de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait la première dilution. Cet ensemble
(échantillon et diluant) constitue la dilution mère (10-1) ou solution mère (SM) ou émulsion mère (EM)
ou suspension mère (SM). Quant à l’échantillon ..25.. , celui-ci constitue déjà la solution mère.
Ensuite, si nécessaire d’autres dilutions décimales sont réalisées.

Le choix d’un diluant est fonction du microorganisme recherché, de la méthode d’analyse réalisée et
de la nature du produit à analyser. Tous les diluants présentés dans le tableau I sont stérilisables à
121°C pendant 20 minutes.

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 Tableau I. Composition des différents diluants pour 1l d’eau distillée

Tryptone sel Ringer Eau Eau peptonée tamponnée

(solution mère) physiologique

Tryptone 1 g NaCl 9g NaCl 9g bacto peptone 20 g

NaCl 8,5 g KCl 0,42 g NaCl 5g
pH = 7 CaCl2 0,48 g Na2 HPO4 9g
NaHCO3 0,2 g K H2 PO4 1,5 g
pH = 7,2

4.1. Préparation de la solution mère

Une quantité (X g ou X ml) d’échantillon pur est prélevée, puis placée dans un sachet stomacher ou
dans un récipient (flacon, tube) taré stérile (selon la nature de l’échantillon) contenant 9X ml de
diluant ; donc, une partie de l’échantillon et neuf parties de diluant. Dans le cas d’échantillons solides,
cette opération permet la mise en solution des microorganismes. Cette opération permet la mise en
solution
L’ensemble est ensuite broyé et/ou homogénéisé pour permettre la répartition homogène des ..26…
dans l’échantillon. Au cours du broyage (manuel ou électrique) les microorganismes doivent être
dispersés mais non détruits. Les instruments utilisés pour le prélèvement doivent toujours être stériles
et ne servir que pour un seul échantillon ou être nettoyés et stérilisés à nouveau avant chaque
utilisation. Certains instruments (pince, ciseau, etc.) peuvent être stérilisés par flambage à l’alcool
95%.

Exemples de prélèvement

o Aliments solides : peser environ 25 g de l'échantillon (au minimum 10 g) dans un sac stérile
de polyéthylène préalablement taré. Il est important de prélever à 4 ou 5 endroits dans
l'échantillon afin d'obtenir un échantillonnage représentatif. Pour le cas des épices et
assaisonnements l’unité d’analyse est toujours réalisée à partir d’une pesée de 10 g.
Viandes en bloc (prélever le premier centimètre de surface à 4 ou 5 endroits à l'aide d'un
instrument stérile) ; Poisson entier cru (enlever la peau à l'aide d'instruments stériles et
prélever le premier centimètre de surface à 4 ou 5 endroits) ; Volaille cru avec peau (prélever
une proportion de peau avec les premiers centimètres du muscle, à 4 ou 5 endroits sur la coupe
de volaille).
o Aliments semi-liquides : mélanger jusqu’à homogénéisation complète et prélever 25 g.

4.2. Revivification
La revivification est réalisée en laissant en repos le produit de broyage à la température de laboratoire
pendant 20 minutes. En effet, suite au broyage, certaines cellules bactériennes peuvent être

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endommagées et entraîner des variations dans les numérations ou porter à croire qu’il n’y a pas ou peu
de µorgs et donc pas ou aucun risque pour le consommateur.

4.3. Dilutions décimales en série

Cette opération favorisera la dispersion des colonies sur gélose, ce qui facilitera le ..27.. de ces
dernières.

On prélève stérilement 1 ml de SM (aspirer et refouler une fois avant le prélèvement) que l’on
introduit dans un tube contenant 9 ml de diluant stérile. Le tube est agité manuellement par des
mouvements de rotation ou au moyen d’un Vortex. On obtient ainsi une dilution au dixième pour les
liquides ou au centième 10-2 pour les solides). On répète cette opération pour chaque dilution préparée,
jusqu’à l’obtention de dilutions appropriées pour l’inoculation ou l’ensemencement des milieux de
culture.
Toutes les manipulations sont à effectuer avec toutes les précautions d’asepsie exigées en
microbiologie. L’introduction éventuelle d’un contaminant ou la contamination de l’opérateur ne
doivent jamais se produire.

Figure ??. Dilutions décimales en série ou en cascade

5. Ensemencement ou inoculation des bactéries

Entre la préparation de la suspension mère, ses dilutions et la mise en culture, il ne doit pas s’écouler
plus de 45 minutes. L’ensemencement consiste à ..28… des microorganismes sur/dans un milieu de
culture. Ce dernier peut être ensemencé de diverses manières (confère cours et Tp de L3BCM) :

Ensemencement Ensemencement Ensemencement Ensemencement

par stries transversales par inondation par piqûre et par touche par inondation

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6. Incubation des boîtes de Pétri

Quel est le but de cette opération ?

Comment se traduit la croissance bactérienne dans un milieu liquide après 2-15 jours/37°C ? et
sur/dans un milieu solide après 24-72 heures/37°C ?

7. Méthode de dénombrement et expression des résultats

En milieu solide, les résultats les plus fiables proviennent du comptage des boîtes contenant
entre 30 et 300 colonies sur milieu ordinaire. Mais en présence d’agent ..29… ou de
différenciation et pour la flore fongique, on retient pour le calcul les boîtes présentant entre 15
et 150 colonies.
En milieu liquide, sont considérés positifs tous les tubes qui présentent un développement
microbien se traduisant par un trouble. Ce dernier peut être mesuré à l’aide d’un
spectrophotomètre.

Le calcul de la concentration en microorganismes [N] présents dans l’échantillon est une moyenne
pondérée à partir des résultats de 2 dilutions successives. Elle est exprimée en unités formant des
colonies par unité de volume (UFC/ml) ou de masse (UFC/g) du produit pur en appliquant la formule
suivante :

N = Σ𝒄 / (n1 + 0,1n2).d.v

N : concentration bactérienne par unité de volume de produit (UFC /ml)

Σ𝒄 : somme des colonies comptées sur les boîtes retenues de 2 dilutions successives

v : volume de l'inoculum appliqué à chaque boîte (généralement 1ml en masse et 0.1ml en surface)

d: la dilution correspondant à la première dilution retenue

n1 : nombre de boites considérées à la première dilution retenue.

n2 : nombre de boites considérées à la deuxième dilution retenue.

Remarque
- Dans le cas d’une seule dilution pour n boite de Pétri. N = Σ𝒄 /n.d.v
- Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs.
- Si aucune boîte ne contient au moins 30 colonies, faire la moyenne arithmétique des
colonies comptées sur les 2 boîtes de la plus petite dilution d et tenir compte de cette
dilution. Bien préciser dans l’expression du résultat qu’il s’agit alors d’une estimation en

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 rédigeant ainsi : « nombre estimé de microorganismes par millilitre = ... » ou « nombre
estimé de microorganismes par gramme = ... ».

8. Interprétation des résultats

Tout contrôle suppose l’existence de spécifications microbiologiques et/normes et toute

expérimentation sera donc interprétée et jugée par comparaison aux exigences inscrites dans ces
dernières. L’objectif est la gestion de la qualité et les résultats seront déclarés conformes ou non.
o Les spécifications microbiologiques sont des critères applicables pendant et après la
préparation afin de s’assurer que l’hygiène et les conditions de productions ont satisfaisantes
et en accord avec la règlementation.
o Les normes sont des spécifications microbiologiques adoptées par la législation qui
s’adressent au produit fini et fixent les limites acceptables de présence de microorganismes
donnés dans des produits bien définis.

Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux (OMS, FAO, ISO,

AFNOR, CE, AFSSA, DGCCRF, ACONOQ, CACQ, etc.) qui se préoccupent de l’établissement de
critères de qualité microbiologique de nos aliments.

L’interprétation des résultats se fait selon un plan d’échantillonnage. Il s’agit d’un ensemble
d’instructions qui indique la taille de l’échantillon (nombre d’unités d’échantillon) pour une taille de
lot déterminé et qui définit les conditions et les modalités d’une acceptation ou d’un refus d’un lot.
Un plan d’échantillonnage prend en compte 4 paramètres :
 n : nombre d’échantillons unitaires à prélever à partir de chaque lot. Il peut varier en fonction
du risque, de la taille des lots et parfois du nombre d’unités disponibles. En général n= 5 dans
un plan à 3 classes et, 5 ou 10 dans un plan à deux classes.
 m : la limite en dessous de laquelle tous les résultats sont considérés comme satisfaisants.
 M : le seuil limite d’acceptabilité au-delà duquel les résultats ne sont plus considérés comme
satisfaisants, sans que le produit soit dangereux. M = 10 m en milieu solide et M= 30 m en
milieu liquide.
 c : le seuil de tolérance ou nombre maximal acceptable d’unités d’analyse donnant les valeurs
comprises entre m et M.

Dans la pratique, selon les microorganismes retenus et leur signification, on utilisera l’un des deux
types de plans suivants :

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Plan à deux classes (ou niveaux)
Fondé sur la définition d’une seule valeur limite de référence, séparant la conformité de la non-
conformité. …… des unités d’analyse ne doit dépasser la limite indiquée. L’indice c est par
convention égal à 0. Autrement dit, on ne tolère pas dans l’aliment la présence d’une contamination
microbienne.

Tableau ??. Mention de la qualité microbiologique d’un échantillon dans un plan à 2 classes

1er cas : présence ou absence d’un µorg dans une 2eme cas : nombre de µorg supérieur ou
quantité donnée d’aliment inférieur à une limite

m=0 m ≠ 0 (m =M)
Absence Présence Inférieur ou égal Supérieur

Satisfaisant Non satisfaisant Satisfaisant Non satisfaisant

(corrompu)

1ère classe 2ème classe 1ère classe 2ème classe

- Salmonella dans 10 ou 25g d’aliments. Listeria monocytogenes dans les denrées

- Listeria monocytogenes dans 10 ou 25g de prêtes à être consommées permettant son
denrées destinées aux nourrissons et denrées développement.
prêtes à être consommées permettant son
développement.

Plan à trois classes.

Ce plan est utilisé lorsqu’on tolère la présence d’un certain niveau de contamination dans l’aliment.
On définit deux valeurs limites de référence : L’indice m séparant la conformité de la qualité
marginale tolérée et l’indice M séparant la qualité marginale tolérée de la non-conformité.

Tableau ??. Mention de la qualité microbiologique d’un échantillon dans un

plan à 3 classes

Concentration Résultat/ Mention Classe

ere
≤m Satisfaisant 1 classe
En milieu ] m – M] Acceptable 2eme classe
solide ] M – 1000 m] Non satisfaisant
M =10 m >1000 m Corrompu 3eme classe

≤m Satisfaisant 1ere classe

En milieu ] m – M] Acceptable 2eme classe
liquide ] M – 1000 m] Non satisfaisant
M = 30 m
>1000 m Corrompu 3eme classe

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 Mention globale de la qualité microbiologique d’un lot dans un plan à 3 classes
o Satisfaisante : si tous les dénombrements sont satisfaisants = tous les
dénombrements sont ≤ m avec, absence de Salmonella.
o Acceptable : si le nombre de dénombrements acceptables est ≤ à c et la somme des
autres satisfaisants.
o Non satisfaisante : si le nombre de dénombrements acceptables est > à c ou si un
seul dénombrement est ≥ à M mais < à 1000 m.
o Corrompue : présence de Salmonella ou un seul dénombrement ≥ 1000 m.

III. Exercices

1. L’analyse de deux denrées alimentaires (X et Y) prélevées dans des grands restaurants de la

place a fourni les résultats consignés dans le tableau suivant :
X Y Critères
FMAT 3,7.107 2, 9.105 3.105
Coliformes totaux 2,5.105 2.103 103
Coliformes thermotolérants 2,5.103 25 10
S. aureus 105 0 100
A.S.R 0 0 30
Salmonella Absence Présence Absence

a. Interprétez les résultats du tableau en considérant chaque groupe de microorganismes

pour chacune des denrées X et Y.
b. Quelles conclusions tirez-vous quant à la qualité microbiologique de ces denrées après
analyse ?

2. Les résultats de l’analyse microbiologique d’une denrée alimentaire produite industriellement

a révélé sa non-conformité pour la présence respectivement de la FMAT, d’Escherichia coli et
Staphylococcus aureus. Interprétez ces résultats.

3. On dénombre dans des lots de viande hachée (par une méthode en milieu solide) les E.coli, les
résultats sont :
Lot a : 220 ; 140 ; 600 ; 150 ; 100 (par gramme)
Lot b : 110 ; 40 ; 30 ; 50 ; 20 (par gramme)
Les critères sont n = 5 ; c = 2 ; m = 50 UFC/g ; M = 500 UFC/g.
Quel sera le résultat rendu pour les trois lots A, B et C ? Justifier.

4. L'analyse de 5 échantillons de viande hachée d'un lot conduit aux résultats suivants :
S. aureus (milieu solide).
Lot a : 150- 540 - 330 -80 – 200
Lot b: 60 - 140 - 90 - 1200 – 280
Les critères sont n = 5 ; c = 1 ; m = 500 UFC/g ; M = 5.000 UFC/g.
Conclure quant à la qualité microbiologique de chaque lot.

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