J.MAR.CHIM.HETEROCYCL.

Volume 17, N° 2 Décembre 2018

SYNTHESIS AND BIOLOGICALEVALUATION OF

NOVEL HETEROCYCLIC DERIVATIVES
Afifa Hafidh(1), Hédia Chaabane(2), Fathi Touati(3)
(1)
Université de Tunis, Laboratoire Matériaux et Environnement, Département de Chimie,
Institut Préparatoire aux Etudes d’Ingénieurs de Tunis IPEIT,
[email protected]
(2)
Laboratoire de Biotechnologie, Institut National de Recherche et d’Analyse Physico-
chimique, Pôle technologique de Sidi-Thabet, 2020, Tunis, Tunisie
(3)
Laboratoire Matériaux Traitement et Analyse, Institut National de Recherche et d'Analyse
Physico-Chimique (INRAP), Technopole Sidi Thabet – 2020 Tunis, Tunisie.

Reçu le 29/03/2018 ; Accepté le 29/10/2018

ABSTRACT : In the current work, novel heterocyclic derivatives containing 1,3,4-

thiadiazole ring have been successfully synthesized through nucleophilic addition reaction, by
the condensation of 1,3,4-thiadiazole-2,5-diamines (1) as starting material with various
electrophilic agents. The newly synthesized compounds were investigated for their
antimicrobial activities. Structures of all the prepared compounds have been proved using
(FTIR), (1H-NMR) and (13C-NMR) spectra. The synthesized compounds were screened for
antibacterial and antifungal activities against Escherichia coli gram(-), Salmonella
typhimurium gram(-), Staphylococus aureus gram(+), Enterococcus feaciumgram
(+),Streptocoque B(agalactiae)gram (+) and Candida albicans. The synthesized compounds
were found to exhibit moderate to high antibacterial and antifungal efficiency against several
tested bacterial strains, using agar diffusion method and filter paper disc-diffusion method.
Ampicillin was used as positive control for all strains except Candida albicans for which
Nystatin was used. The prepared compounds manifested promising biological activity.

Keywords : Antimicrobial activity; 1,3,4-Thiadiazole; Sorbic acid; Phenacetine;

Benzophenone.

1. Introduction

Nous nous sommes intéressés depuis plusieurs années à la synthèse, la réactivité, la

fonctionnalisation de divers composés hétérocycliques et l'étude de leurs propriétés[1-8].
L’importance des hétérocycles dans la découverte de médicaments est l’un des principaux
axes de la chimie médicinale [9,10]. Actuellement plusieurs hétérocycles sont connus pour
leurs propriétés utiles allant des activités pharmacologiques à la capacité de complexation des
métaux. Il existe un grand nombre de produits hétérocycliques pharmacologiquement actifs et
utilisés cliniquement tels que la morphine, la sulfadiazine, l’acétazolamide, le methazolamide,
le mégazol et autres. Les hétérocycles azotés et soufrés sont présents de façon récurrente dans
de nombreux produits naturels et synthétiques présentant une activité biologique et / ou
thérapeutique. Ils sont en grande partie employés dans la conception de structures
biologiquement actives ; ces hétérocycles jouent un rôle essentiel dans plusieurs processus
biologiques. Les hétérocycles azotés et/ou soufrés à cinq chaînons sont des motifs communs
dans de nombreux produits naturels et présentent des propriétés polyvalentes. Ils sont des
structures importantes, en raison de leur efficacité, aussi bien dans le domaine médicinal,
pharmaceutique (médicaments divers, vitamines, hormones, antibiotiques…), que
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technologique (inhibiteur de corrosion, colorants, agents stabilisants, adsorbants,

détergents…). Par ailleurs, le grand intérêt qu’accordent les chimistes à la synthèse des
composés hétéro-aromatiques fonctionnels à cinq chaînons, du type 1,3,4-thiadiazole , est dû
à leur large domaine d’application. Il est connu depuis longtemps que les dérivés 1,3,4-
thiadiazoliques constituent une classe de composés caractérisés par de nombreuses activités
biologiques et pharmacologiques [11-14]. Ils ont montré des propriétés antibiotiques,
analgésiques, myorelaxantes, anti-convulsivantes, antimitotiques, anti-inflammatoires,
antidiurétiques et anticancéreuses [15-17]. D’autre part, les 1,3,4-thiadiazoles ont servi
également, comme des agents chélatants de métaux, d’inhibiteurs d’oxydation et de corrosion
[18].

A l’instar de ce qui précède et tenant compte du large spectre d’activités biologiques et

thérapeutiques des dérivés du 1,3,4-thiadiazole, le but de ce travail est la mise au point d’une
nouvelle méthode simple et efficace pour l’accès d’abord au 1,3,4-thiadiazole-2,5-diamine
puis l’étude de sa réactivité vis-à-vis de divers réactifs électrophiles. La première démarche
consiste en la préparation du 2,5-diamino- 1,3,4-thiadiazole pour le faire réagir avec des
dérivés électrophiles aromatiques et non aromatiques, permettant d'accéder à des hétérocycles
symétriquement fonctionnalisés, susceptibles de présenter des applications thérapeutiques
et/ou biologiques. La deuxième démarche consiste à évaluer l’activité biologique des
nouveaux composés à noyau 1,3,4-thiadiazolidique.

Les microorganismes pathogènes (bactéries, microbes, champignons…) sont généralement à

l’origine de nombreuses maladies humaines. On assiste de plus en plus au jaillissement de
souches microbiennes résistantes aux agents antimicrobiens avec un pouvoir pathogène varié
et une virulence élevée. En plus, des études épidémiologiques ont montré que l’émergence de
nouvelles maladies a eu lieu à des taux alarmants dans les dernières années. De ce fait,
bon nombre de maladies infectieuses courantes deviennent difficiles à soigner. Devant cette
situation, il apparaît nécessaire de développer de nouvelles molécules biologiquement actives.
Nous rapportons, la synthèse et l’étude des activités biologiques de nouveaux composés
hétérocycliques, contenant le noyau 1,3,4-thiadiazole en utilisant comme substrat de départ le
2,5-diamino-1,3,4-thiadiazole (1) et comme réactifs électrophiles :le paracétamol, l’acide 3-
hydroxybenzoïque, la phénacétine, l’α-tétralone, la benzophénone, l’acide sorbique, le
thiosemicarbazide et le 4-phénylthiosemicarbazide.

2. Résultats et discussion
Dans ce travail, le but était de préparer des dérivés 1,3,4-thiadiazoliques, symétriques et
diversement substitués. Nous avons choisi à cet effet le 2,5-diamino-1,3,4-thiadiazole comme
substrat de départ. Nous avons préparé ce composé selon une nouvelle méthode qui consiste à
faire réagir, à chaud, le thiosemicarbazide sur l’urée, en milieu acide dans l’éthanol absolu
comme solvant. Ce protocole a permis d'obtenir le 2,5-diamino-1,3,4-thiadiadiazole-avec un
bon rendement (environ 86%). Sur le plan mécanistique, l’action dut hiosemicarbazide sur
l’urée, sous reflux d’éthanol, provoque une élimination d’une molécule d’eau L’activation du
thiocarbonyle, rend possible une cyclisation intramoléculaire de l’intermédiaire formé qui
perd une molécule d’ammonic pour conduire au 2,5-diamino-1,3,4-thiadiazole (1) (schéma 1).

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Schéma 1 : Mécanisme réactionnel proposé pour la formation du composé (1)

Le N-(4-hydroxyphényl) éthanamide ou l’acétaminophène commercialement connu sous le
nom de paracétamol, est une substance active existant dans de nombreux médicaments. Il
possède un potentiel thérapeutique : antalgique, analgésique et antipyrétique. Nous l’avons
choisi pour le faire réagir avec le substrat (1). Un autre réactif est sélectionné, le N-(4-
éthoxyphényl)acétamide connu commercialement sous le nom de phénacétine est la substance
active aux propriétés analgésiques et antipyrétiques. Nous l’avons utilisé pour le faire agir
avec le composé (1). Trois autres synthons carbonylés aromatiques sont sélectionnés pour
étudier leur réactivité avec le substrat (1) :l’acide 3-hydroxybenzoïque, la 3,4-
dihydronaphtalèn-1(2H)-one, connue sous le nom d’α-tetralone et la benzophénone, utilisée
en tant qu’arôme et conservateur alimentaire, et retrouvée dans les cosmétiques. L’acide
sorbique ou l’acide hexa-2,4-diénoïque est un conservateur alimentaire aux propriétés
antifongiques. De même, Le thiosemicarbazide ou la 1-amino-2-thiourée reconnue pour ses
propriétés antibactériennes [19], antivirales [20], anti-paludéennes [21], anti-tumorales
[22,23] et anticonvulsivantes [24], a été également utilisé comme réactif, vis-à-vis du
composé (1). L’intérêt de ce précurseur en synthèse organique est notoire. Il a montré son
importance dans la synthèse de plusieurs hétérocycles [25-28]. L’action du 4-
phénylthiosemicarbazide sur le substrat (1) est aussi réalisée.
Pour la préparation des produits (2)-(9) (schéma 2), nous avons, tout d’abord, effectué la
condensation du composé (1) avec le paracétamol ou N-(4-hydroxyphenyl)acétamide, sous
reflux d’éthanol absolu, conduisant au N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)- bis(N-(4-
hydroxyphenyl) acetimidamide) (2) (schéma 2, voie (a)).
La synthèse de N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)-bis(3-hydroxybenzamide) (3) (schéma 2, voie
(b)) est réalisée par la condensation du composé (1) avec l’acide 3-Hydroxybenzoïque. Au
reflux de l’éthanol. L’action du substrat (1) sur le N-(4-éthoxyphényl)acétamide (ou
phénacétine) sous reflux d’éthanol absolu permet l’obtention de N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-
diyl)-bis(N-(4-éthoxyphényl)acetimide) (4) (schéma 2, voie (c)). Quant au produit N,N-
bis(3,4-dihydronaphthalèn-1(2H)-ylidene)-1,3,4-thiadiazole-2,5-diimine(5), il est engendré
par la réaction du substrat (1) sur l’α-tétralone (Schéma 2, voie (d)). Nous avons
égalemenpréparé le N,N-bis(diphénylméthylène)-1,3,4-thiadiazole-2,5-diimine(6) à partir de
la benzophénone et le substrat (1) (schéma 1, voie (e)). La formation du composé 1,1'-(1,3,4-
thiadiazole-2,5-diyl)bis(6-méthyl-5,6-dihydropyridin-2(1H)-one) (7) est réalisée suite à
l’action du composé (1 )surl’acide hexa-2,4-diénoïque ou l’acide sorbique (Schéma 2, voie (f)).
La condensation du composé (1) respectivement, avec le thiosemicarbazide et le 4-
phénylthiosemicarbazide, a permis l’obtention de N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)-

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bis(hydrazinecarboximidamide) (8) et de N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)-bis(2-

phenylhydrazinecarboximidamide) (9)(Schéma 2, voie (g)).

Schéma 2: Protocole de synthèse des produits hétérocycliques (2) - (8)

Le résultat obtenu, lors de la condensation de l’acide sorbique avec le substrat (1), a permis
de proposer un mécanisme pour expliquer la formation du composé (7) (schéma 3.

Schéma 3 Mécanisme réactionnel proposé pour la formation du composé(7)

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L’action du thiosemicarbazide sur le composé (1), se manifeste par une attaque nucléophile de
du groupe amino du composé (1) sur la fonction thione, conduisant ainsi, après élimination
d’une molécule de sulfure d’hydrogène, à la formation du produit (8). Un mécanisme
similaire a été proposé pour la formation du composé (9) issu de l’action de
4-phénylthiosemicarbazide sur le substrat (1) (schéma 2, voie g).
2.1.Caractérisation spectroscopique des composés (1)-(9)
2.1.1. Spectroscopie Infrarouge
Les structures des composés hétérocycliques obtenus ont été caractérisés à l’aide de l’analyse
spectroscopique IR. Les spectres de tous les produits ont présenté des bandes d’absorption
appropriées avec les structures proposées. Les spectres infrarouge mettent en évidence, en
particulier, la présence de bandes d’absorption relatives respectivement aux vibrateurs OH,
NH, NH2, C=O, C=C, C=N intra et extracyclique, C-S, à (3451-3446) cm-1 attribuables aux
groupements O-H ; (3450-3196) cm-1 et vers 1620 cm-1dues aux groupements amine NH et
NH2, - (1663-1652) cm-1 dues aux vibrateurs C=O, (1558-1646) cm-1 correspondant aux
groupements imine C=N, (1606-1600cm-1) relatives aux liaison C=C des cycles aromatiques ,
(1350-1300) cm-1 dues aux liaisons C-S et 1235-1250 cm-1 relatives aux liaisons C-O
Les valeurs des nombres d’onde des vibrateurs caractéristiques de chaque produit synthétisé
sont données dans la partie expérimentale.
2.1.2. Spectroscopie de RMN
Les structures des produits synthétisés, ont été identifiées grâce au données spectrales (RMN
1
H et RMN 13C).. Les résultats de la spectroscopie RMN1H et RMN13C de tous les composés
préparés sont rapportés dans la partie expérimentale.
2.2 Activités biologiques
Les germes bactériens constituent une menace quotidienne et constante contre les êtres
humains et leur résistance aux antimicrobiens est devenue une source d’inquiétude pour la
santé. La nécessité de développer de nouvelles molécules biologiquement actives s’est
imposée. Lors de ce travail de synthèse organique, nous avons préparé de nouveaux produits
et testé leurs activités biologiques. Le but est d’aboutir à de nouvelles substances bioactives.
Nous avons alors testé l’activité antimicrobienne de ces produits vis-à-vis de six souches
pathogènes.
Comme il a été cité dans l'introduction, une attention particulière a été associée dans la
littérature aux 1,3,4-thiadiazoles en raison de leurs propriétés antimicrobiennes. Dans ce
contexte et pour étudier l'activité biologique des 1,3,4-thiadiazole-2,5-difonctionnalisés(1)-
(9), nouvellement synthétisées, des essais ont été réalisés pour évaluer leurs effets
antibactériens et antifongiques. Les neuf composés hétérocycliques ont été examinés pour leur
activité antimicrobienne avec la méthode du disque de papier (φ : 5mm) et comparée à celle
de l’ampicilline et la nystatine, considérées comme références. La référence utilisée pour
toutes les souches testées est un agent antibactérien standard l’ampicilline, sauf pour Candida
albicans, nous avons utilisé la nystatine.
Les souches utilisées comme organismes d'essai, dans cette étude, réalisée au laboratoire de
Biotechnologie à l’Institut National de Recherche et d’Analyses Physico-chimiques au pôle
technologique INRAP de Tunisie, étaient : Salmonella typhimurium (ATCC 14028),
Staphylococus aureus (ATCC 6538), Enterococcus feacium (ATCC 19434) Streptococcus
agalactiae (streptocoque B), Escherichia coli (ATCC 8739) et Candida albicans (ATCC
10231). Toutes ces souches pathogènes proviennent du laboratoire de Biotechnologie à

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l’Institut National de Recherche et d’Analyses Physico-chimiques au pôle technologique

INRAP de Tunisie. Les six composés testés ont été dissous dans le diméthylsulfoxyde
((DMSO) à différentes concentrations (2 ; 1,5 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,125 ; 0,0625 ; 0,03125 ; 0,1562 ;
0,00781 ; 0,0039 ; 0,00195) mg.mL-1, ainsi que les antibiotiques de référence utilisées
(ampiciline : 10µg.mL-1, Nystatine : 100 µg.mL-1). Des disques de papier ont été trempés dans
une solution de chaque composé pendant 5 minutes, puis transférés dans une surface du
milieu de culture ensemencé avec l'organisme d'essai. L’incubation s’est faite dans un milieu
biologique adéquat (bouillon nutritif) à 37°C pendant 24h. Les bactéries sont fournies après
incubation. La multiplication des bactéries se traduit par l’apparition d’un trouble dans le
milieu. Les bactéries sont ensemencées sur gélose Mueller Hinton incubée à 37°C pendant 24
heures. Dans des conditions stériles, nous avons fait couler les géloses dans les boites de pétri
avant la détermination de la sensibilité microbienne aux antibiotiques. raclé quelques colonies
bien isolées puis déchargé dans 5 à 10 ml d’eau physiologique stérile à 0,9%. Après
l'incubation, les diamètres des zones d'inhibition autour des disques ont été mesurés (mm). La
détermination de l’activité antibactérienne et antifongique des nouveaux composés, est faite
par l’expression de la zone d’inhibition (en mm) (tableau 1), la concentration minimale
inhibitrice (CMI) (en mg.mL-1) (tableau 2) et la concentration minimale bactéricide (CMB)
(en mg.mL-1) (tableau 3). Les résultats obtenus sont résumés dans les tableaux 1, 2 et 3.
2.2.1. Détermination de l’activité biologique
2.2.1.1. Détermination de la zone d’inhibition
La zone d’inhibition se fait par la méthode de diffusion en disques[29-32]; cette méthode est
rapportée dans la partie expérimentale. Les résultats de sensibilités antimicrobiennes des
produits synthétisés et leurs effets inhibiteurs sur les six micro-organismes sont récapitulés
dans le tableau 1.
Tableau 1- Activités biologiques des composés (1)-(9) : la zone d’inhibition (mm)
c
Composé Zone d’inhibition (mm)
E. coli S. typhimuriumS. aureusE. feaciumS. agalactiaeC. albicans

(1) 8,00 7,50 7,00 9,00 8,75 8,50

(2) 12,50 11,00 19,25 29,50 48,50 12,50
(3) 9,25 9,50 15,50 25,50 37,50 11,50
(4) 13,25 12,25 16,00 26,25 23,50 11,25
(5) 11,25 7,50 9,25 12,75 14,25 9,25
(6) 14,25 13,00 24,25 29,25 13,50 11,50
(7) 10,00 9,50 13,25 15 15,50 10,75
(8) 10,50 10,00 17,25 25,00 26,50 11,00
(9) 12,25 12,25 14,25 18,00 23,25 10,25
a
Ampiciline 12,25 14,50 35,00 37.50 27,50 -
b
Nystatine 31
DMSO - - - - - -
a
Ampicyline 10µg.mL-1 ; bNystatine 100 µg.mL-1 ; cProduit 15 µg.mL-1

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Schéma 4 : Zones d’inhibition du produits synthétisé (2)sur les six souches pathogènes
testées en prenant l’Ampicilline et la Nystatine comme références (+).

D’après les résultats obtenus, les produits synthétisés semblent être dotés d’une activité
inhibitrice remarquable via les différentes bactéries et champignon avec un diamètre
d’inhibition très variable compris entre 7et 48,5 mm. Tous les composés ont montré des
activités antimicrobiennes légèrement inférieures à celle des antibiotiques usuels (Ampicilline
et Nystatine). Le plus actif étant le composé (2). Il est intéressant de noter que ce composé
présente la zone d’inhibition la plus élevée, comprise entre 11 et 48,5 mm par rapport à toutes
les souches pathogènes. A partir de ces résultats, plusieurs constatations peuvent être
dégagées : La présence des motifs NH, OH, NH2, C=O, le groupement phényle et la
délocalisation des électrons dans les molécules hétérocycliques synthétisées, semble être
d’une grande importance, permettant d’accroître le potentiel antibactérien et antifongique des
nouveaux produits.
2.2.1.2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
La concentration minimale inhibitrice (CMI) est la concentration la plus faible d’un
antibiotique capable d’empêcher le développement d’un microorganisme particulier. La CMI
est déterminée par la méthode de micro-dilution (ELISA NCCLS)[33-36]. Cette méthode est
rapportée dans la partie expérimentale. Le tableau 2 rassemble les inhibitions des micro-
organismes testés, par les produits synthétisés, avec différentes concentrations. Les inhibitions
des concentrations minimales ont été déterminées en utilisant un gradient de concentration (2 ;
1,5 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,125 ; 0,0625 ; 0,03125 ; 0,1562 ; 0,00781 ; 0,0039 ; 0,00195) mg.ml-1 pour
chaque composé. Un gradient de concentration du composé (2) contre toutes les souches
testées est donné dans le schéma 6.
Tableau 2 - L’inhibition des micro-organismes par les produits (1)-(9) avec différentes
concentrations CMI (mg.mL-1)

Composé E. coli S. typhimurium S. aureus E. feacium S. agalactiae C. albicans

(1) 0,500 0,500 1 0,500 0,500 0,500

(2) 0,500 0,500 0,031 0,062 0,062 0,250
(3) 0,500 0,500 0,031 0,031 0,003 0,062
(4) 0,500 0,500 0,015 0,015 0,003 0,250
(5) 0,250 0,250 0,500 0,250 0,250 0,250
[6) 0,250 0,250 0,125 0,125 0,250 0,250
(7) 0,500 0,500 0,500 0,250 0,500 0,500
(8) 0,500 0,500 0,007 0,031 0,007 0,250
(9) 0,500 0,500 0,062 0,125 0,062 0,062

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Schéma 5 Le gradient de concentration du composé (2)

Les résultats des CMI des produits testés sont en concordance avec ceux des zones
inhibitrices, puisque là aussi on constate que les meilleurs rendements sont donnés par le
composé (2)qui a montré des CMI faibles contre S. aureus, E.feacium et S. agalactiae. Le
tableau ci-dessus indique que lorsque le diamètre de la zone d’inhibition est grand, la
concentration minimale inhibitrice est petite et inversement.

2.2.1.3. Détermination de la concentration minimale bactéricide (CMB)

La CMB correspond à la plus faible concentration d'antibiotique ne laissant que 0,01% ou
moins de survie de l'inoculum initial après 24 heures de culture à 37°C. Cette valeur
caractérise l'effet bactéricide d'un antibiotique. La CMB, elle aussi est déterminée par la
méthode de micro-dilution [33]. Le tableau 3 résume les inhibitions des micro-organismes par
les produits (1) à (9) avec différentes concentrations.
Tableau 3 - L’inhibition des micro-organismes par les produits (1)-(9) avec différentes
concentrations CMB / mg.mL-1
Composé E. coli S. typhimurium S. aureus E. feacium S. agalactiae C. albicans

(1) 1 1 1,500 0,500 1 0,500

(2) 1 1 0,062 0,062 0,125 0,125
(3) 1 1 0,062 0,125 0,007 0,500
(4) 1 1 0,031 0,031 0,007 0,500
(5) 0,500 1 1 0,500 0,500 1
(6) 0,500 0,500 0,250 0,250 0,500 0,500
(7) 1 1 1 0,500 1 1
(8) 1 1 0,015 0,062 0,015 0,500
(9) 1 1 0,125 0,250 0,125 0,031

L’action antibactérienne des produits testés se traduit par l’apparition de zones d’inhibition
autour des puits ou des disques. Le diamètre de ces dernières diffère d’une bactérie à une
autre et croît de 7 mm à 48 mm. En premier lieu, il faut noter que tous les dérivés 1,3,4-
thiadiazoliques testés ont montré des diamètres d’inhibition convenable devant ceux de
l’Ampicilline et de la Nystatine. D’autre part, nous pouvons ressortir de cette étude plusieurs

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faits : presque tous les composés synthétisés présentent

présentent une activité modérée contre la souche
Candida albicans ; le produit (2)
( présente les meilleurs résultats. A partir de ceux-ci,
ce plusieurs
renseignements peuvent être dégagées, le premier montre que la présence du noyau
1,3,4-thiadiazolique, confère à toute les molécules testées une activité antibactérienne; le
deuxième indique que la présence du groupement phényle a probablement accru cette activité.
Il paraît aussi, d’après ces résultats,
résultats que les propriétés antibactériennes peuvent être attribuées
att
à la délocalisation des électrons dans toutes les molécules et à la présence de groupements
fonctionnels NH, OH et NH2.

Les résultats observés, ont montré que tous les produits évalués ont des activités
antibactériennes remarquables vis-à-vis
vis de toutes
utes les souches testées. Cette activité peut être
due aux interactions des composés hétérocycliques qui franchissent la paroi bactérienne et la
détruisent ; ils interfèrent avec les processus membranaires provocant ainsi, la détérioration de
la bactérie et sa mort.

2.3. Mécanisme d’action des molécules hétérocycliques obtenues sur les cellules
bactériennes
Pour mieux comprendre le mécanisme d’action des molécules hétérocycliques obtenues, sur
les différentes souches bactériennes, nous donnons un schéma général et simplifié d’une
bactérie testée (Schéma 5).

Schéma 5 : schéma général et simplifié de la structure d’une bactérie testée

Comme le montre le schéma 5, une bactérie est formée d’un cytoplasme sous forme
d’émulsion colloïdale (ions, protéines, substances de réserves…). En plus du cytoplasme, la
membrane cellulaire bactérienne étant polarisée au repos et son potentiel est stable ; mais si la
circulation des ions venait d’être perturbée par l’approche d’autres molécules de l’extérieur, la
nouvellee combinaison des mouvements des charges modifierait le potentiel électrique de la
membrane ; ce qui cause la destruction de la paroi bactérienne. Nous pouvons suggérer que
les molécules hétérocycliques, par leurs structures méso-ioniques,
méso ioniques, interfèrent avec
ave les
interactions membranaires et affectent le cytoplasme qui est perforé; sachant que
l’environnement extracellulaire est hypotonique comparativement au milieu intracellulaire qui
est hypertonique, l’eau envahit la cellule (une entrée massive d’eau) provoquant
prov un choc
osmotique qui cause une dérégulation des pressions des deux côtés de la membrane ; celle-ci
ne peut plus résister à la variation brutale de pressions d’où sa rupture et l’écoulement du
cytoplasme. La désintégration et la destruction de la cellule
cellule bactérienne par les produits
synthétisées est représentée par le schéma 6.

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- Les molécules s’insèrent à l’intérieur de la

cellule via la membrane externe ; cela perturbe
la perméabilité membranaire et permet la
diffusion de substances hors de la bactérie.
- Les molécules interfèrent avec la synthèse
protéique et perturbe leur mécanisme.
mécanisme
- Les molécules peuvent causer l’ouverture de
la double hélice de l’ADN ce qui inhibe le
mécanisme de réplication de celui-ci
celui et détruit
la bactérie.
utres processus métaboliques de la
- Blocage d’autres
bactérie.

Schéma 6 Schéma simplifié illustrant l’action des molécules hétérocyclique (agent anti-
anti
bactérien) sur la bactérie
Différents facteurs physico-chimiques
chimiques peuvent influencer la pénétration des molécules
hétérocycliques synthétisées, à travers la paroi bactérienne :
- l’hydrophobicité de la molécule,
- la structure symétrique de la molécule,
- la délocalisation présente dans la molécule, , NH, NH2 et C=O.
- la présence de groupements fonctionnels dans la molécule tels queOH, NH, NH2 et
C=O
Ces facteurs peuvent accélérer plus fortement la diffusion à travers les porines (protéines
transmembranaires qui se regroupent
regroupe et forment des pores). ). Les pores se remplissent d’eau, et
permettent, ainsi, la diffusion on à travers la membrane des molécules hétérocycliques qui
altèrent la bactérie.
D’après les résultats observés, nous pouvons conclure que les molécules synthétisées ont une
capacité lytique sur les bactéries et ont agi :
- d’une
’une façon bactériostatique où il y a eu un blocage du développement des
bactéries.
- selon
elon une action bactéricide en agissant sur la paroi, la membrane cytoplasmique,
la biosynthèse des protéines et en bloquant d’autres métabolismes ce qui a
entrainélala destruction de la bactérie et l’inhibition
inhibition de sa multiplication.
multiplication
2. Conclusion
Une évaluation biologique des nouveaux produits synthétisés, a été réalisée par des tests
antibactériens et antifongiques,
antifongiques en utilisant différentes souches bactériennes.
bactériennes Les composés
synthétisés ont montré une activité inhibitrice remarquable sur des bactéries à gram positif et
à gram négatif et sur une sorte de champignons. Nous avons montré que probablement le
noyau 1,3,4-thiadiadiazole
thiadiadiazole a une capacité manifeste à induire une activité biologique des
composés qui le contiennent. La nature méso-ionique du cycle 1,3,4-thiadiazole
thiadiazole et la nature
symétrique des structures obtenues, rendent
rend ces composés aptes à traverser les membranes
cellulaires et d'interagir avec des affinités distinctes. Outre les effets biologiques,
biologiques les
composés synthétisés pourraient être utilisés dans d’autres domaines de la chimie telle que la

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chimie de coordination, la corrosion, les matériaux hybrides et les polymères organiques. Les
molécules fonctionnalisées synthétisées, permettent d’envisager une réactivité multiple et
l’accès à de nouvelles familles hétérocycliques polynucléaires originales qui pourraient avoir
une importance thérapeutique.
En perspective une évaluation de la toxicité de ces molécules sera effectuée pour pouvoir
confirmer leurs utilisations dans d’éventuelles applications biologiques. Il serait intéressant de
tester l’activité antimicrobienne de ces composés vis-à-vis d’autres classes de bactéries et
champignons et sur d’autres micro-organismes. Une étude sur des tests antiparasitaires et anti-
inflammatoires des nouveaux composés est en cours. D’autres microbes devraient être
sélectionnés pour élargir l’investigation. Une étude des propriétés anti-oxydantes de tous les
produits synthétisés est menée ; les résultats de cet examen seront publiés ultérieurement.
3. Partie Expérimentale
3.1. Appareillage
Les spectres IR des composés (1)-(9) ont été réalisés dans le KBr sur un spectre Perkin-Elmer
1600 séries FT-IR spectromètre. Les nombres d’onde sont exprimés en cm-1. Les spectres de
RMN-1H et 13C ont été enregistrés en solution dans le DMSO-d6, sur un Spectrometer Bruker
DRX (500 MHz, 125 MHz) en utilisant le TMS comme référence interne. Les déplacements
chimiques (δ) sont exprimés en ppm, la constante de couplage est exprimée en Hz. La
multiplicité des signaux est indiquée par les abréviations suivantes: s: singulet, d: doublet, t:
triplet, q : quadruplet, m: multiplet. Les températures de fusion des produits ont été pris
d’abord sur un Banc Koffler, puis déterminées par la méthode des capillaires avec un appareil
Buchi. La purification des produits a été faite par recristallisation dans l’éthanol ou le THF.
Pour la préparation de tous les produits, la technique de chromatographie sur couche mince de
gel de silice (CCM) a été utilisée pour suivre l’avancement de la réaction et vérifier la pureté
des produits obtenus. Les chromatographies CCM, ont été réalisées sur plaques de silice
d’épaisseur 0,2 mm, avec indicateur de fluorescence à 254 nm, en utilisant comme éluant un
mélange d’acétate d’éthyle et d’hexane. Les taches ont été révélées à une lampe UV. Tous les
réactifs utilisés sont commerciaux (Aldrich, 98%), ils n’ont pas subi de purification
supplémentaire.

3.2. Entretiens et conservation des souches bactériennes

3.2.1. Culture bactérienne
L’ensemencement des boites de Pétri contenant un milieu de culture bouillon nutritif plus
Agar est effectué à partir d’une suspension bactérienne fraiche. Les boites sont, par la suite,
incubées pendant 24 h à 37 °C.
3.2.2. Congélation et décongélation
A partir d’une culture bactérienne quelques colonies sont prélevées et repris dans du bouillon
nutritif. Après une incubation de 24 h à 37 °C, la suspension obtenue est mélangée (en
quantité égale) avec le glycérol puis conservée dans des cryotubes à -20 °C. Un cryotube est
décongelé en cas de besoin, pendant quelques secondes à 37 °C et quelques gouttes sont
reprises dans du bouillon nutritif qui sont par la suite incubées à 37 °C pendant 24 h.

3.3. Méthode de diffusion en milieu gélosé: méthode des disques

La zone d’inhibition se fait par la méthode de diffusion en disques [29-32]. Nous rapportons
dans ce qui suit, cette méthode. Les souches bactériennes à tester sont reprises dans un milieu
nutritif agar non inhibiteur afin d’obtenir des colonies isolées. Une colonie est prélevée puis
reprise dans 5 mL de bouillon nutritif et la densité optique est ajustée jusqu’à 0,5 unité de DO

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à 570 nm (UF=106 C.mL-1). La suspension bactérienne est ajustée en comparaison à un

standard Mc Farland 0,5 (~108 UFC/ml). Cette suspension est incubée pendant 3 h à 37 °C.
100 µl de cette suspension sont étalés uniformément à la surface gélosée. La boite de pétri est
placée dans une étuve pendant 30 mn à 37 °C. Des disques de papiers stériles de Whattman,
placés sur la surface de la gélose, à l’aide d’une pince stérile,sont préalablement imbibés par
15 µL de chaque extrait. Les boites sont ensuite placées à 4 °C pendant 1-2 heures, puis
incubées à 37 °C pendant 24 h. L’Ampiciline et la Nystatinesont utilisées comme témoins
positifs. Tous les composés synthétisés ont été pesés et dissous dans le diméthylsulfoxyde
(DMSO). L’activité inhibitrice des extraits de synthèse des produits (1)-(9) est évaluée par la
mesure du diamètre d’inhibition autour des disques,diamètre de la zone claireobservée autour
du disque en millimètre, appelée zone d’inhibition. Un disque d’essai à blanc a été employé
avec le DMSO. Ce solvant n’a pas montré d’effets sur la croissance des germes testés.
3.4. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
La détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) se fait par la méthode de
micro-dilution sur plaque ELISA[33,34]. Elle est déterminée par la méthode de micro-dilution
(NCCLS, 2001). Les souches présentent une charge bactérienne équivalente à 106 UFC/ml.
Ce test est réalisé en duplicate sur des plaques de 96 puits. L’échantillon à analyser est dilué
dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Dans le puits, on met 5 µl de suspension microbienne à
106 UFC/ml, 95 µl bouillon Mueller Hinton et 100 µl de chaque concentration de
l’échantillon. Après agitation, la plaque est incubée pendant 24 heures à 37°C. Après
incubation, 10 µl du bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thyazolyl)-2,5-diphényl-2H-tétrazlium
(MTT) de concentration 5mg/ml sont ajoutés dans chaque puits. En effet, la viabilité des
bactéries est déterminée par la coloration par MTT qui est une méthode colorimétrique ayant
le principe de la réaction chimique de réduction de ce sel de bromure de 3(4,5-
diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényltétrazolium) qui est de couleur jaune en cristaux bleus de
bleu formazan. Cette réduction ne peut se faire que si l’enzyme succinate déshydrogénase
mitochondriale des cellules vivantes est présente ; d’où le témoignage de la viabilité
microbienne. Les inhibitions des concentrations minimales ont été déterminés en utilisant un
gradient de concentration (2 ; 1,5 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,125 ; 0,0625 ; 0,03125 ; 0,1562 ; 0,00781 ;
0,0039 ; 0,00195) mg.mL-1 pour chaque produit. Le tableau 3 rassemble les inhibitions des
micro-organismes par les produits synthétisés avec différentes concentrations CMI / µg.mL-1

3.5. Détermination de la concentration minimale bactéricide (CMB)

La CMB correspond à la plus faible concentration d'antibiotique ne laissant que 0,01% ou
moins de survie de l'inoculum initial après 24 heures de culture à 37°C. Cette valeur
caractérise l'effet bactéricide d'un antibiotique. La CMB est également déterminée par la
méthode de micro-dilution [33-36]. Un volume de 100µL de chaque puits qui n’a pas montré
de turbidité ou de changement de coloration, est étalé sur gélose nutritive. Après incubation
de 24 heures à 37°C, la concentration du produit testé pour laquelle une surcroissance n’a pas
été observée est considérée comme la concentration minimale bactéricide. Le tableau 4
résume les inhibitions des micro-organismes par les produits synthétisés avec différentes
concentrations CBI (µg.mL-1)
3.6. Synthèse des composés (1)-(9)
4.6.1. Synthèse du 2,5-diamino- 1,3,4-Thiadiazole (1)
L’urée (10 mmol) a été dissoute dans une solution chaude d'éthanol (10ml) contenant 3
gouttes d'acide acétique glacial. Une quantité équimolaire du thiosemicarbazide a été ajoutée
à la solution et la réaction a été chauffée au reflux pendant 24 heures. La solution a été
refroidie à température ambiante et le produit (1) a été obtenu sous forme de précipité. Après

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filtration sous vide, le solide a été lavé plusieurs fois avec de l’éthanol et de l’éther puis séché
sous vide.
Rendement = 86 %; Tf = 213°C; IR (KBr, ν et δ (cm-1)): 3440 et 3358 et 1620 (NH2); 1307
(CS)
et 1115-1005 (C-N); RMN 1H (DMSO-d6, δ(ppm)) : 7,01 (s, 4H:2NH2); RMN 13C (DMSO-
d6, δ(ppm)) :161,32 (C=N).
4.6.2. Synthèse de N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)-bis(N-(4-hydroxyphenyl)acétimid-
amide) (2)
On fait réagir 20 mmol de paracétamol avec 10 mmol de l’échantillon (1) dans 10 ml
d’éthanol en présence de 5 gouttes d’acide acétique glacial. Ensuite le mélange est porté au
reflux pendant 10 heures. Après séchage et évaporation du solvant, on obtient un résidu sous
forme de poudre qui est purifié par une recristallisation dans 5ml d’éthanol. On sèche à
l’étuve d’où l’obtention d’un produit de couleur rosâtre (2). Rendement = 85 %; Tf =118,5).IR
(KBr, ν et δ (cm-1)): 3446 (OH); 3339 (NH);3211(CHaromatique); 1658(C=Nextracyclique);
1569(C=Nintracyclique); 1600 (C=Caromatique); 1312 (C-S) et 1230 (C-O). RMN 1H (DMSO-d6,
δ (ppm, J(Hz)) : 1,98 (s, 3H: CH3); 6,68 -7,35 (dd, 4Har,J=7) ; 9,75 (s, 1H:OH) et 9,23 (s,
1H:NH). RMN 13C (DMSO-d6, δ(ppm)) : 23,11 (CH3) ; 115,57-121,22 (Car) ; 131,30 (C-
N) ; 156,76 (C-O); 157,15 (C=N) et 161,12 (C=N).
3.6.3. Synthèse de N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)-bis(3-hydroxybenzamide) (3)
Le mode opératoire de la synthèse du composé (3) consiste à faire réagir 20 mmol d’acide 3-
hydroxybenzoïque avec 10 mmol du substrat (1) dans 10 ml d’éthanol, en ajoutant quelques 3
à 5 gouttes d’acide acétique glacial. Ensuite, le mélange est chauffé au reflux pendant 8
heures. Après un séchage et une évaporation du solvant, on obtient un résidu sous forme de
poudre blanche qui es tpurifié par une recristallisation, dans 5ml d’éthanol. On récupère un
solide blanc. Rendement = 80 %; Tf = 129°C). IR (KBr, ν et δ (cm-1) : 3335 (OH); 3270(NH) ;
3114(CHaromatique); 1652 (C=O); 1649 (C=Nexttracyclique); 1600 (C=Caromatique); 1562
(C=Nintracyclique); 1310 (C-S) et 1235 (C-O). RMN 1H (DMSO-d6, δ(ppm), J(Hz)) : 5,35 (s,
1H:NH) ; 6,85 (s, 1H) ; 7,85 (m, 3H, J=8) et 9,15 (s, 1H: OH). RMN 13C (DMSO-d6,
δ (ppm) : 108,37-129,95 (Car) ; 156,1(Car-O) ; 156,36 (C=N) ; 161,32 (C=N) et 167,5 (C=O).
4.6.4 Synthèse de N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)-bis(N-(4-éthoxyphényl)acetimidamide)
(4)
Dans un ballon rodé de 50 mL muni d’un réfrigérant, placé dans un bain marie, on introduit
10 mmol de 2,5-diamino-1,3,4-thiadiazole (1) avec 20 mmol de la phénacetine dans 10 mL
d’éthanol, suivi de l’ajout de 5 gouttes d’acide acétique glacial utilisé comme catalyseur. Le
mélange réactionnel est mis sous agitation magnétique et maintenu sous reflux d’éthanol
pendant 8h. . Après évaporation du solvant, la phase organique est extraite à l’éther
(3x10mL), séchée sur MgSO4, puis concentrée sous vide. Un solide blanc est obtenu, il est
purifié par recristallisation dans le THF anhydre. Rendement = 75 %; Tf = 156 °C. IR (KBr, ν
et δ (cm-1)): 3300 (NH) ; 3087 et 2943 (CH); 1660 (C=Nextracyclique); 1560 (C=Nintracyclique);
1600 (C=C) 1310 (C-S) ; 1249 (C-O) et 1049 (C-N). RMN 1H (DMSO-d6, δ(ppm) et
J(Hz)):9,8 (s,1H: NH); 6,8 (d, 2Har, J3=9,5); 7,5 (d, 2Har, J3=9); 3,95 (q, 2H : CH2-O, J=4,6);
2,2 (s, 3H : CH3, J= 4,5); 1,3 (t, 3H :CH3, J= 4,5); RMN 13C (DMSO-d6, δ(ppm)): 15,12
(CH3); 24,2 (CH3);117-125,5 (Car); 133,38 (C-N) ; 154,8 (C-O); 156,32 (C=N); 161,28
(C=N).

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3.6.4. Synthèse de N,N-bis(3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-ylidene)-1,3,4-thiadiazole-2,5-

diimine (5)
Dans un ballon rodé de 50 mL muni d’un réfrigérant, placé dans un bain marie, on introduit
10 mmol du composé (1) avec 20 mmol (2,92g) de l’α-tétralone dans 10 mL d’éthanol suivi
de l’ajout de 0,5 mL d’acide acétique glacial. Le mélange réactionnel est mis sous agitation
magnétique et maintenu sous reflux d’éthanol pendant 12h. Après évaporation du solvant, un
précipité marron obtenu est lavé plusieurs fois avec l’éther et l’éthanol et filtré sous vide puis
recristallisé dans 5ml d’éthanol. Rendement = 75 %; Tf = 258°C. IR (KBr, ν et δ (cm-1) : 3449
(NH) ; 3087-2943 (CH) ; 1646 (C=N) ; 1558 (C=N) ; 1600 (C=C); 1309 (C-S) et 1037 (C-N).
RMN 1H (DMSO-d6, δ(ppm) et J(Hz)) :8,45 (d, 1Har, J3=9,5) ; 8,08 (dd, 1Har, J3=9) ; 7,59
(dd, 1Har, J3=9); 7,47 (d, 1Har, J3=9,5); 2,93 (t, 2H, J3=7); 2,53 (t, 2H, J3=7); 2,07 (m, 2H,
J3=6).RMN13C (DMSO-d6, δ (ppm)): 161,03 (C=N),151,80 (C=N);Car{142,63 ;139,74 ;
132,21 ; 128,54 ; 127,56 ; 126,21; 125,86 ; 121,19} ;Ccycliques{23,38 ; 26,29 ; 30,05}.
4.6.6. Synthèse de N,N-bis(diphénylméthylidène)-1,3,4-thiadiazole-2,5-diimine (6)
Une solution du composé (1) (10 mmol) et de (20 mmol) de benzophénone dans 10mL
d’éthanol en présence de quelques gouttes d’acide acétique glacial est portée au reflux
d’éthanol pendant 12h. Après évaporation du solvant, la phase organique est extraite à l’éther
(3x10mL), séchée sur MgSO4, puis concentrée sous vide. Un solide blanc est obtenu, il est
purifié par recristallisation dans le THF anhydre.Rendement = 65 %; Tf = 265 °C). IR (KBr,
ν/cm-1) : 3100(CH) ; 1639(C=N) ; 1583(C=N);1600 (C=C) et 1306(C-S).RMN 1H (DMSO-
d6, δ(ppm):7,6-7,25 (m,10Har).RMN 13C (DMSO-d6, δ/ppm): 124,34; 128,94; 132,51
(Car) ; 154,78 et 157,32 (C=N).
4.6.7 Synthèse de 1,1-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)-bis(6-méthyl-5,6-dihydropyridin-
2(1H)-one) (7)
A une solution de 20 mmol d’acide sorbique dans 10 mL d’éthanol, on ajoute 10 mmol du
composé (1). Le mélange réactionnel est porté sous reflux pendant 12h. Après évaporation du
solvant, on récupère un solide jaune vif qui est lavé avec de l’éther et recristallisé dans 5 Ml
de THF. Rendement = 70%; Tf = 210°C.IR (KBr, ν (cm-1) : 3268 (CH); 1663 (C=O) ; 1606
(C=C) ; 1560 (C=N) ; 1307 (C-S).RMN 1H (DMSO-d6, δ (ppm) et J(Hz)):
RMN 13C (DMSO-d6, δ (ppm)) : 1,06 (d, 3H: CH3, J3=7,5); 3,92 (m, 1H: J3=7,4); 2,5 (m, 2H:
CH2); 6,82 (m, 1H, J3cis= 7); 7,44 (d, 1H; J3cis= 7). RMN 13C (DMSO-d6, δ (ppm)): 21,81;
65,8; 32,5; 140,5; 125,4; 161,5; 162,3.

4.6.8. Synthèse de N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)-bis(hydrazinecarboximidamide) (8)

Une solution de thiosemicarbazide (20 mmol) et de 1,3,4-thiadiazole-3,5-diamine (1)(10
mmol) dans 10mL de THF en présence 4 à 5 gouttes d’acide acétique glacial, est portée à
reflux pendant 4 heures. Après évaporation du solvant sous vide, la phase organique est
extraite à l’éther (3x10mL), séchée sur MgSO4, puis concentrée sous vide. Un solide jaunâtre
est obtenu, il est purifié par recristallisation dans le THF. Rendement = 96 %; Tf = 180°C.IR
(KBr, ν et δ (cm-1) : 3380-3272-3196(NH2et NH); 1645 (C=Nextrantracyclique); 1568
(C=Nintracyclique) et 1312 (C-S). RMN 1H (DMSO-d6, δ (ppm)): 5,2 (s, 2H: NH2) ; 7,3 (s, 1H:
NH) et 8 (s, 2H: NH2). RMN 13C (DMSO-d6, δ/ppm) : 158,15 (C=N) et 161,27 (C=N).

4.6.9. Synthèse de N,N-(1,3,4-thiadiazole-2,5-diyl)-bis(2-phenylhydrazine-

carboximidamide) (9)
Une solution de 4-phénylthiosemicarbazide (20 mmol) et du composé (1) (10 mmol) dans
10mL de THF en présence de 5 gouttes d’acide acétique glacial est portée à reflux pendant 8
heures. Après évaporation du solvant sous vide, la phase organique est extraite à l’éther

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(3x10mL), séchée sur MgSO4, puis concentrée sous vide. Un solide jaune est obtenu, il est
purifié par recristallisation dans le THF.Rendement = 65 %;Tf = 246°C. IR(KBr, ν(cm-1)):
3451, 3355 et 3264 (NH); 1645 et 1563 (C=N) ; 1600 (C=C); RMN 1H (DMSO-d6,
δ (ppm)):9,83 (s, 1H: NHPh); 8,56 (s, 2H: NH2); 8,04 (s,1H: NH).122,8-132,2 (Car); 158,5 et
161,2 (C=N).

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