Utilisation de Nanoparticules D'or Plasmoniques Pour Le Relargage Contrôlé de Médicaments Et La Détection d'ATP en Milieu Cellulaire

Utilisation de nanoparticules d’or plasmoniques pour le
relargage contrôlé de médicaments et la détection

d’ATP en milieu cellulaire
Mémoire
Mélina Drouin
Maîtrise en chimie
Maître ès Sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Mélina Drouin, 2017

Utilisation de nanoparticules d’or plasmoniques pour le
relargage contrôlé de médicaments et la détection
d’ATP en milieu cellulaire
Mémoire
Mélina Drouin
Sous la direction de :
Denis Boudreau, directeur de recherche

Résumé
Les nanomatériaux attirent l’attention dans le domaine biomédical en raison de leurs propriétés liées à
leur taille. Les nanoparticules métalliques, plus particulièrement, possèdent un plasmon de surface
localisé leur conférant une signature d’extinction de la lumière caractéristique. Bien que l’argent
possède de meilleures propriétés plasmoniques, l’or est habituellement préféré pour des applications
médicales, puisqu’il est stable en conditions biologiques en plus d’être biocompatible. Ce projet a donc
pour objectif d’exploiter les propriétés des nanoparticules d’or dans le cadre de deux applications : le
relargage contrôlé de médicaments et la détection d’analytes en milieu cellulaire.
Dans un premier temps, des nanobâtonnets d’or possédant une bande plasmonique dans le proche
infrarouge sont utilisés afin de développer des nano-véhicules pour le transport actif de médicaments.
Ces bâtonnets sont entourés d’une couche de polymère thermosensible permettant l’encapsulation et
le transport de biomolécules jusqu’au site biologique d’intérêt. Un laser dans le proche infrarouge est
utilisé comme stimulus externe pour déclencher le relargage des molécules bioactives en causant une
augmentation locale de température autour des nanobâtonnets. Ces nouveaux modules sont
développés en collaboration avec le Dr. Patrick Mathieu à l’Institut universitaire de cardiologie et de
pneumologie de Québec pour étudier la décalcification des valves cardiaques.
Le second projet vise à développer un outil micrométrique pour la détection d’adénosine

5’-triphosphate dans l’environnement des cellules, et ce, en collaboration avec les groupes des
professeurs Jean-François Masson de l’Université de Montréal et Joachim Spatz de l’Université
d’Heidelberg en Allemagne. Cet outil consiste en une micropipette de verre recouverte de
nanoparticules d’or fonctionnalisée avec un aptamère fluorescent qui possède une grande affinité pour
l’ATP. Lorsque l’aptamère se lie à sa cible, il se replie sur lui-même, rapprochant ainsi le fluorophore
de la surface plasmonique. En microscopie de fluorescence, il est possible de mesurer l’extinction de
fluorescence résultant de ce changement de conformation pour quantifier la concentration d’ATP
localement.
iii
Abstract
Nanomaterials have attracted a great deal of attention in the fields of biology and medicine because of
their unique properties arising from their small size. Metallic nanoparticles, more precisely, can interact
with light in various ways as a result of their localized surface plasmon. Even though silver is the best
plasmonic material, gold is usually preferred for medical applications because it is both more stable in
biological conditions and biocompatible. Therefore, the objective of this project is to take advantage of
the properties of gold nanoparticles in two distinct applications: controlled drug delivery and detection
of biomolecules in cell cultures.
First, gold nanorods with a plasmon in the near-infrared region are used to develop new nanocarriers
for active drug transport. These nanorods are covered with a thermosensitive polymeric shell allowing
the encapsulation of bioactive molecules. A near-infrared laser is used as an external stimulus to trigger
the release of the drug once the nanocarriers have reached the desired biological location by locally
increasing the temperature of the gold nanorods. These new modules are developed in collaboration
with Dr. Patrick Mathieu from the Quebec Heart and Lung Institute of Université Laval in order to study
the decalcification of heart valves.
The second project aims at developing a micrometric tool for the detection of adenosine 5’-triphosphate
in the vicinity of live cells, in collaboration with the groups of Prof. Jean-François Masson of Université
de Montréal and Prof. Joachim Spatz of Heidelberg University in Germany. This tool consists of a glass
micropipette covered with gold nanoparticles and functionalized with a fluorescent ATP-selective
aptamer. Upon binding to its target, the aptamer changes conformation to form a hairpin, which brings
the fluorophore closer to the plasmonic surface. Using fluorescence microscopy, it is possible to
measure the fluorescence quenching resulting from this change of conformation, and thus to quantify
the concentration of ATP locally.
iv
Table des matières
Résumé .............................................................................................................................................. iii
Abstract ............................................................................................................................................. iv
Table des matières ............................................................................................................................ v
Liste des tableaux ........................................................................................................................... vii
Liste des figures ............................................................................................................................. viii
Liste des abréviations .................................................................................................................... xiii
Remerciements .............................................................................................................................. xvii
1. Introduction .................................................................................................................................. 1
1.1 Utilisation de nanoparticules d’or pour le relargage contrôlé de médicaments ...................... 3
1.2 Utilisation de nanoparticules d’or comme biocapteurs pour la mesure d’ATP dans des
cultures cellulaires .................................................................................................................. 7
1.3 Liste des objectifs des deux projets ..................................................................................... 12
2. Principes théoriques .................................................................................................................. 13
2.1 Nanomatériaux ..................................................................................................................... 13
2.1.1 Nanoparticules métalliques ...........................................................................................13
2.1.2 Mécanisme de formation de nanoparticules .................................................................14
2.2 Fluorescence ........................................................................................................................ 16
2.2.1 Mécanismes menant à la luminescence .......................................................................16
2.2.2 Extinction de fluorescence ............................................................................................18
2.2.3 Interactions entre un fluorophore et une nanoparticule métallique ..............................19
2.3 Polymères thermosensibles ................................................................................................. 22
2.4 Aptamères d’acides nucléiques ............................................................................................ 23
2.4.1 Avantages .....................................................................................................................23
2.4.2 Processus de sélection .................................................................................................24
3. Méthodes expérimentales ......................................................................................................... 26
3.1 Méthodes de synthèse ......................................................................................................... 26
3.1.1 Nanoparticules d’or sphériques ....................................................................................26
3.1.2 Nanobâtonnets d’or .......................................................................................................27
3.2 Techniques de caractérisation.............................................................................................. 31
3.2.1 Microscopie électronique à transmission et à balayage ...............................................31
3.2.2 Microscopie de fluorescence ........................................................................................34
3.2.3 Spectrométrie d’émission atomique à plasma à couplage inductif ...............................36
3.2.4 Diffusion dynamique de la lumière ................................................................................38
3.2.5 Analyse du suivi individuel des particules.....................................................................39
3.2.6 Liste des appareils ........................................................................................................40
4. Développement de nano-véhicules plasmoniques pour le relargage contrôlé de
médicaments en milieu biologique .......................................................................................... 41
4.1 Nanobâtonnets d’or .............................................................................................................. 41
v
4.1.1 Protocoles de synthèse.................................................................................................41
4.1.2 Caractérisation ..............................................................................................................43
4.2 Couche de silice ................................................................................................................... 48
4.2.1 Protocole de synthèse ..................................................................................................48
4.3 Couche de polymère thermosensible ................................................................................... 52
4.3.1 Choix du polymère ........................................................................................................52
4.3.2 Premier protocole de synthèse .....................................................................................53
4.3.3 Caractérisation et problèmes rencontrés ......................................................................54
4.3.4 Second protocole de synthèse .....................................................................................56
5. Développement d’une sonde micrométrique pour la détection d’ATP dans
l’environnement des cellules .................................................................................................... 62
5.1 Aptamère spécifique à l’ATP ................................................................................................ 62
5.1.1 Choix de l’aptamère ......................................................................................................62
5.1.2 Modifications apportées à l’aptamère ...........................................................................64
5.2 Synthèse des nanoparticules d’or ........................................................................................ 65
5.2.1 Protocole de synthèse ..................................................................................................65
5.3 Préparation du substrat plasmonique ................................................................................... 69
5.3.1 Protocole de préparation ..............................................................................................69
5.4 Détection d’ATP dans un milieu tampon contrôlé ................................................................ 75
5.4.1 Montage de microscopie de fluorescence ....................................................................75
5.4.2 Résultats en microscopie de fluorescence ...................................................................77
6. Conclusion et perspectives ...................................................................................................... 85
Bibliographie.................................................................................................................................... 89
Annexe 1 – Protocole détaillé pour la première synthèse de nanobâtonnets d’or 76................ 97
Annexe 2 – Protocole détaillé pour la seconde synthèse de nanobâtonnets d’or100 ............... 99
Annexe 3 – Protocole détaillé pour le dosage des nanobâtonnets d’or par ICP-AES ........... 100
Annexe 4 – Protocole détaillé pour l’ajout d’une couche de silice à la surface des
nanobâtonnets d’or107,108 ......................................................................................................... 101
Annexe 5 – Protocole détaillé pour l’ajout d’une couche de polymère thermosensible sur
la silice113................................................................................................................................... 102
Annexe 6 – Protocole détaillé pour l’ajout d’une couche de polymère thermosensible sur
la surface d’or115 ....................................................................................................................... 103
Annexe 7 – Protocole détaillé pour la synthèse de nanoparticules d’or sphériques ............ 104
Annexe 8 – Protocole détaillé pour la préparation des biocapteurs à base de
micropipettes de verre ............................................................................................................. 105
vi
Liste des tableaux
Tableau 3.1 – Liste des appareils utilisés pour la caractérisation des nanoparticules d’or .............. 40
Tableau 4.1 – Évolution des dimensions et du ratio d’aspect des nanobâtonnets au cours de la
première synthèse. ............................................................................................................................ 43
Tableau 4.2 - Dimensions et concentration des nanobâtonnets obtenus avec le second protocole
de synthèse. ...................................................................................................................................... 47
Tableau 4.3 – Épaisseur de la coquille obtenue pour l’ajout de différents volumes d’une solution
de TEOS 9 mM, tel que déterminé à l’aide des images TEM. .......................................................... 50
Tableau 5.1 – Évolution des propriétés des nanoparticules d’or au cours de la synthèse. Données
extraites des analyses au TEM, en NTA et en spectroscopie UV-visible. ........................................ 67
Tableau 5.2 – Liste des composantes du premier montage de microscopie de fluorescence. ........ 75
Tableau 5.3 – Liste des composantes du second montage de microscopie de fluorescence. ......... 80
vii
Liste des figures
Figure 1.1 – Quelques exemples de nanomatériaux utilisés dans le domaine biomédical. 1 .............. 1
Figure 1.2 –Schéma présentant la cytotoxicité des nanoparticules d’argent en milieu biologique riche
en phosphates et chlorures.8 ............................................................................................................... 2
Figure 1.3 – Utilisation des nanoparticules d’or sous différentes formes pour des applications
biomédicales.11 .................................................................................................................................... 2
Figure 1.4 – Différents types de stimuli utilisés afin de contrôler le relargage d’un médicament. 1 ..... 4
Figure 1.5 – Absorption de différents composantes des tissus.19 ....................................................... 5
Figure 1.6 – Schéma illustrant la meilleure pénétration des tissus dans la fenêtre de transparence
biologique.21......................................................................................................................................... 5
Figure 1.7 – Schéma du nano-transporteur plasmonique imaginé afin de répondre aux objectifs du
projet. ................................................................................................................................................... 6
Figure 1.8 – Structure chimique de l’adénosine 5’-trisphosphate et de ses sous-produits d’hydrolyse,

l’adénosine 5’-diphosphate et l’adénosine 5’-monophosphate.26........................................................ 7
Figure 1.9 – Méthode de détection d’ATP par bioluminescence entre une luciférase et la D-
luciférine.32........................................................................................................................................... 8
Figure 1.10 – Schéma présentant la technique de détection d’ATP à la surface des cellules par
l’incorporation d’une luciférase membranaire à l’aide d’une mutation génétique.31 ............................ 9
Figure 1.11 – a) Métabolisme enzymatique du glycérol en présence d’ATP et d’oxygène, suivi de

l’oxydation du peroxyde d’hydrogène la surface de l’électrode de platine. b) Droite d’étalonnage du
biocapteur par électrochimie.34.......................................................................................................... 10
Figure 1.12 – Schéma de concept de l’outil développé par le groupe de Jean-François Masson pour
la détection de bioanalytes dans l’environnement des cellules par diffusion Raman exaltée par une
surface plasmonique.35 ...................................................................................................................... 11
Figure 1.13 – Schéma de concept de l’outil micrométrique développé afin de répondre aux différents
objectifs du projet. ............................................................................................................................. 11
Figure 2.1 – Schéma présentant un plasmon de surface localisé pour une particule métallique
soumise à un champ électromagnétique externe.39 .......................................................................... 13
Figure 2.2 - Spectres d’extinction normalisés pour (A) des nanoparticules sphériques de différentes
compositions et (B) des nanoparticules sphériques d’argent de différentes tailles. 42....................... 14
Figure 2.3 – (A) Diagramme d’énergie libre de nucléation avec, en rouge, la courbe résultante des
deux phénomènes compétitifs. (B) Diagramme de LaMer illustrant la nucléation et la croissance de
nanoparticules.44................................................................................................................................ 15
Figure 2.4 – Diagramme de Jablonski illustrant les différents types de transitions électroniques qui
peuvent avoir lieu lors des processus de luminescence.48 ............................................................... 17
Figure 2.5 – Positions spectrales relatives des phénomènes d’absorption, de fluorescence et de

phosphorescence.47 .......................................................................................................................... 18
Figure 2.6 – Diagramme de Jablonski modifié pour un fluorophore à proximité d’une particule
plasmonique, avec l’apparition de nouveaux chemins d’excitation et d’émission du fluorophore.49 19
viii
Figure 2.7 – Impact de la distance entre une nanoparticule métallique et un fluorophore sur les
composantes d’extinction et d’exaltation de fluorescence.50 ............................................................ 20
Figure 2.8 – Facteurs d’exaltation de fluorescence pour des fluorophores placés à proximité de
nanoparticules (A) d’argents42 et (B) d’or51 de différents diamètres recouvertes d’une couche de silice
modulable. ......................................................................................................................................... 21
Figure 2.9 – Diagrammes de phase illustrant la température critique (A) inférieure et (B) supérieure
de solubilité de polymères thermosensibles.52 .................................................................................. 22
Figure 2.10 – Schéma de concept d’un hydrogel thermosensible s’affaissant sur lui-même à une
température supérieure à sa LCST, libérant ainsi son cargo .54 ....................................................... 23
Figure 2.11 – Changement de conformation d’un aptamère en réponse à sa molécule-cible, ici

l’ATP.56 .............................................................................................................................................. 23
Figure 2.12 – Schéma de la méthode SELEX utilisée pour isoler les aptamères.59 ......................... 24
Figure 3.1 – Schéma de synthèse pour (A) le protocole de Turkevich et (B) le protocole de Brust. 62
........................................................................................................................................................... 26
Figure 3.2 – (A) Oscillation transversale et longitudinale des électrons de conduction des
nanobâtonnets. (B) Spectres d’extinction pour des nanobâtonnets d’or ayant différents ratios
d’aspect. (C) Images de microscopie électronique à transmission des nanobâtonnets caractérisés en
(B) (barre d’échelle de 50 nm).64 ....................................................................................................... 27
Figure 3.3 - Structure chimique du CTAB et son arrangement sous forme de bicouche à la surface
des nanobâtonnets d’or.64 ................................................................................................................. 28
Figure 3.4 – Formes de nanoparticules attendues suite à l’ajout de différents halogènes à une solution
de croissance de germes d’or contenant du nitrate d’argent.75 ........................................................ 29
Figure 3.5 – (A) Schéma réactionnel de la réduction autocatalytique du complexe d’or à la surface
des nanoparticules. (B) Croissance et changement de morphologie des nanobâtonnets au fil du
temps.72 ............................................................................................................................................. 30
Figure 3.6 – (A) Image HR-TEM d’un nanobâtonnet d’or et (B) sa cartographie élémentaire
correspondante obtenue par STEM-EDX montrant la présence d’argent sur toutes les facettes
cristallines.82 ...................................................................................................................................... 31
Figure 3.7 – Schéma des phénomènes pouvant avoir lieu lors de l’interaction entre un faisceau
d’électrons incidents et un échantillon.88 ........................................................................................... 32
Figure 3.8 – Schéma des composantes d’un microscope optique en comparaison avec un microscope
électronique à transmission et à balayage.90 .................................................................................... 33
Figure 3.9 – Schéma des composantes typiques d’un montage de microscope de fluorescence. 92 34
Figure 3.10 – (A) Spectres d’excitation et d’émission d’un fluorophore et (B) signatures de
transmission des différentes composantes du cube de fluorescence utilisé pour imager ce fluorophore
(filtre d’excitation, miroir dichroïque et filtre d’émission) . 91 ............................................................... 35
Figure 3.11 – Processus d’atomisation d’un échantillon introduit dans une source à plasma.93 ...... 36
Figure 3.12 – Schéma des composantes d’un spectromètre d’émission atomique dans un ICP-AES.93
........................................................................................................................................................... 37
Figure 3.13 – Fluctuations temporelles de l’intensité de diffusion d’une lumière laser par de grosses
particules comparativement à de petites particules.95....................................................................... 38
ix
Figure 3.14 – Distinction entre le rayon réel des nanoparticules, tel que mesuré au TEM, et le rayon
hydrodynamique calculé à l’aide de l’analyse DLS.97 ....................................................................... 39
Figure 3.15 – Schéma du montage optique utilisé pour les mesures d’analyse du suivi individuel des
particules.98........................................................................................................................................ 40
Figure 4.1 – Schéma de concept du premier protocole de synthèse de nanobâtonnets d’or utilisé. 41
Figure 4.2 – Schéma de concept du second protocole de synthèse de nanobâtonnets d’or utilisé. 42
Figure 4.3 – Images TEM pour les nanobâtonnets obtenus avec le premier protocole pour des
aliquots prélevés (A) après la première étape de croissance, puis après (B) 30 min, (C) 60 min, (D)
90 min, (E) 120 minutes et (F) la totalité de la seconde croissance. ................................................ 43
Figure 4.4 – Évolution du spectre d’extinction des nanobâtonnets au cours de la première synthèse
pour une même concentration de nanoparticules en solution. ......................................................... 44
Figure 4.5 – (A) Distribution de tailles des nanobâtonnets à la fin de la seconde croissance tel que
déterminé au TEM (n = 187) avec, en bleu, la droite désignant les dimensions de nanosphères. (B)
Évolution de la concentration d’or déterminée par ICP-AES pour des aliquots de nanobâtonnets
dissous dans de l’eau régale avec, en bleu, la droite désignant la concentration d’or dans le milieu
réactionnel (λ = 267,595 nm)............................................................................................................. 45
Figure 4.6 - Images TEM pour les nanobâtonnets obtenus avec le second protocole pour les
synthèses A, B et C. .......................................................................................................................... 46
Figure 4.7 - Spectres d’extinction des nanobâtonnets obtenus avec la seconde méthode de synthèse
comparativement à la première méthode. ......................................................................................... 48
Figure 4.8 – Schéma de la méthode d’ajout d’une couche de silice à la surface des nanobâtonnets
d’or par échange de ligands, puis condensation de TEOS. .............................................................. 49
Figure 4.9 – Mécanisme d’hydrolyse et de condensation d’un précurseur alkoxysilane par un procédé
de type Stöber catalysé par une base.109 .......................................................................................... 49
Figure 4.10 – Images de microscopie électronique à transmission de nanobâtonnets d’or recouverts

d’une couche de silice de (A) (8±1) nm, (B) (16±1) nm, (C) (23±2) nm, (D) (25±2) nm et (E) (30±3)
nm. ..................................................................................................................................................... 50
Figure 4.11 – Évolution de la couche de silice sur les nanobâtonnets d’or pour l’ajout de différents
volumes de TEOS 9 mM. .................................................................................................................. 51
Figure 4.12 – Spectres d’extinction des nanobâtonnets d’or après l’échange de ligands avec le
MPTMS, puis après l’étape d’ajout d’une couche de silice d’épaisseur modulable. ......................... 52
Figure 4.13 – (A) Structure de deux monomères : le NIPAM et le NIPMAM. (B) LCST de différents
polymères thermosensibles, dont le PNIPAM (en bleu) et le PNIPMAM (en magenta). 112 .............. 53
Figure 4.14 – Schéma de synthèse pour l’ajout d’une coquille de polymère thermosensible à la
surface des nanobâtonnets d’or recouverts de silice par (A) fonctionnalisation de surface à l’aide de
groupements méthacrylate, puis (B) polymérisation par précipitation du NIPMAM. ......................... 54
Figure 4.15 – Images TEM de AuNBs@SiO2@MPS (A) dans l’éthanol et (B) dans l’eau après 2 h à
70°C. À titre de comparaison, images TEM de AuNPs@SiO 2 (C) dans l’éthanol et (D) dans l’eau
après 2 h à 70°C. .............................................................................................................................. 55
Figure 4.16 - Schéma de synthèse alternatif pour l’ajout d’une coquille de polymère thermosensible
à la surface des nanobâtonnets d’or par (A) polymérisation par précipitation du styrène, puis (B)
polymérisation par précipitation du NIPMAM. ................................................................................... 56
x
Figure 4.17 – Spectres d’extinction des nanobâtonnets d’or à différentes étapes de l’ajout d’une
couche de PNIPMAM. ....................................................................................................................... 57
Figure 4.18 – Images TEM de AuNBs@PS@PNIPMAM (A) après 30 min et (B) après 120 min de
polymérisation du NIPMAM, puis (C) après un traitement thermique à 46°C pour l’échantillon en (A).
Analyse DLS de (D) AuNBs@PS et (E) AuNBs@PS@PNIPMAM en fonction de la température. . 58
Figure 4.19 – Spectres d’extinction des nanobâtonnets d’or après des traitements dans différents
milieux réactionnels. .......................................................................................................................... 59
Figure 4.20 – Images TEM de nanobâtonnets d’or (A) directement après leur synthèse, (B) après un
traitement de 2h dans l’eau à 70°C et (C) après un traitement de 2h dans l’eau à 70 °C en présence
de KPS. ............................................................................................................................................. 59
Figure 4.21 - Distribution de tailles des nanobâtonnets après différents traitements tel que déterminé
au TEM. ............................................................................................................................................. 60
Figure 4.22 – Analyse DLS des nanobâtonnets d’or dans l’eau nano à température pièce. ............ 61
Figure 5.1 – (A) Schéma présentant le changement de conformation attendu pour deux aptamères
spécifiques à l’ATP possédant une séquence d’acides nucléiques légèrement différente. (B) Courbes
de dénaturation des deux aptamères en présence d’urée mesurées par électrochimie. (C) Courbes
de réponse des aptamères à l’ATP mesurées par électrochimie.120 ................................................ 62
Figure 5.2 – Schéma du repliement de l’aptamère pleine longueur (27 bases azotées) (A) en absence
d’ATP et (B) en présence d’ATP avec l’alignement des paires de bases. L’encadré noir présente le
site de liaison des deux molécules d’ATP.121 En rouge, les bases nucléiques absentes dans la
séquence de l’aptamère déstabilisé sont mises en évidence.120 ...................................................... 63
Figure 5.3 – Modifications apportées aux extrémités de l’aptamère sensible à l’ATP. (A) Ajout à
l’extrémité 5’ d’une chaine alcane possédant un lien disulfide. (B) Ajout à l’extrémité 3’ d’un
fluorophore, le Quasar 670, avec (C) ses spectres d’excitation et d’émission dans l’eau. ............... 65
Figure 5.4 – Schéma de synthèse des nanoparticules d’or sphériques par croissance contrôlée de
germes. .............................................................................................................................................. 66
Figure 5.5 – (A) Image TEM des germes d’or. (B) à (F) Images TEM des nanoparticules d’or obtenues
lors de la croissance après chacun des 5 ajouts de réactifs. ............................................................ 67
Figure 5.6 – Distributions de tailles normalisées de nanoparticules d’or en solution, tel que déterminé
par analyse du suivi individuel des particules. .................................................................................. 68
Figure 5.7 – Évolution du spectre d’extinction des nanoparticules d’or au cours de la croissance. . 69
Figure 5.8 – Schéma de la fonctionnalisation des micropipettes de verre lors de la fabrication du

biocapteur. ......................................................................................................................................... 69
Figure 5.9 – Mécanisme en quatre étapes proposé pour la polycondensation d’un silane tel que
l’ATPMS à la surface d’un substrat de verre. 125 ................................................................................ 70
Figure 5.10 – Mécanisme de réduction d’un lien disulfide à l’aide du TCEP. 127 ............................... 71
Figure 5.11 – Schéma d’une monocouche de molécules thiolées sur une surface d’or, les sphères
jaunes représentant les atomes de soufre, avec les défauts de surface possibles.129 ..................... 71
Figure 5.12 – Schéma de greffage de l’aptamère (en jaune) et du 6-mercaptohexanol (en mauve
foncé) à la surface d’une nanoparticule d’or. .................................................................................... 72
xi
Figure 5.13 – Images SEM d’une micropipette recouvertes de nanoparticules d’or de 47 nm. (A) Vue
d’ensemble de la pointe et (B) vue rapprochée de la surface permettant de distinguer les
nanoparticules individuellement. ....................................................................................................... 72
Figure 5.14 – Spectres d’extinction de nanoparticules d’or déposées sur une surface de verre avec
une faible densité et une grande densité.130 ..................................................................................... 73
Figure 5.15 – Comparaison du spectre d’extinction des nanoparticules d’or en solution et du spectre
de diffusion des nanoparticules d’or sur la pointe de la micropipette, mesurés en microscopie à champ
sombre à l’aide d’un sténopé de 5 µm et d’un spectromètre UV-visible Ocean Optics USB 2000+.
Superposition des spectres des nanoparticules avec les spectres d’excitation et d’émission du
Quasar 670. ....................................................................................................................................... 74
Figure 5.16 – Concordance entre les spectres d’excitation et d’émission du Quasar 670 et les
spectres de transmittance des composantes du cube de fluorescence utilisées dans le montage
optique. .............................................................................................................................................. 76
Figure 5.17 – Schéma du montage d’élution placé sur la platine du microscope, composé d’une
lamelle de verre sur laquelle est immobilisée une pointe de micropipette surmonté d’une cellule de
polydiméthylsiloxane permettant l’insertion de solutions aqueuses. ................................................. 77
Figure 5.18 – (A) Correction du déplacement de la pointe lors de l’expérience par un traitement
d’image sur le logiciel ImageJ grâce à l’extension StackReg. (B) Mesure de la moyenne des niveaux
de gris de différentes régions d’intérêt (en pointillé) sur la pointe du biocapteur à l’aide du logiciel de
traitement d’images. .......................................................................................................................... 78
Figure 5.19 – Variation du signal de fluorescence de la pointe de la pipette en fonction de la

concentration d’ATP présente dans la cellule à perfusion. Les mesures sont effectuées sur le premier
montage de microscopie de fluorescence et la cellule est lavée à l’aide de tampon PBS entre chaque
étalon d’ATP analysé. ....................................................................................................................... 79
Figure 5.20 - Variation du signal de fluorescence de la pointe de la pipette en fonction de la

concentration d’ATP présente dans la cellule à perfusion. Les mesures sont effectuées sur le second
montage de microscopie de fluorescence et la cellule est lavée à l’aide de tampon PBS entre chaque
étalon d’ATP analysé. ....................................................................................................................... 81
Figure 5.21 – Courbes d’étalonnage obtenues pour quatre pipettes préparées sur une échelle de
plusieurs mois avec différents lots de réactifs et différents lots d’aptamère. Les barres d’erreur sur
les courbes des pipettes 3 et 4 correspondent à l’écart-type sur des données provenant de trois
régions d’intérêt sur chaque pipette. ................................................................................................. 81
Figure 5.22 – Comparaison des courbes d’étalonnage obtenues pour des pipettes recouvertes de
nanoparticules d’or de 90 nm et de 50 nm et pour des biocapteurs avec et sans 6-mercaptohexanol.
........................................................................................................................................................... 82
Figure 5.23 - Schéma de greffage de l’aptamère (en jaune) en l’absence de 6-mercaptohexanol à la

surface d’une nanoparticule d’or. ...................................................................................................... 83
Figure 6.1- Déplacement du CTAB à la surface de nanobâtonnets d’or par échange de ligands avec
du PEG-SH, puis avec du RSH.64 ..................................................................................................... 87
xii
Liste des abréviations
ADN Acide désoxyribonucléique
ADP Adénosine 5’-diphosphate

AMP Adénosine 5’-monophosphate
APTMS (3-Aminopropyl)triméthoxysilane
AR Ratio d’aspect
ARN Acide ribonucléique
ATP Adénosine 5’-triphosphate
AuNBs Nanobâtonnets d’or
Nanobâtonnets d’or recouverts de
AuNBs@MPTMS
(3-mercaptopropyl)triméthoxysilane
AuNBs@PS Nanobâtonnets d’or recouvertes de polystyrène
Nanobâtonnets d’or recouvertes de polystyrène, puis de
AuNBs@PS@PNIPMAM
poly(N-isopropylméthacrylamide)
AuNBs@SiO2 Nanobâtonnets d’or recouverts de silice
Nanobâtonnets d’or recouverts de silice, puis de
AuNBs@SiO2@MPS
3-méthacryloxypropyltriméthoxysilane
AuNPs Nanoparticules d’or sphériques
AuNPs@SiO2 Nanoparticules d’or sphériques recouvertes de silice
CCD Dispositif à transfert de charge
Ccrit Concentration critique de nucléation
CMC Concentration micellaire critique
nu
Cmax Concentration de nucléation maximale
nu
Cmin Concentration de nucléation minimale
CS Concentration de solubilité
CTAB Bromure de cétyltriméthylammonium
CTAC Chlorure de cétyltriméthylammonium
CTAI Iodure de cétyltriméthylammonium
Concentration d’un métal dans une solution de nanoparticules
Cα
dissoutes
D Coefficient de diffusion de particules en solution
xiii
DLS Diffusion dynamique de la lumière
DMA Diméthylamine
h Constante de Planck (6,62607004 × 10-34 m² kg / s)
HR-TEM Microscopie électronique à transmission à haute résolution
ICP-AES Spectrométrie d’émission atomique à plasma à couplage inductif
ICP-MS Spectroscopie de masse à plasma à couplage inductif
ISC Croisement inter-système
kB Constante de Boltzmann (1,38064852 × 10-23 m² kg s-2 K-1)
KPS Persulfate de potassium
LCST Température critique inférieure de solubilité
LSPR Plasmon de surface localisé
MBA N,N’-Méthylènebisacrylamide
MPS 3-Méthacryloxypropyltriméthoxysilane
MPTMS (3-Mercaptopropyl)triméthoxysilane
NIPAM N-Isopropylacrylamide
NIPMAM N-Isopropylméthacrylamide
NPs Nanoparticules
NTA Analyse du suivi individuel des particules
PBS Tampon phosphate salin
PCR Amplification en chaîne par polymérase
PEG-SH Polyéthylène glycol méthyl éther thiol
PNIPAM Poly(N-isopropylacrylamide)
PNIPMAM Poly(N-isopropylméthacrylamide)
PS Polystyrène
RH Rayon hydrodynamique
RSH Alcanethiol
R* Rayon critique de nucléation
SDS Dodécylsulfate de sodium
Évolution systématique de ligands par enrichissement
SELEX
exponentiel
SEM Microscopie électronique à balayage
xiv
SM Solution mère
Spectrométrie à dispersion d’énergie couplée à la microscopie
STEM-EDX
électronique à balayage par transmission
S0 Niveau électronique singulet fondamental
S1 Premier niveau électronique excité à l’état singulet
S2 Deuxième niveau électronique excité à l’état singulet
u.a. Unités arbitraires
UCST Température critique supérieure de solubilité
UV Ultra-violet
T Température
TCEP Tris(2-carboxyéthyl)phosphine
Tris(2-carboxyéthyl)phosphine sous forme de sel
TCEP•HCl
d’hydrochlorure
TEM Microscopie électronique à transmission
TEOS Orthosilicate de tétraéthyle
T1 Premier niveau électronique excité à l’état triplet
V Volume d’une nanoparticule
XPS Spectrométrie de photoélectrons induits par rayon X
ΔG Énergie libre du système
ΔGS Énergie libre de surface
ΔGV Énergie libre de volume
ΔG* Énergie libre maximale du système
η Viscosité d’un milieu
λ Longueur d’onde
νA Fréquence du photon absorbé
νF Fréquence du photon de fluorescence
ρ Densité d’un matériau
xv
Extremists have shown what frightens them most : a girl with a book.
- Malala Yousafzai
And to all the little girls who are watching this, never doubt that you are
valuable and powerful and deserving of every chance and opportunity in
the world to pursue and achieve your own dreams.
- Hillary Clinton, Discours de concession 2016
xvi
Remerciements
Mon expérience aux études graduées s’achève enfin après tous ces mois d’efforts, de creusage de
méninges et d’obstacles à surmonter, et je suis si reconnaissante envers tous ceux et celles qui m’ont
accompagnée au cours de cette belle et grande aventure. Je voudrais d’abord offrir le plus grands des
mercis à Denis, mon directeur de maîtrise, pour m’avoir donné le goût et la motivation de faire de la
recherche scientifique avec son éternel enthousiasme et ses idées débordantes. Merci de m’avoir offert
une place au sein de votre groupe lorsque je n’étais qu’une simple stagiaire et d’avoir toujours su
trouvé du temps pour moi malgré votre horaire de Premier Ministre! Merci de m’avoir donné
l’opportunité de prendre en mains mes projets, de faire mes propres erreurs et mes propres
découvertes. Merci de m’avoir exilée en Allemagne pendant 2 semaines en plein dans le mois de
décembre – je n’oublierai jamais le goût du Glühwein et les gens incroyables que j’ai rencontrés là-
bas.
Un merci spécial à Marie et Phil, les deux collègues de mon année avec qui j’ai partagé tant de bons
souvenirs au cours du bac. Nous avons formé un beau trio durant la maîtrise et vous m’avez redonné
le sourire lorsque j’étais contrariée par mes nanoparticules (et disons-le, ça m’est arrivé souvent!).
Merci également à Jérémie pour avoir été mon mentor depuis les trois dernières années et pour m’avoir
remise sur le bon chemin un nombre incalculable de fois. Je suis reconnaissante pour toutes les
pauses Dr. Pepper – ou dans notre cas, les pauses Pokemon Go – qui m’ont permis de demeurer
saine d’esprit, surtout en période d’écriture. Je vais vraiment m’ennuyer de nos discussions
enflammées sur les théories les plus obscures de Game of Thrones et de ton interminable guerre de
memes avec Phil.
Merci aussi aux autres membres du groupe, passés et actuels (Félix, Marie-Christine, Alex, Josée et
Sam), qui m’ont bien fait rire avec leurs sujets de conversations éclectiques et leurs grands débats sur
l’heure du diner. Je vais m’ennuyer de la grande famille du groupe Boudreau et des pots du vendredi
au Pub Universitaire. Merci aussi à mes stagiaires, Mélanie Romain et Lydia Parent, qui ont contribué
à mon premier projet de maîtrise.
xvii
Plus important encore, je voudrais remercier de tout mon cœur ma fabuleuse famille sur qui j’ai toujours
pu compter. Mille mercis Papa et Maman pour tout ce que vous avez fait pour moi, et pour tout ce que
vous continuez de faire dans l’ombre. Merci d’être mon éternel support moral, mes plus grands
cheerleaders et les meilleurs modèles d’accomplissement qu’une petite fille aurait pu recevoir. Quand
j’avais 9 ans, plutôt que de rêver d’être une princesse, je disais que j’irais à l’Université Laval pour avoir
autant de diplômes que vous. Je ne vous remercierai jamais assez de m’avoir aidée à réaliser ce rêve.
Merci également à Sodie (ma soeurette, mon ancienne coloc et ma deuxième maman) pour avoir pris
le temps de m’écouter quand ça allait moins bien, même quand tu venais de passer la semaine à
sauver des bébés à l’hôpital. Tu as toujours été là pour me donner le coup de pied au derrière dont
j’avais besoin. Merci d’avoir partagé mon trip de visiter la Corée du Sud – je rêve encore de notre
ascension du Mt. Namsan et de nos moments entre sœurs à jaser dans les cafés de Séoul. Merci
également à Mathieu de t’occuper aussi bien de Mélo, et surtout, merci de m’avoir accompagnée dans
mon marathon effréné de Gilmore Girls!
Finalement, je tiens à remercier Pierre-Olivier, mon bébé d’amour, pour avoir enduré mes
changements d’humeur, mon anxiété et mes moments de doute au cours des deux dernières années.
Tu as été mon petit soleil, mon épaule sur laquelle pleurer et tu m’as redonné le sourire tant de fois
que j’en ai perdu le compte. Merci pour les aventures qu’on a partagées ensemble, pour les éclats de
rire autour d’un bon épisode de How I Met Your Mother, pour les excellents repas et pour les vignobles
qu’on a visités. Tu es la seule personne avec qui je veux dériver au milieu d’un lac sur un ponton. Je
t’aime fort bébé.
xviii
1. Introduction
Malgré ses récentes avancées technologiques, la médecine moderne continue de faire face à de
nombreux défis, dans des domaines aussi variés que l’imagerie, le diagnostic, la thérapie et la
prévention des maladies. En effet, l’un des principaux obstacles auquel se butent les chercheurs est
la complexité du corps humain, qui rend très difficile la compréhension de certains phénomènes
biologiques. Parmi les stratégies employées pour s’adresser à ces problématiques, les nanomatériaux
organiques et inorganiques apparaissent comme des outils de choix, puisqu’ils possèdent des
propriétés intéressantes qui les distinguent des matériaux à l’état macroscopique.
Figure 1.1 – Quelques exemples de nanomatériaux utilisés dans le domaine biomédical. 1
Il suffit de penser au graphène qui, grâce à ses propriétés électroniques uniques, est à la base de
plusieurs biocapteurs électrochimiques2, ou encore aux points quantiques qui permettent d’imager des
régions précises dans les tissus en raison de leur forte luminescence.3 Les particules magnétiques
présentent quant à elles un potentiel dans le traitement de tumeurs cancéreuses, puisqu’elles peuvent
pénétrer les cellules malsaines et entrainer une hyperthermie mortelle lorsque soumises à un champ
magnétique externe.4 De leur côté, les liposomes sont surtout utilisés comme vecteurs pour le transport
actif de médicaments dans un organisme, en raison de leur morphologie qui rappelle celle des
membranes cellulaires et de leur cavité permettant d’emmagasiner des molécules bioactives.5
Les nanoparticules métalliques attirent également l’attention dans le domaine biomédical grâce à leurs
propriétés optiques facilement modulables qui découlent de leur plasmon de surface localisé (LSPR).
Les nanoparticules d’argent, plus particulièrement, possèdent l’intensité LSPR la plus élevée parmi
1
tous les métaux,6 ce qui en fait de bons candidats entre autres pour le développement de biocapteurs
optiques. Toutefois, leur utilisation in vitro et in vivo demeure limitée en raison de leur cytotoxicité et
de leur manque de stabilité dans des milieux biologiques complexes. En effet, la surface des
nanoparticules d’argent tend à former des oxydes et peut même libérer des ions Ag+ dans leur
environnement. Ces ions sont reconnus pour leurs propriétés biocides, ce qui explique pourquoi les
nanoparticules d’argent sont parfois utilisées comme agents antimicrobiens.7,8 Bien sûr, il existe
certaines méthodes afin de réduire la cytotoxicité des nanoparticules d’argent, comme l’ajout d’une
couche de silice autour de la particule pour diminuer la diffusion des ions à sa surface. Toutefois, ces
techniques présentent une efficacité limitée.9
Figure 1.2 –Schéma présentant la cytotoxicité des nanoparticules d’argent en milieu biologique riche en
phosphates et chlorures.8
Étant à la fois biocompatibles et inertes, les nanoparticules d’or sont donc les plus largement utilisées
en milieu biologique. Bien que le plasmon des nanosphères d’or soit typiquement dans le domaine du
visible, il est possible de modifier leur forme et leur taille de façon à obtenir une longueur d’onde de
résonance jusque dans le proche infrarouge. Ceci permet donc d’adapter les nanoparticules d’or pour
une foule d’applications dans le domaine biomédical.10
Figure 1.3 – Utilisation des nanoparticules d’or sous différentes formes pour des applications biomédicales.11
2
Les nanoparticules d’or présentent également un intérêt au niveau de leur surface, qui peut être assez
aisément modifiée de façon à y ajouter différentes fonctionnalités. Il est possible, par exemple, d’ajouter
une couche de silice fluorescente autour des nanoparticules, ou encore de greffer à leur surface des
anticorps, des protéines et même des brins d’ADN. Plusieurs groupements présentent d’ailleurs une
bonne affinité pour les surfaces d’or, comme les amines et les thiols.12 Ce projet a donc pour but
d’exploiter les propriétés optiques et les propriétés de surface des nanoparticules d’or dans deux
domaines connexes : le relargage contrôlé de médicaments et la détection d’ATP en milieu cellulaire.
1.1 Utilisation de nanoparticules d’or pour le relargage contrôlé de médicaments
La plupart des traitements médicaux envers un patient reposent sur l’administration d’un médicament
composé d’une ou plusieurs molécules bioactives dans le corps humain. L’impact du traitement
thérapeutique dépend alors de trois grands facteurs : l’efficacité du transport du médicament jusqu’au
site biologique d’intérêt (une tumeur, un organe, un tissu, etc.), le contrôle de la dose administrée au
site d’importance et le suivi thérapeutique permettant d’ajuster le traitement d’un patient à l’autre.13
Toutefois, la plupart des traitements disponibles sur le marché sont non-ciblés, ce qui diminue
grandement leur efficacité. Il suffit de penser à la chimiothérapie, un traitement non-ciblé contre le
cancer, qui utilise le système sanguin afin d’acheminer le médicament à travers pratiquement tout le
corps. Puisque seule une fraction des molécules bioactives administrées se rend aux tumeurs
cancéreuses visées, la chimiothérapie demande l’utilisation de doses élevées de médicaments. Ceci
peut mener à l’apparition de nombreux effets secondaires indésirables, tels que la perte des cheveux,
l’apparition de plaies buccales, la diminution de la fertilité et la dépression. 14
Étant donné la complexité des barrières naturelles du système immunitaire et le manque de sélectivité
des méthodes conventionnelles, le relargage contrôlé de molécules dans l’organisme représente un
enjeu de taille pour l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus en plus, les
recherches se tournent donc vers la médecine de précision, qui vise à personnaliser les traitements
en utilisant entre autres la thérapie ciblée.15 Ce type de thérapie consiste à utiliser des nanomatériaux
comme véhicules afin de transporter des médicaments vers un site spécifique grâce à un ciblage actif.
En effet, les nanomatériaux peuvent être fonctionnalisés à l’aide de différents agents de ciblage qui
ont une affinité pour certaines structures biologiques, comme des anticorps, des brins d’ADN ou des
protéines.13
3
Dans un second temps, la thérapie ciblée utilise un stimulus externe afin de contrôler la libération du
médicament. Il peut s’agit d’un stimulus physique, comme de la lumière, un changement de
température ou encore des ultrasons. D’autres systèmes emploient plutôt des stimuli biologiques,
comme une molécule sécrétée par un certain type de cellules, ou encore des stimuli chimiques, comme
un changement de pH ou la présence d’un oxydant.1 Le troisième aspect consiste plutôt à intégrer au
nano-véhicule un système de suivi de l’effet thérapeutique. Ceci peut inclure par exemple des éléments
luminescents qui seraient visible en microscopie de fluorescence,16,17 ou encore des nanoparticules
magnétiques détectables par imagerie à résonance magnétique.18
Figure 1.4 – Différents types de stimuli utilisés afin de contrôler le relargage d’un médicament.1
Les nanoparticules d’or s’avèrent être de bons candidats afin de développer des nano-véhicules
sensibles à la lumière. Les nanosphères d’or possèdent une résonance plasmonique typiquement
autour de 530 nm, c’est-à-dire qu’elles peuvent absorber et diffuser la lumière dans la région du visible.
Par contre, il n’est pas idéal de travailler avec le domaine du visible en milieu biologique, puisque
plusieurs composantes des tissus (comme les protéines, l’eau et l’hémoglobine) possèdent un grand
coefficient d’absorption à ces longueurs d’onde.19 De plus, certaines structures biologiques, telles que
les acides aminés, les flavines, les porphyrines et la mélanine peuvent causer l’autofluorescence des
tissus dans cette région spectrale.20
4
Figure 1.5 – Absorption de différents composantes des tissus.19
Il est par conséquent préférable de se déplacer vers le proche infrarouge, plus spécifiquement entre
650 nm et 1450 nm, une région reconnue comme la fenêtre de transparence biologique et dans laquelle
la pénétration des tissus est maximale et les dommages causés aux cellules sont limités. 21 Certaines
nanoarchitectures d’or possèdent d’ailleurs un plasmon dans cette région spectrale. Les
nanobâtonnets22 de même que les nanoparticules hybrides possédant un cœur de silice et une coquille
d’or18 représentent des structures intéressantes à cet égard, particulièrement pour des dimensions
inférieures à 100 nm, soit une taille optimale pour l’accumulation dans les tissus biologiques.23
Figure 1.6 – Schéma illustrant la meilleure pénétration des tissus dans la fenêtre de transparence
biologique.21
5
L’objectif du projet est donc de développer une plateforme plasmonique multifonctionnelle qui
permettra à la fois d’encapsuler des molécules bioactives, de cibler la région biologique d’intérêt et
d’effectuer le suivi du traitement médical en temps réel. Pour ce faire, nous avons imaginé une
nanostructure basée sur un nanobâtonnet d’or entouré d’une couche de silice fluorescente et d’une
couche de polymère thermosensible dans laquelle un médicament peut être encapsulé. Ce véhicule
peut également être décoré d’agents de ciblage afin d’assurer le transport actif du cargo.
Figure 1.7 – Schéma du nano-transporteur plasmonique imaginé afin de répondre aux objectifs du projet.
Selon ce concept, en réponse à un stimulus lumineux dans le proche infrarouge, le nanobâtonnet

absorbe une partie de l’énergie incidente et la transmet sous forme de chaleur à son environnement.
Ceci entraine l’affaissement de la couche de polymère, qui possède une température critique minimale
de solubilité supérieure à la température du corps humain, libérant ainsi son contenu dans le milieu
biologique. En réponse au traitement, les cellules génèrent alors une molécule ou un ion et, si le
fluorophore incorporé dans la couche de silice y est sensible, il est alors possible de suivre le traitement
en temps réel par microscopie de fluorescence.
À plus long terme, l’application visée pour ces transporteurs à nanocargos est le traitement de maladies
dermatologiques orphelines, puisque la peau peut être facilement traversée par un laser dans
l’infrarouge. Par contre, pour faire une preuve de concept, ces nano-véhicules seront d’abord étudiés
pour effectuer la décalcification des valves aortiques dans des cultures cellulaires cardiaques. Nos
collaborateurs, le Dr. Patrick Mathieu et son équipe à l’Institut universitaire de cardiologie et de
6
pneumologie de Québec, ont en effet développé un médicament pour traiter cette maladie, soit la
2-thiouridine-5'-triphosphate.24 Puisqu’une conséquence du traitement est la libération d’ions calcium
dans le milieu cellulaire, l’incorporation d’un fluorophore sensible au calcium à la couche de silice
permet de faire le suivi du traitement.
1.2 Utilisation de nanoparticules d’or comme biocapteurs pour la mesure d’ATP dans des
cultures cellulaires
Une des molécules les plus étudiées dans le domaine des biocapteurs est l’adénosine 5’-triphosphate
(ATP). Découverte par Karl Lohmann en 1929,25 sa structure consiste en un sucre, le ribose, auquel
sont liées une chaine de trois groupements phosphates ainsi qu’une base azotée portant le nom
d’adénine (voir figure 1.8). L’intérêt de l’ATP provient de son rôle central en tant que source d’énergie
dans le métabolisme des cellules. En effet, l’hydrolyse de l’ATP est une réaction exothermique qui
alimente une grande variété de processus biologiques, tels que le transport actif transmembranaire, la
division cellulaire et la synthèse de biomolécules essentielles à la survie cellulaire. Au cours de cette
réaction, les sous-produits générés sont l’adénosine 5’-diphosphate (ADP) ainsi qu’un groupement
phosphate libre, mais l’ADP peut être hydrolysée à son tour pour former de l’adénosine
5’-monophosphate (AMP), ce qui libère davantage d’énergie.26
Figure 1.8 – Structure chimique de l’adénosine 5’-trisphosphate et de ses sous-produits d’hydrolyse, l’adénosine
5’-diphosphate et l’adénosine 5’-monophosphate.26
Étant donné le rôle vital de l’ATP pour le métabolisme, il n’est pas étonnant d’apprendre que sa
concentration en milieu intracellulaire est relativement élevée; plusieurs études l’estiment dans le
7
domaine du faible millimolaire (1-10 mM) tout dépendant du type de cellule étudié.27,28 Toutefois, les
chercheurs ont longtemps cru que la concentration d’ATP dans le milieu extracellulaire était nulle. À
l’époque, il était illogique de penser que les cellules puissent se débarrasser d’une partie – même
infime – de leur ATP, car le seul rôle qu’on lui octroyait était celui de carburant. Cette croyance était
appuyée par le fait qu’aucun mécanisme de transport membranaire n’était alors connu pour l’ATP.29
Cependant, des études menées à partir des années 1950 ont permis de démontrer que l’ATP est bien
présente en milieu extracellulaire, bien que ce soit en faible concentration (typiquement de 20 nM à
10 µM). Il s’avère que l’ATP traverse la membrane cellulaire par exocytose et joue alors un rôle
important dans la régulation de plusieurs phénomènes biologiques, comme la contraction musculaire,
l’agrégation des plaquettes sanguines, la neurotransmission et la vasoconstriction.29 Cette molécule
est également excrétée par les cellules en réponse à un stress externe, puisqu’elle promeut la
réparation tissulaire et l’activation du système immunitaire.30
Afin de mieux comprendre les différents rôles de l’ATP, il est important de connaître avec précision sa
concentration dans les cellules ainsi que dans leur environnement en fonction du temps. L’une des
techniques les plus utilisées pour la mesure d’ATP dans le milieu extracellulaire repose sur la
bioluminescence générée par une interaction entre une enzyme oxydative, une luciférase, et une
molécule pouvant générer de la lumière lorsqu’elle subit une oxydation, une luciférine. De manière
générale, une luciférase est utilisée pour catalyser la réaction à multiples étapes entre la D-luciférine,
l’oxygène ainsi que l’ATP avec son cofacteur métallique (Mg2+). L’oxyluciférine est alors formée à l’état
excité et émet de la lumière à une longueur d’onde de 560 nm en retournant au niveau fondamental.
Cette méthode, bien qu’elle possède une sensibilité et une sélectivité très élevées, repose cependant
sur des mesures d’ensemble qui ne permettent pas le suivi en temps réel.31,32
Figure 1.9 – Méthode de détection d’ATP par bioluminescence entre une luciférase et la D-luciférine.32
8
Il y a une dizaine d’années, un groupe de recherche a toutefois exploité ce couple luciférase/luciférine
dans le but d’effectuer le suivi de la concentration d’ATP à la surface de cellules. 33 Pour ce faire, une
protéine membranaire comportant un segment luciférase a été incorporée à une lignée cellulaire. Cette
enzyme oxydative est située à l’interface en contact avec le milieu extracellulaire, comme le montre la
figure 1.10, ce qui permet de sonder l’ATP tout près des récepteurs membranaires. Dans le cadre de
cette étude, la concentration d’ATP tout près de la membrane s’est révélée plus élevée que dans le
reste du milieu extracellulaire, soit de l’ordre de 100 à 200 µM pour les deux types de cellules étudiés.
Figure 1.10 – Schéma présentant la technique de détection d’ATP à la surface des cellules par l’incorporation
d’une luciférase membranaire à l’aide d’une mutation génétique. 31
Cependant, cette technique est peu applicable à d’autres systèmes, puisqu’elle requiert l’incorporation
d’une nouvelle protéine à la membrane cellulaire par mutation génétique. En plus d’être complexe,
cette manipulation génétique pourrait également avoir un impact sur le métabolisme des cellules et,
par conséquent, modifier la concentration d’ATP par rapport aux cellules préexistantes. Cette méthode
se limite également à la mesure d’ATP à l’interface entre la membrane et le milieu extracellulaire.
Afin de s’adresser à ces problématiques, d’autres outils de mesure plus localisés ont également été
imaginés. Le groupe de Nicholas Dale, par exemple, a développé une microélectrode de platine
recouverte de glycérol kinase et de glycérol-3-phosphate oxydase. Ces enzymes, en présence d’ATP
et d’oxygène, permettent de métaboliser le glycérol pour former du peroxyde d’hydrogène. L’oxydation
de ce dernier composé, catalysée sur une surface de platine, peut alors être détectée par une simple
mesure d’électrochimie, ce qui permet de quantifier la concentration d’ATP en milieu extracellulaire
dans une gamme de 200 nM à 50 µM (voir figure 1.11).
9
Figure 1.11 – a) Métabolisme enzymatique du glycérol en présence d’ATP et d’oxygène, suivi de l’oxydation du
peroxyde d’hydrogène la surface de l’électrode de platine. b) Droite d’étalonnage du biocapteur par
électrochimie.34
Encore une fois, cette technique de mesure possède certains inconvénients. Tout d’abord, le diamètre
de la microélectrode (25-100 µm) est du même ordre de grandeur que le diamètre des cellules, ce qui
rend cet outil très invasif en plus de limiter sa précision spatiale. De plus, la mesure dépend à la fois
de la concentration d’ATP et de glycérol dans l’environnement cellulaire, deux paramètres qui varient
aussi bien dans le temps que dans l’espace sondé.
Le présent projet vise donc à développer un outil micrométrique non-invasif pour effectuer la détection
localisée d’adénosine 5’-triphosphate dans les milieux intra et extracellulaire, et ce, en fonction du
temps. Cette méthode de détection doit être à la fois non-invasive et présenter une grande sélectivité
pour l’analyte d’intérêt. De plus, le biocapteur doit posséder une bonne sensibilité dans le domaine de
concentration de l’analyte retrouvé dans les échantillons biologiques. Idéalement, cet outil doit
également être polyvalent afin de détecter éventuellement d’autres biomolécules intéressantes.
Pour y arriver, nous nous sommes tournés vers les nanoparticules d’or afin de tirer profit de leurs
propriétés plasmoniques et de leur biocompatibilité. Afin de trouver un support micrométrique pour ces
nanoparticules d’or, nous nous sommes inspirés de travaux effectués par nos collaborateurs, le groupe
de Jean-François Masson à l’Université de Montréal, qui se spécialisent dans le développement de
biocapteurs. Récemment, cette équipe a développé un outil composé d’une micropipette de verre
recouverte de nanoparticules d’or pour la détection de biomolécules par microscopie Raman (voir
figure 1.12).35
10
Figure 1.12 – Schéma de concept de l’outil développé par le groupe de Jean-François Masson pour la détection
de bioanalytes dans l’environnement des cellules par diffusion Raman exaltée par une surface plasmonique. 35
En effet, ce concept tire profit des propriétés plasmoniques des nanoparticules d’or afin d’exalter la
diffusion Raman d’un métabolite se trouvant à proximité. Nos collaborateurs ont testé ces biocapteurs
en milieu biologique et sont parvenus à détecter différentes biomolécules d’intérêt, notamment l’ATP,
le glucose, le pyruvate, le lactate ainsi que l’urée. Cependant, cette technique est présentement limitée
à de la détection semi-quantitative, puisque l’intensité des bandes Raman varie grandement en
fonction de l’orientation du métabolite et de la distance qui le sépare de la surface plasmonique.
Figure 1.13 – Schéma de concept de l’outil micrométrique développé afin de répondre aux différents objectifs du
projet.
Le but est donc de nous baser sur ce prototype afin de développer un outil de détection quantitatif pour
l’ATP. Pour ce faire, nous avons imaginé un substrat composé d’une micropipette de verre recouverte
11
de nanoparticules d’or de 50 nm de diamètre. La surface du capteur est fonctionnalisée avec un
aptamère fluorescent, soit un court simple brin d’ADN modifié avec un fluorophore, qui possède une
grande affinité pour l’ATP. Lorsque l’aptamère se lie à sa molécule cible, il se replie sur lui-même,
rapprochant ainsi le fluorophore de la surface des nanoparticules d’or. Grâce à un montage de
microscopie de fluorescence, il est alors possible de mesurer l’extinction de fluorescence résultant de
ce changement de conformation et, par conséquent, de quantifier la concentration d’ATP localement.
1.3 Liste des objectifs des deux projets
Pour résumer, les objectifs du premier projet sont de :

• Développer une nanoarchitecture plasmonique biocompatible dans le domaine de l’infrarouge;
• Permettre l’encapsulation de molécules bioactives à proximité de la nanoparticule;
• Inclure un agent de ciblage pour assurer le transport actif du cargo;
• Assurer un suivi du traitement en incorporant un fluorophore sensible au calcium.
Dans un second temps, les objectifs du projet de détection d’ATP sont de :

• Développer un outil de détection micrométrique pour quantifier la concentration d’ATP
dans l’environnement de cellules;
o Synthétiser des nanoparticules d’or sphérique avec un contrôle adéquat de la
morphologie et de la taille;
o Greffer ces nanoparticules à la surface de micropipettes de verre;
o Ajouter un aptamère spécifique à l’ATP en surface.
• Développer une plateforme de détection en microscopie de fluorescence;
• Tester les performances de l’outil de détection avec des solutions d’ATP aqueuses;
• Tester les performances de l’outil de détection dans des conditions biologiques.
12
2. Principes théoriques
2.1 Nanomatériaux
Les nanomatériaux représentent une classe de matériaux ayant au moins une dimension dans le
domaine nanométrique. Leur intérêt provient principalement de leur taille, à la frontière du domaine
atomique, qui leur confère des propriétés différant grandement du matériau à l’état macroscopique. Le
confinement des électrons dans une ou plusieurs dimensions, par exemple, procure aux
nanostructures des propriétés électroniques et optiques uniques qui suscitent l’attention dans une
multitude de domaines. Par ailleurs, leur grand rapport surface/volume ouvre la porte à une grande
gamme de modifications de surface qui permet de créer des nanoarchitectures adaptées à de
nouvelles applications.36,37
2.1.1 Nanoparticules métalliques
Les nanoparticules métalliques présentent un intérêt particulier dans les technologies émergentes en
raison de leurs propriétés plasmoniques. En effet, en présence d’un champ électromagnétique externe
d’une certaine fréquence, les électrons de conduction des nanoparticules métalliques peuvent se
mettre à osciller collectivement autour du noyau chargé positivement. Cette résonance, illustrée à la
figure 2.1, porte le nom de plasmon de surface localisé, en raison du confinement de la nanoparticule
dans les trois dimensions.38,39
Figure 2.1 – Schéma présentant un plasmon de surface localisé pour une particule métallique soumise à un
champ électromagnétique externe.39
Une conséquence de ce phénomène électronique est que les nanoparticules métalliques possèdent
une signature d’absorption et de diffusion de la lumière à des longueurs d’onde bien précises. Lors du
processus d’absorption, la lumière incidente est convertie sous forme de chaleur par le plasmon, alors
qu’elle est réémise de manière isotropique à la même fréquence au moment de la diffusion. La
13
combinaison de ces deux phénomènes, que l’on nomme l’extinction, peut d’ailleurs être mesurée par
spectroscopie UV-visible.40 La fréquence à laquelle les électrons d’une nanostructure entrent en
résonance dépend toutefois de nombreux facteurs, tels que la nature du matériau la composant, sa
taille, sa forme ainsi que la constante diélectrique de son milieu environnant.41 Des nanoparticules
sphériques d’indium, par exemple, possèdent un maximum plasmonique dans l’ultraviolet, tandis que
les nanoparticules composées d’argent et d’or ont un maximum respectivement aux environs de
400 nm et 530 nm. De plus, comme l’illustre la figure 2.2, la position de la bande plasmonique se
déplace vers le rouge lorsque le diamètre des nanoparticules, ici composées d’argent, augmente.42
Figure 2.2 - Spectres d’extinction normalisés pour (A) des nanoparticules sphériques de différentes
compositions et (B) des nanoparticules sphériques d’argent de différentes tailles.42
La taille des particules influence également leur propension à absorber et à diffusion la lumière. En
effet, le spectre d’extinction des particules de petite taille est dominé par la composante d’absorption,
tandis que les grosses particules sont considérées comme plus diffusives. 43 Plusieurs paramètres
doivent donc être considérés lors du choix d’une nanostructure pour une application visée.
2.1.2 Mécanisme de formation de nanoparticules
Il existe deux grands types d’approche afin de préparer des nanoparticules. L’approche descendante
consiste à former des colloïdes à partir d’un matériau macroscopique, ce qui inclut entre autres les
différentes techniques de lithographie et d’ablation laser. L’approche ascendante, de son côté, utilise
les atomes et les molécules comme blocs de départ pour former des nanoparticules, que ce soit par
exemple par déposition chimique en phase vapeur, par procédé solution-gélification ou par émulsion.
14
Dans le cas des nanoparticules métalliques, la méthode de synthèse la plus courante est la réduction
de complexes métalliques en solution. Ce processus ascendant suit généralement deux étapes : la
nucléation et la croissance des germes. La nucléation est un processus au cours duquel des
précurseurs atomiques ou moléculaires à l’état solvaté s’assemblent pour former des cristaux solides.
D’un point de vue thermodynamique, cette réaction est favorisée par la diminution de l’énergie libre de
volume (ΔGV) issue de la formation des cristaux. Ce changement de phase, par contre, mène à
l’apparition d’une nouvelle interface solide-liquide, ce qui fait augmenter l’énergie libre de surface du
système (ΔGS). Pour des germes très petits, la résultante ΔG de ces deux phénomènes compétitifs
donne une valeur positive, puisque le rapport surface/volume est très important (voir figure 2.3 A). Un
rayon critique R*, cependant, est atteint lorsque l’énergie libre du système est à son maximum (ΔG*).
À partir de cette taille, la pente de ΔG devient négative et la diminution de l’énergie libre de volume
devient la force motrice qui stabilise les germes formés.44
Figure 2.3 – (A) Diagramme d’énergie libre de nucléation avec, en rouge, la courbe résultante des deux
phénomènes compétitifs. (B) Diagramme de LaMer illustrant la nucléation et la croissance de nanoparticules.44
Le diagramme de LaMer à la figure 2.3 B permet d’illustrer la cinétique de nucléation et de croissance

des germes en solution. Selon ce modèle, une espèce atomique est d’abord ajoutée en solution; dans
le cas de nanoparticules métalliques, il s’agit souvent d’un précurseur sous forme de complexe qui est
réduit par l’ajout d’un réducteur. Au début de la réaction, la concentration atomique augmente jusqu’à
atteindre, dans un premier temps, la concentration de saturation (C S). À ce point, le coût énergétique
associé à la création d’une interface solide-liquide est trop grand pour permettre la formation de germes
15
stables. La concentration atomique continue par conséquent d’augmenter jusqu’à la concentration
nu
minimale de nucléation (Cmin ). Au-delà de cette valeur, la concentration critique de nucléation (Ccrit)
est atteinte, ce qui mène à la formation de germes jusqu’à ce que les réserves atomiques retombent
nu
sous la barre de Cmin . Typiquement, une étape du nucléation de courte durée permet d’obtenir une
population de germes de faible polydispersité. C’est pour cette raison que le réducteur ou le précurseur
métallique est habituellement ajouté très rapidement dans le milieu réactionnel.
Les germes ainsi formés subissent par la suite une période de croissance lors de laquelle les réactifs
sont consommés, et ce, jusqu’à ce que la concentration atomique atteigne de nouveau la concentration
de solubilité. Durant cette étape, cependant, les germes ne grossissent pas au même rythme, ce qui
mène à un certain régime de tailles de particules. Les plus petites particules, qui possèdent une énergie
libre de surface plus élevée, sont alors susceptibles de se dissoudre en solution puis de s’agglomérer
à des particules de plus grande taille afin de diminuer l’énergie de surface globale du système. Ce
processus est nommé la maturation d’Ostwald.44,45
2.2 Fluorescence
La luminescence est une émission de lumière qui se produit lorsqu’une molécule dans un état
électronique excité retourne à son état fondamental. Ce processus est divisé en deux catégories
distinctes, soit la fluorescence et la phosphorescence, en fonction des niveaux électroniques impliqués
lors de l’émission.46
2.2.1 Mécanismes menant à la luminescence
Les différents phénomènes qui entrent en jeu lors de la luminescence peuvent être illustrés à l’aide
d’un diagramme de Jablonski schématisant les principaux niveaux énergétiques d’une molécule
luminescente (voir figure 2.4). Celle-ci est considérée à l’état fondamental lorsque ses électrons se
trouvent au niveau électronique singulet de plus faible énergie (S0). En présence d’un faisceau incident
d’énergie suffisante, les électrons de la molécule peuvent être excités du niveau fondamental vers un
niveau singulet plus énergétique (S1 ou S2, par exemple). Ce processus d’absorption est ultrarapide,
soit de l’ordre de 10-15 seconde. Puisque que chaque niveau électronique possède plusieurs sous-
niveaux vibrationnels, il existe un grand nombre de transitions électroniques possibles lors de
l’excitation. C’est pour cette raison que le spectre d’absorption d’une molécule présente une bande
large plutôt qu’une raie très étroite.46,47
16
Figure 2.4 – Diagramme de Jablonski illustrant les différents types de transitions électroniques qui peuvent avoir
lieu lors des processus de luminescence.48
Une fois à l’état excité, la molécule peut retourner à l’état fondamental par l’intermédiaire de plusieurs
phénomènes radiatifs ou non-radiatifs. De manière générale, les électrons des différents niveaux
vibrationnels de plus haute énergie retournent rapidement (10-12 s) au niveau vibrationnel fondamental
de S1 ou S2 par un processus non-radiatif appelé la relaxation vibrationnelle. Lorsque les niveaux
vibrationnels de deux niveaux électroniques se chevauchent, les électrons peuvent également être
transférés vers l’état de moindre énergie sans émettre de photon. Si le transfert s’effectue entre deux
niveaux singulets, ce phénomène est nommé conversion interne. Puisqu’il y a conservation de la
multiplicité, ce transfert électronique est permis par les règles de sélection. À l’inverse, un croisement
inter-système (ISC) désigne un transfert d’un niveau excité singulet S1 vers un niveau excité triplet T1
qui est interdit par ces mêmes règles. Pour cette raison, le croisement inter-système est
significativement plus lent (10-10 s) que la conversion interne (10-12 s).
Lors de la désexcitation radiative, les électrons reviennent aux différents niveaux vibrationnels de l’état
fondamental S0 en convertissant leur énergie sous forme de photons plutôt que sous forme de chaleur.
Dans le cas de la fluorescence, les électrons se trouvent initialement dans un état excité singulet,
tandis que la phosphorescence implique une transition à partir d’un état excité triplet. Étant donné que
la phosphorescence demande un changement de la multiplicité qui est interdit, il s’agit d’un phénomène
moins probable et beaucoup plus lent (10-5-10-7 s) que la fluorescence (10-8-10-9 s). Le temps de vie
de fluorescence ou de phosphorescence, c’est-à-dire le temps de résidence des électrons à l’état
17
excité avant leur retour à l’état fondamental, est d’ailleurs caractéristique à chaque molécule
luminescente et peut être mesuré à l’aide de différents montages optiques.46,47
Figure 2.5 – Positions spectrales relatives des phénomènes d’absorption, de fluorescence et de

phosphorescence.47
Il est important de noter que l’énergie liée à l’excitation est généralement plus élevée que l’énergie
libérée lors de l’émission de fluorescence, en raison de la vitesse des processus de relaxation non-
radiatifs. C’est pourquoi, sur un spectre de fluorescence, la bande d’émission est déplacée vers les
plus hautes longueurs d’onde par rapport à la bande d’excitation. Ce déplacement spectral, aussi
appelé déplacement de Stokes, varie entre autres en fonction de la structure du fluorophore et de son
environnement.46,47
2.2.2 Extinction de fluorescence
Plusieurs phénomènes peuvent entrainer une diminution de l’intensité de fluorescence d’un

échantillon. C’est le cas par exemple du photoblanchiment, un processus au cours duquel un
fluorophore subit une altération irréversible de sa structure en réponse à une source d’excitation
d’énergie suffisante. D’autres processus d’atténuation sont plutôt réversibles, puisqu’ils sont reliés à
l’environnement du fluorophore. Cette catégorie comprend entre autres l’extinction de fluorescence de
type collisionnel et de type statique.
L’extinction collisionnelle se produit quand un fluorophore à l’état excité entre en contact avec une
espèce chimique en lui transférant son énergie. Lors de ce mécanisme dynamique, le fluorophore
retourne à son état fondamental sans émettre de photon, tandis que de le désactivateur diffuse son
énergie sous forme non-radiative. Les atomes lourds, l’oxygène et les halogènes sont des exemples
18
de désactivateurs de ce type, tout comme les molécules contenant des groupements amine ou
acrylamide. Puisque l’extinction collisionnelle repose sur la diffusion des espèces, elle dépend de la
concentration du désactivateur en solution. De plus, étant donné que la collision doit avoir lieu lorsque
le fluorophore est à l’état excité, l’extinction dépend également du temps de vie de fluorescence de
l’espèce impliquée. En effet, un fluorophore qui possède un temps de vie long risque davantage de
transférer son énergie à un désactivateur qu’une molécule avec un temps de vie court.
L’extinction statique a plutôt lieu lorsqu’un fluorophore forme un complexe non-fluorescent avec un
désactivateur. Dans ce cas, l’extinction se produit quand le fluorophore se trouve à l’état fondamental
et ne repose pas sur la diffusion des espèces en solution. En ce sens, l’extinction ne dépend pas du
temps de vie de fluorescence, mais plutôt de la fraction de fluorophore formant un complexe avec le
désactivateur.46
2.2.3 Interactions entre un fluorophore et une nanoparticule métallique
Les nanoparticules métalliques peuvent également influencer l’émission de fluorescence d’une

molécule en raison de leurs propriétés plasmoniques. Plusieurs phénomènes compétitifs entrent alors
en jeu et, selon la distance séparant le fluorophore de la surface métallique, l’effet ressenti se traduit
soit par une augmentation ou par une diminution de l’intensité de fluorescence.
Figure 2.6 – Diagramme de Jablonski modifié pour un fluorophore à proximité d’une particule plasmonique, avec
l’apparition de nouveaux chemins d’excitation et d’émission du fluorophore.49
Tout d’abord, un fluorophore à l’état excité peut se coupler aux différents modes plasmoniques d’une
particule se trouvant à proximité, lui transférant par le fait même son énergie. Dans le cas où le plasmon
dissipe cette énergie sous forme de chaleur, une extinction de la fluorescence est observée. Au
contraire, le plasmon peut utiliser cette énergie pour émettre lui-même de la fluorescence aux mêmes
19
longueurs d’onde que le fluorophore, et ce, de façon très rapide. Cette nouvelle espèce fluorescence,
nommée plasmophore, crée un chemin supplémentaire de désexcitation radiative, ce qui contribue à
une augmentation de l’intensité de fluorescence (voir figure 2.6).49
L’exaltation plasmonique de la fluorescence peut également se produire par deux phénomènes plus
indirects. En effet, un fluorophore placé dans l’environnement d’une nanoparticule métallique tire profit
de son large coefficient d’extinction. Le fluorophore, qui possède alors une meilleure section efficace
de capture, subit par conséquent une augmentation de son taux d’excitation. De plus, un fluorophore
dans l’environnement d’une nanoparticule métallique ressent un fort champ électrique local, qui
déstabilise son dipôle à l’état excité. Ceci mène à une diminution de son temps de vie ainsi qu’à une
augmentation de son taux d’émission radiatif. Ce recyclage plus efficace des électrons est d’ailleurs
favorisé lorsque le plasmon de la nanoparticule se superpose aux bandes d’excitation et d’émission
du fluorophore.49
Il est possible de quantifier l’effet global d’une nanoparticule sur un fluorophore à l’aide du facteur
d’exaltation. Ce paramètre mathématique correspond au rapport entre l’intensité de fluorescence d’une
molécule à proximité d’une particule plasmonique et l’intensité de fluorescence de la même molécule
sans l’influence du métal. Tel qu’illustré à la figure 2.7, l’effet global observé résulte des composantes
d’exaltation et d’extinction de fluorescence, qui sont toutes deux dépendantes de la distance entre la
surface métallique et le fluorophore (d).
Figure 2.7 – Impact de la distance entre une nanoparticule métallique et un fluorophore sur les composantes
d’extinction et d’exaltation de fluorescence.50
20
Typiquement, l’extinction de fluorescence est considérée comme un phénomène à courte portée,
puisque son influence diminue à raison de 1/d3. L’extinction se fait donc ressentir dans les premiers
nanomètres à la surface d’une particule métallique. En comparaison, l’exaltation de fluorescence
diminue uniquement selon (r/r+d), où r correspond au rayon de la nanoparticule. À plus grande
distance, c’est par conséquent le phénomène d’exaltation qui domine.50
À titre d’exemple, la figure 2.8 présente les facteurs d’exaltation obtenus de façon expérimentale pour
des fluorophores à proximité de nanoparticules sphériques d’argent et d’or de différentes tailles. La
distance séparant les fluorophores de la surface métallique est modulée dans les deux cas par une
couche de silice uniforme entourant les nanoparticules. Dans le cas des nanoparticules d’argent, le
maximum d’exaltation pour la fluorescéine se situe environ à 7 nm de la surface, tandis qu’il est
repoussé à 10 nm dans le cas du rose Bengal à proximité de nanoparticules d’or. De plus, le facteur
d’exaltation augmente en fonction de la taille des particules pour les deux architectures étudiées,
puisque l’intensité et la portée du plasmon sont également fonction de la taille.
Figure 2.8 – Facteurs d’exaltation de fluorescence pour des fluorophores placés à proximité de nanoparticules
(A) d’argents42 et (B) d’or51 de différents diamètres recouvertes d’une couche de silice modulable.
Ces résultats illustrent bien la contribution de l’extinction et de l’exaltation de fluorescence sur des
systèmes plasmoniques réels. Toutefois, il est important de noter que l’allure de la courbe résultante
dépend de plusieurs facteurs, dont la forme, la taille et la nature des nanoparticules impliquées ainsi
que le recouvrement spectral entre le plasmon et les bandes d’émission et d’excitation du fluorophore.
21
2.3 Polymères thermosensibles
Les polymères thermosensibles sont des matériaux «intelligents» qui réagissent à un changement de
température par une modification de phase. Cette propriété les rend particulièrement attrayants pour
des applications telles que le relargage de médicaments, le transport de gènes et l’ingénierie tissulaire.
Cette transition de phase est due à un changement drastique de l’état de solvatation d’un polymère à
une température précise. Par exemple, certains polymères deviennent insolubles à haute température
et possèdent une température critique inférieure de solubilité (LCST). Au contraire, d’autres polymères
deviennent insolubles à basse température et sont plutôt caractérisés par une température critique
supérieure de solubilité (UCST). 52
Figure 2.9 – Diagrammes de phase illustrant la température critique (A) inférieure et (B) supérieure de solubilité
de polymères thermosensibles.52
La figure 2.9 présente les diagrammes de phases caractéristiques de ces deux types de polymère en
fonction de la fraction volumique du mélange polymère/solvant. La transition d’une phase polymérique
soluble vers deux phases immiscibles est due à une modification de l’état d’hydratation du polymère.
En effet, à la température critique de solubilité, les ponts hydrogène intramoléculaires et
intermoléculaires du polymère deviennent plus favorables par rapport aux liaisons hydrogène avec
l’eau. Ceci cause un affaissement de la couche polymérique de même que le relargage des molécules
de solvant, ce qui mène à l’augmentation de l’entropie du système. Selon l’équation de Gibbs, la
création de deux phases distinctes est alors favorisée thermodynamiquement.53 Ce changement de
volume de l’hydrogel thermosensible peut donc être exploité afin de libérer une molécule bioactive qui
y serait encapsulée, tel qu’illustré à la figure 2.10.
22
Figure 2.10 – Schéma de concept d’un hydrogel thermosensible s’affaissant sur lui-même à une température
supérieure à sa LCST, libérant ainsi son cargo .54
2.4 Aptamères d’acides nucléiques
Les aptamères d’acides nucléiques sont de courts simples brins d’ADN ou d’ARN qui ont la capacité
de se lier à une espèce chimique de façon réversible. À cet égard, ils sont analogues aux anticorps qui
possèdent une grande affinité pour un antigène spécifique. Les aptamères ont toutefois la particularité
de changer de conformation lorsqu’ils se lient à leur molécule cible, tel qu’illustré à la figure 2.11, afin
de créer une cavité adaptée pour le substrat. Cette interaction entre l’aptamère et sa molécule cible
fait intervenir une combinaison de ponts hydrogène, d’interactions électrostatiques, de forces de Van
der Waals et d’interactions entre des cycles aromatiques.55
Figure 2.11 – Changement de conformation d’un aptamère en réponse à sa molécule-cible, ici l’ATP.56
2.4.1 Avantages
Les aptamères possèdent plusieurs avantages dans le domaine de la biodétection par rapport aux
anticorps. Tout d’abord, ils sont beaucoup plus polyvalents, c’est-à-dire qu’il existe une grande libraire
23
d’aptamères pouvant se lier à des espèces aussi diverses que des ions, des molécules, des protéines
complexes et même des cellules. Les aptamères peuvent également être synthétisés en laboratoire,
tandis que les anticorps doivent généralement être isolés à partir d’animaux de laboratoire immunisés
avec des antigènes sélectionnés. À cet égard, les aptamères sont donc typiquement moins
dispendieux et peuvent également être modifiés à l’aide de différents groupements fonctionnels pour
les rendre plus adaptés à une application visée. Finalement, ces courtes séquences d’ADN ou d’ARN
sont plus résistantes aux variations de pH et de température. Il est important de noter, toutefois, que
les aptamères possèdent une constante d’association envers leur molécule cible qui est presque
toujours inférieure à celle des anticorps.55,57
2.4.2 Processus de sélection
Afin de sélectionner un ou plusieurs aptamères spécifiques à une cible désirée, un processus

d’évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel, aussi nommé SELEX, est utilisé.
Cette technique, développée en 1990 par les groupes de Szostak et Gold, consiste à isoler les
aptamères possédant les caractéristiques souhaitées à partir d’une large librairie pouvant contenir de
1013 à 1018 séquences d’acides nucléiques aléatoires.55,58 Ce bassin d’aptamères est alors mis en
contact avec la cible et les brins d’ADN ou d’ARN ayant réagi sont isolés du reste à l’aide de différentes
méthodes de lavage.
Figure 2.12 – Schéma de la méthode SELEX utilisée pour isoler les aptamères.59
24
Les aptamères obtenus peuvent alors être isolés et répliqués de façon exponentielle à l’aide d’une
technique d’amplification en chaîne par polymérase (PCR), de façon à pouvoir évaluer leur réponse
individuellement. Dans un processus SELEX typique, les aptamères subissent de 8 à 15 cycles de
liaison, lavage et amplification afin d’effectuer une ségrégation efficace des brins désirés. Plusieurs
aptamères s’avèrent habituellement sélectifs à la même molécule cible, mais ceux-ci peuvent posséder
différentes constantes d’association avec le substrat et différentes configurations 3D. Il est donc
essentiel d’évaluer les propriétés intrinsèques des aptamères pour s’assurer de choisir le brin d’ADN
ou d’ARN le plus approprié pour l’application visée.60
25
3. Méthodes expérimentales
3.1 Méthodes de synthèse
3.1.1 Nanoparticules d’or sphériques
Il existe plusieurs protocoles de synthèse pour obtenir des nanoparticules d’or sphériques (AuNPs) en
solution. Ceux-ci permettent d’atteindre des tailles et des fonctionnalités de surface diverses, en
fonction de l’application visée pour ces nanomatériaux. Une des méthodes les plus connues a été
développée par Turkevich et al. en 1951.61 Elle consiste en la réduction d’un sel d’or, l’acide
chloraurique (HAuCl4), à l’aide de citrate de sodium tribasique dans l’eau et à reflux. Le citrate de
sodium agit à la fois comme réducteur et stabilisateur de la surface des particules formées. Ce
protocole mène habituellement à la formation d’une solution diluée de nanoparticules d’or d’un
diamètre de 10 à 20 nm. Il est toutefois possible de moduler la taille des nanoparticules obtenues par
cette méthode en modifiant simplement le ratio entre le sel d’or et le citrate de sodium. L’inconvénient
de cette technique provient du fait que les particules ont tendance à agréger de façon irréversible lors
d’une étape successive d’échange de ligands.62
Figure 3.1 – Schéma de synthèse pour (A) le protocole de Turkevich et (B) le protocole de Brust.62
En 1994, Brust et Schriffin ont développé une nouvelle méthode de synthèse permettant d’obtenir des
nanoparticules d’or solubles en phase organique.63 Dans ce protocole, l’acide chloraurique est réduit
à l’aide de borohydrure de sodium (NaBH4), un réducteur fort, dans un milieu biphasique. Des
alcanethiols sont également ajoutés au milieu réactionnel pour stabiliser la surface des nanoparticules,
et le bromure de tétraoctylammonium (TOAB) est alors employé comme agent de transfert de phase.
Cette méthode permet d’obtenir des AuNPs de plus petite taille, typiquement de 1,5 à 5 nm, avec une
plus faible polydispersité et une meilleure stabilité colloïdale que la méthode de Turkevich. Le diamètre
des particules peut être modulé en fonction du ratio entre le sel d’or et l’alcanethiol et de la température
utilisée.62
26
3.1.2 Nanobâtonnets d’or
Les nanobâtonnets d’or (AuNBs) sont des architectures anisotropes possédant deux bandes
plasmoniques distinctes. La première, à haute énergie, correspond à l’oscillation transversale des
électrons de conduction et la seconde, dans le rouge ou le proche infrarouge, est attribuable à
l’oscillation longitudinale des électrons. Il est possible de moduler le plasmon longitudinal simplement
en faisant varier le ratio d’aspect (AR) des nanobâtonnets, c’est-à-dire le ratio entre leur longueur et
leur largeur. Typiquement, plus le ratio d’aspect est élevé, plus cette deuxième bande plasmonique se
déplace vers le rouge.
Figure 3.2 – (A) Oscillation transversale et longitudinale des électrons de conduction des nanobâtonnets. (B)
Spectres d’extinction pour des nanobâtonnets d’or ayant différents ratios d’aspect. (C) Images de microscopie
électronique à transmission des nanobâtonnets caractérisés en (B) (barre d’échelle de 50 nm).64
Plusieurs chemins de synthèse ascendants mènent à la formation des nanobâtonnets d’or en solution.
Les premières méthodes à avoir été développées reposent sur l’électrochimie65,66 ou encore sur la
réduction photochimique d’un complexe d’or67,68 pour entraîner la croissance anisotropique des
nanoparticules. Plus tard, la méthode de réduction d’un sel d’or, typiquement utilisée pour générer des
nanoparticules sphériques, a été adaptée aux nanobâtonnets grâce à l’ajout d’ions d’argent et de
surfactants en solution.69
27
De manière générale, pour une synthèse en une seule étape, du borohydrure de sodium (NaBH 4) est
utilisé comme réducteur fort pour réduire rapidement l’acide chloraurique (HAuCl4) dans un milieu
contenant du nitrate d’argent (AgNO3), du bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) et de l’acide
L-ascorbique.70 Cette synthèse peut également être séparée en deux étapes, soit la synthèse de
germes suivie de leur croissance, afin d’obtenir un meilleur contrôle sur la taille des bâtonnets et sur
leur polydispersité.71 Dans ce cas, des germes de 1 à 4 nm sont d’abord préparés par réduction de
l’acide chloraurique par du NaBH4 en présence de CTAB72 ou de citrate de sodium tribasique73 pour
stabiliser leur surface. Un faible volume de cette solution de germes est ensuite injecté rapidement
dans une solution de croissance composée typiquement de CTAB, de HAuCl4, d’AgNO3 et d’acide L-
ascorbique.
Figure 3.3 - Structure chimique du CTAB et son arrangement sous forme de bicouche à la surface des
nanobâtonnets d’or.64
28
Plusieurs mécanismes sont proposés afin d’expliquer la croissance des nanoparticules dans un axe
particulier. De manière générale, le contrôle des facettes cristallines serait attribuable à la fois au CTAB
et aux ions d’argent, mais leur rôle précis dans la synthèse demeure sujet à débats. Tout d’abord, le
bromure de cétyltriméthylammonium est un surfactant qui forme des micelles d’environ 6 nm au-delà
de sa concentration micellaire critique (CMC) de 1 mM.70 Son rôle principal lors de la synthèse est de
stabiliser les nanoparticules en formant une bicouche à leur surface, de manière à empêcher leur
agrégation.74 Il a toutefois été proposé que le CTAB pourrait également contribuer à diriger la
croissance anisotropique en passivant préférentiellement certaines facettes cristallines, permettant
ainsi aux bouts des bâtonnets de croître plus rapidement. Il a aussi été suggéré que les micelles de
CTAB pourraient servir de « moules » pour dicter la forme de nanoparticules. En effet, à une
concentration supérieure à 20 mM, telle qu’utilisée lors de la synthèse, le CTAB forme des micelles
cylindriques qui peuvent s’allonger encore plus en présence de certains additifs organiques. 70
Le contre-ion bromure de ce surfactant joue également un rôle au sein du mécanisme de croissance.

En effet, il a été démontré que l’utilisation d’iodure de cétyltriméthylammonium (CTAI) lors de la
croissance de germes d’or en présence de nitrate d’argent favorise la formation de sphères ou de
formes irrégulières, tandis que le chlorure de cétyltriméthylammonium (CTAC) mène plutôt à la
formation de cubes concaves (voir figure 3.4). Pour cette raison, la présence d’ions chlorure et iodure
en solution entraîne habituellement une diminution du rendement de nanobâtonnets.75,76
Figure 3.4 – Formes de nanoparticules attendues suite à l’ajout de différents halogènes à une solution de
croissance de germes d’or contenant du nitrate d’argent.75
29
Ce phénomène peut être expliqué en partie par le fait que les ions bromure du CTAB semblent jouer
un rôle dans la réduction de l’or en transformant le complexe AuCl4- en AuBr4- par échange d’ions. En
présence d’acide L-ascorbique, qui est un réducteur faible à une température inférieure à 100°C, le
complexe AuBr4- est réduit en AuBr2-, une espèce stable en solution. À l’ajout des germes, cependant,
les ions Au(I) peuvent se réduire de façon autocatalytique à la surface de nanoparticules d’or, tel
qu’illustré à la figure 3.5. Cette réaction, qui alimente la croissance des bâtonnets, peut être exprimée
de la façon suivant : 3AuI → 2Au0 + AuIII.72
Figure 3.5 – (A) Schéma réactionnel de la réduction autocatalytique du complexe d’or à la surface des
nanoparticules. (B) Croissance et changement de morphologie des nanobâtonnets au fil du temps. 72
Trois principaux mécanismes sont suggérés dans la littérature pour expliquer le rôle de l’argent dans
la croissance anisotropique des nanobâtonnets et deux d’entre eux font également intervenir les ions
bromure. D’une part, il est proposé que les ions d’argent forment un complexe avec le CTAB et que ce
complexe s’adsorbe plus fortement à la surface des nanoparticules d’or que le CTAB seul, améliorant
ainsi la passivation de certaines surfaces.77 Il est également possible que l’argent passive
préférentiellement des facettes cristallines en se réduisant à leur surface,78 mais certains proposent
plutôt un mécanisme de passivation faisant intervenir l’argent sous forme AgBr. 79 Des mesures
expérimentales obtenues par spectrométrie de photoélectrons induits par rayon X (XPS) de même que
par spectroscopie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) ont permis de montrer que les
nanobâtonnets d’or contiennent entre 2,5 et 9% d’argent et que cet élément se trouve
préférentiellement à leur surface.80,81 Toutefois, il semble que l’argent soit retrouvé sur l’ensemble des
facettes cristallines des nanoparticules, selon des études effectuées par microscopie électronique à
transmission à haute résolution (HR-TEM) ainsi que par spectrométrie à dispersion d’énergie couplée
à la microscopie électronique à balayage par transmission (STEM-EDX).82 Ceci suggère donc que le
mécanisme de passivation de surface par l’argent est encore mal compris.
30
Figure 3.6 – (A) Image HR-TEM d’un nanobâtonnet d’or et (B) sa cartographie élémentaire correspondante
obtenue par STEM-EDX montrant la présence d’argent sur toutes les facettes cristallines.82
Il existe plusieurs variantes à cette synthèse par croissance contrôlée de germes assistée par l’argent.
Par exemple, certains protocoles de synthèse demandent l’ajout au CTAB d’un cosurfactant comme
l’oléate de sodium, afin de modifier la morphologie des micelles et ainsi diminuer la polydispersité des
nanobâtonnets.83,84 Il est également possible de remplacer l’acide L-ascorbique par un phénol comme
l’hydroquinone, afin de préparer des nanobâtonnets possédant un grand ratio d’aspect. 85 En effet, il a
été démontré que l’hydroquinone ainsi que d’autres dérivés aromatiques peuvent s’intercaler dans le
système micellaire de CTAB et modifier la réactivité de surface des nanobâtonnets au cours de leur
croissance.86
3.2 Techniques de caractérisation
3.2.1 Microscopie électronique à transmission et à balayage
La microscopie électronique regroupe un ensemble de techniques d’imagerie permettant la

caractérisation des nanomatériaux et se distingue de la microscopie optique en plusieurs aspects.
Comme l’indique son nom, la microscopie électronique requiert l’utilisation d’une source d’électrons
plutôt qu’une source de lumière visible. Il peut s’agir, par exemple, d’un filament de tungstène ou une
pointe d’hexaborure de lanthane sous haut voltage. Les électrons sous haut vide se comportent de
façon analogue à la lumière, mais ils ont l’avantage de posséder une longueur d’onde bien inférieure,
soit de l’ordre du picomètre. Selon le critère de Rayleigh, la résolution spatiale d’un système de mesure
est directement proportionnelle à la longueur d’onde de la source. Ainsi, les microscopes électroniques
peuvent atteindre une résolution suffisante pour imager des structures dans le domaine du
nanomètre.87
31
Pour mieux comprendre ce type d’imagerie, il est essentiel de s’attarder à la façon dont les électrons
peuvent interagir avec la matière. La figure 3.7 résume l’ensemble des processus pouvant avoir lieu
lorsqu’un faisceau d’électrons, dirigé par des lentilles magnétiques, entre en contact avec un
échantillon. D’abord, certains électrons peuvent être absorbés par l’échantillon ou mener à la formation
de paires électron-trou. D’autres interagissent plutôt avec la matière pour mener à l’émission de
rayons X, de lumière visible, de rayonnement Bremsstrahlung ou d’électrons Auger. Des électrons
peuvent également être diffusés de façon élastique ou inélastique par les atomes de l’échantillon ou
encore entrer en collision avec les noyaux pour être rétrodiffusés.88
Figure 3.7 – Schéma des phénomènes pouvant avoir lieu lors de l’interaction entre un faisceau d’électrons
incidents et un échantillon.88
La microscopie électronique à transmission (TEM), de son côté, permet de détecter les électrons qui
sont transmis, c’est-à-dire les électrons qui traversent l’échantillon. La microscopie électronique à
balayage (SEM) utilise plutôt les électrons secondaires qui sont émis suite à l’ionisation de la surface
par les électrons incidents. En raison de cette différence fondamentale au niveau de la mesure, les
plateformes de TEM et de SEM présentent une structure distincte (voir figure 3.8). La différence la plus
notable est reliée à la position de l’échantillon en relation avec le détecteur. Dans le cas de la
microscopie électronique à transmission, l’échantillon est situé près de la source, au plan objet, et les
électrons transmis sont récoltés plus bas, au plan image, sur un écran fluorescent ou encore sur une
caméra. Dans une plateforme SEM, l’échantillon est plutôt situé dans une chambre au bas de l’appareil
et les électrons secondaires émis lors du balayage sont récoltés par un détecteur plus près de
l’échantillon.89
32
Figure 3.8 – Schéma des composantes d’un microscope optique en comparaison avec un microscope
électronique à transmission et à balayage.90
La microscopie électronique à transmission, qui repose sur la détection d’électrons transmis, permet
d’obtenir une image en deux dimensions de l’échantillon et dont les niveaux de gris donnent de
l’information sur la densité du matériau observé. Ce type d’imagerie demande donc l’utilisation de hauts
voltages et d’échantillons très minces afin de minimiser l’absorption et la diffusion des électrons. Ce
type d’imagerie s’applique de façon relativement simple aux nanoparticules métalliques, puisque
celles-ci sont peu affectées par un faisceau d’électrons énergétiques et peuvent être déposées en un
mince film sur une grille de carbone. Cependant, la préparation d’échantillons s’avère plus complexe
avec des spécimens biologiques, comme des cellules, qui sont plus épais et plus fragiles.89
L’imagerie SEM, de son côté, est plutôt une technique d’analyse de surface qui permet d’acquérir des
informations sur la topographie d’un échantillon. En effet, le faisceau d’électrons n’est pas statique,
mais se déplace afin de balayer la surface de l’échantillon. Le voltage utilisé est également beaucoup
plus bas qu’en TEM. De plus, la chambre du microscope permet d’accommoder des spécimens de
plus grande taille et la préparation des échantillons s’en trouve grandement simplifiée. Par conséquent,
la microscopie électronique à transmission et à balayage sont des techniques d’imagerie
complémentaires.87
33
3.2.2 Microscopie de fluorescence
La microscopie de fluorescence est une technique optique permettant d’imager des échantillons
luminescents. Dans un montage conventionnel, une source polychromatique traverse un filtre optique
afin de sélectionner la longueur d’onde d’excitation appropriée, contrairement à la spectrofluorimétrie
qui demande habituellement l’utilisation d’un monochromateur. Par la suite, un miroir dichroïque placé
sur le parcours optique à 45° a pour rôle de réfléchir la lumière d’excitation sur l’échantillon à travers
un objectif. Les molécules fluorescentes du substrat sont alors excitées et retournent à l’état
fondamental en émettant des photons. Par la suite, la lumière d’émission traverse le miroir dichroïque,
qui est transparent à ces longueurs d’onde, avant d’atteindre le filtre d’émission. Ce filtre optique a
pour fonction de permettre à la lumière d’émission d’atteindre le détecteur, habituellement une caméra,
et de bloquer les photons de la source qui peuvent être diffusés par l’échantillon afin de diminuer le
bruit de fond.91
Figure 3.9 – Schéma des composantes typiques d’un montage de microscope de fluorescence.92
Pour choisir le cube de fluorescence le plus approprié pour un échantillon, il est important de connaître
le spectre d’excitation de même que le spectre d’émission du fluorophore qui doit être imagé. Tel
qu’illustré à la figure 3.10, il est idéal de sélectionner des fenêtres d’excitation et d’émission bien
distinctes, c’est-à-dire qui ne se superposent pas, afin de limiter la contamination du signal d’émission
par celui de la source. Le miroir dichroïque, de son côté, doit réfléchir la lumière de la source de façon
efficace, mais transmettre la lumière d’émission à des longueurs d’onde plus élevées. La combinaison
des filtres optiques et du miroir dichroïque aura un grand impact sur l’intensité du signal ainsi que sur
le rapport signal sur bruit mesurés.91
34
Figure 3.10 – (A) Spectres d’excitation et d’émission d’un fluorophore et (B) signatures de transmission des
différentes composantes du cube de fluorescence utilisé pour imager ce fluorophore (filtre d’excitation, miroir
dichroïque et filtre d’émission) .91
La détection par microscopie de fluorescence possède plusieurs avantages par rapport à d’autres
techniques d’analyse comme la microscopie Raman. L’utilisation de la fluorescence permet entre
autres d’obtenir des mesures sensibles et sélectives à l’espèce luminescente choisie en sélectionnant
un cube approprié. De plus, cette technique permet d’obtenir une réponse analytique rapide, ce qui en
fait une méthode de choix pour la détection d’analytes en temps réel. Contrairement à la
spectrofluorimétrie, la microscopie de fluorescence est adaptée à la fois à l’étude de solutions de
fluorophores et à l’analyse de substrats solides. En générant une image de l’échantillon, la microscopie
fournit donc de l’information sur la distribution spatiale des espèces fluorescentes.46
35
3.2.3 Spectrométrie d’émission atomique à plasma à couplage inductif
La spectrométrie d’émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP-AES) est une technique
d’analyse élémentaire permettant de déterminer la concentration de métaux en solution. Pour ce faire,
un échantillon aqueux est injecté dans un nébuliseur qui a pour rôle de le transformer en aérosol. Les
gouttelettes sont ensuite acheminées dans une torche à plasma où elles subissent une étape de
désolvatation puis de volatilisation pour obtenir des atomes libres en phase gazeuse. Ce procédé
d’atomisation est permis grâce à la très haute température du plasma d’argon généré à l’aide d’une
bobine d’induction et dont la température peut atteindre jusqu’à 10 000 K.
Figure 3.11 – Processus d’atomisation d’un échantillon introduit dans une source à plasma.93
Les atomes ainsi produits sont alors excités par cette source hautement énergétique. Les électrons de
valence subissent donc une transition vers un ou plusieurs niveaux électroniques supérieurs et peuvent
retourner à leur niveau fondamental par divers chemins en émettant des photons d’énergie quantifiée.
Puisque les niveaux électroniques possèdent une énergie caractéristique à chaque élément, il est
possible de déterminer la nature de l’espèce analysée en mesurant son spectre d’émission atomique.
Pour y arriver, les photons émis par l’échantillon atomisé sont récoltés par un polychromateur tel que
présenté à la figure 3.12. Typiquement, les photons sont acheminés vers un réseau de diffraction à
échelle par une série de miroirs afin de séparer les photons de différentes longueurs d’onde. Un
disperseur croisé permet ensuite de séparer les photons dans le domaine du visible de ceux dans l’UV,
de façon à ce qu’ils soient conduits vers un détecteur approprié. Afin d’effectuer la détection de
plusieurs longueurs d’onde en simultanée, le détecteur le plus communément utilisé est une caméra
de type dispositif à transfert de charge (CCD). Il est alors possible de corréler la concentration d’un
métal en solution à l’intensité d’une de ses raies élémentaires.
36
Figure 3.12 – Schéma des composantes d’un spectromètre d’émission atomique dans un ICP-AES.93
L’ICP-AES peut être utilisée pour déterminer la concentration d’une solution de nanoparticules
métalliques (CNPs). Pour ce faire, il est nécessaire tout d’abord de dissoudre les nanoparticules pour
favoriser leur atomisation. Dans le cas des nanoparticules d’or, il est possible d’utiliser l’eau régale, un
mélange d’acide chlorhydrique et d’acide nitrique dans un ratio typique de 3:1, afin d’effectuer la
dissolution. La concentration de nanoparticules peut être calculée à partir de l’équation suivante :
𝐶𝛼
𝐶𝑁𝑃𝑠 = (3.1)
𝜌𝑉
Où Cα correspond à la concentration du métal dans la solution de nanoparticules dissoutes, ρ et la

densité du métal et V est le volume d’une nanoparticule. Bien que l’ICP-AES soit une technique
d’analyse très sensible et précise, le calcul de CNPs est grandement limité par l’incertitude sur le volume
des nanoparticules analysées. En effet, pour déterminer la valeur de V, il est nécessaire de choisir un
modèle géométrique pour représenter la forme des nanoparticules, ce qui peut être simple dans le cas
des nanoparticules sphériques, mais qui peut devenir plus complexe dans le cas de formes
anisotropiques comme les nanobâtonnets. De plus, le calcul repose sur les dimensions des
nanoparticules déterminées à l’aide d’images TEM ou SEM qui ont une précision limitée et qui peuvent
varier grandement dans le cas d’un échantillon polydisperse. Pour des formes plus complexes, il est
donc préférable d’utiliser d’autres techniques d’analyse pour déterminer C NPs, comme l’analyse du suivi
individuel des particules, abordé à la section 3.2.5.
37
3.2.4 Diffusion dynamique de la lumière
La diffusion dynamique de la lumière (DLS) est une technique d’analyse permettant de déterminer la
taille de nanoparticules en solution en fonction de leurs mouvements browniens. En effet, des
particules suspendues dans un solvant bougent de façon aléatoire en raison des collisions ayant lieu
dans leur milieu fluide. Plus les particules sont grosses et plus leur mouvement est lent, puisqu’elles
possèdent une inertie plus importante. Lorsqu’un échantillon de nanoparticules est illuminé à l’aide
d’une source laser, les particules diffusent une certaine partie de cette lumière incidente et celle-ci peut
être mesurée avec un détecteur placé à un angle précis, typiquement 90° ou 173°. La diffusion de la
lumière par différentes particules peut créer des interférences positives ou négatives en fonction de
leur position dans le médium. Puisque la position des particules varie selon leurs mouvements
browniens, l’intensité résultant de la lumière diffusée varie également en fonction du temps, tel
qu’illustré à la figure 3.13.94 Cette variation est plus rapide dans le cas des nanoparticules de petite
taille, puisque leurs mouvements browniens sont également plus rapides.
Figure 3.13 – Fluctuations temporelles de l’intensité de diffusion d’une lumière laser par de grosses particules
comparativement à de petites particules.95
Mathématiquement, le temps de corrélation de cette fluctuation d’intensité peut être utilisé pour calculer
le coefficient de diffusion des particules en solution (D). Ce coefficient dépend à la fois des propriétés
du médium utilisé (indice de réfraction, viscosité et température) et des propriétés du matériau
composant les particules (indice de réfraction et coefficient d’absorption). Cette valeur du coefficient
de diffusion est par la suite utilisée pour calculer le rayon hydrodynamique des particules, à l’aide de
l’équation de Stokes-Einstein :
38
𝑘𝐵 𝑇
𝑅𝐻 = (3.2)
6𝜋𝜂𝐷
Où kB correspond à la constante de Boltzmann, T est la température absolue du médium et η

représente la viscosité du solvant. Ce rayon hydrodynamique correspond au rayon d’une particule
sphérique, incluant sa sphère de solvatation, qui se comporte de façon similaire aux particules de
l’échantillon analysé.94 Cette valeur numérique de taille possède donc un sens réel uniquement dans
le cas où les particules mesurées sont de forme sphérique. Dans le cas de particules allongées de
type nanobâtonnet, cette valeur correspond plutôt au rayon d’une sphère se comportant de façon
similaire en solution. L’analyse par DLS se distingue donc de l’analyse par TEM, puisqu’elle permet
d’obtenir une distribution de taille de particules en solution, ce qui fournit des informations sur leur
stabilité colloïdale de même que sur leur polydispersité.96
Figure 3.14 – Distinction entre le rayon réel des nanoparticules, tel que mesuré au TEM, et le rayon
hydrodynamique calculé à l’aide de l’analyse DLS.97
3.2.5 Analyse du suivi individuel des particules
Le rayon hydrodynamique de nanoparticules en solution peut également être déterminé par une
analyse du suivi individuel des particules (NTA). Cette technique d’analyse, développée en 2006, se
distingue de la DLS par l’utilisation d’une plateforme d’imagerie comme outil de détection, tel qu’illustré
à la figure 3.15. Dans un montage typique, une diode laser est utilisée pour irradier à un certain angle
un échantillon placé dans une chambre microfluidique. La lumière diffusée par les particules est alors
recueillie à l’aide d’un objectif monté sur une caméra CCD. Cette technique de microscopie permet
d’imager les particules et de suivre leur mouvement brownien. Un logiciel de traitement d’images
permet ensuite de repérer les nanoparticules et de suivre leur déplacement afin de calculer leur
coefficient de diffusion en solution. De la même manière qu’en DLS, ce coefficient permet d’obtenir le
rayon hydrodynamique des particules en passant par l’équation de Stokes-Einstein. Le logiciel peut
également compter les nanoparticules pour fournir la concentration de l’échantillon analysé.
39
Figure 3.15 – Schéma du montage optique utilisé pour les mesures d’analyse du suivi individuel des particules.98
Pour que cette technique fournisse des mesures fiables, il est nécessaire que l’échantillon soit
suffisamment dilué –typiquement entre 1 x 107 et 5 x 109 NPs/mL – pour permettre au logiciel
d’imagerie de distinguer les particules individuelles. De plus, il est essentiel que les particules
possèdent une taille suffisante pour être détectées par diffusion sans toutefois sédimenter au cours de
la mesure. En général, la NTA permet donc d’analyser des échantillons de nanoparticules possédant
un diamètre entre 20 nm et 1 µm. De plus, elle permet de déterminer la concentration d’une solution
de nanoparticules de formes complexes ou encore d’une solution possédant une grande polydispersité
avec une meilleure précision qu’en ICP-AES.
3.2.6 Liste des appareils
Tableau 3.1 – Liste des appareils utilisés pour la caractérisation des nanoparticules d’or
Type d’analyse Modèle de l’appareil Compagnie

Agilent
Spectroscopie UV-visible Cary 50**
Technologies
Microscopie électronique à transmission Tecnai G2 Spirit BioTwin FEI
Microscopie électronique à balayage Quanta 3D FEI
Spectrométrie à plasma à couplage inductif
équipé d’une détection par spectrométrie Optima 3000 Perkin Elmer
d'émission atomique
Diffusion dynamique de la lumière Zetasizer Nano ZS Malvern
Analyse du suivi individuel des particules Nanosight NS300 Malvern
**Un Cary 5000 est utilisé pour les spectres au-delà de 1100 nm.
40
4. Développement de nano-véhicules plasmoniques pour le
relargage contrôlé de médicaments en milieu biologique
4.1 Nanobâtonnets d’or
4.1.1 Protocoles de synthèse
Au cours du projet, deux protocoles de synthèse ont été utilisés pour obtenir des nanobâtonnets de
taille contrôlée avec un ratio d’aspect variant de 2,0 à 5,8. Le premier protocole, tiré de la littérature,76
est schématisé à la figure 4.1 et décrit de manière détaillée à l’annexe 1. Il s’agit d’une synthèse par
croissance contrôlée de germes assistée par l’argent en trois étapes. Tout d’abord, des germes sont
formés par réduction rapide d’un sel d’or par du borohydrure de sodium dans une solution concentrée
de CTAB (100 mM). Une particularité de cette méthode est l’ajout de bromure de potassium pour
obtenir un ratio molaire KBr:CTAB de 1:10. Le bromure de potassium a pour rôle de doper le milieu
réactionnel en ions Br- afin de diminuer l’impact des ions chlorure et des ions iodure en solution. À
titre d’exemple, le CTAB disponible commercialement contient habituellement une faible concentration
en I- qui varie d’un fournisseur et d’un lot à l’autre, et cette espèce empoisonne la croissance
anisotropique des nanoparticules en plus de diminuer la reproductibilité de la synthèse. 99
Figure 4.1 – Schéma de concept du premier protocole de synthèse de nanobâtonnets d’or utilisé.
En parallèle, une solution de croissance primaire est préparée en ajoutant du bromure de potassium,
du nitrate d’argent, de l’acide chloraurique et de l’acide L-ascorbique à une solution de CTAB 100 mM.
Cette solution est donc une source d’or au degré d’oxydation 1 et une source d’ions Ag+ essentiels à
la passivation de surfaces. Un faible volume de germes est ensuite ajouté à la solution de croissance
41
primaire et la réaction procède pendant une heure à 30°C, une température suffisante pour dissoudre
complètement le CTAB. Une seconde étape de croissance a pour but de poursuivre la maturation des
nanobâtonnets en plus de réduire la polydispersité des particules. Pour ce faire, une solution d’acide
L-ascorbique 9,4 mM est ajoutée goutte à goutte à un débit de 30 µL/min afin de réduire l’Au(III)
résiduel en Au(I), qui peut être réduit de façon autocatalytique à la surface des nanobâtonnets. Dans
le but de se débarrasser des réactifs excédentaires, la solution finale de nanobâtonnets est centrifugée
à deux reprises. Le dernier culot de nanobâtonnets est redispersé dans une solution de CTAB 0,16 mM
pour éviter l’agrégation des particules.
Ce protocole permet en théorie de synthétiser des nanobâtonnets avec un ratio d’aspect de 2,0 à 4,2,
ce qui correspond à un maximum d’extinction de la bande plasmonique longitudinale situé environ
entre 650 et 900 nm. Pour atteindre des ratios d’aspect supérieurs et se déplacer davantage vers
l’infrarouge, il est toutefois nécessaire de se tourner vers un autre protocole. Cette seconde méthode,
illustrée à la figure 4.2 et décrite en détail à l’annexe 2, est également adaptée de la littérature.100
Figure 4.2 – Schéma de concept du second protocole de synthèse de nanobâtonnets d’or utilisé.
Il s’agit d’une synthèse par croissance de germes contrôlée en deux étapes. Contrairement au premier
protocole, le réducteur faible dans la solution de croissance n’est pas l’acide L-ascorbique, mais
l’hydroquinone, puisque celle-ci favorise la croissance de nanobâtonnets avec un ratio d’aspect élevé
en s’intercalant dans les micelles cylindriques de CTAB. Le protocole original ne demande pas d’ajout
de bromure de potassium, mais il serait possible de doper le milieu réactionnel avec le même ratio
KBr:CTAB qu’à la première synthèse dans le but de réduire la polydispersité des nanobâtonnets
causées par des impuretés dans les réactifs commerciaux.
42
4.1.2 Caractérisation
Pour chacun des deux protocoles de synthèse, les nanobâtonnets obtenus ont été caractérisés par
microscopie électronique à transmission et par spectroscopie UV-visible. Dans le cas de la première
méthode, l’évolution de la synthèse a été suivie en prélevant des aliquots après la première étape de
croissance, puis à différents moments durant la deuxième croissance.
Figure 4.3 – Images TEM pour les nanobâtonnets obtenus avec le premier protocole pour des aliquots prélevés
(A) après la première étape de croissance, puis après (B) 30 min, (C) 60 min, (D) 90 min, (E) 120 minutes et (F) la
totalité de la seconde croissance.
Tel qu’attendu, la taille des nanobâtonnets augmente au cours de la seconde croissance, en raison de
l’ajout d’acide L-ascorbique qui favorise la déposition de l’Au(I) sur les différentes facettes des
particules. Puisque la longueur et la largeur des bâtonnets évoluent sensiblement au même rythme,
leur ratio d’aspect demeure similaire tout au long de la synthèse.
Tableau 4.1 – Évolution des dimensions et du ratio d’aspect des nanobâtonnets au cours de la première
synthèse.
Longueur Largeur Nombre de

Solution Ratio d’aspect particules
nm analysées
1re croissance 45 ± 12 15 ± 4 3±1 200
2e croissance 30 min 57 ± 11 21 ± 7 3,0 ± 0,8 164
2e croissance 60 min 62 ± 8 21 ± 4 3,1 ± 0,7 206
2e croissance 90 min 66 ± 7 21 ± 6 3,3 ± 0,8 162
2e croissance 120 min 68 ± 12 25 ± 8 2,9 ± 0,7 172
2e croissance finale 68 ± 9 23 ± 5 3,1 ± 0,8 186
43
Le spectre d’extinction des nanobâtonnets a également été suivi au cours de la synthèse. Comme le
montre la figure 4.4, les spectres présentent deux bandes plasmoniques tel qu’anticipé. La première
bande, à environ 800 nm, est attribuable au plasmon longitudinal, tandis que la seconde, vers 530 nm,
correspond à l’oscillation transversale des électrons de conduction. Pour une même concentration de
nanobâtonnets, l’intensité des bandes plasmoniques augmente en fonction du temps accordé à la
seconde croissance, étant donné l’augmentation de la taille des particules. Bien que la bande
transversale demeure à la même position durant la croissance, la bande longitudinale se déplace de
façon significative entre 775 nm et 815 nm. Ce déplacement est dû, en partie, au fait que la bande
longitudinale est très sensible aux faibles variations de ratio d’aspect d’un aliquot à l’autre. De plus, les
images TEM permettent d’observer que la pointe des bâtonnets change au cours de la synthèse,
débutant par une forme arrondie et terminant avec une forme plus angulaire. Tel que rapporté dans la
littérature, ce changement de morphologie peut également affectée la position de la bande
longitudinale.72
0,8
1re croissance
0,7 2e croissance 30 min
0,6
Extinction (u.a.)
2e croissance 60 min
2e croissance finale
0,3
0,2
0,1
0
400 500 600 700 800 900 1000
Longueur d'onde (nm)
Figure 4.4 – Évolution du spectre d’extinction des nanobâtonnets au cours de la première synthèse pour une
même concentration de nanoparticules en solution.
De plus, il est important de noter que l’aire sous la courbe de la bande longitudinale est beaucoup plus
grande que l’aire sous la bande à 530 nm. Puisque le plasmon des nanosphères d’or se superpose à
la bande transversale des nanobâtonnets, cet important ratio entre les bandes indique que la proportion
de sphères en solution est faible comparativement à la population de bâtonnets, ce qui est corrélé par
les observations au TEM. Toutefois, la bande qui apparait entre 550 et 600 nm indique que la synthèse
comporte d’autres impuretés, puisque cette bande est caractéristique au plasmon de particules d’or de
forme cubique101 ou octaédrique.102
44
Afin de mieux visualiser la diversité de formes et de tailles des particules à la fin de la synthèse, un
diagramme de distribution de tailles a été tracé grâce aux données extraites des images TEM (voir
figure 4.5 A). Ce graphique permet d’isoler les particules ayant une forme plus sphérique, donc ayant
une longueur et une largeur similaire, des bâtonnets ayant une forme allongée. Dans le cas de cet
échantillon, le rendement de bâtonnets a été estimé à 94% (175 bâtonnets/187 particules analysées),
ce qui démontre un bon contrôle de la forme grâce à cette technique de croissance de germes
contrôlée. Toutefois, il faut demeurer prudent avec l’interprétation des images TEM, puisqu’il est
reconnu que les nanobâtonnets et les nanosphères ont tendance à s’agglomérer séparément, créant
ainsi deux populations distinctes sur les grilles de carbone. 103 Il est donc essentiel de compiler les
données sur plusieurs images TEM représentatives de l’échantillon pour éviter de biaiser les résultats.
90 200
Longueur des particules (nm)
Concentration d'or (mg/L)

80 A) B)
70 160
60
120
50
40 80
30
20 40
10
0 0
0 10 20 30 40 50 60 0 50 100 150 200
Largeur des particules (nm) Durée croissance secondaire (min)
Figure 4.5 – (A) Distribution de tailles des nanobâtonnets à la fin de la seconde croissance tel que déterminé au
TEM (n = 187) avec, en bleu, la droite désignant les dimensions de nanosphères. (B) Évolution de la
concentration d’or déterminée par ICP-AES pour des aliquots de nanobâtonnets dissous dans de l’eau régale
avec, en bleu, la droite désignant la concentration d’or dans le milieu réactionnel (λ = 267,595 nm).
Afin de mieux comprendre l’impact de la seconde étape de croissance sur l’évolution des particules,
différents aliquots de nanobâtonnets ont été dissous dans l’eau régale puis analysés par ICP-AES (voir
le protocole détaillé de l’analyse à l’annexe 3). En spectrométrie d’émission atomique, l’or possède
trois raies caractéristiques principales, soit à 208,209 nm, 242,795 nm et 267,595 nm. Afin d’obtenir
un meilleur signal de même qu’une meilleure sensibilité, la raie à 267,595 nm a été sélectionnée pour
l’analyse. Tel qu’illustré à la figure 4.5 B, une concentration d’or en solution de (37,5 ± 0,4) mg/L a été
déterminée à la fin de la première croissance, pour un ajout total de 189,5 mg/ au mélange réactionnel,
ce qui indique que seulement 20 % de l’or a été réduit à la surface des germes. Au cours de la seconde
croissance, cependant, la concentration d’or dans les aliquots augmente de façon linéaire pendant les
45
100 premières minutes avant d’atteindre un plateau à la fin de la synthèse. Ceci s’explique par le fait
que, lors de l’ajout de la solution d’acide L-ascorbique, l’Au(III) résiduel dans le milieu est réduit en
Au(I) et cette espèce peut alors se réduire en Au(0) à la surface des particules de façon autocatalytique.
La seconde étape de croissance permet donc d’atteindre une concentration de (152,8 ± 0,4) mg/L d’or
dans la solution finale, ce qui représente un pourcentage de réduction de l’or de 81 %.
À partir de ces données, il serait théoriquement possible de calculer la concentration de nanoparticules

en solution en se basant sur la densité de l’or et sur le volume des nanobâtonnets. Toutefois,
l’incertitude sur la donnée obtenue serait très élevée, puisqu’il serait nécessaire d’estimer que toutes
les nanoparticules en solution sont de forme et de taille semblables en plus d’estimer le volume des
nanobâtonnets en fonction des dimensions mesurées au TEM. Pour obtenir une valeur plus fiable, les
nanobâtonnets ont donc été analysé par suivi individuel des particules (NTA). Grâce à cette technique,
la concentration de particules dans la solution finale a été calculée à (2,9 ± 0,1) x 1011 NPs/mL par le
logiciel de traitement d’images pour cinq réplicas du même échantillon.
Dans le cas de la seconde méthode de synthèse, les particules ont uniquement été caractérisées à la
fin de la période de croissance. La figure 4.6 présente les images TEM obtenues pour les trois
conditions testées. La différence majeure entre les synthèses A, B et C est la quantité de germes
ajoutée à la solution de croissance ainsi que la concentration d’ions Ag+ dans le milieu réactionnel. En
effet, le volume de solution de germes ajouté augmente de la synthèse A à C (respectivement 80 µL,
160 µL et 320 µL) tandis que la concentration d’AgNO3 diminue légèrement.
Figure 4.6 - Images TEM pour les nanobâtonnets obtenus avec le second protocole pour les synthèses A, B et C.
Tel qu’attendu, les nanobâtonnets synthétisés par cette méthode possèdent un ratio d’aspect
beaucoup plus élevé qu’avec le protocole précédent, en raison de l’utilisation de l’hydroquinone comme
réducteur faible. Par ailleurs, la taille des nanobâtonnets d’or diminue de la synthèse A à la synthèse
46
C, selon les dimensions mesurées à l’aide des images TEM (voir tableau 4.2). Ceci s’explique par le
fait que toutes les synthèses possèdent la même concentration d’or dans la solution de croissance,
alors que le volume de germes ajouté varie. Par conséquent, plus il y a de germes en solution, moins
il y a de réactifs disponibles par unité de surface, ce qui mène à l’obtention de nanobâtonnets plus
petits, comme dans le cas de la synthèse C.
Tableau 4.2 - Dimensions et concentration des nanobâtonnets obtenus avec le second protocole de synthèse.
Longueur Largeur Concentration

Solution Ratio d’aspect
nm x 1011 NPs/mL
A 105 ± 18 22 ± 3 4,8 2,35 ± 0,02
B 91 ± 14 28 ± 7 5,2 3,62 ± 0,07
C 81 ± 13 14 ± 2 5,8 4,9 ± 0,3
Un autre élément important à remarquer est que le ratio aspect augmente de la synthèse A à C,
passant de 4,8 à 5,8. Ceci peut paraître contradictoire, puisqu’il est connu dans la littérature que le
ratio d’aspect des bâtonnets augmente en fonction de la concentration d’AgNO3 dans la solution de
croissance.104 Toutefois, la concentration d’ions Ag+ varie très peu d’une synthèse à l’autre et le
changement dans le ratio d’aspect des bâtonnets serait plutôt attribuable à l’augmentation significative
de la concentration de germes en passant de la synthèse A à la synthèse C. En effet, il est rapporté
dans la littérature qu’une augmentation de la quantité de germes en solution entraîne une hausse du
ratio d’aspect des nanobâtonnets,105,106 bien que ce phénomène soit encore mal compris.
Encore une fois, les spectres d’extinction mesurés présentent deux bandes plasmoniques
caractéristiques aux nanobâtonnets. La position de la bande longitudinale pour les synthèses A, B et
C est respectivement de 1036 nm, 1103 nm et 1148 nm, puisque le plasmon se déplace typiquement
vers le rouge lorsque le ratio d’aspect augmente. Ce second protocole permet par conséquent
d’atteindre des longueurs d’onde plus loin dans le proche infrarouge qu’avec le premier protocole.
Toutefois, la bande longitudinale est beaucoup plus évasée avec cette seconde méthode. La largeur
à mi-hauteur varie entre 293 nm et 365 nm, tandis qu’elle atteignait à peine 117 nm avec la première
méthode, ce qui est un indicateur que les nanobâtonnets sont plus polydisperses. Encore une fois, les
images TEM permettent d’observer la présence d’impuretés de forme sphérique, cubique ou
octaédrique, mais le rendement de nanobâtonnets demeure très élevé.
47
1
Extinction normalisée (u.a.)

0,9 Protocole 1
0,8 Protocole 2 (A)
0,7 Protocole 2 (B)
0,6 Protocole 2 (C)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
400 600 800 1000 1200
Figure 4.7 - Spectres d’extinction des nanobâtonnets obtenus avec la seconde méthode de synthèse
comparativement à la première méthode.
Ces deux protocoles sont intéressants, puisqu’ils permettent d’obtenir des nanobâtonnets d’or avec un
plasmon couvrant une large gamme de longueurs d’onde dans le proche infrarouge. Les
nanobâtonnets synthétisés à l’aide du premier protocole ont toutefois été sélectionnés pour la suite du
projet, étant donné leur plus faible polydispersité. Il faut cependant noter que la surface des bâtonnets
est recouverte d’une bicouche de CTAB pour les deux méthodes proposées, ce qui signifie qu’elle peut
être fonctionnalisée avec de la silice ou du polymère à l’aide des mêmes protocoles. La seule différence
provient de la surface disponible, mais ceci peut être ajusté en diluant ou en concentrant les
nanobâtonnets au besoin.
4.2 Couche de silice
4.2.1 Protocole de synthèse
Pour effectuer l’ajout d’une couche de silice à la surface des nanobâtonnets, une synthèse en deux
étapes a été utilisée (voir l’annexe 4 pour le protocole complet). La première étape consiste à activer
la surface des nanobâtonnets d’or en déplaçant une partie de la bicouche de CTAB à l’aide d’une
molécule bifonctionnelle, le (3-mercaptopropyl)triméthoxysilane (MPTMS). En effet, le MPTMS
possède une fonction thiol à son extrémité, ce qui lui permet d’adhérer fortement à la surface d’or en
plus d’exposer son groupement silane vers le milieu réactionnel.107 La seconde étape vise à effectuer
la croissance d’une couche de silice par un procédé de type Stöber. 108 Pour ce faire, les bâtonnets
recouverts de MPTMS (AuNBs@MPTMS) sont transférés dans une solution d’éthanol contenant un
48
précurseur de type alkoxysilane, ici l’orthosilicate de tétraéthyle (TEOS). La réaction d’hydrolyse et de
condensation du silane est alors catalysée par l’ajout d’une base, la diméthylamine (DMA).
Figure 4.8 – Schéma de la méthode d’ajout d’une couche de silice à la surface des nanobâtonnets d’or par
échange de ligands, puis condensation de TEOS.
Afin d’obtenir des coquilles de silice uniformes et d’éviter la seconde nucléation, il est essentiel de
contrôler la cinétique d’hydrolyse et de condensation du précurseur. Pour y arriver, il est possible de
ralentir la réaction d’hydrolyse en utilisant une quantité minimale de base et d’eau. De plus, l’épaisseur
de la coquille de silice peut être modulée avec précision en jouant sur le volume et sur le nombre
d’ajouts de TEOS dans le milieu réactionnel.
Hydrolyse
Condensation
Figure 4.9 – Mécanisme d’hydrolyse et de condensation d’un précurseur alkoxysilane par un procédé de type
Stöber catalysé par une base.109
49
Les nanobâtonnets d’or recouverts de silice (AuNBs@SiO2) ont d’abord été caractérisés par TEM. La
figure 4.10 présente quelques exemples de coquilles obtenues pour un ajout croissant de TEOS au
milieu réactionnel. La technique de déplacement de ligands suivie de la polycondensation du TEOS
permet d’obtenir des couches de silice uniformes sur toutes les facettes des nanobâtonnets en plus de
limiter la formation de nanoparticules de silice. En effet, en absence de MPTMS, le TEOS se condense
exclusivement sous forme de nanoparticules de silice et la surface des nanobâtonnets reste couverte
uniquement de la bicouche de CTAB.
Concentration de TEOS ↑
Figure 4.10 – Images de microscopie électronique à transmission de nanobâtonnets d’or recouverts d’une
couche de silice de (A) (8±1) nm, (B) (16±1) nm, (C) (23±2) nm, (D) (25±2) nm et (E) (30±3) nm.
Tableau 4.3 – Épaisseur de la coquille obtenue pour l’ajout de différents volumes d’une solution de TEOS 9 mM,
tel que déterminé à l’aide des images TEM.
Volume de TEOS 9mM Épaisseur de la coquille Écart-type relatif

Nombre d’ajouts
mL nm %
0,25 5,6 ± 0,8 14
0,30 8 ± 1 14
1 0,35 10 ± 1 14
0,40 13 ± 2 16
0,45 15 ± 3 19
0,25 13 ± 2 13
0,30 16 ± 1 9
2 0,35 18 ± 2 11
0,40 20 ± 2 11
0,45 21 ± 3 13
0,25 23 ± 2 8
0,30 25 ± 2 8
3 0,35 28 ± 2 7
0,40 30 ± 3 9
0,45 33 ± 4 11
50
Afin de moduler l’épaisseur de la couche de silice avec précision, différents volumes d’ajout de TEOS
9 mM dans l’éthanol ont été testés. Comme le montre le tableau 3.1, la coquille de silice devient de
plus en plus épaisse à mesure que la quantité de TEOS dans le milieu augmente, puisqu’il y a
davantage de réactifs disponibles pour l’étape de polycondensation. En effectuant un seul ajout de
TEOS, il est donc possible de moduler la couche de silice de 5,6 nm à 15 nm avec une bonne précision.
Cependant, il est difficile de produire une couche plus mince, étant donné que les nanobâtonnets ont
alors tendance à agréger. De plus, lors que le volume de TEOS ajouté est plus grand que 0,45 mL, la
concentration de précurseur en solution devient suffisante pour entraîner la formation de
nanoparticules de silice individuelles.
40
Épaisseur de la coquille (nm)
1 ajout
35
2 ajouts
30
3 ajouts
25
20
15
10
5
0
0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
Volume de TEOS 9 mM ajouté (mL)
Figure 4.11 – Évolution de la couche de silice sur les nanobâtonnets d’or pour l’ajout de différents volumes de
TEOS 9 mM.
Pour atteindre des tailles supérieures à 15 nm, il est donc nécessaire de faire plusieurs petits ajouts
de TEOS. Avec deux ajouts, l’épaisseur de la coquille varie entre 13 et 21 nm, tandis qu’avec trois
ajouts il est possible d’atteindre des tailles de 23 à 33 nm. La figure 4.11 permet de mieux visualiser
l’évolution de la coquille de silice et son uniformité. De manière générale, l’écart-type relatif sur
l’épaisseur de la couche diminue en fonction du nombre d’ajouts effectué, puisque des ajouts
successifs permettent de corriger les imperfections de surface initiales.
Les nanobâtonnets recouvertes de silice ont également été caractérisés par spectroscopie UV-visible.
Comme le montre la figure 4.12, l’étape d’échange de ligands avec le MPTMS n’a pas d’influence sur
la position de la bande plasmonique longitudinale. Cependant, l’ajout de la couche de silice entraîne
un déplacement significatif de cette bande vers le rouge, tel qu’attendu, étant donné que l’indice de
51
réfraction de la silice est plus élevé que celui de l’eau. 42 Le déplacement augmente également en
fonction de l’épaisseur de la couche, passant de 31 à 38 nm lorsque la couche varie de 8 à 30 nm,
puisque le plasmon des nanobâtonnets possède une certaine portée dans le milieu environnant. Il est
intéressant de noter que la bande longitudinale devient plus étroite lorsque l’épaisseur de la coquille
de silice augmente, ce qui suggère encore une fois une meilleure uniformité de la surface avec
plusieurs ajouts de TEOS.
1
AuNBs
0,9
AuNBs@MPTMS
0,8 (8±1) nm silice
0,4
0,3
0,2
0,1
0
400 500 600 700 800 900 1000
Figure 4.12 – Spectres d’extinction des nanobâtonnets d’or après l’échange de ligands avec le MPTMS, puis
après l’étape d’ajout d’une couche de silice d’épaisseur modulable.
4.3 Couche de polymère thermosensible
4.3.1 Choix du polymère
Un des polymères thermosensibles les plus utilisés dans la littérature est le PNIPAM ou poly(N-
isopropylacrylamide). Cet hydrogel biocompatible est particulièrement utilisé dans le domaine du
transport actif de médicaments, puisqu’il possède une LCST de 32°C, c’est-à-dire qu’il passe d’une
phase hydratée et gorgée de molécules bioactives à une phase déshydratée et plus dense lorsque
cette température est atteinte.110 Ceci est idéal pour induire un relargage progressif d’un médicament
dès l’entrée du polymère dans le corps humain, qui maintient sa température à (36,8 ± 0,4)°C en
conditions normales.111 Toutefois, dans le cadre du projet, le but est de relarguer un principe actif dans
l’organisme uniquement lorsque le nano-véhicule aura atteint le site biologique ciblé, et ce, en induisant
un chauffage local à l’aide d’une source laser. Par conséquent, il est nécessaire d’utiliser un polymère
thermosensible possédant une LCST supérieure à 37°C, sans toutefois être trop élevée pour éviter
d’induire la mort cellulaire.
52
Figure 4.13 – (A) Structure de deux monomères : le NIPAM et le NIPMAM. (B) LCST de différents polymères
thermosensibles, dont le PNIPAM (en bleu) et le PNIPMAM (en magenta).112
Tel que démontré dans la littérature, il est possible de modifier la structure du N-isopropylacrylamide
(NIPAM) ou bien de lui ajouter un second monomère pour moduler la LCST du polymère final (voir
figure 4.13). Par exemple, le N-isopropylméthacrylamide (NIPMAM) est obtenu en ajoutant un
groupement méthyle au monomère de départ; le polymère résultant, le poly(N-
isopropylméthacrylamide) (PNIPMAM), possède alors une LCST de 42°C.112 Ce polymère a donc été
sélectionné pour le projet, puisqu’il peut être synthétisé de façon simple et similaire au PNIPAM en
plus de respecter les exigences de température.
4.3.2 Premier protocole de synthèse
Une première approche a été testée pour ajouter une couche de polymère thermosensible sur les
nanobâtonnets d’or recouverts de silice (voir l’annexe 5 pour le protocole de synthèse détaillé).113 La
première étape consiste à apprêter la surface de silice en y incorporant des groupements méthacrylate,
qui serviront de points d’ancrage pour la polymérisation du NIPMAM. Pour ce faire, du
3-méthacryloxypropyltriméthoxysilane (MPS) est hydrolysé, puis condensé à la surface du réseau de
silice par catalyse basique avec du DMA dans l’éthanol. Par la suite, les nanobâtonnets sont transférés
dans l’eau et la couche d’hydrogel thermosensible est ajoutée par un processus de polymérisation par
précipitation du NIPMAM initié par le persulfate de potassium (KPS), un initiateur radicalaire soluble
en milieu aqueux, en présence d’un surfactant, le dodécylsulfate de sodium (SDS).
53
Figure 4.14 – Schéma de synthèse pour l’ajout d’une coquille de polymère thermosensible à la surface des
nanobâtonnets d’or recouverts de silice par (A) fonctionnalisation de surface à l’aide de groupements
méthacrylate, puis (B) polymérisation par précipitation du NIPMAM.
Le N,N’-métylènebisacrylamide (MBA) est ajouté au mélange réactionnel dans un ratio MBA:NIPMAM

de 1:9 dans le but de former une matrice de polymère réticulée. De cette manière, les molécules
bioactives seront encapsulées de façon plus efficace dans la couche de polymère.
4.3.3 Caractérisation et problèmes rencontrés
Les nanobâtonnets ont été caractérisés par microscopie électronique à transmission après chacune
des deux étapes de synthèse. Tel qu’illustré à la figure 4.15, les nanobâtonnets d’or recouverts de
silice et de MPS (AuNBs@SiO2@MPS) présentent une morphologie coeur@coquille bien définie dans
l’éthanol. Cependant, après l’étape de polymérisation par précipitation du NIPMAM dans l’eau à 70°C
pendant 2 h, la couche de silice est presque complètement érodée. Pour investiguer la cause de cette
érosion, les AuNBs@SiO2 de même que les AuNBs@SiO2@MPS ont été chauffés à 70°C pendant
une période de 2 h sans ajouter les réactifs de polymérisation, et la dégradation de la silice a également
été observée au TEM. L’érosion se produit aussi lorsque ces échantillons sont laissés dans l’eau à
température pièce pendant 24 h. Il semble donc que ce soit le traitement thermique en milieu aqueux
qui soit au cœur du problème.
L’hypothèse la plus logique est que la présence d’eau cause l’hydrolyse des liens Si-O-Si, détruisant
ainsi le réseau de silice, et que la cinétique de cette réaction est accélérée à haute température. De
54
plus, il s’avère en fait que, lors de l’ajout de la couche de silice, il y a présence de CTAB dans le milieu
réactionnel dans le but de stabiliser les nanobâtonnets d’or. Tel que rapporté dans la littérature, le
CTAB peut agir en tant que « moule » ou « gabarit » en s’assemblant sous forme de micelles au
moment de la polycondensation du TEOS, afin de créer un réseau de silice poreux. 114a La porosité de
cette coquille de silice la rendrait donc particulièrement sensible à l’hydrolyse des liens Si-O-Si, puisque
la surface de contact avec le milieu aqueux est accrue. Le rayon de courbure prononcé aux extrémités
des nanobâtonnets pourrait également avoir une influence sur la sensibilité de la silice à l’hydrolyse,
mais ce facteur n’a pas été étudié au cours de ce projet.114b
Figure 4.15 – Images TEM de AuNBs@SiO2@MPS (A) dans l’éthanol et (B) dans l’eau après 2 h à 70°C. À titre de
comparaison, images TEM de AuNPs@SiO2 (C) dans l’éthanol et (D) dans l’eau après 2 h à 70°C.
Afin d’étudier cette hypothèse, les AuNBs@SiO2 ont été comparés à des nanoparticules d’or
sphériques recouvertes de silice (AuNPs@SiO2). Ces nanoparticules d’or, d’un diamètre d’environ 50
nm, ont été synthétisées par croissance contrôlée de germes en présence de citrate de sodium
tribasique (voir protocole à l’annexe 7), donc dans un milieu ne contenant pas de CTAB. Une couche
de silice d’environ 20 nm a ensuite été ajoutée à l’aide d’une méthode similaire à celle utilisée pour les
nanobâtonnets d’or. À des fins de comparaison, ces nanostructures ont également été chauffées à
70°C pendant 2 h dans l’eau et, comme le montre la figure 4.15, la couche de silice dans ce cas ne
présente aucun signe d’érosion. Pour éviter de dégrader la silice, il serait donc nécessaire d’effectuer
la polymérisation du NIPMAM dans un autre solvant comme l’éthanol, ou encore de retirer le CTAB du
milieu réactionnel avant d’ajouter la couche de silice. Ces alternatives n’ont toutefois pas encore été
testées.
55
4.3.4 Second protocole de synthèse
En parallèle, un second protocole a été étudié pour ajouter une coquille de PNIPMAM aux
nanobâtonnets d’or (voir l’annexe 6).115 Dans cette méthode, les nanobâtonnets d’or sont d’abord
recouverts d’une mince couche de polystyrène (PS) grâce à la polymérisation par précipitation du
styrène par le KPS en milieu aqueux. Le MBA est également utilisé comme agent de réticulation dans
un ratio molaire MBA:styrène d’environ 1:3, afin d’obtenir une coquille de polymère réseautée.116
Figure 4.16 - Schéma de synthèse alternatif pour l’ajout d’une coquille de polymère thermosensible à la surface
des nanobâtonnets d’or par (A) polymérisation par précipitation du styrène, puis (B) polymérisation par
précipitation du NIPMAM.
Étant donné que le styrène et le MBA ont une plus grande affinité pour la bicouche de CTAB que pour
le milieu aqueux, ceux-ci polymérisent préférentiellement à la surface des nanobâtonnets d’or. Tel que
rapporté dans la littérature, le polystyrène agit alors comme point d’ancrage pour la polymérisation par
précipitation du NIPMAM en formant un environnement hydrophobe et riche en terminaisons
méthacrylate.
Les nanobâtonnets recouverts de polystyrène (AuNBs@PS), puis de PNIPMAM

(AuNBs@PS@PNIPMAM) ont d’abord été caractérisés par spectroscopie UV-visible. Tout d’abord, la
bande plasmonique longitudinale des nanobâtonnets se déplace significativement vers le bleu lors de
l’ajout de la couche de polystyrène, passant de 782 à 729 nm. Le système AuNBs@PS a été très peu
caractérisé dans la littérature, mais cette tendance a déjà été rapportée par le groupe de Chen, qui
l’attribue à une diminution de la permittivité locale autour du cœur plasmonique. 117 Cette hypothèse
n’est supportée par aucun fait de la littérature et semble aller à l’encontre d’un autre point soulevé dans
l’article : l’indice de réfraction du polystyrène est supérieur à celui de l’eau. À cet égard, la bande
56
longitudinale se déplace ensuite de 10 nm vers le rouge suite à l’ajout de la couche de polymère
thermosensible, ce qui serait dû à une augmentation de l’indice de réfraction du milieu.
1
AuNBs
AuNBs@PS
0,8
PNIPMAM 30 min
PNIPMAM 60 min
0,6 PNIPMAM 90 min
PNIPMAM 120 min
0,4
0,2
0
400 500 600 700 800 900 1000
Figure 4.17 – Spectres d’extinction des nanobâtonnets d’or à différentes étapes de l’ajout d’une couche de
PNIPMAM.
Le plasmon des nanobâtonnets est similaire pour les 4 aliquots prélevés après 30, 60, 90 et 120 min
de polymérisation du NIPMAM. Toutefois, les images TEM de ces aliquots présentent des différences
marquées. Tel qu’illustré à la figure 4.18, les AuNBs@PS@PNIPMAM obtenus après 30 minutes sont
bien séparés et définis, tandis qu’ils forment un réseau de polymère interconnecté après 120 minutes
de réaction. Le premier aliquot a donc été utilisé pour le reste des caractérisations, et les nanosphères
de polymères visibles sur la grille TEM ont été éliminées en grande partie par centrifugation.
Dans le but de vérifier la réponse du polymère thermosensible à la température, les nano-véhicules

ont été étudiés par DLS. Les AuNBs@PS présentent un diamètre hydrodynamique constant dans une
gamme de température de 25°C à 50°C (voir figure 4.18 D), tel qu’attendu. Cependant, pour les
AuNBs@PS@PNIPMAM, le diamètre hydrodynamique diminue drastiquement de 37°C à 46°C,
passant de (197 ± 22) nm à (140 ± 16) nm, ce qui représente un affaissement de la structure de 29%
(voir figure 4.18 E). La LCST du polymère est d’environ 41°C, très près de la donnée rapportée dans
la littérature. De plus, comme le montre la figure 4.18 C, la structure du nano-véhicule est conservée,
même après ce traitement thermique dans l’eau, ce qui présente un net avantage par rapport à la
méthode de synthèse précédente. Il est d’ailleurs à noter que l’affaissement de la couche de polymère
peut, en théorie, être modulé en modifiant le ratio entre le monomère et l’agent de réticulation. 115 De
cette manière, il serait donc possible de contrôler la cinétique de relargage des molécules bioactives
encapsulées.
57
100
hydrodynamique (nm)
95 D)
90
Diamètre
85
80
75
70
20 25 30 35 40 45 50 55
Température (°C)
240
hydrodynamique (nm)
220 E)
200
Diamètre
180
160
140
120
100
35 37 39 41 43 45 47
Température (°C)
Figure 4.18 – Images TEM de AuNBs@PS@PNIPMAM (A) après 30 min et (B) après 120 min de polymérisation du
NIPMAM, puis (C) après un traitement thermique à 46°C pour l’échantillon en (A). Analyse DLS de (D)
AuNBs@PS et (E) AuNBs@PS@PNIPMAM en fonction de la température.
Cette seconde méthode de synthèse permet d’obtenir des nano-véhicules fonctionnels pour
l’application visée. Toutefois, d’autres tests ont été effectués afin de vérifier la présence de la couche
de polystyrène à la surface des AuNBs, puisque très peu d’articles dans la littérature se sont penchés
sur ce type de caractérisation.117,118 Pour ce faire, des AuNBs tel que synthétisés ont été comparés à
trois autres échantillons ayant subi un traitement à 70°C pendant 2 h dans l’eau 1) sans ajout de
réactifs, 2) en présence de KPS et 3) en présence de KPS, de styrène et de MBA. Ces solutions ont
été analysées par spectroscopie UV-visible, par TEM et par DLS.
Tout d’abord, les spectres d’extinction présentés à la figure 4.19 montrent que la température et la
présence de KPS dans le milieu ont une influence sur la position de la bande plasmonique
longitudinale. En effet, le plasmon des nanobâtonnets d’or se déplace vers le bleu de 13 nm après le
traitement thermique et de 47 nm lorsque le KPS est présent dans le milieu réactionnel sous haute
58
température. De manière étonnante, l’effet très marqué de ces deux paramètres ne semble pas être
rapporté dans la littérature. Grâce à ces nouveaux résultats, il est possible d’émettre l’hypothèse
qu’une hausse de température et la présence d’une espèce radicalaire comme le persulfate de
potassium peuvent induire une modification de la morphologie des nanobâtonnets, changeant ainsi
l’énergie de résonance du plasmon longitudinal.
1
0,9
0,8 AuNBs
0,7
0,6 AuNBs 70°C
0,5
0,4 AuNBs 70°C + KPS
0,3
0,2 AuNBs 70°C + réactifs
0,1
0
600 700 800 900
Figure 4.19 – Spectres d’extinction des nanobâtonnets d’or après des traitements dans différents milieux
réactionnels.
Pour vérifier cette hypothèse, ces quatre échantillons ont par la suite été caractérisés par TEM. Tel
qu’illustré à la figure 4.20, la pointe des nanobâtonnets d’or passe d’une forme angulaire tout juste
après leur synthèse à une forme plus arrondie après le traitement thermique. Cette modification de la
forme des bâtonnets est encore plus marquée en présence de persulfate de potassium, ce qui permet
d’expliquer le déplacement graduel du plasmon vers les plus courtes longueurs d’onde. 72 Il semble
donc qu’une température élevée et la présence de radicaux favorise le remaniement des atomes d’or
à la surface des nanoparticules, passant d’une conformation en pointe vers une conformation arrondie
afin de diminuer l’énergie de surface du système.
Figure 4.20 – Images TEM de nanobâtonnets d’or (A) directement après leur synthèse, (B) après un traitement de
2h dans l’eau à 70°C et (C) après un traitement de 2h dans l’eau à 70 °C en présence de KPS.
59
Les dimensions des nanobâtonnets ont également été mesurées à l’aide des images TEM et portées
en graphique à la figure 4.21. Selon ces résultats, il semble que la distribution de tailles des
nanobâtonnets d’or demeure similaire pour les quatre échantillons étudiés, ce qui indique que le
déplacement de la bande plasmonique ne serait pas dû à un changement dans le ratio d’aspect des
AuNBs, mais uniquement à un changement de morphologie des pointes.
100
Longueur des particules (nm)
AuNBs
90 AuNBs 70°C
AuNBs 70°C + KPS
80 AuNBs 70°C + réactifs
70
60
50
40
0 10 20 30
Largeur des particules (nm)
Figure 4.21 - Distribution de tailles des nanobâtonnets après différents traitements tel que déterminé au TEM.
La présence de la couche de polystyrène à la surface des AuNBs n’a toutefois pas pu être confirmée
par microscopie électronique à transmission. La principale difficulté provient du fait qu’une mince
couche de PS est très difficile à observer au TEM, même en utilisant un agent de coloration comme
l’acide phosphotungstique, étant donné qu’elle peut facilement être confondue avec une bicouche de
CTAB ou avec de l’eau adsorbée sur la surface d’or. Comme analyse préliminaire, les quatre
échantillons ont donc été caractérisés par DLS, afin de vérifier s’il y a modification du diamètre
hydrodynamique des nanobâtonnets après chaque traitement. Comme le montre la figure 4.22, le
diamètre hydrodynamique des AuNBs fraichement synthétisés diminue à haute température et en
présence de KPS, passant de (63,7 ± 0,4) nm à (60,7 ± 0,7) nm après le traitement thermique et à
(59,3 ± 0,9) nm avec l’ajout du persulfate de potassium. Cette variation semble être occasionnée par
l’arrondissement des pointes des bâtonnets. Toutefois, lorsque tous les réactifs sont présents en
solution à 70°C, le diamètre des nanoparticules solvatées est plus grand, atteignant (62,2 ± 0,3) nm.
Ce résultat suggère que le polystyrène est bien déposé à la surface des AuNBs par polymérisation par
précipitation, augmentant ainsi la taille des particules, mais il s’agit uniquement d’une preuve indirecte.
60
65
Diamètre hydrodynamique (nm)

64
63
62
61
60
59
58
AuNBs AuNBs 70°C AuNBs 70°C + AuNBs 70°C +
KPS réactifs
Figure 4.22 – Analyse DLS des nanobâtonnets d’or dans l’eau nano à température pièce.
Pour confirmer ou infirmer la présence de la couche de polystyrène, il serait donc nécessaire de faire
des analyses plus poussées en utilisant des techniques comme la spectroscopie infrarouge et la
thermogravimétrie. L’inconvénient principal de ces méthodes d’analyse est qu’elles demandent
plusieurs milligrammes d’échantillon, ce qui représente une masse importante dans le domaine des
nanoparticules, en plus d’être destructrices. De plus, comme la coquille de polystyrène est en théorie
très mince, le poids du polymère représente une fraction infime du poids total des AuNBs@PS, ce qui
signifie qu’il faut une masse d’échantillon encore plus grande pour espérer repérer le polystyrène.
Néanmoins, ces techniques permettraient d’identifier avec précision les espèces chimiques présentes
à la surface des nanobâtonnets d’or.
61
5. Développement d’une sonde micrométrique pour la
détection d’ATP dans l’environnement des cellules
5.1 Aptamère spécifique à l’ATP
5.1.1 Choix de l’aptamère
Plusieurs aptamères sensibles à l’ATP ont été rapportées dans la littérature.119 Chacun de ces
aptamères possède une certaine séquence d’acides nucléiques qui vient dicter sa constante
d’association avec l’ATP de même que sa conformation 3D en présence et en absence de sa cible.
Grâce à cette large banque d’aptamères, il est possible de sélectionner un brin d’ADN possédant les
caractéristiques désirées pour une application particulière. Pour le présent projet, l’aptamère choisi
doit posséder deux caractéristiques importantes : 1) une gamme de détection d’ATP dans le domaine
physiologique et 2) un changement de conformation important permettant de mesurer une grande
variation de signal entre la position allumée et éteinte.
A)
B) C)
[Urée] (M) [ATP] (M)

Figure 5.1 – (A) Schéma présentant le changement de conformation attendu pour deux aptamères spécifiques à
l’ATP possédant une séquence d’acides nucléiques légèrement différente. (B) Courbes de dénaturation des deux
aptamères en présence d’urée mesurées par électrochimie. (C) Courbes de réponse des aptamères à l’ATP
mesurées par électrochimie.120
62
Un aptamère répondant à ces deux critères a été développé par le groupe de Kevin W. Plaxco. 120 Tel
qu’illustré à la figure 5.1, ces chercheurs ont modifié la séquence d’acides nucléiques d’un simple brin
d’ADN sensible à l’ATP connu dans la littérature121 afin de le déstabiliser et ainsi d’augmenter son
changement de conformation. En effet, l’aptamère original, illustré à la figure 5.2, forme
préférentiellement une boucle en l’absence d’ATP et demeure sous une conformation repliée en
captant jusqu’à deux molécules ATP dans son site de liaison.
La stratégie employée pour modifier cet aptamère est de retirer quatre bases azotées –deux à
chacune des extrémités du simple brin d’ADN –dans le but de diminuer le nombre de bases
complémentaires stabilisant la conformation repliée (voir figure 5.2). En théorie, cette altération force
le dépliement du brin d’ADN en l’absence d’ATP sans toutefois affecter le site de liaison, permettant
ainsi à l’aptamère déstabilisé de capté lui aussi deux molécules d’ATP.
Figure 5.2 – Schéma du repliement de l’aptamère pleine longueur (27 bases azotées) (A) en absence d’ATP et (B)
en présence d’ATP avec l’alignement des paires de bases. L’encadré noir présente le site de liaison des deux
molécules d’ATP.121 En rouge, les bases nucléiques absentes dans la séquence de l’aptamère déstabilisé sont
mises en évidence.120
Dans cette étude, les aptamères sont modifiés à une extrémité avec un groupement thiol qui leur
permet d’être greffés sur une surface d’or, et à l’autre extrémité avec un indicateur d’oxydoréduction,
le bleu de méthylène, qui peut être réduit par la surface d’or. Le signal mesuré par électrochimie pour
ce capteur varie en fonction de la position du bleu de méthylène dans l’espace, donc en fonction du
degré de repliement de l’aptamère.
63
Afin d’étudier la conformation la plus stable en absence de la cible, les aptamère greffés à la surface
d’or ont été placés dans un milieu exempt d’ATP, puis une concentration croissante d’urée a été
ajoutée (voir figure 5.1 B). En effet, l’urée s’avère être un agent de dénaturation de l’ADN qui déplace
l’équilibre vers la conformation totalement dépliée de l’aptamère. Comme le montrent les courbes de
dénaturation, le capteur utilisant l’aptamère pleine longueur subit un changement de signal important
lorsque la concentration d’urée en solution passe de 0 à 8 M, tandis que celui faisant usage de
l’aptamère déstabilisé présente un signal constant peu importe le milieu. Ceci suggère donc que la
modification de la séquence d’ADN a eu l’effet espéré : l’aptamère ayant 27 bases se retrouve
majoritairement sous forme repliée en l’absence d’ATP, alors que l’aptamère plus court est plutôt sous
forme dépliée.
La réponse de ces deux aptamères à différents étalons d’ATP a également été investiguée. La figure
5.1 C montre les courbes d’étalonnage obtenues par électrochimie pour les deux capteurs. Tel
qu’attendu, l’aptamère déstabilisé présente un plus grand changement de signal à une même
concentration d’ATP que l’aptamère original, étant donné qu’il change plus drastiquement de
conformation. Toutefois, le domaine de réponse du capteur reste le même pour les deux aptamères,
ce qui indique que les modifications apportées à la séquence de bases azotées n’ont pas eu d’impact
marqué sur le site de liaison de l’ATP.
5.1.2 Modifications apportées à l’aptamère
L’aptamère déstabilisé du groupe de Plaxco a été sélectionné pour le projet. Ce simple brin d’ADN a
été synthétisé par la compagnie Biosearch Technologies, qui offre l’option de modifier les extrémités
avec différents groupements fonctionnels. À l’extrémité 5’ de l’ADN, un groupement thiol a donc été
ajouté afin de permettre le greffage de l’aptamère sur la surface des nanoparticules d’or. Toutefois,
puisque les groupements thiol libres possèdent une stabilité limitée, la compagnie préfère expédier
l’ADN avec un lien disulfide, tel qu’illustré à la figure 5.3 A. Ce lien disulfide doit par conséquent être
réduit avant d’effectuer le greffage sur le métal. De façon complémentaire, un fluorophore portant le
nom de Quasar 670 (Q670) a été ajouté de façon covalente à l’extrémité 3’. Celui-ci est un analogue
de la cyanine 5 (Cy5) et possède un spectre d’excitation et d’émission situé dans le rouge, c’est-à-dire
dans la fenêtre de transparence biologique. Dans l’eau, sa longueur d’onde d’excitation maximale est
située à 647 nm et sa longueur d’onde d’émission se trouve à 668 nm.
64
C) 1
Fluorescence normalisée
Excitation Q670
0,8
Émission Q670
0,6
(u.a)
0,4
0,2
0
500 600 700 800
Longueur d’onde (nm)
Figure 5.3 – Modifications apportées aux extrémités de l’aptamère sensible à l’ATP. (A) Ajout à l’extrémité 5’
d’une chaine alcane possédant un lien disulfide. (B) Ajout à l’extrémité 3’ d’un fluorophore, le Quasar 670, avec
(C) ses spectres d’excitation et d’émission dans l’eau.
L’aptamère synthétisé et modifié est ensuite purifié par la compagnie par chromatographie en phase
liquide à haute performance en phase inverse. Une fois reçu, l’aptamère est alors séparé en aliquots
de 0,5 à 1 nmol par des collaborateurs au Centre de recherche en infectiologie du Centre hospitalier
de l’Université Laval, dans le but de faciliter la manipulation de l’ADN durant la préparation du
biocapteur. L’aptamère est par la suite conservé à l’abri de la lumière à -20°C pendant une période
maximale de 1 an, tel que recommandé par la compagnie.
5.2 Synthèse des nanoparticules d’or
5.2.1 Protocole de synthèse
Les nanoparticules d’or ont été préparées par croissance contrôlée de germes (voir le protocole détaillé
de synthèse à l’annexe 7). Pour ce faire, des AuNPs possédant un diamètre de 12 nm ont d’abord été
65
synthétisés à l’aide d’une méthode inspirée de la synthèse de Turkevich. Plus précisément, une
solution de citrate de sodium tribasique est portée à ébullition, température suffisante pour transformer
cette espèce en un réducteur fort. Une solution concentrée d’acide chloraurique est ensuite ajoutée
très rapidement au milieu réactionnel, une étape critique pour assurer une période de nucléation courte
et donc une faible polydispersité des nanoparticules résultantes. Le citrate de sodium permet de réduire
directement l’Au(III) en Au(0) en plus de stabiliser les germes formés en agissant en tant que ligand
de surface.
Figure 5.4 – Schéma de synthèse des nanoparticules d’or sphériques par croissance contrôlée de germes.
La seconde étape de synthèse consiste à faire croître les germes en ajoutant de façon répétée de
faibles quantités de réactifs, afin de limiter la seconde nucléation. Dans un premier temps, les germes
sont dilués dans une solution de citrate de sodium, puis portés à ébullition sous reflux. Une solution
d’Au(III) est alors ajoutée au milieu réactionnel sous haute agitation, dans le but de distribuer
rapidement les réactifs de façon uniforme dans l’environnement des nanoparticules d’or. Après 45
minutes, de faibles quantités d’acide chloraurique et de citrate de sodium sont ajoutées de nouveau
en solution pour poursuivre la croissance. Ce processus peut être répété à plusieurs reprises afin
d’atteindre la taille de nanoparticules désirée.
66
Les AuNPs ont été caractérisées à différentes étapes de la synthèse par TEM afin de déterminer leur
taille et leur niveau de polydispersité. Pour plus de deux cents particules analysées, un diamètre moyen
des germes de (12 ± 1) nm a été déterminé. Au cours de la période de croissance, la taille des AuNPs
atteint (29 ± 5) nm après un seul ajout de réactifs, puis (47 ± 4) nm après un total de 5 ajouts. Comme
l’illustre le tableau 5.1, la période de croissance des germes permet donc de moduler avec précision
la taille des nanoparticules d’or obtenues.
Figure 5.5 – (A) Image TEM des germes d’or. (B) à (F) Images TEM des nanoparticules d’or obtenues lors de la
croissance après chacun des 5 ajouts de réactifs.
Tableau 5.1 – Évolution des propriétés des nanoparticules d’or au cours de la synthèse. Données extraites des
analyses au TEM, en NTA et en spectroscopie UV-visible.
Nombre de λ
Diamètre des particules Concentration
particules d’extinction
Solution (nm) (par NTA)
analysées au maximale
TEM NTA TEM x 1011 NPs/mL nm
Germes 12 ± 1 - 241 - 519
1 ajout 29 ± 5 31,3 ± 0,7 95 2,1 ± 0,2 523
2 ajouts 35 ± 4 37,6 ± 0,7 108 2,2 ± 0,1 523
3 ajouts 40 ± 4 40,5 ± 0,4 99 2,8 ± 0,3 526
4 ajouts 43 ± 4 42,7 ± 0,5 103 2,3 ± 0,1 526
5 ajouts 47 ± 4 47,7 ± 0,2 103 2,7 ± 0,2 528
67
Les nanoparticules d’or ont également été caractérisées par NTA afin d’obtenir des informations sur la
distribution de taille des colloïdes en solution. La solution de germes n’a toutefois pas été analysée,
étant donné que les particules doivent posséder un diamètre minimal de 20 nm pour assurer une
diffusion suffisante du faisceau laser. Tel qu’attendu, la taille des AuNPs déterminée par cette
technique semble être légèrement plus élevée que celle mesurée par TEM, bien qu’à l’intérieur de
l’incertitude de cette dernière, puisque la NTA fait le calcul du diamètre hydrodynamique des particules.
Les données présentées à la figure 5.6 montrent bien que la taille des nanoparticules d’or augmente
en fonction du nombre d’ajouts de réactifs au cours de l’étape de croissance. De plus, ces courbes de
distribution de taille sont très étroites, ce qui signifie que chaque échantillon présente une faible
polydispersité et qu’il y a absence d’agrégats en solution.
1
Concentration normalisée
0,9
1) 29 nm
0,8
2) 35 nm
0,7
3) 40 nm
0,6
(u.a.)
4) 43 nm
0,5
5) 47 nm
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 20 40 60 80 100
Diamètre hydrodynamique (nm)
Figure 5.6 – Distributions de tailles normalisées de nanoparticules d’or en solution, tel que déterminé par
analyse du suivi individuel des particules.
La technique de NTA a également été utilisée pour déterminer la concentration de nanoparticules dans
ces 5 aliquots de synthèse. Comme le montre tableau 5.1, la concentration mesurée varie légèrement
d’un échantillon à l’autre, passant de (2,1 ± 0,2) x 10 11 NPs/mL à (2,8 ± 0,3) x 1011 NPs/mL. Cette
variation ne semble pas être due à de la seconde nucléation au cours de la période de croissance,
puisque la concentration de nanoparticules d’or n’augmente pas graduellement en fonction du nombre
d’ajouts. De plus, une seule population de nanoparticules a été observée au TEM. Il semblerait donc
que la variation observée soit plutôt reliée aux dilutions effectuées pour que les échantillons analysés
soient dans la gamme de concentration idéale à l’analyse en NTA.
68
1
Extinction normalisée
germes
0,8 1 ajout
2 ajouts
(u.a.)
0,6 3 ajouts
4 ajouts
0,4 5 ajouts
0,2
0
350 400 450 500 550 600 650 700
Figure 5.7 – Évolution du spectre d’extinction des nanoparticules d’or au cours de la croissance.
Finalement, l’analyse par spectroscopie UV-visible a permis de mesurer l’évolution du spectre

d’extinction des nanoparticules d’or au cours de la synthèse. Tel que prédit par la théorie de Mie,43 le
plasmon des AuNPs se déplace légèrement vers le rouge à mesure que leur taille augmente, passant
d’un maximum à 518 nm pour les germes à 528 nm pour les nanoparticules finales de 47 nm. De plus,
la bande plasmonique devient plus étroite au cours de la croissance, ce qui pourrait être attribuable à
la diminution de la polydispersité des particules, tel qu’observé en TEM de même qu’en NTA.
5.3 Préparation du substrat plasmonique
5.3.1 Protocole de préparation
Figure 5.8 – Schéma de la fonctionnalisation des micropipettes de verre lors de la fabrication du biocapteur.
69
La préparation du biocapteur se fait en plusieurs étapes,122 qui sont décrites en détail à l’annexe 8. Les
micropipettes de verre sont préparées par l’équipe du professeur Jean-François Masson à l’aide d’une
technique de déformation mécanique.35 De manière générale, la pointe de capillaires de verre
disponibles commercialement est chauffée puis étirée, jusqu’à ce qu’elle atteigne le diamètre désiré, à
l’aide d’un appareil permettant de préparer de pipettes en série. Par la suite, la surface des
micropipettes de verre est nettoyée avec une solution de piranha, un mélange 3 H2SO4 : 1 HNO3 à la
fois acide et oxydant qui permet de dissoudre entre autres les contaminants organiques. 123 Ce
traitement permet également d’augmenter le nombre de groupements hydroxyle à la surface du verre,
augmentant ainsi sa réactivité pour la fonctionnalisation subséquente avec un silane. 124
La prochaine étape consiste à incuber les pipettes dans un solution 0,3% (V/V) de
(3-aminopropyl)triméthoxysilane (APTMS), dans le but d’ajouter des fonctions amine libres à la surface
(voir figure 5.8). Cette réaction se produit dans l’éthanol anhydre, puisque la présence d’eau
favoriserait l’hydrolyse suivie de la polycondensation du silane en solution. En s’assurant de demeurer
en milieu anhydre, l’APTMS réagit uniquement à la surface de la micropipette de verre où une mince
couche d’eau demeure adsorbée après le traitement au piranha.125
Figure 5.9 – Mécanisme en quatre étapes proposé pour la polycondensation d’un silane tel que l’ATPMS à la
surface d’un substrat de verre.125
Après un rinçage à l’éthanol, puis à l’eau pour éliminer l’APTMS résiduel, les micropipettes sont
incubées dans une solution aqueuse de nanoparticules d’or d’un diamètre de 47 nm. Tel que rapporté
dans la littérature, les nanoparticules d’or peuvent se lier à des groupements amine par un lien datif
entre le doublet de l’azote et les orbitales libres du métal.126 Cette technique permet d’immobiliser
uniformément des nanoparticules d’or sur un substrat après une incubation de quelques heures.
70
Figure 5.10 – Mécanisme de réduction d’un lien disulfide à l’aide du TCEP.127
Une fois que le substrat plasmonique est prêt, la prochaine étape consiste à effectuer le greffage de
l’aptamère à la surface d’or. Toutefois, le brin d’ADN doit préalablement subir un traitement afin de
réduire le lien disulfide à son extrémité 5’ pour générer un groupement thiol. Pour ce faire, l’aptamère
réagit avec la tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), un réducteur possédant une grande sélectivité
pour les groupements disulfides, selon le mécanisme illustré à la figure 5.10. À des fins pratiques, le
réducteur est ajouté à la solution sous la forme d’un sel d’hydrochlorure (TCEP•HCl), une espèce à la
fois non-volatile et soluble dans l’eau qui est plus simple à manipuler comparativement à la TCEP en
phase liquide.128
Figure 5.11 – Schéma d’une monocouche de molécules thiolées sur une surface d’or, les sphères jaunes
représentant les atomes de soufre, avec les défauts de surface possibles. 129
Par la suite, le greffage est accompli en incubant la pointe des micropipettes dans la solution
d’aptamère thiolé. Le but est de former une monocouche auto-assemblée d’ADN à la surface des
nanoparticules d’or. À cet égard, la fonction thiol est particulière utile, puisque les atomes de soufre
peuvent se lier avec trois atomes d’or de surface pour former trois liens Au-S. La nature semi-covalente
de ces liens rend l’interaction entre le soufre et l’or dynamique, ce qui signifie que les défauts de surface
de la monocouche auto-assemblée peuvent être corrigés en partie par désorption des molécules du
substrat.129 Habituellement, une monocouche d’alcanethiol peut être densément organisée à la surface
de l’or. Toutefois, dans le cas de simples brins d’ADN, le squelette phosphate chargé négativement
limite le rapprochement des chaines lors de l’assemblage. Pour limiter la formation de structures
désordonnées ou affaissées, le greffage est donc effectué dans un tampon phosphate salin (PBS). Les
71
ions sodium et potassium chargés positivement peuvent alors se lier au squelette de phosphate et
diminuer les répulsions électrostatiques entre les chaines d’ADN. En théorie, ceci permet d’augmenter
la densité de greffage de l’aptamère sur la surface d’or.
Figure 5.12 – Schéma de greffage de l’aptamère (en jaune) et du 6-mercaptohexanol (en mauve foncé) à la
surface d’une nanoparticule d’or.
La dernière étape de préparation consiste à tremper la pointe des pipettes dans une solution de
6-mercaptohexanol pendant quelques heures. Comme le montre la figure 5.12, le 6-mercaptohexanol
a pour rôle de combler les espaces libres à la surface des nanoparticules d’or pour favoriser le
dépliement de l’aptamère en absence d’ATP. De cette manière, le brin d’ADN présente un plus grand
changement de conformation entre la position allumée et éteinte, augmentant ainsi la différence de
signal observable en microscopie de fluorescence.
A) B)
Figure 5.13 – Images SEM d’une micropipette recouvertes de nanoparticules d’or de 47 nm. (A) Vue d’ensemble
de la pointe et (B) vue rapprochée de la surface permettant de distinguer les nanoparticules individuellement.
72
Les micropipettes plasmoniques ont d’abord été caractérisées par microscopie électronique à
balayage afin d’évaluer l’efficacité du greffage sur la surface de verre. Tel qu’illustré à la figure 5.13,
les nanoparticules d’or de 47 nm recouvrent en grande partie la pointe effilée des micropipettes, dont
le diamètre peut être estimé à quelques centaines de nanomètres à l’extrémité. Bien que le verre soit
visible sur certaines zones en raison d’une couverture partielle, la majeure partie de la pointe est
fonctionnalisée d’une couche dense de nanoparticules d’or sphériques.
Il est important de noter que l’immobilisation des AuNPs sur une surface devrait en théorie modifier
leur spectre d’extinction, par rapport à celui mesuré en solution. Le groupe de Schmid, entre autres, a
démontré l’effet de la densité de greffage de nanoparticules d’or sur leur plasmon, en utilisant comme
substrat une lamelle de verre.130 Comme le montre la figure 5.14, le spectre d’extinction des
nanoparticules d’or déposées sur une surface avec une faible densité se rapproche de celui de
nanoparticules suspendues en solution, étant donné qu’elles sont trop éloignées les unes des autres
pour interagir. Toutefois, lorsque la densité de greffage est plus élevée, les nanoparticules d’or se
mettent à coupler entre elles, ce qui mène à un élargissement de la bande plasmonique de même qu’à
un déplacement vers le rouge.131
Figure 5.14 – Spectres d’extinction de nanoparticules d’or déposées sur une surface de verre avec une
faible densité et une grande densité.130
De manière à caractériser davantage la surface des micropipettes, le spectre de diffusion des

nanoparticules sur la pointe a été mesuré à l’aide d’un montage optique maison. Pour ce faire, la pointe
de la pipette a d’abord été imagée en microscopie en champ sombre grâce à un microscope IX71 de
Olympus et un objectif 60x, puis la lumière de la source diffusée par les nanoparticules d’or a été
73
récoltée par un spectromètre UV-visible Ocean Optics USB 2000+. Un sténopé de 5 µm a également
été placé au niveau du plan image intermédiaire du microscope dans le but de collecter uniquement
les photons provenant de la fenêtre imagée. La figure 5.15 permet de comparer le spectre d’extinction
des nanoparticules d’or de 47 nm en solution avec le spectre de diffusion de ces mêmes particules
immobilisées sur la pointe d’une micropipette. Tel que prévu, le spectre des AuNPs est déplacé vers
les hautes longueurs d’onde et est plus large lors qu’elles sont immobilisées de façon dense sur le
substrat.
1 1
Diffusion/Extinction normaliseé
Fluorescence normalisée (u.a.)

0,8 0,8
0,6 0,6
(u.a)
0,4 0,4
0,2 0,2
0 0
300 400 500 600 700 800 900
AuNPs Pipette@AuNPs
Q670 Excitation Q670 Émission
Figure 5.15 – Comparaison du spectre d’extinction des nanoparticules d’or en solution et du spectre de diffusion
des nanoparticules d’or sur la pointe de la micropipette, mesurés en microscopie à champ sombre à l’aide d’un
sténopé de 5 µm et d’un spectromètre UV-visible Ocean Optics USB 2000+. Superposition des spectres des
nanoparticules avec les spectres d’excitation et d’émission du Quasar 670.
Cette modification de la bande plasmonique permet également d’obtenir une meilleure superposition
avec les spectres d’excitation et d’émission du Quasar 670. Ce haut degré de recouvrement, lorsque
les nanoparticules d’or sont greffées sur une surface, favorise l’interaction entre le plasmon et le
fluorophore. Ceci est particulièrement avantageux dans le cadre de ce projet, où la variation de signal
observé en raison du changement de conformation de l’aptamère dépend de l’efficacité des processus
d’extinction et d’exaltation de fluorescence.
Il aurait été possible d’améliorer le recouvrement de surface en déposant un film d’or continu sur la
pointe de la pipette, par dépôt chimique en phase vapeur par exemple. En effet, un film d’or possède
un plasmon de surface, tout comme les nanoparticules d’or, à la différence qu’il n’est pas localisé.
74
Toutefois, la technique de greffage des AuNPs permet d’obtenir une plus grande surface disponible
pour la fonctionnalisation des aptamères, en raison de l’importante rugosité de surface. De plus,
comme en témoignent les images SEM et le spectre de diffusion de la micropipette, les AuNPs sur la
pointe sont suffisamment rapprochées pour qu’il y ait apparition de « points chauds » entre des
nanoparticules adjacentes. À ces points de contact ou de grande proximité, le couplage plasmonique
est si important que les phénomènes reliés aux propriétés plasmoniques des nanoparticules, comme
l’exaltation de fluorescence, sont beaucoup plus intenses qu’à proximité de nanoparticules isolées. 131
Par conséquent, l’utilisation d’une couche de nanoparticules d’or devrait permettre, en théorie, de
greffer davantage de brins d’ADN et d’augmenter la différence de signal mesurée en microscopie de
fluorescence entre les deux conformations de l’aptamère, bien que cette hypothèse n’ait pas été
confirmée expérimentalement dans le cadre de ce projet.
5.4 Détection d’ATP dans un milieu tampon contrôlé
5.4.1 Montage de microscopie de fluorescence
Afin d’étudier la réponse du biocapteur à l’ATP, des mesures en microscopie de fluorescence ont été
réalisées à l’aide d’un montage optique décrit au tableau 5.2. Le montage repose sur un microscope
inversé modèle IX71 d’Olympus, un instrument adapté à l’imagerie de cultures cellulaires en raison de
l’objectif placé en-dessous de l’échantillon qui permet de positionner le plan objet sur les composantes
biologiques se trouvant au fond du récipient, sans avoir à observer à travers toute son l’épaisseur.
Tableau 5.2 – Liste des composantes du premier montage de microscopie de fluorescence.
Composante Modèle Compagnie

Microscope inversé IX71 Olympus
Objectif UPlanFl 20x Olympus
05-LHR-991
Source Melles Griot
Laser HeNe 633 nm, 8 mW
Obturateur VS25 et VMM-T1 Uniblitz
Filtre d’excitation HQ615/40x Chroma
Miroir dichroïque FF640-Di01 Semrock
Filtre d’émission FF01-685/40-25 Semrock
Caméra CCD ALTA-U32 Apogee Imaging Systems
75
Le cube de fluorescence sélectionné est adapté aux spectres d’excitation et d’émission du Quasar
670, comme le montre la figure 5.16. Le filtre d’excitation transmet les photons ayant une longueur
d’onde entre 590 et 640 nm qui sont ensuite réfléchis par le miroir dichroïque (< 640 nm) vers
l’échantillon. Les photons émis par l’échantillon sont alors transmis à travers le miroir dichroïque
(> 640 nm) puis le filtre d’émission (650-700 nm) jusqu’à une caméra CCD de la compagnie Apogee
Imaging Systems. Un obturateur est placé dans le parcours du laser et est relié à la caméra; de cette
façon, la source éclaire l’échantillon uniquement lorsque le détecteur est activé, ce qui permet de
réduire le photoblanchiment des fluorophores.
Fluorescence normalisée (u.a)
1 100
0,8 80
Transmittance %
0,6 60
0,4 40
0,2 20
0 0
550 600 650 700 750
Q670 Excitation Q670 Émission
Filtre d'excitation Miroir dichroïque
Filtre d'émission
Figure 5.16 – Concordance entre les spectres d’excitation et d’émission du Quasar 670 et les spectres de
transmittance des composantes du cube de fluorescence utilisées dans le montage optique.
Dans la première série de mesures, une source laser à 633 nm a été utilisée plutôt qu’une lampe à
incandescence halogène conventionnelle, puisque les micropipettes de verre recouvertes de
nanoparticules d’or s’avèrent être fortement diffusantes. En utilisant une source polychromatique, il est
donc possible que le biocapteur diffuse la lumière provenant de la source et, comme les filtres et le
miroir dichroïque ne sont pas efficaces à 100%, cette lumière incidente peut se rendre jusqu’à la
caméra. Le but d’utiliser une source monochromatique est alors de limiter le signal parasite de diffusion
mesuré par le détecteur.
76
Une cellule d’élution a également été installée sur la platine du microscope, afin de faciliter les mesures
de microscopie de fluorescence sur les biocapteurs en présence de différentes solutions d’ATP (voir
figure 5.17). En effet, la pointe des micropipettes est d’abord sectionnée, puis immobilisée sur une
lamelle de verre. Cette étape a pour but de rapprocher la pointe de l’objectif 20x en plus de limiter ses
mouvements au cours de l’élution pour maintenir le focus au même endroit.
Figure 5.17 – Schéma du montage d’élution placé sur la platine du microscope, composé d’une lamelle de verre
sur laquelle est immobilisée une pointe de micropipette surmonté d’une cellule de polydiméthylsiloxane
permettant l’insertion de solutions aqueuses.
Par la suite, un moule de polydiméthylsiloxane possédant des orifices d’entrée et de sortie est collé
sur la lamelle de verre, créant ainsi une cellule de perfusion d’un volume approximatif de 100 µL. Grâce
à des pousse-seringue, il est alors possible d’injecter des solutions dans l’environnement du biocapteur
à un rythme constant de 500 µL/min qui favorise un renouvellement rapide dans la cellule.
5.4.2 Résultats en microscopie de fluorescence
Afin de simuler l’environnement biologique dans une matrice simple, des étalons d’ATP de 1 à 20 mM
ont été préparés dans du tampon phosphate à pH 7,4. Ces solutions ont été injectées dans la cellule
à perfusion à tour de rôle, avec une étape de lavage au PBS entre chaque étalon, dans le but de
quantifier la variation de signal de fluorescence du biocapteur. L’aptamère fluorescent est
théoriquement sous sa conformation dépliée en absence d’ATP. Le fluorophore greffé à l’extrémité 3’
devrait donc se trouver à environ 7 nm de la surface plasmonique, longueur approximative d’un simple
brin d’ADN de 23 bases. En présence d’ATP, l’aptamère se replie sur lui-même, rapprochant ainsi le
Quasar 670 à environ 1 nm de la surface des nanoparticules d’or, considérant la longueur de l’espaceur
à l’extrémité 5’ du brin d’ADN. Le fluorophore passe donc d’un environnement éloigné à un
environnement dominé par l’extinction de fluorescence, ce qui devrait se traduire par une perte de
signal lors du suivi en microscopie.
77
Au cours de l’expérience, la réponse du capteur a été mesurée à raison d’une image à chaque 20
secondes. La lampe a été ajustée à 12,5% de puissance avec un temps d’exposition de 100 ms et une
segmentation d’image permettant de combiner des pixels, afin de minimiser le photoblanchiment du
fluorophore. Les images acquises au cours de l’expérience sont par la suite traitées à l’aide du logiciel
ImageJ. La première étape de traitement consiste à corriger tout défaut de superposition entre les
images qui pourrait résulter d’un déplacement de la pipette au cours de l’acquisition. Pour ce faire, les
images de la série sont alignées grâce à une extension portant le nom de StackReg, qui considère la
pointe de la pipette comme un corps rigide capable de mouvements de translation et de rotation. Par
la suite, la série d’images corrigées est analysée à l’aide d’une extension nommée Time Series
Analysis qui permet de calculer la moyenne d’intensité des pixels dans une région d’intérêt
sélectionnée sur l’image (voir figure 5.18). La moyenne des niveaux de gris de la pipette est par la
suite corrigée pour chaque image en soustrayant le signal provenant du bruit de fond.
Figure 5.18 – (A) Correction du déplacement de la pointe lors de l’expérience par un traitement d’image sur le
logiciel ImageJ grâce à l’extension StackReg. (B) Mesure de la moyenne des niveaux de gris de différentes
régions d’intérêt (en pointillé) sur la pointe du biocapteur à l’aide du logiciel de traitement d’images.
Comme l’illustre la figure 5.19, ce traitement d’images permet d’obtenir un graphique de la moyenne
des niveaux de gris corrigée en fonction du temps écoulé lors de l’expérience. Tel qu’attendu, l’intensité
du signal de fluorescence du biocapteur diminue significativement en présence de solutions contenant
une concentration croissante d’ATP. De plus, la moyenne des niveaux de gris augmente de nouveau
78
lorsque la cellule est lavée avec du PBS. Ces résultats sont très encourageants, puisqu’ils témoignent
du mouvement de repliement et de dépliement de l’aptamère en fonction de son environnement, un
facteur central pour le développement d’un biocapteur sensible pour l’ATP.
16 000
PBS
Moyenne corrigée des
niveaux de gris (u.a.)
15 000 1,8 mM
3,6 mM
14 000 5,4 mM
7,3 mM
13 000 9,1 mM
18,1 mM
12 000
0 50 100 150
Temps (min)
Figure 5.19 – Variation du signal de fluorescence de la pointe de la pipette en fonction de la concentration d’ATP
présente dans la cellule à perfusion. Les mesures sont effectuées sur le premier montage de microscopie de
fluorescence et la cellule est lavée à l’aide de tampon PBS entre chaque étalon d’ATP analysé.
Cependant, ces premières données ont permis de soulever certains problèmes avec le montage de
microscopie de fluorescence utilisé. Tout d’abord, il est difficile de calculer avec précision le
pourcentage de perte de signal observé en fonction de la concentration d’ATP en solution, puisque le
rapport signal sur bruit des données traitées est très faible. Un moyen simple de corriger ce problème
est de diminuer le bruit en refroidissant la caméra CCD plutôt que de l’utiliser à température pièce. Le
second problème observé est la perte de signal graduelle observée après 75 minutes de suivi. Trois
hypothèses permettent d’expliquer cette tendance. D’une part, il est possible que la diminution de
signal du biocapteur soit due à du photoblanchiment du fluorophore greffé à l’aptamère, en raison
d’une surexposition à la source laser. D’un autre côté, il se peut qu’une fraction des brins d’ADN
demeure en position repliée malgré les lavages au PBS, témoignant ainsi d’un manque de réversibilité
de l’aptamère causant une perte de signal progressif. Finalement, la diminution du signal peut être
attribuée à une perte de focus sur la pointe de la pipette au cours de l’expérience, menant à l’acquisition
d’images plus diffuses et dont l’intensité des pixels est moins élevée. Le dernier problème observé
avec ce montage est que la source laser n’éclaire pas uniformément l’échantillon, mais forme plutôt
des patrons de diffraction au plan objet. Ceci est particulièrement problématique en raison des
79
mouvements de translation et de rotation de la pipette au cours de l’expérience. L’extension StackReg
permet de corriger ces mouvements, mais ne prend pas en compte la variation d’intensité de la source
d’un point à l’autre de l’image.
Tableau 5.3 – Liste des composantes du second montage de microscopie de fluorescence.
Composante Modèle Compagnie

Microscope inversé IX71 Olympus
Objectif UPlanFl 20x Olympus
Source X-Cite 200 DC Lumen Dynamics
Préfiltre d’excitation FF01-624/40 Semrock
Filtre d’excitation HQ615/40x Chroma
Miroir dichroïque FF640-Di01 Semrock

Filtre d’émission FF01-685/40-25 Semrock
Caméra CCD ALTA-U32 Apogee Imaging Systems
Afin de corriger ces problèmes, certains changements ont été effectués au montage de microscopie.
Tout d’abord, la caméra a été refroidie jusqu’à environ -30°C dans le but diminuer le bruit mesuré. De
plus, la platine du microscope a été stabilisée de manière à éviter de perdre la mise au point sur la
pipette. La source laser a également été changée pour une lampe halogène beaucoup plus uniforme
au plan objet et possédant un obturateur intégré. Puisque les micropipettes recouvertes de
nanoparticules d’or sont très diffusantes et que la source à halogène est polychromatique, un préfiltre
d’excitation a été ajouté avant le cube de fluorescence afin de limiter le nombre de photons diffusés
vers la caméra.
La figure 5.20 présente les données obtenues après le traitement des images acquises à l’aide de ce
second montage de microscopie. Ce graphique démontre une nette amélioration du rapport signal sur
bruit au cours de l’expérience, qui facilite grandement la quantification de la perte de signal observée.
De plus, après chaque lavage de la cellule à perfusion à l’aide d’une solution de PBS, la moyenne des
niveaux de gris du biocapteur retourne à sa valeur originale. Ceci suggère que la diminution de signal
observée précédemment n’était pas due à un manque de réversibilité du capteur, ni au
photoblanchiment du fluorophore, mais plutôt à une perte de focus sur la pipette. Bref, les modifications
apportées au montage de microscopie semblent avoir porté fruit.
80
15000
Moyenne corrigée des niveaux

14000
10 mM
13000
PBS
de gris (u.a.) 12000 8 mM
11000 6 mM
10000
4 mM
2 mM
9000
8000
0 20 40 60 80 100
Temps (min)
Figure 5.20 - Variation du signal de fluorescence de la pointe de la pipette en fonction de la concentration d’ATP
présente dans la cellule à perfusion. Les mesures sont effectuées sur le second montage de microscopie de
fluorescence et la cellule est lavée à l’aide de tampon PBS entre chaque étalon d’ATP analysé.
Il est possible d’extraire plusieurs informations à partir de ces nouvelles données expérimentales. Tout
d’abord, la vitesse de réponse du capteur a été estimée à 2 minutes 30 secondes, ce qui correspond
au temps nécessaire pour que l’intensité de fluorescence de la sonde atteigne un plateau. Ce genre
de temps de réponse, typique des aptamères, est généralement limité par la vitesse à laquelle le brin
d’ADN ou d’ARN passe d’une conformation à une autre. Cette caractéristique peut s’avérer limitante
pour la mesure de variations rapides de concentration d’ATP en milieu biologique. Toutefois, plusieurs
phénomènes cellulaires associés à des changements de concentration d’ATP se produisent sur une
durée de plusieurs minutes, voire plusieurs heures, et pourraient être étudiés à l’aide de ce biocapteur.
30%
25%
% Perte de signal
20%
15% Pipette 1
Pipette 2
10%
Pipette 3
5%
Pipette 4
0%
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
[ATP] (mmol/L)
Figure 5.21 – Courbes d’étalonnage obtenues pour quatre pipettes préparées sur une échelle de plusieurs mois
avec différents lots de réactifs et différents lots d’aptamère. Les barres d’erreur sur les courbes des pipettes 3 et
4 correspondent à l’écart-type sur des données provenant de trois régions d’intérêt sur chaque pipette.
81
À partir de ces données, il est également possible de calculer le pourcentage de perte de signal du
biocapteur en fonction de la concentration d’ATP présente dans le milieu. La figure 5.21 présente les
courbes d’étalonnages obtenues pour quatre pipettes distinctes préparées à partir de différents lots de
réactifs et différents lots d’aptamère. Dans le cas des pipettes 3 et 4, les barres d’erreur proviennent
de mesures effectuées sur trois régions d’intérêt sur la pointe de chaque pipette. Ces données
témoignent de la répétabilité et de la reproductibilité du biocapteur dans une gamme de linéarité allant
d’environ 1 à 10 mM avec un coefficient de corrélation variant entre 0,98 et 0,99. Il est intéressant de
noter que cette gamme de linéarité correspond aux concentrations d’ATP retrouvées à l’intérieur des
cellules, ce qui rend ces biocapteurs adaptés aux mesures en milieu intracellulaire. Une perte de signal
significative de 25% est observée à une concentration de 10 mM d’ATP, ce qui indique qu’une partie
de la population d’aptamères passe d’une conformation dépliée à une conformation repliée dans ce
milieu, tel qu’attendu.
Suite à cette évaluation initiale des performances du biocapteur, l’influence de deux paramètres de
synthèse a été étudiée, soit la taille des nanoparticules d’or utilisées et l’importance du recouvrement
de 6-mercaptohexanol. Pour ce faire, trois biocapteurs ont été comparés : le premier est recouvert de
nanoparticules d’or de 50 nm avec de l’aptamère et du 6-mercaptohexanol, le second est identique
mais sans mercaptohexanol et le troisième est recouverts de AuNPs de 90 nm avec de l’aptamère et
du mercaptohexanol.
30% 30%
25% 25%
% Gain de signal
% Perte de signal
20% 20%
15% 15%
10% 10%
5% 5%
0% 0%
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
[ATP] (mmol/L)
50 nm avec mercaptohexanol 90 nm avec mercaptohexanol
50 nm sans mercaptohexanol
Figure 5.22 – Comparaison des courbes d’étalonnage obtenues pour des pipettes recouvertes de nanoparticules
d’or de 90 nm et de 50 nm et pour des biocapteurs avec et sans 6-mercaptohexanol.
82
Tel qu’illustré à la figure 5.22, chaque biocapteur a été analysé en microscopie de fluorescence avec
différents étalons d’ATP, selon la méthode décrite précédemment. Au premier abord, la taille des
nanoparticules d’or semble avoir un impact important sur l’efficacité du capteur. En effet, en passant
de nanoparticules d’un diamètre de 50 nm à 90 nm, la sensibilité de la micropipette chute d’un facteur
d’environ 2,5 dans la gamme de 1 à 10 mM. Ceci peut sembler contradictoire, puisqu’en théorie le
plasmon de surface localisé est plus intense pour des nanoparticules de grande taille, en plus de
posséder une plus grande portée.42 La différence de signal observée entre la position allumée et éteinte
devrait donc être plus importante avec les AuNPs de plus grande taille.
Toutefois, il s’avère que les nanoparticules de 90 nm sont beaucoup plus diffusantes que celles de 50
nm. Par conséquent, en microscopie, les pipettes recouvertes de nanoparticules de 90 nm diffusent
théoriquement un nombre plus important de photons provenant de la source vers la caméra. La
diffusion du capteur vient donc créer un signal parasite qui masque le signal de fluorescence provenant
de l’aptamère, diminuant ainsi le pourcentage de perte d’intensité observé. Pour valider cette
hypothèse, des micropipettes recouvertes de AuNPs de 50 nm et de 90 nm sans aptamère fluorescent
ont été analysées sur le montage de microscopie. Dans le cas des plus petites nanoparticules, aucun
signal de diffusion n’a été mesuré par la caméra CCD pour le temps d’intégration typique de 100 ms.
Au contraire, la micropipette recouvertes de nanoparticules de 90 nm était clairement visible sur la
caméra, et ce, malgré les deux filtres d’excitation utilisés sur ce montage. La taille des AuNPs utilisées
dans la préparation du biocapteur est donc limitée par leur facteur de diffusion.
Figure 5.23 - Schéma de greffage de l’aptamère (en jaune) en l’absence de 6-mercaptohexanol à la surface d’une
nanoparticule d’or.
Un changement encore plus drastique de la sensibilité est observé en absence de 6-mercaptohexanol

à la surface du biocapteur. En effet, un gain de signal variant de 1 à 4 % est observé avec ce nouveau
système dans une gamme de 3 à 19 mM d’ATP, ce qui s’oppose à la perte de signal mesurée en
présence de 6-mercaptohexanol. Pour expliquer ces résultats, il faut se rappeler du rôle de
83
l’alcanethiol, qui consiste à redresser les brins d’aptamère en comblant les espaces libres à la surface
des nanoparticules d’or. En absence de cette molécule, les simples brins d’ADN auraient donc
davantage tendance à s’affaisser sur le substrat plasmonique, tel qu’illustré à la figure 5.23. Par
conséquent, le Quasar 670 serait très près de la surface d’or en absence d’ATP et s’éloignerait
légèrement en se repliant autour de sa molécule cible, menant ainsi à une faible augmentation de
l’intensité de fluorescence du capteur. Selon ces résultats, il semble donc que l’utilisation de
nanoparticules d’or de 50 nm et la présence de 6-mercaptohexanol en surface soient les paramètres
optimaux pour les performances du biocapteur.
84
6. Conclusion et perspectives
Ces travaux de maîtrise avaient pour but d’exploiter les propriétés uniques des nanoparticules d’or
dans différentes applications biomédicales. Dans un premier temps, des nanobâtonnets d’or ont été
utilisés dans le développement de nano-véhicules pour le relargage contrôlé de médicaments, en
raison de leur biocompatibilité et de leurs propriétés optiques modulables. Par la suite, des
nanoparticules d’or sphériques ont servi à l’élaboration d’un outil de détection de l’ATP en milieu
biologique, grâce à leurs propriétés plasmoniques.
L’objectif du premier projet était de développer un nano-véhicule capable d’encapsuler des molécules
bioactives d’intérêt, de les transporter au site biologique visé grâce à du ciblage actif, puis de les
relarguer de façon contrôlée grâce à un stimulus externe. L’architecture imaginée repose sur un
nanobâtonnet d’or possédant un plasmon longitudinal dans la fenêtre du proche infrarouge. Cette
nanostructure est entourée d’une couche de silice dopée d’un fluorophore pouvant interagir avec le
milieu biologique, ainsi que d’une couche de polymère thermosensible permettant l’encapsulation un
médicament. À la surface du nano-véhicule sont greffés des agents de ciblage pour assurer leur
transport jusqu’au site d’intérêt. Ce concept original prévoit également l’utilisation d’un laser dans le
proche infrarouge pour déclencher le relargage du principe actif, puisque les nanobâtonnets d’or
peuvent absorber ces photons incidents, entrainant ainsi une hausse de température locale et donc un
affaissement de la couche de polymère thermosensible.
Au cours de ces travaux, des nanobâtonnets d’or ont d’abord été synthétisés par croissance contrôlée
de germes à l’aide de deux protocoles adaptés de la littérature. Les nanobâtonnets obtenus possèdent
un ratio d’aspect variant entre 3 et 5,8, ce qui permet de moduler leur bande plasmonique longitudinale
entre 800 et 1150 nm, en fonction du laser qui sera utilisé dans l’application finale. Par la suite, les
AuNBs ont été recouverts d’une couche de silice uniforme à l’aide d’un protocole de polycondensation
du TEOS catalysé en milieu basique. L’épaisseur de la couche de silice a pu être ajustée entre 5,6 et
33 nm en fonction du nombre et du volume d’ajouts de TEOS en solution. Le plan était ensuite de
greffer un silane comportant une fonction méthacrylate à la surface de la couche de silice de façon à
créer des points d’ancrage pour la polymérisation par précipitation du polymère thermosensible, le
PNIPMAM. Toutefois, il s’est avéré que la couche de silice est instable en milieu aqueux, et plus
85
particulièrement à haute température. Puisque cette érosion n’est pas observée dans le cas de
nanosphères d’or recouvertes de silice, il semble que la présence de CTAB dans le milieu réactionnel
au cours de la condensation de type Stöber mène à l’obtention d’une couche de silice poreuse et
sensible à l’hydrolyse autour des nanobâtonnets d’or.
Pour contourner ce problème, les nanobâtonnets d’or ont plutôt été recouverts d’une mince couche de
polystyrène avant d’effectuer la polymérisation du NIPMAM en milieu aqueux, une technique rapportée
dans plusieurs articles scientifiques. La couche de PNIPMAM obtenue est d’environ 80 nm et possède
une LCST d’environ 42 °C, ce qui permettrait en théorie d’incorporer une quantité appréciable de
molécules bioactives et de les relarguer uniquement en présence d’un stimulus lumineux. Les travaux
effectués sur ce projet ont donc mené à la synthèse de structures de type AuNBs@PS@PNIPMAM
qui servent de base aux nano-véhicules imaginés.
Dans le but de compléter les objectifs de ce projet, certains éléments supplémentaires devront toutefois
être incorporés à ces nano-véhicules. Puisque l’idée est d’abord de tester ces nano-véhicules pour la
décalcification des valves aortiques à l’aide de cultures cellulaires cardiaques, il sera important
d’encapsuler le médicament (la 2-thiouridine-5’-triphosphate) dans la couche de polymère
thermosensible, ce qui peut être effectué à basse température. De plus, pour assurer le transport actif
vers les cellules d’intérêt, il faudra ajouter un agent de ciblage à la surface de ces nanostructures. Il
peut s’agir, par exemple, d’un anticorps spécifique à la myosine, une protéine exprimée dans le cœur
pour la contraction musculaire.132 De plus, il sera nécessaire d’intégrer de façon covalente un
fluorophore sensible aux ions calcium à la couche de polystyrène ou de PNIPMAM de façon à suivre
le traitement de décalcification en temps réel.
Cependant, avant d’effectuer les tests en milieu biologiques, il sera essentiel de s’adresser au
problème de la présence de CTAB dans l’environnement des nanobâtonnets d’or. En effet, le CTAB
est reconnu comme étant cytotoxique à partir d’une concentration relativement basse de 1 à 10 µM.
De plus, ce surfactant forme une bicouche dense et extrêmement stable à la surface des AuNBs en
milieu aqueux, mais les molécules de CTAB peuvent se détacher en milieu biologique hautement salin
et causer la mort cellulaire.133 Il existe différents moyens dans la littérature pour retirer le CTAB de la
surface d’or, afin de rendre les nanoparticules non-cytotoxiques. Une stratégie particulièrement
86
intéressante en vue d’éviter l’agrégation des nanobâtonnets est d’effectuer une ou plusieurs étages
d’échange de ligands, suivi de centrifugations pour retirer les molécules de CTAB. Par exemple, la
figure 6.1 illustre une technique de déplacement du CTAB à l’aide molécules thiolées comme le
polyéthylène glycol méthyl éther thiol (PEG-SH) ou un alcanethiol (RSH). Ce genre de réaction
permettrait de retrouver le caractère biocompatible des nanobâtonnets d’or afin de les rendre
applicables en milieu de culture cellulaire.
Figure 6.1- Déplacement du CTAB à la surface de nanobâtonnets d’or par échange de ligands avec du PEG-SH,
puis avec du RSH.64
Le second projet visait à développer un biocapteur sélectif à l’ATP et de taille micrométrique dans le
but d’effectuer des mesures en temps réel à l’intérieur comme à l’extérieur de cellules. Pour ce faire,
l’outil de détection doit être à la fois non-invasif, posséder une grande affinité pour l’analyte d’intérêt et
présenter une grande sensibilité dans le domaine de concentration d’ATP retrouvé dans le milieu
biologique. Le but du projet était également de développer un outil polyvalent, c’est-à-dire qui pourrait
éventuellement être adapté pour la détection de différentes biomolécules d’intérêt.
Au cours de ces travaux de maîtrise, un outil de détection d’ATP basé sur une micropipette de verre a
été développé avec succès en collaboration avec le groupe du professeur Jean-François Masson. Tout
d’abord, la pointe de la micropipette a été fonctionnalisée à l’aide d’un silane comportant un
groupement amine terminal. Des nanoparticules d’or synthétisées par croissance contrôlée de germes
ont par la suite été immobilisées sur la surface grâce à des interactions avec les fonctions amine,
créant ainsi un tapis de nanoparticules plasmoniques. Un aptamère thiolé sélectif à l’ATP a ensuite été
greffé sur la surface d’or, suivi de 6-mercaptohexanol afin de favoriser le redressement des brins
87
d’ADN. Ce biocapteur mise sur le changement de conformation de l’aptamère en fonction de son
milieu, passant d’une configuration dépliée en l’absence d’ATP à une configuration repliée en présence
de sa molécule cible. Un fluorophore, le Quasar 670, est en effet ajouté à l’extrémité 3’ du brin d’ADN
et son intensité de fluorescence varie grandement selon la distance qui le sépare de la surface d’or.
En microscopie de fluorescence, il a donc été possible de détecter le phénomène d’extinction de
fluorescence caractéristique au rapprochement de la sonde de la surface plasmonique en présence
d’ATP.
Les performances du biocapteur ont été testées sur un montage de microscopie de fluorescence avec
des étalons d’ATP dans une solution de tampon phosphate salin. Dans ces conditions, les
micropipettes analysées ont permis de détecter quantitativement l’adénosine 5’-trisphosphate dans
une gamme entre 1 et 10 mM, ce qui correspond à la concentration d’ATP retrouvée en milieu
intracellulaire. Ces résultats ont également démontré une bonne répétabilité des mesures sur une
même micropipette ainsi qu’une bonne reproductibilité entre des biocapteurs synthétisés sur plusieurs
mois et à partir de différents lots de réactifs. De plus, la perte de signal observée est significative,
atteignant environ 25% à une concentration de 10 mM d’ATP. En raison de leur faible diamètre, de
leur biocompatibilité et de leur efficacité, ces pipettes micrométriques s’avèrent donc être des candidats
de choix pour la détection d’adénosine 5’-triphosphate à l’intérieur des cellules.
Pour la suite du projet, il serait intéressant de poursuivre les études de détection d’ATP dans un milieu
plus complexe, par exemple dans un milieu de culture cellulaire qui comporte une grande quantité de
biomolécules et d’ions qui pourraient influencer les performances de l’aptamère. Ensuite, les
micropipettes pourraient être testées à l’intérieur de cellules afin de vérifier l’efficacité de cet outil de
détection sur des échantillons biologiques réels. Ces études sont déjà en cours grâce à la collaboration
de deux groupes de recherche, soit celui du professeur Joachim Spatz à l’Université de Heidelberg en
Allemagne et celui du professeur André Marette de l’Université Laval. Finalement, l’aptamère en
surface du biocapteur pourrait être remplacé par un brin d’ADN sensible à une autre biomolécule,
comme le glucose, le pyruvate ou le lactate afin de vérifier la versatilité de la plateforme de détection
développée.
88
Bibliographie
(1) Karimi, M. Introduction. In Smart Internal Stimulus-Responsive Nanocarriers for Drug and Gene
Delivery; 2015; pp 1–6.
(2) Yang, Y.; Asiri, A. M.; Tang, Z.; Du, D.; Lin, Y. Graphene Based Materials for Biomedical
Applications. Mater. Today 2013, 16 (10), 365–373.
(3) Li, J.; Zhu, J.-J. Quantum Dots for Fluorescent Biosensing and Bio-Imaging Applications.
Analyst 2013, 138 (9), 2506–2515.
(4) Tran, N.; Webster, T. J. Magnetic Nanoparticles: Biomedical Applications and Challenges. J.
Mater. Chem. 2010, 20 (40), 8760.
(5) Bozzuto, G.; Molinari, A. Liposomes as Nanomedical Devices. Int. J. Nanomedicine 2015, 10,
975–999.
(6) Blaber, M. G.; Arnold, M. D.; Ford, M. J. A Review of the Optical Properties of Alloys and
Intermetallics for Plasmonics. J. Phys. Condens. Matter 2010, 22 (14), 143201.
(7) Stensberg, M. C.; Wei, Q.; Mclamore, E. S.; Porterfield, D. M.; Wei, A.; Sepulveda, M. S.
Toxicological Studies on Silver Nanoparticles: Challenges and Opportunities in Assessment,
Monitoring and Imaging. 2012, 6 (5), 879–898.
(8) Guo, Z.; Chen, G.; Zeng, G.; Yan, M.; Huang, Z.; Jiang, L.; Peng, C.; Wang, J.; Xiao, Z. Are
Silver Nanoparticles Always Toxic in the Presence of Environmental Anions? Chemosphere
2016, 171, 318–323.
(9) Xu, K.; Wang, J. X.; Kang, X. L.; Chen, J. F. Fabrication of Antibacterial Monodispersed Ag-
SiO2 Core-Shell Nanoparticles with High Concentration. Mater. Lett. 2009, 63 (1), 31–33.
(10) Zhou, W.; Gao, X.; Liu, D.; Chen, X. Gold Nanoparticles for in Vitro Diagnostics. Chem. Rev.
2015, 115 (19), 10575–10636.
(11) Yang, X.; Yang, M.; Pang, B.; Vara, M.; Xia, Y. Gold Nanomaterials at Work in Biomedicine.
Chem. Rev. 2015, 115 (19), 10410–10488.
(12) Sperling, R. A.; Parak, W. J. Surface Modification, Functionalization and Bioconjugation of
Colloidal Inorganic Nanoparticles. Philos. Trans. R. Soc. A 2010, 368, 1333–1383.
(13) Shi, J.; Votruba, A. R.; Farokhzad, O. C.; Langer, R. Nanotechnology in Drug Delivery and
Tissue Engineering: From Discovery to Applications. Nano Lett. 2010, 10 (9), 3223–3230.
(14) Hale, K. E. Toxicities of Chemotherapy. In Principles of Critical Care; Hall, J. B., Schmidt, G.
A., Kress, J. P., Eds.; McGraw-Hill: New York, 2014.
(15) Church, G. M. Precision Chemistry for Precision Medicine. ACS Cent. Sci. 2015, 1 (1), 11–13.
(16) Wu, C.; Chen, T.; Han, D.; You, M.; Peng, L.; Cansiz, S.; Zhu, G.; Li, C.; Xiong, X.; Jimenez,
E.; et al. Engineering of Switchable Aptamer Micelle Flares for Molecular Imaging in Living
Cells. ACS Nano 2013, 7 (7), 5724–5731.
(17) Wang, K.; He, X.; Yang, X.; Shi, H. Functionalized Silica Nanoparticles: A Platform for
Fluorescence Imaging at the Cell and Small Animal Levels. Acc. Chem. Res. 2013, 46 (7),
1367–1376.
(18) Hirsch, L. R.; Stafford, R. J.; Bankson, J. a; Sershen, S. R.; Rivera, B.; Price, R. E.; Hazle, J.
D.; Halas, N. J.; West, J. L. Nanoshell-Mediated near-Infrared Thermal Therapy of Tumors
under Magnetic Resonance Guidance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100 (23), 13549–
89
13554.
(19) Pansare, V. J.; Hejazi, S.; Faenza, W. J.; Prud’Homme, R. K. Review of Long-Wavelength
Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores, and Multifunctional Nano
Carriers. Chem. Mater. 2012, 24 (5), 812–827.
(20) Berezin, M. Y.; Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging.
Chem. Rev. 2010, 110 (5), 2641–2684.
(21) Agostinis, P.; Berg, K.; Cengel, K. a; Foster, T. H.; Girotti, A. W.; Gollnick, S. O.; Hahn, S. M.;
Hamblin, M. R.; Juzeniene, A.; Kessel, D.; et al. Photodynamic Therapy of Cancer : An Update.
Am. Cancer Soc. 2011, 61, 250–281.
(22) Murphy, C. J.; Thompson, L. B.; Alkilany, A. M.; Sisco, P. N.; Boulos, S. P.; Sivapalan, S. T.;
Yang, J. A.; Chernak, D. J.; Huang, J. The Many Faces of Gold Nanorods. J. Phys. Chem. Lett.
2010, 1 (19), 2867–2875.
(23) Singh, R.; Lillard, J. W. Nanoparticle-Based Targeted Drug Delivery. Exp. Mol. Pathol. 2009, 86
(3), 215–223.
(24) Bouchareb, R.; Côté, N.; Boulanger, M.-C.; Le Quang, K.; El Husseini, D.; Asselin, J.; Hadji, F.;
Lachance, D.; Shayhidin, E. E.; Mahmut, A.; et al. Carbonic Anhydrase XII in Valve Interstitial
Cells Promotes the Regression of Calcific Aortic Valve Stenosis. J. Mol. Cell. Cardiol. 2015, 82,
104–115.
(25) Langen, P.; Hucho, F. Karl Lohmann and the Discovery of ATP. Angew. Chemie - Int. Ed. 2008,
47 (10), 1824–1827.
(26) Barrett, K. E.; Barman, S. M.; Boitano, S.; Brooks, H. L. Chapter 1 . General Principles & Energy
Production in Medical Physiology; 2015.
(27) Huang, H.; Zhang, X.; Li, S.; Liu, N.; Lian, W.; McDowell, E.; Zhou, P.; Zhao, C.; Guo, H.; Zhang,
C.; et al. Physiological Levels of ATP Negatively Regulate Proteasome Function. Cell Res.
2010, 20 (12), 1372–1385.
(28) Gribble, F. M.; Loussouarn, G.; Tucker, S. J.; Zhao, C.; Nichols, C. G.; Ashcroft, F. M. A Novel
Method for Measurement of Submembrane ATP Concentration. J. Biol. Chem. 2000, 275 (39),
30046–30049.
(29) Gordon, J. L. Extracellular ATP: Effects, Sources and Fate. Biochem. J. 1986, 233, 309–319.
(30) Stagg, J.; Smyth, M. J. Extracellular Adenosine Triphosphate and Adenosine in Cancer.
Oncogene 2010, 29 (39), 5346–5358.
(31) Falzoni, S.; Donvito, G.; Di Virgilio, F. Detecting Adenosine Triphosphate in the Pericellular
Space. Interface Focus 2013, 3 (3), 20120101.
(32) Marques, S. M.; Esteves Da Silva, J. C. G. Firefly Bioluminescence: A Mechanistic Approach
of Luciferase Catalyzed Reactions. IUBMB Life 2009, 61 (1), 6–17.
(33) Pellegatti, P.; Falzoni, S.; Pinton, P.; Rizzuto, R.; Di Virgilio, F. A Novel Recombinant Plasma
Membrane-Targeted Luciferase Reveals a New Pathway for ATP Secretion. Mol. Biol. Cell
2005, 16, 3659–3665.
(34) Llaudet, E.; Hatz, S.; Droniou, M.; Dale, N. Microelectrode Biosensor for Real-Time
Measurement of ATP in Biological Tissue. Anal. Chem. 2005, 77 (10), 3267–3273.
(35) Lussier, F.; Brulé, T.; Vishwakarma, M.; Das, T.; Spatz, J. P.; Masson, J. F. Dynamic-SERS
Optophysiology: A Nanosensor for Monitoring Cell Secretion Events. Nano Lett. 2016, 16 (6),
3866–3871.
90
(36) Rao, C., Müller, A., C. K. The Chemistry of Nanomaterials Synthesis, Properties and
Applications; 2004.
(37) Bréchignac, C.; Houdy, P.; Lahmani, M. Nanomaterials and Nanochemistry; 2007.
(38) Rycenga, M.; Cobley, C. M.; Zeng, J.; Li, W.; Moran, C. H. Controlling the Synthesis and
Assembly of Silver Nanostructures for Plasmonic Applications. Chem Rev 2012, 111 (6), 3669–
3712.
(39) Willets, K. A.; Duyne, R. P. Van. Localized Surface Plasmon Resonance Spectroscopy and
Sensing. Annu. Rev. Phys. Chem. 2007, 58, 267–297.
(40) Bohren, C. E.; Huffman, D. R. Chapter 1: Introduction. In Absorption and Scattering of Light by
Small Particle; 2004.
(41) Kelly, K. L.; Coronado, E.; Zhao, L. L.; Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal
Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. J. Phys. Chem. B
2003, 107 (3), 668–677.
(42) Asselin, J.; Legros, P.; Grégoire, A.; Boudreau, D. Correlating Metal-Enhanced Fluorescence
and Structural Properties in Ag@SiO2 Core-Shell Nanoparticles. Plasmonics 2016, 11 (5),
1369–1376.
(43) Jain, P. K.; Lee, K. S.; El-Sayed, I. H.; El-Sayed, M. A. Calculated Absorption and Scattering
Properties of Gold Nanoparticles of Different Size, Shape, and Composition: Applications in
Biological Imaging and Biomedicine. J. Phys. Chem. B 2006, 110, 7238–7248.
(44) Sun, Y. Controlled Synthesis of Colloidal Silver Nanoparticles in Organic Solutions: Empirical
Rules for Nucleation Engineering. Chem. Soc. Rev. 2013, 2497–2511.
(45) Chang, J.; Waclawik, E. R. Colloidal Semiconductor Nanocrystals: Controlled Synthesis and
Surface Chemistry in Organic Media. RSC Adv. 2014, 4 (45), 23505–23527.
(46) Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3e ed.; Springer: New York, USA,
2006.
(47) Aly, S. M.; Carraher, C. E.; Harvey, P. D. Introduction to Photophysics and Photochemistry.
Macromol. Contain. Met. Met. Elem. Photophysics Photochem. Met. Polym. (Volume 10) 2010,
10, 1–43.
(48) Gagnon, J. Développement de Nanosondes Plasmoniques D’indium Pour L’exaltation de La
Fluorescence Dans l’UV. 2014, 103.
(49) Lakowicz, J. R.; Ray, K.; Chowdhury, M.; Szmacinski, H.; Fu, Y.; Zhang, J.; Nowaczyk, K.
Plasmon-Controlled Fluorescence: A New Paradigm in Fluorescence Spectroscopy. Analyst
2008, 133 (10), 1308–1346.
(50) Goulet, P. J. G.; Aroca, R. F. Surface-Enhancement of Fluorescence Near Noble Metal
Nanostructures. In Topics in Fluorescence Spectroscopy, Volume 8: Radiative Decay
Engineering; 2005; Vol. 8, pp 223–247.
(51) Lin, H.; Chen, I. Study of the Interaction between Gold Nanoparticles and Rose Bengal
Fluorophores with Silica Spacers by Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy. J. Phys.
Chem. C 2015, 119, 26663–26671.
(52) Gandhi, A.; Paul, A.; Sen, S. O.; Sen, K. K. Studies on Thermoresponsive Polymers: Phase
Behaviour, Drug Delivery and Biomedical Applications. Asian J. Pharm. Sci. 2015, 10 (2), 99–
107.
(53) Ward, M. A.; Georgiou, T. K. Thermoresponsive Polymers for Biomedical Applications.
91
Polymers (Basel). 2011, 3 (3), 1215–1242.
(54) Cheng, X.; Jin, Y.; Sun, T.; Qi, R.; Fan, B.; Li, H. Oxidation- and Thermo-Responsive poly(N-
Isopropylacrylamide-Co-2-Hydroxyethyl Acrylate) Hydrogels Cross-Linked via Diselenides for
Controlled Drug Delivery. RSC Adv. 2015, 5 (6), 4162–4170.
(55) Mascini, M.; Palchetti, I.; Tombelli, S. Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Fundamentals and
Bioanalytical Aspects. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2012, 51 (6), 1316–1332.
(56) Özalp, V. C.; Schäfer, T. Aptamer-Based Switchable Nanovalves for Stimuli-Responsive Drug
Delivery. Chemistry 2011, 17 (36), 9893–9896.
(57) Chiu, T.-C.; Huang, C.-C. Aptamer-Functionalized Nano-Biosensors.; 2009; Vol. 9.
(58) Nanoparticles, A.; Applications, M. Aptamer-Functionalized Nanoparticles. 2012, No. 5, 3670–
3676.
(59) Creative Biogene Biotechnology. http://www.creative-
biogene.com/Services/Aptamers/Technology-Platforms.html.
(60) Iliuk, A. B.; Hu, L.; Tao, W. A. Aptamer in Bioanalytical Applications. Anal. Chem. 2011, 83 (12),
4440–4452.
(61) Turkevich, J.; Stevenson, P. C.; Hillier, J. A Study of the Nucleation and Growth Processes I N
the Synthesis of. Discuss. Faraday Soc. 1951, 11, 55–75.
(62) Yeh, Y.-C.; Creran, B.; Rotello, V. M. Gold Nanoparticles: Preparation, Properties, and
Applications in Bionanotechnology. Nanoscale 2012, 4 (6), 1871–1880.
(63) Brust, M.; Walker, M.; Bethell, D.; Schiffrin, D. J.; Whyman, R. Synthesis of Thiol-Derivatised
Gold Nanoparticles in. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994, 801–802.
(64) Burrows, N. D.; Lin, W.; Hinman, J. G.; Dennison, J. M.; Vartanian, A. M.; Abadeer, N. S.;
Grzincic, E. M.; Jacob, L. M.; Li, J.; Murphy, C. J. Surface Chemistry of Gold Nanorods.
Langmuir 2016, 32 (39), 9905–9921.
(65) Chang, S.-S.; Lee, C.-L.; Wang, C. R. C. Gold Nanorods: Electrochemical Synthesis and
Optical Properties. J. Phys. Chem. B 1997, 101 (34), 6661–6664.
(66) Chang, S.-S.; Shih, C.-W.; Chen, C.-D.; Lai, W.-C.; Wang, C. R. C. The Shape Transition of
Gold Nanorods. Langmuir 1998, 15 (3), 701–709.
(67) Kim, F.; Song, J. H.; Yang, P. Photochemical Synthesis of Gold Nanorods. J. Am. Chem. Soc.
2002, 124 (48), 14316–14317.
(68) Esumi, K.; Matsuhisa, K.; Torigoe, K. Preparation of Rodlike Gold Particles by UV Irradiation
Using Cationic Micelles as a Template. Langmuir 1995, 11 (9), 3285–3287.
(69) Jana, N. R.; Jana, N. R.; Gearheart, L.; Gearheart, L.; Murphy, C. J.; Murphy, C. J. Wet
Chemical Synthesis of High Aspect Ratio Cylindrical Gold Nanorods. J. Phys. Chem. B 2001,
105 (19), 4065–4067.
(70) Jana, N. R. Gram-Scale Synthesis of Soluble, near-Monodisperse Gold Nanorods and Other
Anisotropic Nanoparticles. Small 2005, 1 (8–9), 875–882.
(71) Johnson, C. J.; Dujardin, E.; Davis, S. A.; Murphy, C. J.; Mann, S. Growth and Form of Gold
Nanorods Prepared by Seed-Mediated, Surfactant-Directed Synthesis. J. Mater. Chem. 2002,
12 (6), 1765–1770.
(72) Edgar, J. A.; McDonagh, A. M.; Cortie, M. B. Formation of Gold Nanorods by a Stochastic
“popcorn” mechanism. ACS Nano 2012, 6 (2), 1116–1125.
92
(73) Gole, A.; Murphy, C. J. Seed-Mediated Synthesis of Gold Nanorods: Role of the Size and
Nature of the Seed. Chem. Mater. 2004, 16 (19), 3633–3640.
(74) Nikoobakht, B.; El-sayed, M. a. Evidence for Bilayer Assembly of Cationic Surfactants on the
Surface of Gold Nanorods Evidence for Bilayer Assembly of Cationic Surfactants on the Surface
of Gold Nanorods. Assembly 2001, No. 18, 6368–6374.
(75) Lohse, S. E.; Burrows, N. D.; Scarabelli, L.; Liz-Marza, L. M.; Murphy, C. J. Anisotropic Noble
Metal Nanocrystal Growth: The Role of Halides. 2014.
(76) Kozek, K. A.; Kozek, K. M.; Wu, W.-C.; Mishra, S. R.; Tracy, J. B. Large-Scale Synthesis of
Gold Nanorods through Continuous Secondary Growth. Chem. Mater. 2013, 25 (22), 4537–
4544.
(77) Hubert, F.; Testard, F.; Spalla, O. Cetyltrimethylammonium Bromide Silver Bromide Complex
as the Capping Agent of Gold Nanorods. Langmuir 2008, 24 (17), 9219–9222.
(78) Liu, M.; Guyot-Sionnest, P. Mechanism of silver(I)-Assisted Growth of Gold Nanorods and
Bipyramids. J. Phys. Chem. B 2005, 109 (47), 22192–22200.
(79) Jana, N. R.; Gearheart, L.; Murphy, C. J. Seed-Mediated Growth Approach for Shape-
Controlled Synthesis of Spheroidal and Rod-like Gold Nanoparticles Using a Surfactant
Template. Adv. Mater. 2001, 13 (18), 1389–1393.
(80) Orendorff, C. J.; Murphy, C. J. Quantitation of Metal Content in the Silver-Assisted Growth of
Gold Nanorods. J. Phys. Chem. B 2006, 110 (9), 3990–3994.
(81) Grzelczak, M.; Sánchez-Iglesias, A.; Rodríguez-González, B.; Alvarez-Puebla, R.; Pérez-Juste,
J.; Liz-Marzán, L. M. Influence of Iodide Ions on the Growth of Gold Nanorods: Tuning Tip
Curvature and Surface Plasmon Resonance. Adv. Funct. Mater. 2008, 18 (23), 3780–3786.
(82) Jackson, S. R.; McBride, J. R.; Rosenthal, S. J.; Wright, D. W. Where’s the Silver? Imaging
Trace Silver Coverage on the Surface of Gold Nanorods. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136 (14),
5261–5263.
(83) Yong, K. T.; Sahoo, Y.; Swihart, M. T.; Schneeberger, P. M.; Prasad, P. N. Templated Synthesis
of Gold Nanorods (NRs): The Effects of Cosurfactants and Electrolytes on the Shape and
Optical Properties. Top. Catal. 2008, 47 (1–2), 49–60.
(84) Ye, X.; Zheng, C.; Chen, J.; Gao, Y.; Murray, C. B. Using Binary Surfactant Mixtures to
Simultaneously Improve the Dimensional Tunability and Monodispersity in the Seeded Growth
of Gold Nanorods. Nano Lett. 2013, 13 (2), 765–771.
(85) Zhang, L.; Xia, K.; Lu, Z.; Li, G.; Chen, J.; Deng, Y.; Li, S.; Zhou, F.; He, N. Efficient and Facile
Synthesis of Gold Nanorods with Finely Tunable Plasmonic Peaks from Visible to near-IR
Range. Chem. Mater. 2014, 26 (5), 1794–1798.
(86) Ye, X.; Jin, L.; Caglayan, H.; Chen, J.; Xing, G.; Zheng, C.; Doan-Nguyen, V.; Kang, Y.;
Engheta, N.; Kagan, C. R.; et al. Improved Size-Tunable Synthesis of Monodisperse Gold
Nanorods through the Use of Aromatic Additives. ACS Nano 2012, 6 (3), 2804–2817.
(87) FEI. An Introduction to Electron Microscopy. 2010.
(88) Williams, D. B.; Carter, C. B. Transmission Electron Microscopy; Springer, 2009.
(89) Egerton, R. F. Physical Principles of Electron Microscopy; 2005; Vol. 8.
(90) Central Microscopy Research Facility - The University of Iowa.
https://cmrf.research.uiowa.edu/transmission-electron-microscopy.
(91) Murphy, D. B.; Davidson, M. W.; Microscopy, F. Fluorescence Microscopy. In Fundamentals of
93
Light Microscopy and Electronic Imaging; 2012; pp 199–231.
(92) R&D Systems. https://www.rndsystems.com/resources/protocols/detection-visualization-
antibody-binding.
(93) Skoog, D. A.; Holler, F. J.; Crouch, S. R. Chapter Ten - Atomic Emission Spectrometry. In
Principles of Instrumental Analysis; Brooks Cole: Belmont, CA, 2007.
(94) Podzimek, S. Chapter 2 : Light Scattering. In Light Scattering, Size Exclusion Chromatography
and Asymmetric Flow Field Flow Fractionation; John Wiley & Sons: Hoboken, New Jersey,
2011; pp 37–98.
(95) Dynamic Light Scattering. https://en.wikipedia.org/wiki/Dynamic_light_scattering.
(96) Zheng, T.; Bott, S.; Huo, Q. Techniques for Accurate Sizing of Gold Nanoparticles Using
Dynamic Light Scattering with Particular Application to Chemical and Biological Sensing Based
on Aggregate Formation. ACS Appl. Mater. Interfaces 2016, 8 (33), 21585–21594.
(97) Fritsch International. http://www.fritsch-international.com/particle-sizing/fritsch-
knowledge/hydrodynamic-diameter/.
(98) Malvern Instruments Ltd. Using Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) to Assess Nanoparticle
Toxicity in Waste Water; 2015.
(99) Rayavarapu, R. G.; Ungureanu, C.; Krystek, P.; Van Leeuwen, T. G.; Manohar, S. Iodide
Impurities in Hexadecyltrimethylammonium Bromide (CTAB) Products: Lot-Lot Variations and
Influence on Gold Nanorod Synthesis. Langmuir 2010, 26 (7), 5050–5055.
(100) Tebbe, M.; Kuttner, C.; Männel, M.; Fery, A.; Chanana, M. Colloidally Stable and Surfactant-
Free Protein-Coated Gold Nanorods in Biological Media. ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7
(10), 5984–5991.
(101) Lee, D.; Yoon, S. Gold Nanocube-Nanosphere Dimers: Preparation, Plasmon Coupling, and
Surface-Enhanced Raman Scattering. J. Phys. Chem. C 2015, 119 (14), 7873–7882.
(102) Wu, H. L.; Tsai, H. R.; Hung, Y. T.; Lao, K. U.; Liao, C. W.; Chung, P. J.; Huang, J. S.; Chen, I.
C.; Huang, M. H. A Comparative Study of Gold Nanocubes, Octahedra, and Rhombic
Dodecahedra as Highly Sensitive SERS Substrates. Inorg. Chem. 2011, 50 (17), 8106–8111.
(103) Scarabelli, L.; Sánchez-Iglesias, A.; Pérez-Juste, J.; Liz-Marzán, L. M. A “Tips and Tricks”
Practical Guide to the Synthesis of Gold Nanorods. J. Phys. Chem. Lett. 2015, 6 (21), 4270–
4279.
(104) Vigderman, L.; Zubarev, E. R. High-Yield Synthesis of Gold Nanorods with Longitudinal SPR
Peak Greater than 1200 Nm Using Hydroquinone as a Reducing Agent. Chem. Mater. 2013,
25 (8), 1450–1457.
(105) Su, G.; Yang, C.; Zhu, J. J. Fabrication of Gold Nanorods with Tunable Longitudinal Surface
Plasmon Resonance Peaks by Reductive Dopamine. Langmuir 2015, 31 (2), 817–823.
(106) Burrows, N. D.; Harvey, S.; Idesis, F. A.; Murphy, C. J. Understanding the Seed-Mediated
Growth of Gold Nanorods through a Fractional Factorial Design of Experiments. Langmuir 2016,
acs.langmuir.6b03606.
(107) Sendroiu, I. E.; Warner, M. E.; Corn, R. M. Fabrication of Silica-Coated Gold Nanorods
Functionalized with DNA for Enhanced Surface Plasmon Resonance Imaging Biosensing
Applications. Langmuir 2009, 25 (19), 11282–11284.
(108) Stöber, W.; Fink, A.; Bohn, E. Controlled Growth of Monodisperse Silica Spheres in the Micron
Size Range. J. Colloid Interface Sci. 1968, 26 (1), 62–69.
94
(109) Lofgreen, J. E. Controlling Morphology and Porosity to Improve Performance of Molecularly
Imprinted Sol–gel Silica. Chem. Soc. Rev. 2014, 43 (3), 911–933.
(110) You, Y. Z.; Kalebaila, K. K.; Brock, S. L.; Oupický, D. Temperature-Controlled Uptake and
Release in PNIPAM-Modified Porous Silica Nanoparticles. Chem. Mater. 2008, 20 (10), 3354–
3359.
(111) Kasper, D. L.; Fauci, A. S.; Hauser, S. L.; Longo, D. L.; Jameson, J. L.; Loscalzo, J. Chapter
28 : Fever , Hyperthermia , and Rash. In Harrison’s Manual of Medicine; 2017; pp 1–6.
(112) Pernia Leal, M.; Torti, A.; Riedinger, A.; La Fleur, R.; Petti, D.; Cingolani, R.; Bertacco, R.;
Pellegrino, T. Controlled Release of Doxorubicin Loaded within Magnetic Thermo-Responsive
Nanocarriers under Magnetic and Thermal Actuation in a Microfluidic Channel. ACS Nano 2012,
6 (12), 10535–10545.
(113) Kawano, T.; Niidome, Y.; Mori, T.; Katayama, Y.; Niidome, T. PNIPAM Gel-Coated Gold
Nanorods for Targeted Delivery Responding to a near-Infrared Laser. Bioconjug. Chem. 2009,
20 (2), 209–212.
(114a) Gorelikov, I.; Matsuura, N. Single-Step Coating of Mesoporous Silica on Cetyltrimethyl
Ammonium Bromide-Capped Nanoparticles. Nano Lett. 2008, 8 (1), 369–373.
(114b) Galarneau, A.; Nader, M.; Guenneau, F.; Di Renzo, F.; Gedeon, A. Understanding the Stability
in Water of Mesoporous SBA-15 and MCM-41. J. Phys. Chem. C 2007, 111 (23), 8268-8277.
(115) Contreras-Cáceres, R.; Pacifico, J.; Pastoriza-Santos, I.; Pérez-Juste, J.; Fernández-Barbero,
A.; Liz-Marzán, L. M. Au@pNIPAM Thermosensitive Nanostructures: Control over Shell Cross-
Linking, Overall Dimensions, and Core Growth. Adv. Funct. Mater. 2009, 19 (19), 3070–3076.
(116) Govindaiah, P.; Lee, S. J.; Kim, J. H.; Cheong, I. W. Synthesis and Characterization of
Poly(styrene-Co-Fluorescein O-methacrylate)/poly(N-Isopropylacrylamide)-Fe3O4 Core/shell
Composite Particles. Polymer (Guildf). 2011, 52 (22), 5058–5064.
(117) Gu, P.; Birch, D. J. S.; Chen, Y. Dye-Doped Polystyrene-Coated Gold Nanorods: Towards
Wavelength Tuneable SPASER. Methods Appl. Fluoresc. 2014, 2 (2), 24004.
(118) Obare, S. O.; Jana, N. R.; Murphy, C. J. Preparation of Polystyrene- and Silica-Coated Gold
Nanorods and Their Use as Templates for the Synthesis of Hollow Nanotubes. Nano Lett. 2001,
1 (11), 601–603.
(119) Ma, C.; Lin, C.; Wang, Y.; Chen, X. DNA-Based ATP Sensing. TrAC - Trends Anal. Chem.
2016, 77, 226–241.
(120) White, R. J.; Rowe, A. A.; Plaxco, K. W. Re-Engineering Aptamers to Support Reagentless,
Self-Reporting Electrochemical Sensors. Analyst 2010, 135 (3), 589–594.
(121) Lin, C. H.; Patel, D. J. Structural Basis of DNA Folding and Recognition in an AMP-DNA
Aptamer Complex: Distinct Architectures but Common Recognition Motifs for DNA and RNA
Aptamers Complexed to AMP. Chem. Biol. 1997, 4 (11), 817–832.
(122) Xiao, Y.; Lai, R. Y.; Plaxco, K. W. Preparation of Electrode-Immobilized, Redox-Modified
Oligonucleotides for Electrochemical DNA and Aptamer-Based Sensing. Nat. Protoc. 2007, 2
(11), 2875–2880.
(123) Holmes, M.; Keeley, J.; Hurd, K.; Schmidt, H.; Hawkins, A. Optimized Piranha Etching Process
for SU8-Based MEMS and MOEMS Construction. J. Micromech. Microeng. 2010, 20 (11), 1–8.
(124) Nordin, N. H.; Ahmad, Z. Monitoring Chemical Changes on the Surface of Borosilicate Glass
Covers during the Silanisation Process. J. Phys. Sci. 2015, 26 (2), 11–22.
95
(125) Aswal, D. K.; Lenfant, S.; Guerin, D.; Yakhmi, J. V.; Vuillaume, D. Self Assembled Monolayers
on Silicon for Molecular Electronics. Anal. Chim. Acta 2006, 568 (1–2), 84–108.
(126) Quek, S. Y.; Venkataraman, L.; Choi, H. J.; Louie, S. G.; Hybertsen, M. S.; Neaton, J. B.
Amine−gold Linked Single-Molecule Circuits: Experiment and Theory. Nano Lett. 2007, 7 (11),
3477–3482.
(127) Proteomics and Mass Spectrometry Core Facility Blog.
https://sites.psu.edu/msproteomics/2014/05/30/tcep-or-dtt/.
(128) Burns, J. a; Butler, J. C.; Moran, J.; Whitesides, G. M. Selective Reduction of Disulfides by
tris(2-Carboxyethyl)phosphine. J. Org. Chem. 1991, 56 (9), 2648–2650.
(129) Love, J. C.; Estroff, L. A.; Kriebel, J. K.; Nuzzo, R. G.; Whitesides, G. M. Self-Assembled
Monolayers of Thiolates on Metals as a Form of Nanotechnology; 2005; Vol. 105.
(130) Dusemund, B.; Hoffmann, A.; Salzmann, T.; Kreibig, U.; Schmid, G. Cluster Matter: The
Transition of Optical Elastic Scattering to Regular Reflection. Zeitschrift für Phys. D Atoms, Mol.
Clust. 1991, 20 (1), 305–308.
(131) Halas, N. J.; Lal, S.; Chang, W. S.; Link, S.; Nordlander, P. Plasmons in Strongly Coupled
Metallic Nanostructures. Chem. Rev. 2011, 111 (6), 3913–3961.
(132) Scott, R. C.; Crabbe, D.; Krynska, B.; Ansari, R.; Kiani, M. F. Aiming for the Heart: Targeted
Delivery of Drugs to Diseased Cardiac Tissue. Expert Opin. Drug Deliv. 2008, 5 (4), 459–470.
(133) Ray, P. C.; Yu, H.; Fu, P. P. Toxicity and Environmental Risks of Nanomaterials: Challenges
and Future Needs. J. Environ. Sci. Heal. C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 2009, 27 (1), 1–
35.
96
Annexe 1 – Protocole détaillé pour la première synthèse de
nanobâtonnets d’or76
Préparation de la solution de croissance primaire
• Dans un ballon de 250 mL avec agitateur magnétique lavés à l’eau régale :
o Préparer une solution 122 mM de CTAB (3,431 g dans 77 mL d’eau nano) et agiter la
solution à 500 rpm dans un bain d’huile à 30°C jusqu’à dissolution complète des cristaux
de CTAB.
o Préparer une solution 941 mM de KBr (112 mg dans 1 mL d’eau nano préchauffée à 30°C)
et ajouter à la solution de CTAB.
o Préparer une solution 19 mM d’AgNO3 (3,3 mg dans 1 mL d’eau nano préchauffée à 30°C)
et ajouter à la solution de CTAB.
o Préparer une solution 96 mM de HAuCl4∙3H2O (37,9 mg dans 20 mL d’eau nano

préchauffée à 30°C) et ajouter à la solution de CTAB. **La solution devrait tourner orange,
en raison de la formation du complexe AuBr4-.**
o Préparer une solution 105 mM d’acide L-ascorbique (18,6 mg dans 1 mL d’eau nano
préchauffée à 30°C) et ajouter à la solution de CTAB. **La solution devrait devenir
transparente, puisque l’Au(III) est réduit en Au(I) par l’acide L-ascorbique.**
Préparation de la solution de germes
o Préparer une solution 125 mM de CTAB (0,364 g dans 8 mL d’eau nano) et agiter la
de CTAB.
o Préparer une solution 100 mM de KBr (11,9 mg dans 1 mL d’eau nano) et ajouter à la
solution de CTAB.
o Préparer une solution 2,5 mM de HAuCl4∙3H2O (3,0 mg dans 3 mL d’eau nano) et ajouter
1 mL à la solution de CTAB. Maintenir la solution à 30°C avec une agitation vigoureuse
(~1150 rpm).
o Préparer une solution 10 mM de NaBH4 (3,8 mg dans 10 mL d’eau nano très froide) et
ajouter 0,6 mL de cette solution à la solution de germes.
97
o Agiter la solution de germes pendant 2 minutes, puis laisser sans agitation pour 3 minutes.
**La solution devrait prendre une légère teinte brunâtre, attribuable à la formation de
germes.**
o Ajouter 0,136 mL de la solution de germes rapidement dans la solution de croissance

primaire. Agiter vigoureusement pendant quelques secondes, puis retirer l’agitateur
magnétique et laisser reposer la solution sans agitation pendant 1h à 30°C. **La solution
finale devrait avoir une couleur magenta.**
Préparation de la solution de croissance secondaire
• Préparer une solution 9,5 mM d’acide L-ascorbique (16,7 mg dans 10 mL d’eau nano).
• Une fois la croissance primaire terminée, prélever cette solution à l’aide d’une seringue et
ajouter 5 mL à la solution de nanobâtonnets à l’aide d’un pousse-seringue à un débit de 30
µL/min. Pour ce faire, mettre la solution de nanobâtonnets sous agitation à 30°C à ~500 rpm.
**La solution devrait prendre une teinte de rose plus foncée.**
• Centrifuger les nanobâtonnets 2 fois à 8000 RCF x 15 minutes. La première fois, redisperser
le culot dans 100 mL d’eau nano. La seconde fois, redisperser dans 100 mL une solution
aqueuse contenant 0,16 mM de CTAB (58,3 mg dans 1 L d’eau nano).
**Conserver à température pièce, puisque le CTAB est très peu soluble dans l’eau froide et tend à
précipiter sous forme de cristaux, ce qui déstabilise les nanobâtonnets.**
98
Annexe 2 – Protocole détaillé pour la seconde synthèse de
nanobâtonnets d’or100
Préparation de la solution de germes
o Préparer une solution 0,2 M de CTAB (0,365 g dans 5 mL d’eau nano) et agiter la solution
à 300 rpm dans un bain d’huile à 32°C jusqu’à dissolution complète des cristaux de CTAB.
o Ajouter 5 mL d’une solution 0,5 mM de HAuCl4∙3H2O (3 mg dans 15 mL d’eau nano).
o Préparer une solution 10 mM de NaBH4 (3,8 mg dans 10 mL d’eau nano très froide).
Ajouter 0,6 mL de cette solution à la solution de CTAB.
o Faire maturer les germes pendant 30 min à 32°C avec une agitation de 300 rpm.
Préparation de la solution de croissance primaire
• Dans un vial de 20 mL en verre avec agitateur magnétique lavé à l’eau régale :
o Ajouter réparer une solution 0,1 M de CTAB (0,365 g dans 10 mL d’eau nano) et agiter la
de CTAB.
o Ajouter 50 µL d’une solution 0,1 M de HAuCl4∙3H2O (39,4 mg dans 1 mL d’eau nano).
o Ajouter un certain volume d’une solution 5 mM d’AgNO3 (8,5 mg dans 10 mL d’eau nano).
- Solution A : 1,49 mL
- Solution B : 1,11 mL
- Solution C : 1,11 mL
o Ajouter 150 µL d’une solution 0,1 M d’hydroquinone (11 mg dans 1 mL d’eau nano).
o Ajouter un certain volume de la solution de germe sous agitation vigoureuse (~1150 rpm).
- Solution A : 80 µL
- Solution B : 160 µL
- Solution C : 320 µL
• Agiter la solution de nanobâtonnets pendant 24 h à 32°C sans agitation. **La solution finale
devrait avoir une teinte rouge.**
• Centrifuger les nanobâtonnets 2 fois à 8000 RCF x 20 minutes. La première fois, redisperser
le culot dans 10 mL d’eau nano. La seconde fois, redisperser dans 5 mL une solution aqueuse
contenant 0,16 mM de CTAB (58,3 mg dans 1 L d’eau nano).
99
Annexe 3 – Protocole détaillé pour le dosage des
nanobâtonnets d’or par ICP-AES
Préparation des solutions étalon
Utiliser une solution mère d’or de 1000 ppm (SM). Préparer des étalons de 0,1 ppm à 10 ppm dans
des fioles jaugées de 10 mL. Ajouter 150 µL d’eau régale aux étalons pour être dans les mêmes
conditions que les échantillons.
0,1 µg/mL = 1 µL SM + 150 µL eau régale et ajuster à 10 mL avec de l’eau nano
0,5 µg/mL= 5 µL SM + 150 µL eau régale et ajuster à 10 mL avec de l’eau nano
1 µg/mL= 10 µL SM + 150 µL eau régale et ajuster à 10 mL avec de l’eau nano
Préparation des échantillons
Centrifuger les nanobâtonnets une fois à 8000 RCF pendant 15 minutes afin de retirer l’or n’ayant pas
réagi au cours de la synthèse et redisperser dans le même volume d’eau nano. Prélever 100 µL de
nanobâtonnets bien centrifugées et transférer dans une fiole jaugée de 10 mL. Dissoudre les
nanoparticules dans 150 µL d’eau régale et ajuster à 10 mL avec de l’eau DM.
100
Annexe 4 – Protocole détaillé pour l’ajout d’une couche de silice
à la surface des nanobâtonnets d’or107,108
Préparation de la surface par échange de ligands
• Dans un vial de 50 mL en polypropylène :
o Ajouter 2,5 mL d’une solution de nanobâtonnets d’or.
o Ajouter 25 µL d’une solution 10 mM de MPTMS (20 µL dans 10 mL d’éthanol).
• Agiter pendant 45 min à température pièce sur une plaque à 300 tours/min.
Ajout de la couche de silice par un procédé de type Stöber
• Dans un vial de 50 mL en polypropylène, ajouter dans l’ordre :
o 20 mL d’éthanol ;
o Un certain volume d’une solution 9 mM de TEOS (30 µL dans 15 mL d’éthanol) variant

entre 0,25 mL et 0,45 mL ;
o 2,5 mL d’une solution de nanobâtonnets d’or avec du MPTMS en surface ;
o 0,25 mL de DMA.
• Agiter pendant 24 h à température pièce sur une plaque à 300 tours/min entre chaque ajout
de TEOS.
• Agiter pendant 48 h à température sur la plaque à 300 tours/min après le dernier ajout de
TEOS.
• Centrifuger 1 x 12 min x 6400 g et redisperser le culot dans 10 mL d’éthanol.
101
Annexe 5 – Protocole détaillé pour l’ajout d’une couche de
polymère thermosensible sur la silice113
Ajout d’une fonction méthacrylate à la couche de silice
• Dans un vial de 50 mL en polypropylène, ajouter dans l’ordre :
o 10 mL AuNBs@SiO2 (dans l’éthanol) ;
o 125 µL de diméthylamine ;
o 1 mL d’une solution 100 mM de 3-méthacryloxypropyltriméthoxysilane (12 µL dans 0,5 mL

d’éthanol).
• Agiter pendant 24 h à température pièce sur une plaque à 300 tours/min.
• Centrifuger 2 x 15 min x 6400 RCF et redisperser le culot dans 10 mL d’eau nano.
Ajout de la couche de PNIPMAM à la surface de la silice
• Dans un ballon tricol de 25 mL avec agitateur magnétique, ajouter dans l’ordre :
o 1 mL de AuNBs@SiO2@MPS (dans l’eau) ;
o 1,8 mL d’une solution 100 mM de N-isopropylméthacrylamide (25,4 mg dans 2 mL d’eau

nano) ;
o 0,4 mL d’une solution 50 mM de N,N’-méthylènebisacrylamide (3,9 mg dans 0,5 mL d’eau

nano);
o 0,04 mL d’une solution 100 mM de dodécylsulfate de sodium (5,8 mg dans 0,2 mL d’eau
nano) ;
o 0,4 mL d’une solution 10 mM de persulfate de potassium (4,1 mg dans 1,5 mL d’eau nano).
• Purger le tricol à l’azote pendant 5 minutes.
• Chauffer à 70°C pendant 2 h.
• Laisser refroidir sous agitation, puis centrifuger 1 x 12 min x 6400 RCFet redisperser le culot
dans 2 mL d’eau nano.
102
Annexe 6 – Protocole détaillé pour l’ajout d’une couche de
polymère thermosensible sur la surface d’or115
Ajout d’une couche de polystyrène
• Dans un ballon de 100 mL avec agitateur magnétique :
o Ajouter 50 mL de AuNBs, puis chauffer à 30°C.
o Ajouter 10 µL de styrène sans inhibiteur de polymérisation (au besoin, purifier le styrène

sur une colonne d’alumine).
o Ajouter 4,7 mg de N,N’-méthylènebisacrylamide.
o Après 15 minutes, augmenter la température à 70°C et initier la polymérisation en ajoutant

20 µL d’une solution 100 mM de persulfate de potassium (4 mg dans 150 µL d’eau nano).
• Agiter pendant 2 h à 70°C.
• Laisser refroidir sous agitation à température pièce, puis centrifuger 1 x 10 min x 3000 RCF et
redisperser le culot dans 50 mL d’une solution aqueuse contenant 0,16 mM de CTAB.
Ajout de la couche de PNIPMAM
• Dans un ballon tricol de 25 mL avec agitateur magnétique, ajouter dans l’ordre :
o 1 mL de AuNBs@SiO2@MPS (dans l’eau) ;
o 1,8 mL d’une solution 100 mM de N-isopropylméthacrylamide (25,4 mg dans 2 mL d’eau

nano) ;
o 0,4 mL d’une solution 50 mM de N,N’-méthylènebisacrylamide (3,9 mg dans 0,5 mL d’eau

nano);
o 0,04 mL d’une solution 100 mM de dodécylsulfate de sodium (5,8 mg dans 0,2 mL d’eau
nano) ;
o 0,4 mL d’une solution 10 mM de persulfate de potassium (4,1 mg dans 1,5 mL d’eau nano).
• Purger le tricol à l’azote pendant 5 minutes.
• Chauffer à 70°C pendant une période de 30 min à 2 h. **La solution devrait prendre une teinte
rosée et devenir laiteuse.**
• Laisser refroidir sous agitation, puis centrifuger 3 x 12 min x 6400 RCF et redisperser le culot
dans 2 mL d’eau nano.
103
Annexe 7 – Protocole détaillé pour la synthèse de
nanoparticules d’or sphériques
Préparation de la solution de germes de 12 nm
• Dans un ballon de 500 mL (propre, lavé à l’eau régale) avec agitateur magnétique :
o Mettre sous forte agitation 200 mL d’eau nano (environ 900 rpm).
o Ajouter 176 mg de citrate de sodium tribasique.
o Chauffer la solution à reflux, en programmant la température à 110°C.
o Préparer une solution 0,124 M de HAuCl4•H2O (49 mg dans 1 mL d’eau nano) et injecter
0,8 mL de cette solution très rapidement dans la solution de citrate.
• Agiter pendant 30 min à reflux. **La solution devrait prendre une teinte noire à l’ajout de la
solution de sel d’or, mais la couleur devient rapidement mauve, puis tourne au rouge foncé
après 5 minutes.**
• Laisser refroidir sous agitation à température pièce, puis transférer dans des tubes en
polypropylène et conserver à 4°C à l’abri de la lumière.
Croissance contrôlée des germes jusqu’à un diamètre de 47 nm
• Dans un ballon de 250 mL (propre, lavé à l’eau régale) avec agitateur magnétique :
o Ajouter 82,5 mL d’eau nano.
o Ajouter 2 mL d’une solution 34 mM de citrate de sodium tribasique (120 mg dans 12 mL

d’eau nano).
o Chauffer la solution à reflux en agitant à 600 rpm à une température de 110°C.
o Ajouter 2,5 mL de la solution de germes de 12 nm.
o Attendre 1 min que la température se stabilise.
o Ajouter 1,7 mL d’une solution 5,9 mM de HAuCl4•H2O (23 mg dans 10 mL d’eau nano).
• Chauffer 45 min à reflux.

• Ajouter simultanément 1,7 mL de la solution de sel d’or et 2 mL de la solution de citrate de
sodium très rapidement.
• Répéter ces deux étapes 3 autres fois pour poursuivre la croissance des particules.
• Laisser refroidir sous agitation à température pièce, puis transférer dans des tubes en
polypropylène et conserver à 4°C à l’abri de la lumière.
104
Annexe 8 – Protocole détaillé pour la préparation des
biocapteurs à base de micropipettes de verre
Fonctionnalisation des micropipettes de verre avec des nanoparticules d’or
• Nettoyer la surface des micropipettes de verre en les plongeant dans une solution de piranha
(3 H2SO4 : 1 H2O2) pendant 15 min.
• Rincer les micropipettes abondamment à l’eau.
• Immobiliser les pipettes dans un pétri 100 mm x 15 mm en polystyrène de manière surélevée

à l’aide de colle chaude (10 pipettes par pétri).
• Rincer les pipettes abondamment à l’éthanol.
• Ajouter 25 mL d’une solution 0,3 % (V/V) d’APTMS dans l’éthanol (90 µL dans 30 mL
d’éthanol).
• Sceller le pétri à l’aide de parafilm pour limiter l’évaporation du solvant.
• Agiter le pétri sur une plaque à 70 tours/min pendant 30 min à température pièce.
• Rincer le pétri et les pipettes abondamment à l’éthanol, puis à l’eau.
• Ajouter 25 mL de la solution de nanoparticules d’or de 47 nm (voir annexe 7) et sceller de

nouveau avec du parafilm. **Si les nanoparticules d’or ont tendance à agréger (la couleur
passe du rouge au mauve rapidement), rincer le pétri, puis ajouter une solution fraiche de
nanoparticules pendant que le pétri est sous agitation.**
• Agiter le pétri sur une plaque à 70 tours/min pendant 18 h à température pièce.
• Rincer les pipettes abondamment à l’eau.
• Laisser sécher et entreposer à température pièce.
Greffage de l’aptamère en surface
• Préparer une solution de tampon phosphate salin (PBS) de pH 7,4 contenant 8,1 mM de
Na2HPO4, 1,9 mM de NaH2PO4•H2O, 2,7 mM de KCl et 13,7 mM de NaCl. Pour ce faire,
mélanger 0,9194 g de Na2HPO4, 0,2081g de NaH2PO4•H2O, 0,1592 g de KCl et 0,6440 g de
NaCl à 800 mL d’eau nano.
• Préparer une solution 10 mM de TCEP•HCl (4,3 mg dans 1,5 mL de PBS).
• Préparer une solution 200 mM d’aptamère (1 nmol/ 5 µL de PBS).
105
o Ajouter 10 µL de la solution de TCEP à la solution d’aptamère.
o Incuber 90 min à 25 °C dans le noir à 400 rpm afin de réduire le lien disulfide à l’extrémité
5’ de l’aptamère.
o Compléter le volume à 1 mL avec du PBS.
o Incuber la pointe des micropipettes dans la solution d’aptamère pendant 24 h à 25°C dans
le noir à 400 rpm.
• Préparer une solution 2 mM de 6-mercaptohexanol (2,7 µL dans 10 mL de PBS).
• Incuber la pointe des micropipettes dans la solution de 6-mercaptohexanol pendant 5 h à 25°C

dans le noir à 400 rpm.
• Rincer les micropipettes abondamment à l’eau nano.
• Ranger les micropipettes à sec dans un pétri, dans le noir à 4°C.
106

Utilisation de Nanoparticules D'or Plasmoniques Pour Le Relargage Contrôlé de Médicaments Et La Détection d'ATP en Milieu Cellulaire

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Utilisation de Nanoparticules D'or Plasmoniques Pour Le Relargage Contrôlé de Médicaments Et La Détection d'ATP en Milieu Cellulaire

Transféré par

Informations du document

Description originale:

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Utilisation de Nanoparticules D'or Plasmoniques Pour Le Relargage Contrôlé de Médicaments Et La Détection d'ATP en Milieu Cellulaire

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Utilisation de nanoparticules d’or plasmoniques pour le

relargage contrôlé de médicaments et la détection

© Mélina Drouin, 2017

Denis Boudreau, directeur de recherche

Le second projet vise à développer un outil micrométrique pour la détection d’adénosine

Figure 1.5 – Absorption de différents composantes des tissus.19 ....................................................... 5

Figure 1.8 – Structure chimique de l’adénosine 5’-trisphosphate et de ses sous-produits d’hydrolyse,

Figure 1.11 – a) Métabolisme enzymatique du glycérol en présence d’ATP et d’oxygène, suivi de

Figure 2.5 – Positions spectrales relatives des phénomènes d’absorption, de fluorescence et de

Figure 2.11 – Changement de conformation d’un aptamère en réponse à sa molécule-cible, ici

Figure 4.10 – Images de microscopie électronique à transmission de nanobâtonnets d’or recouverts

Figure 5.8 – Schéma de la fonctionnalisation des micropipettes de verre lors de la fabrication du

Figure 5.19 – Variation du signal de fluorescence de la pointe de la pipette en fonction de la

Figure 5.20 - Variation du signal de fluorescence de la pointe de la pipette en fonction de la

Figure 5.23 - Schéma de greffage de l’aptamère (en jaune) en l’absence de 6-mercaptohexanol à la

ADN Acide désoxyribonucléique

ADP Adénosine 5’-diphosphate

- Hillary Clinton, Discours de concession 2016

Figure 1.1 – Quelques exemples de nanomatériaux utilisés dans le domaine biomédical. 1

1.1 Utilisation de nanoparticules d’or pour le relargage contrôlé de médicaments

Selon ce concept, en réponse à un stimulus lumineux dans le proche infrarouge, le nanobâtonnet

1.3 Liste des objectifs des deux projets

Pour résumer, les objectifs du premier projet sont de :

Dans un second temps, les objectifs du projet de détection d’ATP sont de :

2.1.1 Nanoparticules métalliques

2.1.2 Mécanisme de formation de nanoparticules

Le diagramme de LaMer à la figure 2.3 B permet d’illustrer la cinétique de nucléation et de croissance

2.2.1 Mécanismes menant à la luminescence

Figure 2.5 – Positions spectrales relatives des phénomènes d’absorption, de fluorescence et de

2.2.2 Extinction de fluorescence

Plusieurs phénomènes peuvent entrainer une diminution de l’intensité de fluorescence d’un

2.2.3 Interactions entre un fluorophore et une nanoparticule métallique

Les nanoparticules métalliques peuvent également influencer l’émission de fluorescence d’une

2.4 Aptamères d’acides nucléiques

2.4.2 Processus de sélection

Afin de sélectionner un ou plusieurs aptamères spécifiques à une cible désirée, un processus

3.1.1 Nanoparticules d’or sphériques

Le contre-ion bromure de ce surfactant joue également un rôle au sein du mécanisme de croissance.

3.2 Techniques de caractérisation

3.2.1 Microscopie électronique à transmission et à balayage

La microscopie électronique regroupe un ensemble de techniques d’imagerie permettant la

Où Cα correspond à la concentration du métal dans la solution de nanoparticules dissoutes, ρ et la

Où kB correspond à la constante de Boltzmann, T est la température absolue du médium et η

3.2.5 Analyse du suivi individuel des particules

3.2.6 Liste des appareils

Type d’analyse Modèle de l’appareil Compagnie

4.1.1 Protocoles de synthèse

Longueur Largeur Nombre de

Concentration d'or (mg/L)

À partir de ces données, il serait théoriquement possible de calculer la concentration de nanoparticules

Longueur Largeur Concentration

Extinction normalisée (u.a.)

4.2 Couche de silice

4.2.1 Protocole de synthèse

Volume de TEOS 9mM Épaisseur de la coquille Écart-type relatif

4.3 Couche de polymère thermosensible

4.3.1 Choix du polymère

4.3.2 Premier protocole de synthèse