Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20, 13563­13574; doi:10.3390/molecules200813563

ACCÈS LIBRE

molécules
ISSN 1420­3049
www.mdpi.com/journal/molecules
Article

Isolement et identification de composés cytotoxiques à partir de

Aeschynomene fascicularis, une plante médicinale maya
1
Edgar E. Caamal­Fuentes 1, Sergio R. Peraza­Sánchez 1, Luis W. Torres­Tapia et Rosa E. Moo­Puc 2,*

1
Unidad de Biotecnología, Centro de Investigación Sientífica de Yucatán (CICY), Calle 43 No. 130,
Col. Chuburná de Hidalgo, Mérida, Yucatán 97200, Mexique ; E­Mails : [email protected]
(EEC­F.) ; [email protected] (SRP­S.); [email protected] (LWT­T.)

2
Unidad de Investigación Médica Yucatán, Unidad Médica de Alta Especialidad, Centro Médico
Ignacio García Téllez, Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), Calle 41 No. 439, Col. Industrial,
Mérida, Yucatán 97150, Mexique

* Auteur à qui la correspondance doit être adressée ; E­Mail : [email protected] ;

Tél./Fax : +52­922­5656.

Rédactrice académique : Isabel CFR Ferreira

Reçu : 28 mai 2015 / Accepté : 10 juillet 2015 / Publié : 24 juillet 2015

Résumé : La plante Aeschynomene fascicularis (Fabaceae) a été utilisée dans la médecine traditionnelle maya
de la péninsule du Yucatan. Cependant, les composés présents dans la plante responsables de ses propriétés
curatives n'ont pas encore été étudiés. L'écorce de racine d'Aeschynomene fascicularis a été extraite avec du
méthanol à 100 % pour obtenir un extrait brut. L'extrait au méthanol a été

Les fractions Hx ont été divisées successivement avec des solvants de polarité croissante pour obtenir les
fractions correspondantes d'hexane (Hx), de dichlorométhane (DCM) et d'acétate d'éthyle (EtOAc), ainsi qu'une
fraction hydroalcoolique résiduelle. Ces fractions ont été testées pour leurs activités cytotoxiques en utilisant un
test MTT sur des lignées cellulaires cancéreuses Hep­2. La fraction Hx a conduit à l'isolement de la spinochalcone
C (1), de la spinochalcone A (2), de l'isocordoine (3) et du secundiflorol G (4). Leurs structures ont été identifiées
sur la base de preuves spectroscopiques et de propriétés chimiques. Tous les composés ont été soumis à des
tests de cytotoxicité et d'antiprolifératifs sur un panel de sept lignées cellulaires, dont une lignée cellulaire de type
normal. La spinochalcone A (2) a montré une activité cytotoxique contre la lignée cellulaire DU­145 et une activité
antiproliférative contre la lignée cellulaire KB.
Le Secundiflorol G (4) a montré une forte activité cytotoxique envers les lignées cellulaires KB et Hep­2.
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13564

De plus, l'isocordoïne (3) a montré une activité modérée sur les lignées cellulaires KB, Hep­2 et DU­145.
Les composés actifs 2, 3 et 4 sont des entités thérapeutiques potentielles contre le cancer.

Mots clés : Fabacées ; flavonoïdes ; plante médicinale maya ; activité cytotoxique ; activité antiproliférative

1. Introduction

La flore de la péninsule du Yucatan est riche en plantes vasculaires, comprenant 2 600 à 3 000 espèces [1].
Certaines de ces espèces ont été utilisées en médecine traditionnelle par les communautés locales pour le traitement d’un
grand nombre de maladies [2–4]. Par conséquent, en raison de leurs utilisations traditionnelles, ces plantes constituent de
bonnes sources de nouvelles molécules qui peuvent être utilisées pour le traitement de différentes maladies. De plus, 50 % des
médicaments anticancéreux utilisés dans les essais cliniques ont été isolés à partir de plantes [5]. Par conséquent, les plantes
médicinales traditionnelles peuvent servir de sources potentielles dans le développement de nouveaux agents anticancéreux
plus efficaces pour les thérapies futures.
Au Yucatan, les plantes médicinales sont utilisées dans les communautés urbaines et rurales comme pratique courante
pour le contrôle de nombreux types de maladies, y compris le cancer. De plus, elles sont utilisées dans le traitement d'affections
compatibles avec les symptômes du cancer : abcès, callosités, cors, bosses dures, polypes, tumeurs ou verrues. Lors d'un
criblage préliminaire des constituants cytotoxiques des plantes utilisées dans la médecine traditionnelle maya pour traiter les
symptômes de type cancéreux, 21 espèces ont été collectées et les extraits de méthanol brut de diverses parties de la plante
ont été soumis à un test de cytotoxicité sur un panel de lignées cellulaires cancéreuses [6]. Les résultats ont indiqué que l'
écorce de racine d'Aeschynomene fascicularis a une activité cytotoxique prononcée sur les lignées cellulaires cancéreuses.

Aeschynomene fascicularis Cham. et Schltdl. (Fabaceae) est un arbuste largement répandu du Mexique à la Colombie.
Cette plante est communément connue sous le nom de kabal pich par les anciens habitants de la péninsule du Yucatan, et elle
a été utilisée dans la médecine traditionnelle maya pour traiter les tumeurs superficielles [2].
Peu d'études chimiques ont été réalisées sur les espèces du genre Aeschynomene [7]. Récemment, notre groupe a isolé des
ptérocarpans à partir de l'extrait méthanolique d' A. fascicularis [8]. Par conséquent, il n'existe pas encore d'études sur les
principes actifs cytotoxiques de la plante médicinale A. fascicularis.
Poursuivant nos efforts de recherche de nouveaux agents anticancéreux issus de plantes médicinales mayas de la
péninsule du Yucatan, nous avons réalisé un fractionnement guidé de l'extrait d'écorce de racine pour isoler et identifier le(s)
composé(s) cytotoxique(s) de cette plante. Ainsi, l'objectif de cette étude était d'isoler et d'identifier les composés cytotoxiques
actifs d' A. fascicularis.

2. Résultats et discussion

2.1. Identification des composés 1 à 4

La fraction hexanique active obtenue à partir de l'extrait méthanolique de l'écorce de racine d' A. fascicularis a été soumise
à une purification chromatographique, ce qui a permis d'isoler quatre composés. Les structures chimiques de tous les composés
ont été déterminées par l'analyse de leurs spectres RMN (1 H, 13C, HSQC et HMBC) et de leurs spectres de masse et par
comparaison de ces données avec celles publiées dans la littérature.
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13565

Composé 1 : huile jaune. UV λmax (CHCl3) nm : 239, 308 ; FTIR (film) νmax cm−1 : 3385, 1649, 1600,
1450, 1332, 1122 ; EI­MS 70 eV, m/z (intensité relative %) : 374 ([M]+, 30), 359 (100), 303 (25), données
1
(20), 131 (15), 103 (17). Pour 255 H­RMN (400 MHz, CDCl3) et 13C­RMN (100 MHz, CDCl3) , voir tableau
1. Le composé 1 a montré une masse moléculaire de 374 amu. Son spectre FTIR a montré des bandes à
3385 et 1649 cm−1
, qui, en conjonction avec le 1
Le signal RMN du 13C d'un proton chélaté à δ 13,74 (1H,
s), les signaux dus à deux protons trans­oléfiniques à δ 7,57 (1H, d, J = 15,4 Hz) et δ 7,86 (1H, d, J = 15,4
Hz), et un signal de carbonyle α,β­insaturé à δ 191,9 dans le spectre RMN du 13C ont confirmé la structure
1
d'une chalcone. De plus, le Le spectre RMN du H a montré des signaux dans la région aromatique appartenant à un
singulet à δ 7,40 et deux ensembles de multiplets à δ 7,43 (3H) et δ 7,65 (2H) caractéristiques des protons
dans les cycles penta­substitués et mono­substitués, respectivement. Français La présence de deux protons
cis­oléfiniques à δ 5,59 (1H, d, J = 9,8 Hz) et δ 6,32 (1H, d, J = 9,8 Hz) ainsi que deux signaux pour deux
méthyles (δ 25,9 et 18,0) et un signal à δ 77,8 dû à un carbone quaternaire dans le spectre RMN 13C sont
cohérents avec la présence d'un cycle 2,2­diméthyl­pyrane. De plus, les signaux à δ 1,46 (6H), δ 3,36 (1H,
d, J = 7,3 Hz) et un multiplet à δ 5,26 (1H) indiquent la présence d'un groupe isoprényle. La position de tous
les protons et carbones a été établie en combinant les expériences bidimensionnelles HSQC et HMBC. La
structure attribuée (Figure 1) correspond au spinochalcone C, précédemment rapporté à partir de Tephrosia
spinosa [9].

3'''

4
4'' 4 1'''
2''
HO 6'
O 6'
β1 3'
β 1
3'
3'' α
3''' 2'
α 1''
2'
1''' Oh oh
Oh oh
2
1

HO HO O
OH
OH

Oh oh 4 OCH3
3

Figure 1. Structures chimiques des flavonoïdes isolés d’ Aeschynomene fascicularis 1–4.

Tableau 1. Spectres RMN des composés 1 et 2.

Spinochalcone C (1) δH Spinochalcone A (2) δH

Position
(J = Hz) δC (J = Hz) δC
1 135,0 135.2
2 7,65 m 128,6 7,62 m 128,5
3 7,43 m 129,0 7,40 m 129,0
4 7,43 m 130,6 7,40 m 130,6
5 7,43 m 129,0 7,40 m 129,0
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13566

Tableau 1. Suite

Spinochalcone C (1) δH Spinochalcone A (2) δH

Position
(J = Hz) δC (J = Hz) δC
6 7,65 m 128,6 7,62 m 128,5
Un 7,57 jours (15,4) 120,6 7,56 jours (15,4) 120,7
B 7,86 jours (15,4) 144,0 7,86 jours (15,4) 144,0
1′ 113,8 113,7
2′ 164,4 162,6
3′ 117.1 114,5
4′ 158,0 160,4
5′ 113.2 119,0
6′ 7,40 s 125,2 7,55 s 128,6
1′′ 3,46 j (7,0) 22.0
2′′ 77,8 5,30 m 121,4

2′′­(CH3)2 3′ 1,46 s 28.6

′ 5,59 jours (9,8) 128,7 135,0
1,76 s 25,9
3′′­(CH3)2
1,84 s 18.0
4′′ 6,32 jours (9,8) 121,7
1′′′ 3,36 jours (7,3) 21.6 3,33 jours (7,0) 29.3
2′′ 5,26 m 122,0 5,30 m 122,0
3′′′ 131,7 134,8
3′′­ 1,69 s 25,9 1,79 s 25,9
(CH3)2 1,82 s 18.0 1,80 s 18.0
2′­OH 13,74 s 13,63 s
4′­OH 6,31 s
C=O 191,9 192.1

Composé 2 : solide amorphe jaune. UV λmax (CHCl3) nm : 238, 322 ; FTIR (film) νmax cm−1 : 3390, H­ (400 MHz, CDCl3)
1
1634, 1608, 1567, 1362, 1147; et 13C­ (100 MHz, CDCl3) RMN : voir tableau 1 ; EI­MS 70 eV, m/z (intensité relative
%) : 376 ([M]+, 100), 333 (40), 305 (45), 265 (30), 201 (40), 161 (60), 131 (40), 103 (35). Le composé 2 a une masse
1
moléculaire de 376 amu. Un ensemble de signaux dans les spectres H, 13C­RMN et FTIR a indiqué la présence d'un
squelette de chalcone similaire au composé 1.
Cependant, 2 présente deux groupes isoprényles confirmés par la présence de signaux méthyles à δ 1,76, 1,79, 1,80 et 1,84
(3H chacun), deux signaux à δ 3,33 et 3,46 (2H, J = 7,0 Hz) et un multiplet à δ 5,30 (2H).
La localisation de tous les protons et carbones a été établie en combinant les expériences bidimensionnelles HSQC et HMBC.
La structure attribuée (figure 1) correspond à la spinochalcone A, précédemment rapportée à partir de Tephrosia spinosa
[10]. Les attributions RMN complètes de 1 et 2 sont rapportées ici pour la première fois.

Composé 3 : solide amorphe jaune. FTIR (film) νmax cm−1 : 3231, 1629, 1613, 1480, 1444, 1362, 1234 ; EI­MS 70 eV, m/z
(intensité relative %) : 308 ([M]+, 55), 265 (90), 231 (12), 149 (100), 131 (37), 103 (40), 77 (20).
1
RMN 1H (400 MHz, CDCl3) : δ 1,78 (3H, s, 3′′­Me), 1,85 (3H, s, 3′′­Me), 3,49 (2H, d, J = 7,0 Hz, H­1′
′), 5,31 (1H, t, J = 7,0 Hz, H­2′′), 6,44 (1H, d, J = 8,9 Hz, H­5′), 7,43 (5H, m, protons du cycle B), 7,60 (1H, d, J = 15,4 Hz, H­
α), 7,74 (1H, d, J = 8,9 Hz, H­6′), 7,89 (1H, d, J = 15,4 Hz, H­β),
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13567

13,76 (1H, s, OH). RMN du 13C (100 MHz, CDCl3) : δ 18,2 (3′′­Me), 22,0 (C­1′′), 26,0 (3′′­Me), 108,1 (C­5′), 114,3 (C­1′),
114,4 (C­3′), 120,8 (C­α), 121,3 (C­2′′), 128,7 (C­2/C­6), 129,2 (C­3/C­5), 129,6 (C­6′), 130,8 (C­4), 135,1 (C­1) 136,1 (C­3′′),
144,5 (C­β), 162,0 (C­4′), 164,2 (C­2′), 192,3 (C=O).
Le composé 3 a donné des caractéristiques spectrales identiques à celles décrites pour l'isocordoïne, qui a été précédemment
isolée de Cordoa piaca [11] et de la racine de Lonchocarpus xuul [12].

20
Composé 4 : solide amorphe brun­rouge. [α] D +9,5 (c 0,02, CHCl3); UV λmax (CHCl3) nm: 238, 283;
1
FTIR (film) νmax cm−1 : 3385, 1618, 1598, 1506, 1454, 1275, 1157, 1116. Dans le Spectre RMN H, un
ensemble de cinq protons couplés mutuellement (δ 2,88 (1H, dd, J = 16,0, 4,0 Hz), 3,02 (1H, ddd, J = 16,0, 10,0, 3,0 Hz),
3,52 (1H, m), 4,09 (1H, t, J = 10,0 Hz) et 4,36 (1H, d, J = 10,0 Hz)) a suggéré la présence d'un
squelette d'isoflavane. Le 1
Le spectre RMN du H a également montré la présence d'un méthoxyle à δ 3,74 (s), et des
signaux d'un groupe α,α­diméthyl­allyle typique ont été observés (δ 1,37 (3H, s), 1,51 (3H, s), 4,97 (1H, dd, J = 18,0, 1,0 Hz),
5,02 (1H, dd, J = 11,0, 1,0 Hz) et 6,13 (1H, ddd, J = 18,0, 11,0, 3,0 Hz). Un proton aromatique isolé à δ 6,56 (1H, s) et trois
protons dans un système ABC (δ 6,36 (1H, d, J = 3,0 Hz), 6,38 (1H, dd, J = 8,0, 3,0 Hz) et 6,92 (1H, d, J = 8,0 Hz)) indiquent
qu'un cycle aromatique est penta­substitué et qu'un autre cycle est tri­substitué. La caractérisation du composé 4 a été
réalisée par spectre RMN H par rapport à celui rapporté pour le secundiflorol G, un flavane précédemment décrit comme
en comparant les 1isolé de Sophora secundiflora [13]. Cette étude est le premier rapport sur la présence de chalcones et de
flavanes dans le genre Aeschynomene et, en particulier, sur la contribution à la phytochimie de l'espèce A. fascicularis.

2.2. Activités biologiques

Cette étude a été menée pour isoler des composés actifs de l'écorce de racine d' A. fascicularis. Notre étude de
fractionnement guidé suggère que la flavane 4 et les chalcones 2 et 3 sont les principaux composés responsables de l'activité
biologique observée dans l'extrait d'origine et la fraction hexanique active. Les résultats des essais biologiques sur six lignées
cellulaires cancéreuses humaines et leurs indices de sélectivité (IS) par rapport à une lignée cellulaire normale sont présentés
dans les tableaux 2 à 5.
Le composé 1 n'a montré aucune activité sur les lignées cellulaires testées à la concentration maximale (100 µM).
Le composé 2 a montré une bonne activité cytotoxique contre les lignées cellulaires DU­145 et PC­3 ; de plus, ce
composé a montré une sélectivité élevée par rapport à une lignée cellulaire normale. Il est intéressant de noter que seul ce
composé a montré une bonne activité antiproliférative contre la lignée cellulaire KB (tableau 4).
Le composé 3 a montré des activités cytotoxiques sur les lignées cellulaires Hep­2, KB et DU­145 ; cependant, ce
composé a montré une faible sélectivité (SI) envers toutes les lignées cellulaires testées. L'activité cytotoxique de l'isocordoine
(3) sur les lignées cellulaires cancéreuses ovariennes, prostatiques et leucémiques humaines a été documentée [14,15]. De
plus, il a été démontré que l'isocordoine est active contre les parasites Leishmania mexicana et Trypanosoma cruzi [14].
Le présent travail contribue à montrer que l'isocordoïne est cytotoxique contre les lignées cellulaires cancéreuses Hep­2,
HeLa et SiHa, dans lesquelles cette molécule n'avait pas été testée auparavant.
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13568

Tableau 2. Activité cytotoxique (CC50) de l’extrait, des fractions et des composés isolés de l’écorce
de racine d’A. fascicularis .

Lignées cellulaires CC50 µg/mL (µM)

Fractions/Composés
MDCK Hep­2 Ko HéLa SiHa DU­145 PC­3

Extrait brut 150,3 (ND) 55,3 (ND) 14,0 (ND) 16,7 (ND) 24,0 (ND) 23,5 (ND) 50.2 (ND)
Fraction hexanique 175,4 (ND) 33,7 (ND) 21,5 (ND) 18,9 (ND) 30,1 (ND) 29.1 (ND) 21,6 (ND)
Fraction de dichlorométhane ­ un ­ ­ ­ ­ ­ ­

­ ­ ­ ­ ­ ­ ­
Fraction d'acétate d'éthyle
­ ­ ­ ­ ­ ­ ­
Fraction aqueuse
1 ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­

2 ­ ­ ­ ­
92,1 (245,0) 6.1 (16.3) 9,7 (26,0)
3 ­ ­
4.2 (14.0) 6.1 (20.0) 11,0 (27,0) 7,0 (23,1) 18,4 (60,3)
4 29,7 (83,4) 3,9 (11,0) 5,3 (15,0) 8.1 (23.0) 14,7 (41,3) 21,5 (60,6) 16,5 (46,4)
Docétaxel 1.1 (1.4) 0,07 (0,1) 0,2 (0,3) 0,19 (0,25) 0,17 (0,22) 0,007 (0,01) 0,07 (0,1)

a > 100 µg/mL. ND = non déterminé ; plage d'activité en µg/mL : < 5 = très forte ; 5–10 = forte ; 10–20 = modérée ; 20–100 =
faible ; > 100 = inactive [16].

Tableau 3. Indice de sélectivité (IS) de l’activité cytotoxique des composés isolés de l’écorce de
racine d’A. fascicularis .

Lignées cellulaires SI
Composé
Hep­2 KB HeLa SiHa DU­145 PC­3
Extrait brut 2.7 10.7 9.0 6.3 6.3 3.0
Fraction hexanique 5.2 8.1 9.2 5.8 6.0 8.1
Fraction de dichlorométhane ­ ­ ­ ­ ­ ­
­ ­ ­ ­ ­ ­
Fraction d'acétate d'éthyle
­ ­ ­ ­ ­ ­
Fraction aqueuse
1 ­ un
­ ­ ­ ­ ­

2 ­ ­ ­ ­ 15.0 9.4
3 0,7 0,5 ­ ­ 0,6 0,23
4 7.6 5.5 3.6 2.0 1.3 1.8
Docétaxel 14.0 4.6 5.6 6.3 140 14.0

a Indéterminé ; non sélectif lorsque SI < 10 [12].

Tableau 4. Activité antiproliférative (CI50) des composés isolés de l’écorce de racine d’A. fascicularis .

Lignées cellulaires IC50 a µg/mL (µM)

Composé
MDCK Hep­2 Ko HéLa SiHa DU­145 PC­3
un

1 ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­

2 ­ ­ ­ ­ ­
18,7 (50,0) 6.0 (16.0)
3 ­ ­ ­ ­ ­
18,4 (60,8) 13,3 (43,8)
4 ­ ­ ­ ­ ­
25,4 (72,0) 21,2 (60,0)
Docétaxel 0,11 (0,14) 0,05 (0,07) 0,04 (0,06) 0,03 (0,04) 0,07 (0,1) 0,01 (0,02) 0,007 (0,01)
a > 100 µM ; plage d’activité en µg/mL : < 5 = très forte ; 5–10 = forte ; 10–20 = modérée ; 20–100 = faible ; > 100 = inactif [16].
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13569

Tableau 5. Indice de sélectivité (IS) de l’activité antiproliférative des composés isolés de l’écorce de racine d’A.
fascicularis .

Lignées cellulaires IC50 SI

Composé
Hep­2 Ko HeLa SiHa DU­145 PC­3
­ ­ ­ ­ ­ ­
un

1
2 ­ 3.1 ­ ­ ­ ­
3 ­ ­ ­ ­ 1.4 ­
4 ­ ­ ­ 1.2 ­ ­
Docétaxel 2.0 2.3 3.5 1.4 7 14
a Indéterminé ; non sélectif lorsque SI < 10 [17].

Le secundiflorol G (4) a montré une activité puissante et une sélectivité modérée envers les lignées cellulaires cancéreuses
orales­laryngées Hep­2 et KB. Auparavant, l'activité cytotoxique de divers isoflavanes avait été rapportée contre les lignées
cellulaires cancéreuses de la bouche [18,19] et est cohérente avec les résultats obtenus dans ce travail pour le secundiflorol G (4)
envers les lignées KB et Hep­2. Par conséquent, nous proposons l'utilisation potentielle du secundiflorol G dans la chimiothérapie
du cancer oral­laryngé.
Il s'agit du premier rapport sur la pharmacologie des composés 1, 2 et 4. De plus, on peut en déduire que l'activité cytotoxique
observée pour l'extrait méthanolique et la fraction hexanique peut être attribuée aux composés 2, 3 et 4. Le mécanisme d'action
par lequel les chalcones et les isoflavanes exercent leur activité cytotoxique reste inconnu ; cependant, Sabzevari [20] a décrit les
composés de type chalcone comme ayant un mécanisme de toxicité radicalaire. En outre, il a été élucidé que le principal
mécanisme d'action des chalcones est l'induction de l'apoptose in vitro et in vivo [21–23]. En revanche, le mécanisme par lequel
les isoflavanes exercent leur cytotoxicité n'a pas été bien élucidé.

Enfin, la spinochalcone A (2) est le composé le plus abondant présent, jusqu'à 30 % de la fraction hexanique de l'écorce de
racine d' A. fascicularis (mesurée par GC­MS), et cela pourrait être exploité pour développer la 2 comme molécule marqueur
potentielle (avec 3 et 4) pour standardiser la fraction hexanique d' A. fascicularis en tant que phytomédicament. En plus de cela, il
convient de souligner l'effet antiprolifératif que la 2 a présenté contre la lignée cellulaire KB, apportant une valeur ajoutée au
développement d' A. fascicularis en tant que phytomédicament pour le traitement du cancer de la cavité buccale et du larynx. À
l'heure actuelle, les thérapies contre le cancer utilisent plusieurs médicaments cytotoxiques agissant en synergie, afin d'améliorer
le pouvoir curatif de toutes les substances ensemble. Cela souligne l'efficacité d'un phytomédicament préparé à partir de la fraction
hexanique d' A. fascicularis.
La présente étude suggère que les chalcones 2 et 3 et la flavane 4 sont les principaux composés responsables de l’activité
biologique observée dans l’extrait original d’ A. fascicularis et sont des candidats potentiels pour le développement de médicaments
en raison de leurs activités cytotoxiques et antiprolifératives efficaces.

3. Section expérimentale

3.1. Généralités

Les spectres UV ont été réalisés dans du CH2Cl2 à l'aide d'un spectrophotomètre Beckman Coulter DU­650 (Brea, CA, USA).
Les spectres FTIR ont été mesurés avec un spectrophotomètre Nicolet Protégé (Madison, WI, USA).
Les spectres RMN (1 H, 13C, DEPT, COSY, HSQC et HMBC) ont été acquis sur un spectromètre Bruker Avance (Billerica, MA,
USA) 400 Ultra Shield et le TMS a été utilisé comme étalon interne. Basse résolution
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13570

Les spectres de masse ont été pris sur un chromatographe en phase gazeuse 6890N d'Agilent Technologies (Santa Clara, CA,
États­Unis) couplé à un spectromètre de masse 5975B (GC­MS). La chromatographie sur colonne a été réalisée sur du gel de
silice 60 (70­230 mesh) de Merck (Darmstadt, Allemagne) et du Sephadex LH­20 de Sigma (St. Louis, MO, États­Unis). La CCM
a été réalisée sur du gel de silice pré­enduit 60 F254 (0,25 mm) (Merck). Les taches sur CCM ont été visualisées sous lumière UV
et par pulvérisation de réactif d'acide phosphomolybdique, suivie d'un chauffage. La densité optique des plaques développées
avec le bromure de 3­(4,5­diméthylthiazol­2­yl)­2,5­diphényl tétrazolium (MTT, Sigma) et la sulforhodamine B (SRB, Sigma) a été
lue dans un spectrophotomètre ThermoSpectronic de Bio­Rad (Hercules, CA, États­Unis).

3.2. Matériel végétal

L'écorce de racine d' A. fascicularis a été collectée en mai 2009 à Yaxcabá, Yucatan (latitude 20°38′06′′N ; longitude 88°48′42′
′O) (Mexique). Le matériel végétal a été identifié et authentifié par un taxonomiste de l'Unité des ressources naturelles du Centro
de Investigación Científica de Yucatán (CICY). Les spécimens portant le numéro de référence P. Simá 2997 ont été déposés à
l'herbier U Najil Tikin Xiw du CICY.

3.3. Isolement des composés actifs

L'écorce de racine séchée en poudre (594 g) a été extraite par macération à température ambiante avec du MeOH (3 × 500
mL) pendant 24 h. Les surnageants ont été filtrés et évaporés sous vide au moyen d'un évaporateur rotatif pour obtenir un extrait
séché. L'extrait MeOH (84 g) a été suspendu dans 500 mL de MeOH/H2O (1:3) et extrait à l'aide de solvants de polarité croissante
(3 × 1000 mL) : hexane, CH2Cl2 et EtOAc.
Les solvants ont été éliminés à l'aide d'un évaporateur rotatif (40 °C) pour obtenir les fractions hexane, dichlorométhane, acétate
d'éthyle et aqueuse. Seule la fraction hexane a montré une activité cytotoxique contre la lignée cellulaire cancéreuse Hep­2 (CC50
= 18 µg/mL).
Français La fraction d'hexane active (6,4 g) a été soumise à une chromatographie liquide sous vide (VLC) sur gel de silice en
utilisant des mélanges d'hexane (Hx) et d'acétone (An) de polarité ascendante pour produire 11 fractions, qui ont été regroupées
en six fractions finales (A1­A6), selon leur similarité sur CCM. Les fractions A2 et A3 ont chacune été purifiées par chromatographie
sur colonne de gel de silice (CC) sous élution isocratique avec Hx/An (9:1) pour produire respectivement la spinochalcone C (1,
60 mg) et la spinochalcone A (2, 65 mg). La fraction A4 a été explorée à l'aide d'un Sephadex LH­20 CC pour obtenir quatre
fractions (B1­B4). La fraction B2 a été éluée avec du MeOH (100 %) et a été en outre soumise à un gel de silice CC en utilisant le
système isocratique Hx/An (8:2) pour obtenir le composé 3 (5 mg). Enfin, à partir de la fraction A6, le composé 4 (20 mg) a été
isolé au moyen d'un gel de silice CC en utilisant le système solvant CH2Cl2/MeOH (9:1).

3.4. Culture cellulaire

Trois types de lignées cellulaires cancéreuses obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) ont été
cultivées : deux lignées cellulaires cancéreuses orales­laryngées, le carcinome du nasopharynx (KB, ATCC­CCL­17) et le
carcinome du larynx (Hep­2, ATCC­CCL­23) ; deux lignées cellulaires cancéreuses du col de l'utérus, l'adénocarcinome du col de
l'utérus (HeLa, ATCC­CCL­2) et le carcinome épidermoïde du col de l'utérus (SiHa, ATCC­HTB­35) ; et deux lignées cellulaires
cancéreuses de la prostate, le carcinome de la prostate (DU­145, ATCC­HTB­81) et l'adénocarcinome de la prostate (PC­3,
ATCC­CRL­1435) ; ainsi qu'une lignée cellulaire normale (MDCK, ATCC­CCL­34). Les cellules ont été cultivées dans
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13571

Flacons stériles Costar T75 contenant du DMEM (Gibco, Hong Kong, Chine), additionné de sérum fœtal bovin (10 %, v/
v), de 100 U/mL de pénicilline G et de 100 mg/mL de streptomycine à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO2 (95 %
d'humidité). À une confluence de 70 à 80 %, les cellules ont été détachées du flacon de culture par traitement avec 0,05
% de trypsine­EDTA (Gibco), et une suspension de 5 × 104 cellules/mL de cellules viables a été ensemencée dans une
plaque de microtitration à 96 puits (Costar, Washington, DC, États­Unis) et incubée.

3.5. Essai de cytotoxicité

La cytotoxicité a été évaluée par le test MTT comme décrit précédemment par Rahman [24]. Lorsque les cellules ont
atteint 90 % de confluence dans une plaque de microtitration, le DMEM a été remplacé par du milieu frais et les cellules
ont été incubées avec des composés à diverses concentrations. Après 72 h d'incubation, 10 μL de solution de bromure de
3­(4,5­diméthylthiazol­2­yl)­2,5­diphényl tétrazolium (MTT, Sigma) (5 mg/mL) ont été ajoutés à chaque puits et incubés à
37 °C pendant 4 h. Le milieu a été aspiré et le produit formazan a été solubilisé avec de l'isopropanol acidifié (HCl 0,4 N ).
La quantité de MTT­formazan est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes et a été déterminée en
mesurant la densité optique (DO) à 590 nm à l'aide d'un lecteur de bio­essai (Bio­Rad). Toutes les déterminations ont été
effectuées en triple.

3.6. Essai antiprolifératif

L'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses a été évaluée par la méthode de la sulforhodamine B [25].
Lorsque les cellules ont atteint 70 % de confluence dans une plaque de microtitration, le milieu a été remplacé par du
DMEM 5 % FBS et des échantillons à diverses concentrations. Après 48 h, le milieu a été jeté et les cellules ont été fixées
en ajoutant 50 μL d'acide trichloroacétique à 10 % (TCA, Sigma­Aldrich Chemical, St. Louis, MO, États­Unis). Les cellules
ont ensuite été incubées à 4 °C pendant 30 min ; le TCA a été vidangé et les plaques ont été laissées à sécher. Ensuite,
50 μL de colorant SRB (10 mg d'acide acétique à 1 %, Sigma) ont été ajoutés à chaque puits pendant 30 min. Enfin, les
plaques ont été lavées quatre fois avec de l'acide acétique à 1 % (100 μL). La DO a été mesurée à 540 nm à l'aide d'un
lecteur ELISA (Bio­Rad). Le docétaxel a été utilisé comme témoin positif, tandis que les cellules incubées avec seulement
0,05 % de DMSO ont été utilisées comme témoin négatif. Toutes les déterminations ont été effectuées en triple.

3.7. Analyse des données

Français Les activités cytotoxiques et antiprolifératives des composés testés ont été calculées comme le pourcentage
de cellules tuées ou le pourcentage d'inhibition de la prolifération cellulaire, respectivement, à l'aide de l'équation :
inhibition de la croissance (%) = (DOtémoin − DOéchantillon/DOtémoin) × 100. Les résultats sont exprimés comme la
concentration du composé qui a tué 50 % des cellules (CC50) et qui a réduit la croissance cellulaire de 50 % (IC50),
respectivement, et ils ont été calculés à l'aide du logiciel GraphPad Prism 4. De plus, le niveau de cytotoxicité sur les
cellules normales a été évalué en déterminant l'indice de sélectivité (SI) de chaque composé, qui est calculé comme le
rapport de la cytotoxicité ou de la croissance cellulaire réduite sur les cellules normales par rapport aux cellules
cancéreuses (SI = cellules normales/cellules cancéreuses) [26]. Il est généralement considéré que l'efficacité biologique
n'est pas due à une toxicité générale lorsque SI ≥ 10 [17].
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13572

4. Conclusions

La présente étude suggère que les chalcones 2 et 3 et la flavane 4 sont les principaux composés responsables
de l’activité biologique observée dans l’extrait original d’ A. fascicularis et sont des candidats potentiels pour le
développement de médicaments en raison de leurs activités cytotoxiques et antiprolifératives efficaces.

Remerciements

Nous tenons à remercier Paulino Simá­Polanco de l'Unité des Ressources Naturelles (CICY) pour son aide dans
l'identification et la collecte du matériel végétal. Ce travail a été soutenu par la subvention CONACYT numéro CB 2010­156755.

Contributions des auteurs

Edgar E. Caamal­Fuentes, Sergio R. Peraza­Sánchez et Rosa E. Moo­Puc ont conçu des recherches ; Edgar E.
Caamal­Fuentes, Sergio R. Peraza­Sánchez, Luis W. Torres­Tapia et Rosa E. Moo­Puc ont effectué des recherches
et analysé les données ; Edgar E. Caamal­Fuentes a rédigé l'article.
Sergio R. Peraza­Sánchez et Rosa E. Moo­Puc ont dirigé l'ensemble de la recherche. Tous les auteurs ont lu et
approuvé le manuscrit final.

Conflits d'intérêts

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts.

Abréviations

λmax, longueur d'onde d'absorption maximale ; νmax, fréquence de la hauteur maximale dans le spectre
infrarouge ; amu, unité de masse atomique ; COSY, spectroscopie de corrélation ; DMSO, diméthylsulfoxyde ;
DEPT, rehaussement sans distorsion par transfert de polarisation ; EI­MS, spectre de masse à impact électronique ;
FTIR, spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier ; HSQC, cohérence quantique simple hétéronucléaire ;
HMBC, corrélation de liaisons multiples hétéronucléaires ; RMN, résonance magnétique nucléaire ; OD, densité
optique ; CCM, chromatographie sur couche mince.

Références

1. VázquezDomínguez, E. ; Arita, HT La péninsule du Yucatan : Histoire biogéographique 65 millions

années de préparation. Ecography 2010, 33, 212–219.
2. Osadao, R. El Libro del Judío o Medicina Doméstica, Descripción de las Virtudes de las Yerbas Medicinales de
Yucatán, 2e éd.; Dr. Dorothy Andrew de Zapata.; Mérida, Mexique, 1834 ; Volume 1, p. 20­255.

3. Florès, J. ; Espejel­Carvajal, I. Etnoflora Yucatanense : Types de végétation de la péninsule du Yucatán ;

Universidad Autónoma de Yucatán, Sostenibilidad Maya : Mérida, Yucatán, Mexique, 1994 ; Fascicule 3.

4. Flores, J. Etnoflora Yucatanense : Légumineuses. Florística, Etnobotánica et Ecología; Université

Autonome du Yucatán : Mérida, Yucatán, Mexique, 2001 ; Tome 18.
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13573

5. Newman, DJ; Cragg, Les produits naturels génétiquement modifiés comme sources de nouveaux médicaments au cours des 30
années allant de 1981 à 2010. J. Nat. Prod. 2012, 75, 311–335.

6. Caamal­Fuentes, E. ; Torres­Tapia, LW ; Simá­Polanco, P. ; Peraza­Sánchez, SR; Moo­Puc, R.

Sélection de plantes utilisées dans la médecine traditionnelle maya pour traiter les symptômes du cancer.
J. Ethnopharmacol. 2011, 135, 719­724.
7. Fullas, F.; Kornberg, LJ; Wani, MC; Wall, ME; Farnsworth, NR; Chagwedera, TE; Kinghorn, AD Deux
nouveaux constituants aromatiques du bois de racine d'Aeschynomene mimosifolia.
J. Nat. Prod. 1996, 59, 190–192.
8. Caamal­Fuentes, E.; Moo­Puc, R.; Torres­Tapia, LW; Peraza­Sanchez, SR Ptérocarpes de l'écorce de
racine d'Aeschynomene fascicularis. Nat. Prod. Commun. 2013, 8, 1421–1422.
9. Rao, EV; Prasad, YR Flavonoïdes prénylés de Tephrosia spinosa. Phytochemistry 1992, 32,
183–185.
10. Rao, EV; Prasad, YR Deux chalcones de Tephrosia spinosa. Phytochemistry 1992, 31, 2121–2122.
11. De Lima, OG ; Marini­Bettolo, GB ; de Mello, JF; delle Monache, F. ; de Barros Coélho, JS; de Andrade
Lyra, FD; Fernandes de Alburquerque, MM Chalcones C­ et O­prénylées de Cordoa piaca. Gazz. Chim.
Italien. 1973, 103, 771­777.
12. Borges­Argáez, R.; Peña­Rodríguez, LM; Waterman, P. Flavonoïdes de deux Lonchocarpus
espèces de la péninsule du Yucatan. Phytochemistry 2002, 60, 533–540.
13. Tanaka, T. ; Ohyama, M. ; Iinuma, M. ; Shirataki, Y. ; Komatsu, M. ; Charles LB Isoflavonoïdes de Sophora
secundiflora, S. arizonica et S. gypsophila. Phytochimie 1998, 48, 1187­1193.
14. Borges­Argáez, R.; Balnbury, L.; Flowers, A.; Giménez­Turba, A.; Ruiz, G.; Waterman, PG; Peña­
Rodríguez, LM Activité cytotoxique et antiprotozoaire des flavonoïdes de Lonchocarpus spp.
Phytomédecine 2007, 14, 530–533.
15. Borges­Argáez, R. ; Vela­Catzín, T. ; Yam­Puc, A. ; Chan­Bacab, M. ; Moo­Puc, R. ; Cáceres­Fafan, M.
Études antiprotozoaires et cytotoxiques sur certains dérivés de l'isocordoïne. Planta Med. 2009, 75, 1336–1338.

16. Wibowo, A. ; Ahmat, N. ; Hamzah, AS; Sufian, AS; Ismail, NH Malaysianol A, un nouvel oligomère trimère
resvératrol issu de l'écorce de tige de Dryobalanops spicea. Fitoterapia 2011, 82, 676­681.
17. Vonthron­Sénécheau, C.; Bernard­Weniger, B.; Ouattara, M.; Tra­Bi, F.; Kamenan, A.; Lobstein, A.; Brun,
R.; Anton, R. Activité antiplasmodiale in vitro et cytotoxicité de plantes ivoiriennes sélectionnées
ethnobotaniquement. J. Ethnopharmacol. 2003, 87, 221–222.
18. Alvarez, L.; Rios, MY; Esquivel, C.; Chávez, MI; Delgado, G.; Aguilar, MI; Villarreal, ML; Navarro, V.
Isoflavanes cytotoxiques d' Eysenhardtia polystachya. J. Nat. Prod. 1998, 61, 767–770.
19. Choi, CW; Choi, YH; Cha, MR; Kim, YS; Yon, G., Kim, YK; Choi, SU; Kim, YH; Ryu, SY Composants
antitumoraux isolés de l'extrait de bois de cœur de Dalbergia odorifera.
J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 2009, 52, 375–379.
20. Sabzevari, O.; Galati, G.; Moridani, MY; Siraki, A.; O'Brien, PJ Mécanismes cytotoxiques moléculaires des
hydroxychalcones anticancéreuses. Chem. ­Biol. Interact. 2004, 148, 57–67.
21. Tabata, K.; Motani, K.; Takayanagi, N.; Nishimura, R.; Asami, S.; Kimura, Y.; Ukiya, M.; Hasegawa, D.;
Akihisa, T.; Suzuki, T. Le xanthoangelol, un constituant majeur de la chalcone d' Angelica keiskei, induit
l'apoptose dans les cellules de neuroblastome et de leucémie. Biol. Pharm. Bull. 2005, 28, 1404–1407.
Machine Translated by Google

Molécules 2015, 20 13574

22. Zi, X.; Simoneau, AR Flavokawain A, une nouvelle chalcone issue de l'extrait de kava, induit l'apoptose dans les
cellules cancéreuses de la vessie par l'implication de la voie apoptotique dépendante de la protéine Bax et des
mitochondries et supprime la croissance tumorale chez la souris. Cancer Res. 2005, 65, 3479–3486.
23. Nishimura, R. ; Tabata, K. ; Arakawa, M. ; Ito, Y. ; Kimura, Y. ; Akihisa, T. ; Nagai, H. ; Sakuma, A. ; Kohno, H. ;
Suzuki, T. L'isobavachalcone, un constituant chalcone d' Angelica keiskei, induit l'apoptose dans le neuroblastome.
Biol. Pharma. Taureau. 2007, 30, 1878­1883.
24. Rahman, A. ; Choudhary, ML ; Thonsen, WJ Techniques de bio­essai pour le développement de médicaments ;
Harwood Academic Publishers : Amsterdam, Pays­Bas, 2001 ; pp. 28–29.
25. Skehan, P.; Storeng, R.; Scudiero, D.; Monks, A.; McMahon, J.; Vistica, D.; Warren, JT; Bokesch, H.; Kenney, S.;
Boyd, MR Nouveau test colorimétrique de cytotoxicité pour le dépistage des médicaments anticancéreux. J. Natl.
Cancer Inst. 1990, 82, 1107–1112.
26. Mena­Rejon, G. ; Caamal­Fuentes, E. ; Cantillo­Ciau, Z. ; Cedillo­Rivera, R. ; Flores­Guido, J. ; Moo­Puc, R.
Activité cytotoxique in vitro de neuf plantes utilisées en médecine traditionnelle maya.
J. Ethnopharmacol. 2009, 21, 462­465.

Disponibilité des échantillons : Les échantillons des composés ne sont pas disponibles auprès des auteurs.

© 2015 par les auteurs ; titulaire de la licence MDPI, Bâle, Suisse. Cet article est un article en libre accès distribué selon les
termes et conditions de la licence Creative Commons Attribution

(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).