ISO 11133 2014 (F) - Character PDF Document

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ISO
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NORME
INTERNATIONALE 11133
Première édition
2014-05-15
Version corrigée
2014-11-01
Microbiologie des aliments, des

aliments pour animaux et de l’eau —
Préparation, production, stockage et
essais de performance des milieux de
culture
Microbiology of food, animal feed and water — Preparation,
production, storage and performance testing of culture media
Numéro de référence
ISO 11133:2014(F)
© ISO 2014
ISO 11133:2014(F)

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Publié en Suisse
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ISO 11133:2014(F)

Sommaire Page
Avant-propos.................................................................................................................................................................................................................................v
Introduction............................................................................................................................................................................................................................. viii
1 Domaine d’application.................................................................................................................................................................................... 1
2 Références normatives.................................................................................................................................................................................... 1
3 Termes et définitions........................................................................................................................................................................................ 2
3.1 Termes généraux et définitions................................................................................................................................................. 2
3.2 Terminologie relative aux essais de performance..................................................................................................... 2
3.3 Terminologie relative aux milieux de culture................................................................................................................ 3
3.4 Terminologie relative aux micro-organismes test..................................................................................................... 7
4 Gestion de l’assurance qualité................................................................................................................................................................. 8
4.1 Documentation........................................................................................................................................................................................ 8
4.2 Stockage......................................................................................................................................................................................................... 9
4.3 Préparation des milieux en laboratoire.............................................................................................................................. 9
4.4 Stockage et durée de conservation des milieux préparés................................................................................ 12
4.5 Préparation avant utilisation.................................................................................................................................................... 13
4.6 Incubation des milieux solides en boîtes de Petri.................................................................................................. 15
4.7 Mise au rebut des milieux............................................................................................................................................................ 15
5 Souches test pour essais de performance................................................................................................................................15
5.1 Généralités................................................................................................................................................................................................ 15
5.2 Sélection des souches test........................................................................................................................................................... 15
5.3 Conservation et entretien des souches test................................................................................................................. 16
5.4 Micro-organismes pour essais de performance....................................................................................................... 17
6 Contrôle qualité et essais de performance des milieux de culture................................................................20
6.1 Exigences générales.......................................................................................................................................................................... 20
6.2 Contrôle de la qualité physique et chimique............................................................................................................... 20
6.3 Contrôle de la qualité microbiologique........................................................................................................................... 20
6.4 Exigences générales relatives aux essais de performance microbiologique................................... 21
6.5 Évaluation de performance et interprétation des résultats........................................................................... 23
6.6 Milieux et réactifs de confirmation..................................................................................................................................... 23
7 Méthodes pour les essais de performance des milieux de culture solides...........................................23
7.1 Généralités................................................................................................................................................................................................ 23
7.2 Méthodes pour les essais quantitatifs............................................................................................................................... 23
7.3 Essais des milieux de culture utilisés pour la filtration sur membrane.............................................. 26
7.4 Méthodes pour essais qualitatifs........................................................................................................................................... 26
8 Méthodes pour les essais de performance des milieux de culture liquides.........................................27
8.1 Généralités................................................................................................................................................................................................ 27
8.2 Méthode quantitative en tubes pour les essais de performance des milieux
d’enrichissement liquides (méthode de dilution jusqu’à extinction).................................................... 27
8.3 Méthode qualitative en tubes pour les essais de performance des milieux
liquides sélectifs.................................................................................................................................................................................. 28
8.4 Méthode qualitative dans un seul tube (turbidité) pour les essais de performance des
milieux liquides.................................................................................................................................................................................... 29
9 Méthodes pour les essais de performance des diluants et des milieux de transport................30
9.1 Généralités................................................................................................................................................................................................ 30
9.2 Méthode d’évaluation des diluants...................................................................................................................................... 30
9.3 Méthode d’évaluation des milieux de transport...................................................................................................... 31
10 Documentation des résultats d’essai............................................................................................................................................32
10.1 Informations fournies par le fabricant............................................................................................................................. 32
10.2 Traçabilité................................................................................................................................................................................................. 32
Annexe A (informative) Dénomination des composants des milieux de culture dans les Normes
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ISO 11133:2014(F)

internationales d’analyse microbiologique des aliments, des aliments pour animaux et

des eaux....................................................................................................................................................................................................................... 33
Annexe B (normative) Préparation du stock de référence et de la culture de travail....................................35
Annexe C (normative) Logigrammes des méthodes pour les essais de performance.....................................40
Annexe D (informative) Exemple de fiche de contrôle pour l’enregistrement des résultats des
essais des milieux de culture.................................................................................................................................................................45
Annexe E (normative) Micro-organismes test et critères de performance pour les milieux de
culture couramment utilisés en microbiologie alimentaire.................................................................................47
Annexe F (normative) Micro-organismes test et critères de performance pour les milieux de
culture couramment utilisés en microbiologie des eaux.........................................................................................70
Annexe G (normative) Utilisation de cartes de contrôle pour le suivi des essais quantitatifs des
milieux de culture solides.........................................................................................................................................................................82
Annexe H (informative) Assurance qualité des milieux de culture — Diagnostic d’anomalie...............89
Annexe I (informative) Essais quantitatifs des milieux liquides...........................................................................................91
Annexe J (normative) Détermination des essais de performance microbiologique pour les milieux
de culture normalisés...................................................................................................................................................................................95
Bibliographie............................................................................................................................................................................................................................ 99
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ISO 11133:2014(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC
concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant:
Avant-propos — Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique ISO/TC 147 Qualité de l’eau, sous-
comité SC 4, Méthodes microbiologiques.
Cette première édition de l’ISO 11133 remplace la deuxième édition de l’ISO/TS 11133-1 (ISO/TS 11133-
1:2009) et la première édition de l’ISO/TS 11133-2:2003, qui ont fait l’objet d’une révision technique.
Elle intègre l’Amendement ISO/TS 11133-2:2003/Amd.1:2011. En particulier, elle inclut également
des exigences applicables aux milieux de culture de microbiologie destinés à l’analyse des eaux. Elle
remplace l’ISO 9998:1991.
La présente version corrigée de l’ISO 11133:2014 comprend les corrections suivantes.
— Au paragraphe 8.3.2, 6ème tiret, mise à jour de la référence 5.4.2.6.
— Dans l’Annexe E
Milieux sélectifs pour le dénombrement des microorganismes
— IS Productivité : correction du critère;
— mCCDA Productivité : remplacement du milieu de référence “TSA” par “Gélose au sang”,
corrections des renvois aux notes de bas de tableau, correction du critère;
— mCCDA Sélectivité : ajout des critères;
— TBX Productivité : ajout du numéro WDCM 00012d, corrections des notes de bas de tableau;
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Milieux d’enrichissement sélectifs

— Bolton Productivité : cocktails de souches répartis dans 2 cellules du tableau distinctes;
— EE Productivité : corrections des renvois aux notes de bas de tableau;
— l’en-tête entre les milieux EE et Fraser a été supprimé;
— ITC Productivité : cocktails de souches répartis dans 2 cellules du tableau distinctes;
— Brucella : corrections des renvois aux notes de bas de tableau;
Milieux liquides non sélectifs
— EPT et Ringer : pour la souche E. coli, corrections des renvois aux notes de bas de tableau;
Milieux d’isolement sélectifs
— Gélose Listeria : réalignement de la Fonction Spécificité avec la souche Listeria innocua;
— VRBG Productivité : ajout de Salmonella Enteritidis WDCM 00030, corrections des renvois
aux notes de bas de tableau;
Milieux d’isolement non sélectifs
— Gélose nutritive : correction des numéros WDCM;
Milieux à usages multiples
— Ajout du milieu Gélose au sang et de ses caractéristiques;
— EPT : norme ISO 21528-1, correction des souches et de leurs numéros WDCM;
— TSA : retrait de E.coli O157 :H7 et de son numéro WDCM 00014 (non-toxigénique);
— Dans l’Annexe F
Milieux sélectifs pour le dénombrement des micro-organismes par comparaison avec un milieu
de référence non sélectif
— Colilert : remplacement par Colilert-18 et changement du numéro WDCM 00207 de la souche
Pseudomonas aeruginosa par 00024;
— Slanetz : ajout d’un renvoi aux notes de bas de tableau;
— Sulfite de fer/TS et TSC : milieu de référence modifié par “TSA ou autre milieu non sélectif
pour les anaérobies ou gélose au sang”;
Milieux sélectifs pour le dénombrement des micro-organismes par comparaison avec un lot
précédemment accepté
— Colilert : remplacement par Colilert-18 et changement du numéro WDCM 00207 de la souche
Pseudomonas aeruginosa par 00024;
— Sel : remplacement de “sel” par “solution saline”;
— XLD : ajout d’un renvoi aux notes de bas de tableau
— EPT : ajout d’un renvoi aux notes de bas de tableau;
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ISO 11133:2014(F)

— TSA : ajout d’un renvoi aux notes de bas de tableau et de nouvelles souches de E. coli de
numéros WDCM 00012, 00013, et 00179.
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ISO 11133:2014(F)

Introduction
Dans les laboratoires pratiquant des examens microbiologiques, les principaux objectifs sont la
conservation, la revivification, la croissance, la recherche et/ou le dénombrement d’une grande
variété de micro-organismes. Les milieux de culture sont utilisés dans toutes les méthodes de culture
microbiologique traditionnelles comme dans de nombreuses autres méthodes alternatives. Il existe de
nombreuses formules de milieux de culture disponibles dans le commerce et un plus grand nombre
encore, destinées à des utilisations spécifiques, sont décrites dans la littérature.
De nombreux essais et modes opératoires dépendent de l’aptitude des milieux de culture à donner des
résultats homogènes et reproductibles. Les exigences relatives aux milieux peuvent être spécifiques à
la fois à l’échantillon et aux souches à rechercher. Des milieux de culture satisfaisant à des critères de
performance établis constituent donc un préalable à toute analyse microbiologique fiable. Il convient
d’effectuer un nombre suffisant d’essais afin de démontrer
a) que chaque lot de milieu est acceptable,
b) que le milieu répond aux besoins et
c) que le milieu peut donner des résultats homogènes.
Ces trois critères constituent une part essentielle des procédures internes de contrôle qualité et, avec
la documentation appropriée, permettent une surveillance efficace des milieux de culture, contribuant
ainsi à l’obtention de données exactes et fiables. Pour une analyse microbiologique fiable, il est essentiel
d’utiliser des milieux de culture de qualité reconnue. Pour tous les milieux décrits dans les méthodes
normalisées, il est indispensable de définir les critères d’acceptation minimaux nécessaires pour garantir
leur fiabilité. Il est recommandé, pour la détermination des caractéristiques de performance d’un milieu
de culture, de procéder à des essais conformes à la présente Norme internationale.
Il convient que l’établissement de critères de performance minimaux largement acceptés pour les milieux
conduise à des produits de qualité plus homogène, et réduise le nombre d’analyses supplémentaires
dans les laboratoires où ils sont utilisés.
En outre, les critères d’acceptation mesurés selon des méthodes définies dans la présente Norme
internationale peuvent être utilisés par tous les laboratoires de microbiologie pour évaluer le caractère
productif, sélectif et/ou électif d’un milieu de culture.
Les exigences relatives à l’analyse microbiologique des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau
contenues dans la présente Norme internationale prévalent dans l’évaluation de la qualité des milieux
de culture.
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NORME INTERNATIONALE ISO 11133:2014(F)
Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et

de l’eau — Préparation, production, stockage et essais de
performance des milieux de culture
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale définit les termes relatifs à l’assurance qualité des milieux de culture
et spécifie les exigences relatives à la préparation des milieux de culture destinés à être appliqués pour
l’analyse microbiologique des aliments, des aliments pour animaux et des d’échantillons de la production
d’aliments et d’aliments pour animaux ainsi que de tous les types d’eau destinés à la consommation ou
utilisés dans la production alimentaire.
Ces exigences sont applicables à toutes catégories de milieux de culture préparés pour être utilisés dans
les laboratoires qui réalisent des analyses microbiologiques.
La présente Norme internationale définit également des critères et décrit des méthodes pour les essais
de performance des milieux de culture. La présente Norme internationale s’applique aux producteurs
tels que:
— les entités commerciales qui produisent et/ou distribuent des milieux prêts à l’emploi, semi-finis
reconstitués ou déshydratés,
— les entités non commerciales qui fournissent des milieux à des tiers,
— les laboratoires de microbiologie qui préparent des milieux de culture pour leur propre usage.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales.
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 2: Règles spécifiques pour la préparation
des viandes et produits à base de viande.
des produits de la pêche.
des produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche.
du lait et des produits laitiers.
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ISO 11133:2014(F)

des échantillons prélevés au stade de production primaire.
ISO 7704, Qualité de l’eau — Évaluation des membranes filtrantes utilisées pour des analyses microbiologiques.
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations.
ISO 8199, Qualité de l’eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
NOTE 1 Le présent article donne les définitions générales relatives à l’assurance qualité des milieux de culture
et fournit la terminologie relative aux essais de performance, aux milieux de culture et aux micro-organismes
test.
NOTE 2 Les Tableaux E.2 et F.2 donnent des explications sur les noms abrégés des milieux.
3.1 Termes généraux et définitions

3.1.1
maîtrise de la qualité
partie du management de la qualité axée sur la satisfaction des exigences pour la qualité
Note 1 à l’article: Voir Référence [1].
3.1.2
lot de milieu de culture
unité de milieu homogène et conforme aux exigences de traçabilité, correspondant à une quantité définie
de produits en vrac, de produits semi-finis ou finis, de type et de qualité homogènes, qui a été produite
au cours d’une période définie et identifiés sous un même numéro de lot
3.1.3
substrat chromogène
substrat fluorogène
substrat contenant un groupement chromophore/fuorophore et un substrat utilisable par des bactéries
ou des champignons
Note 1 à l’article: après avoir divisé le substrat chromogène/fluorogène, le chromophore/fluorogène est libéré et
un produit final coloré ou fluorescent devient visible/peut être détecté, en utilisant une lampe à rayons ultraviolets
(UV) si nécessaire.
3.2 Terminologie relative aux essais de performance

3.2.1
performance d’un milieu de culture
réponse d’un milieu de culture soumis à une souche test dans des conditions définies
3.2.2
micro-organisme cible
micro-organisme ou groupe de micro-organismes à rechercher ou à dénombrer
3.2.3
micro-organisme non cible
micro-organisme qui est supprimé par le milieu et/ou les conditions d’incubation ou qui ne présente pas
les caractéristiques attendues du micro-organisme cible
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ISO 11133:2014(F)

3.2.4
productivité d’un milieu de culture
taux de récupération d’un micro-organisme cible à partir d’un milieu de culture dans des conditions
définies
3.2.5
sélectivité d’un milieu de culture
degré d’inhibition d’un micro-organisme non cible sur ou dans un milieu de culture sélectif dans des
conditions définies
3.2.6
électivité d’un milieu de culture
spécificité d’un milieu de culture
démonstration de caractéristiques visuelles spécifiées, dans des conditions définies, par les micro-
organismes cibles mais non par les micro-organismes non cibles
3.3 Terminologie relative aux milieux de culture

3.3.1
milieu de culture
mélange de substances, sous forme liquide, semi-solide ou solide, qui contient des constituants naturels
et/ou synthétiques permettant la croissance des micro-organismes (avec ou sans inhibition de certains
d’entre eux), leur identification ou leur conservation
Note 1 à l’article: lorsque cette expression est utilisée en combinaison avec d’autres mots, on l’abrège souvent pour
n’utiliser que le terme «milieu» (par exemple, milieu d’enrichissement).
3.3.2 Milieux de culture classés par composition

3.3.2.1
milieu chimiquement défini
milieu de culture exclusivement composé de constituants chimiquement définis dont la structure
moléculaire et le degré de pureté sont connus
3.3.2.2
milieu chimiquement indéfini ou partiellement indéfini
milieu de culture entièrement ou partiellement composé de matières premières naturelles ayant subi
une transformation ou tout autre traitement, dont la composition chimique n’est pas complètement
définie
Note 1 à l’article: une liste harmonisée des désignations des différents composants chimiquement indéfinis
utilisés dans les milieux de culture est spécifiée à l’Annexe A.
3.3.2.3
milieu de culture chromogène
milieu de culture fluorogène
milieu de culture contenant un ou plusieurs substrats chromogènes/fluorogènes
Note 1 à l’article: les milieux de culture chromogènes facilitent l’identification des bactéries ou des champignons
au moyen d’une couleur définie et de caractéristiques morphologiques (croissance typique du milieu de culture).
Les milieux fluorogènes nécessitent d’être interprétés à l’aide d’une lampe UV. Les produits issus de réaction
biochimiques nécessaires à l’efficacité des milieux de culture chromogènes/fluorogènes sont normalement le
résultat de l’activité enzymatique de certains organismes, laquelle dépend grandement du maintien précis de
conditions spécifiques (par exemple, température, valeur de pH, concentrations du substrat).
3.3.3 Milieux de culture classés par consistance

ISO 11133:2014(F)

3.3.3.1
milieu liquide
milieu de culture consistant en une solution aqueuse d’un ou de plusieurs constituants, tel que l’eau
peptonée et le bouillon nutritif
Note 1 à l’article: dans certains cas, des particules solides sont ajoutées au milieu de culture liquide, tel que le
milieu de viande cuite.
Note 2 à l’article: les milieux liquides répartis dans des tubes, des fioles ou flacons sont couramment appelés
«bouillons».
3.3.3.2
milieu solide
milieu semi-solide
milieu liquide contenant des produits gélifiants (par exemple, agar-agar, gélatine) à différentes
concentrations
Note 1 à l’article: étant donné que les milieux gélosés par de l’agar-agar sont utilisés dans le monde entier, le terme
«gélose» est souvent utilisé comme synonyme de milieu solide et donc en association avec d’autres termes, par
exemple, «gélose pour dénombrement».
Note 2 à l’article: les milieux solides contenus dans des boîtes de Petri sont couramment appelés «milieux gélosés».
Les milieux contenus dans des tubes ou des petits flacons maintenus en position inclinée pendant la solidification
sont fréquemment appelés «géloses inclinées» ou «géloses en pente». Si le milieu est réparti pour remplir le fond
du contenant, cela forme un «culot».
3.3.4 Milieux de culture classés selon leur application

3.3.4.1
milieu de transport
milieu destiné à préserver et à maintenir la viabilité des micro-organismes en minimisant le changement
numérique pendant la période qui sépare le prélèvement de l’échantillon du traitement de celui-ci au
laboratoire.
EXEMPLE Milieu de transport Stuart ou Amies
3.3.4.2
milieu de conservation
milieu destiné à préserver et à maintenir la viabilité des micro-organismes pendant une longue période,
à les protéger contre les influences défavorables qui peuvent se manifester pendant une période de
stockage prolongée et permettant la récupération desdits micro-organismes au terme de cette période
EXEMPLE Milieu à l’œuf de Dorset, gélose nutritive en pente
3.3.4.3
milieu de dilution
milieu de suspension
milieu destiné à disperser les micro-organismes d’une matrice solide dans une phase liquide et/ou à
réduire leur concentration par dilution, sans multiplication ou inhibition pendant le temps de contact
EXEMPLE Solution peptone sel.
3.3.4.4
milieu de revivification
milieu permettant aux micro-organismes ayant subi un stress ou ayant été altérés de se régénérer et de
retrouver leur aptitude de croissance normale, sans nécessairement favoriser leur multiplication
EXEMPLE Eau peptonée tamponnée
Note 1 à l’article: un milieu de revivification peut également servir de milieu de pré-enrichissement, par exemple,
eau peptonée tamponnée.

ISO 11133:2014(F)

3.3.4.5
milieu de pré-enrichissement
milieu d’enrichissement
milieu se présentant en général sous une forme liquide qui, de par sa composition, crée des conditions
particulièrement favorables à la multiplication des micro-organismes
EXEMPLE Bouillon tryptone soja
3.3.4.5.1
milieu d’enrichissement sélectif
milieu d’enrichissement qui permet la multiplication de micro-organismes cibles spécifiques tout en
empêchant partiellement ou totalement la croissance d’autres micro-organismes non-cibles
EXEMPLE Milieu Rappaport-Vassiliadis au soja (RVS)
3.3.4.5.2
milieu d’enrichissement non sélectif
milieu d’enrichissement qui permet la croissance d’une grande variété de micro-organismes
EXEMPLE Bouillon à l’infusion cœur-cervelle
3.3.4.6
milieu d’isolement
milieu solide ou semi-solide qui permet la croissance de micro-organismes
3.3.4.6.1
milieu d’isolement sélectif
milieu d’isolement qui permet la croissance de micro-organismes cibles spécifiques, tout en empêchant,
totalement ou partiellement, celle d’autres micro-organismes
EXEMPLE gélose modifiée à la céfopérazone, au charbon et au désoxycholate (gélose mCCD)
3.3.4.6.2
milieu d’isolement non sélectif
milieu d’isolement qui n’est pas destiné à l’inhibition sélective de micro-organismes
EXEMPLE Gélose nutritive
3.3.4.6.3
milieu de culture sélectif chromogène
milieu de culture sélectif fluorogène
milieu de culture chromogène/fluorogène qui contient également des composés sélectifs permettant
l’inhibition totale/partielle de la flore annexe présente dans les matériaux analysés et qui contribue
ainsi à la recherche précise de micro-organismes cibles
EXEMPLE Gélose TBX, milieu MUG/EC
3.3.4.7
milieu de différenciation
milieu de caractérisation
milieu qui permet de rechercher une ou plusieurs caractéristiques physiologiques/biochimiques des
micro-organismes en vue de leur identification
EXEMPLE Gélose TBX, gélose lactosée au tergitol 7 et au TTC
Note 1 à l’article: les milieux de différenciation qui peuvent être utilisés comme des milieux d’isolement sont
désignés sous le nom de milieux d’isolement/de différenciation, par exemple, gélose xylose lysine désoxycholate
(XLD), gélose lactosée au TTC.

ISO 11133:2014(F)

3.3.4.8
milieu d’identification
milieu destiné à produire une réaction spécifique pour l’identification de micro-organismes qui souvent
ne nécessite pas la conduite d’essais supplémentaires de confirmation
EXEMPLE Gélose bile-esculine-azide
3.3.4.9
milieu de dénombrement
milieu de culture sélectif ou non sélectif permettant de quantifier les micro-organismes
EXEMPLE Gélose Baird-Parker, gélose à l’extrait de levure
Note 1 à l’article: un milieu de dénombrement peut inclure les propriétés de milieux de revivification et/ou
d’enrichissement.
3.3.4.10
milieu de confirmation
milieu contribuant à l’identification ou à la caractérisation du micro-organisme après une étape
préliminaire de revivification et/ou d’enrichissement et/ou d’isolement
EXEMPLE Gélose Kligler au Fer
3.3.4.11
milieu contenant des neutralisants
milieu de transport, milieu de dilution ou milieu de culture contenant des ingrédients neutralisants
pour inactiver des détergents/désinfectants ou d’autres agents biocides
3.3.4.12
milieu à applications multiples
milieu se rapportant à plusieurs catégories
EXEMPLE La gélose au sang est un milieu de revivification (3.3.4.4), un milieu d’isolement (3.4.4.6) et un
milieu de différenciation (3.3.4.7) utilisé pour la recherche de l’hémolyse. L’eau peptonée tamponnée est un
diluant (3.3.4.3) et un milieu de pré-enrichissement (3.3.4.5).
3.3.4.13
milieu de référence
milieu, en général non sélectif, destiné à une évaluation comparative de performance, indépendant du
milieu soumis à essai et adapté à une utilisation en tant que milieu témoin
EXEMPLE Gélose tryptone soja (TSA)
3.3.5 Milieux de culture classés selon la méthode de préparation

3.3.5.1
milieu prêt à l’emploi
milieu liquide, solide ou semi-solide fourni dans des boîtes, flacons, tubes ou autres contenants sous
forme de produit prêt à l’emploi ou utilisable immédiatement après avoir été régénéré ou utilisable
immédiatement après avoir été régénéré et supplémenté
3.3.5.1.1
milieu de culture fini
milieu sous forme de produit prêt à être ensemencé
3.3.5.1.2
milieu utilisable immédiatement après avoir été régénéré
milieu à régénérer, par exemple destiné à être utilisé dans le cadre d’une technique d’ensemencement en
profondeur ou à être coulé dans des boîtes de Petri

ISO 11133:2014(F)

3.3.5.1.3
milieu utilisable immédiatement après avoir été régénéré et supplémenté
milieu à régénérer, supplémenter et répartir avant utilisation (milieu prêt à l’emploi incomplet)
EXEMPLE Gélose tryptose sulfite cyclosérine (TSC), Gélose Baird-Parker ou gélose au plasma de lapin et au
fibrinogène (RPF)
3.3.5.2
milieu préparé à partir de formules déshydratées commerciales
milieu sous forme déshydratée qui nécessite une réhydratation et un traitement avant utilisation,
aboutissant à l’un des deux produits suivants:
— milieu complet,
— milieu incomplet dans lequel sont ajoutés des suppléments avant utilisation
EXEMPLE Produits en poudre, granulés compactés ou lyophilisés
3.3.5.3
milieu préparé à partir de composants individuels
milieu entièrement produit par un laboratoire de microbiologie à partir de ses ingrédients individuels,
fournis par un fabricant de milieux microbiologiques
3.4 Terminologie relative aux micro-organismes test

3.4.1
souche test
micro-organisme utilisé en général pour les essais de performance des milieux de culture
Note 1 à l’article: les souches test sont définies en fonction de leur provenance (voir 3.4.2 à 3.4.7).
3.4.2
souche de référence
micro-organisme obtenu directement auprès d’une collection de cultures de référence, c’est-à-dire
une collection de cultures membre de la World Federation of Culture Collections (WFCC) (Fédération
mondiale des collections de cultures) ou de l’European Culture Collections Organisation (ECCO)
(Organisation européenne des collections de cultures), défini au moins par son genre et son espèce,
classé et décrit selon ses caractéristiques et issu, de préférence, de produits alimentaires, de produits
pour animaux, de l’environnement de production des aliments ou aliments pour animaux, ou d’eau, le
cas échéant
3.4.3
stock de référence
ensemble de cultures identiques distinctes obtenues à partir d’une subculture de la souche de référence
préparée au laboratoire ou obtenue auprès d’un fournisseur
3.4.4
culture mère
subculture primaire obtenue à partir d’un stock de référence
3.4.5
culture de travail
subculture issue d’un stock de référence, d’une culture mère ou d’un matériau de référence, certifié ou
non

ISO 11133:2014(F)

3.4.6
matériau de référence
MR
matériau contenant une quantité suffisamment homogène et stable de micro-organismes revivifiables
définie pour être adaptée à son application prévue dans un processus de mesurage
Note 1 à l’article: voir Référence [3].
3.4.7
matériau de référence certifié
MRC
matériau de référence caractérisé par une procédure métrologique validée pour la quantité de micro-
organismes revivifiables, accompagné d’un certificat donnant la valeur de la quantité spécifiée de micro-
organismes revivifiables, son incertitude associée et une déclaration de sa traçabilité métrologique
Note 1 à l’article: voir Référence [3].
4 Gestion de l’assurance qualité
4.1 Documentation
4.1.1 Documentation fournie par le fabricant ou par le producteur
Les informations suivantes doivent être disponibles auprès du fabricant ou du producteur (entités
commerciales ou non commerciales distribuant des milieux à des tiers):
— le nom du milieu, de ses composants individuels et des suppléments ainsi que, si possible, leurs
codes produit,
— la fiche technique, par exemple: formule, application prévue, contenance le cas échéant, références,
— la fiche de données de sécurité si nécessaire,
— le numéro de lot,
— la valeur du pH cible du milieu complet,
— les informations relatives au stockage et la date de péremption,
— la durée de conservation assignée,
— le certificat de contrôle qualité comprenant les souches test utilisées et les résultats des essais de
performance avec les critères d’acceptation.
4.1.2 Acceptation des produits à la livraison
Pour chaque lot de produit (ingrédient ou milieu de culture), vérifier:

— l’identification du produit,
— l’intégrité de l’emballage,
— la date de péremption du produit,
— la documentation fournie,
— le nombre d’unités reçues.
Consigner la date de réception.

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4.2 Stockage
4.2.1 Généralités
Dans tous les cas, suivre les instructions du fabricant.
4.2.2 Contrôle qualité et contrôle des milieux déshydratés et des suppléments
Les milieux sont livrés dans des emballages étanches, sous forme de poudre déshydratée ou de granulés
compactés. Les suppléments contenant différentes substances permettant la sélectivité ou le diagnostic,
sont fournis sous forme lyophilisée, liquide ou de poudre. Il convient d’organiser les approvisionnements
de manière à assurer une rotation régulière du stock (c’est-à-dire la méthode du premier entré, premier
sorti). Lorsqu’un emballage est ouvert
— vérifier l’étanchéité,
— enregistrer la date de la première ouverture, et
— évaluer visuellement le contenu des emballages ouverts.
Après l’ouverture d’un nouvel emballage, la qualité du milieu va dépendre des conditions de stockage.
Une diminution de la qualité des milieux déshydratés se traduit par un changement des caractéristiques
de fluidité du produit, de l’homogénéité, une prise en masse, des variations de couleur, etc. Tout milieu
déshydraté ayant pris l’humidité ou montrant des signes manifestes de changement d’aspect doit être
éliminé.
Lorsqu’un flacon de milieu déshydraté est ouvert, dater le contenant et indiquer une durée maximale de
stockage.
4.3 Préparation des milieux en laboratoire
La préparation précise des milieux de culture constitue l’une des étapes fondamentales pour garantir
l’intégrité de l’analyse microbiologique et doit faire l’objet d’une attention particulière.
Respecter les bonnes pratiques de laboratoire et les instructions du fabricant pour la manipulation des
milieux déshydratés et d’autres composants, notamment ceux contenant des substances dangereuses,
par exemple des sels biliaires, de l’azoture de sodium, des antibiotiques ou d’autres agents sélectifs.
Lorsque les milieux sont préparés à partir de formules déshydratées commerciales, observer de manière
stricte les instructions du fabricant. Consigner toutes les données importantes, par exemple le code, le
numéro de lot, la masse/le volume, la valeur du pH, la date de préparation, les conditions de stérilisation,
le nom de l’opérateur.
Pour les milieux préparés à partir de composants individuels, suivre précisément la formule. Enregistrer
tous les détails comme précédemment, ainsi que l’identité complète (c’est-à-dire le code, le numéro du
lot et la date de péremption si disponible) de tous les composants utilisés.
L’Annexe D donne un exemple de fiche d’enregistrement de ces informations.
4.3.2 Qualité des composants de base de milieux
La formule des composants de base de milieux est décrite dans les Normes internationales spécifiques
(voir Bibliographie). Lorsqu’ils sont disponibles, il convient que la masse moléculaire et le numéro de
registre CAS1) d’une substance chimique soient indiqués dans la formule.
1) ) Numéro CAS/Numéro de registre CAS: numéro d’identification unique du Chemical Abstracts Service (CAS)
attribué éléments chimiques, composés, polymères, séquences biologiques, mélanges et alliages.

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Il arrive parfois qu’un ingrédient particulier (par exemple, les ingrédients listés ci-après) spécifié dans
la formule doive être modifié afin d’obtenir une performance constante et homogène du milieu.
— les peptones ou les extraits de viande ou de levure en fonction de leurs propriétés nutritives,
— l’agar en fonction de son pouvoir gélifiant,
— les substances tampons,
— les sels biliaires, l’extrait de bile et le désoxycholate, les colorants antibactériens, en fonction de
leurs propriétés sélectives,
— les indicateurs colorés,
— les antibiotiques, en fonction de leur activité et de leurs interactions avec les autres ingrédients.
NOTE À l’échelle industrielle, les fabricants indiquent en général que la formule est optimisée afin de satisfaire
aux critères de performance requis. Il est d’usage courant de sélectionner d’abord l’ingrédient, puis d’ajuster la
concentration d’un lot à l’autre afin d’obtenir la même performance et de minimiser les variations inter-lots.
4.3.3 Eau
Pour la préparation des milieux de culture, utiliser uniquement de l’eau purifiée, c’est-à-dire de l’eau
distillée, déminéralisée, déionisée ou produite par osmose inverse, ou de l’eau de qualité équivalente
exempte de substances susceptibles d’inhiber ou d’influencer la croissance des micro-organismes dans
les conditions d’essai, par exemple, des traces de chlore, d’ammoniac et d’ions métalliques.
L’eau purifiée doit être stockée dans des contenants hermétiquement fermés constitués d’un matériau
inerte (verre neutre, polyéthylène, etc.) exempt de toute substance inhibitrice. Il est cependant
recommandé d’utiliser l’eau dès sa production.
Il convient que la contamination microbienne ne dépasse pas 103 unités formant colonies (UFC)/
ml et qu’elle soit, de préférence, inférieure à 102 UFC/ml. Il convient de contrôler régulièrement
la contamination microbienne conformément à l’ISO 6222[4] avec incubation à 22 °C ± 1 °C pendant
68 h ± 4 h ou en utilisant une méthode équivalente.
NOTE L’eau passée à travers un échangeur d’ions (déminéralisée) peut avoir une teneur en micro-organismes
très élevée. Il est donc conseillé de ne pas utiliser ce procédé sans vérifier la teneur microbienne de l’eau. Consulter le
fabricant afin de connaître le meilleur moyen de minimiser la contamination microbienne. Une eau déminéralisée
fortement contaminée, même stérilisée par filtration, peut encore contenir des substances pouvant inhiber la
croissance de certains micro-organismes.
Sauf exigence contraire, requise pour des raisons de conception, la conductivité de l’eau utilisée au
laboratoire ne doit pas être supérieure à 25 µScm−1 (ce qui équivaut à une résistivité ≥ 0,04 MΩ cm) et
de préférence inférieure à 5 µScm−1 (eau de qualité 3, voir ISO 3696[5]) à 25 °C. Il convient de vérifier la
conductivité de l’eau avant utilisation.
4.3.4 Pesée et réhydratation
En suivant les précautions de sécurité appropriées, peser soigneusement la quantité nécessaire de

milieu déshydraté ou d’ingrédients individuels et mélanger en ajoutant progressivement le volume d’eau
nécessaire pour éviter la formation d’agrégats. Utiliser une balance suffisamment précise. Il convient
que les erreurs maximales admissibles soient de 1 % ou moins, comme indiqué dans l’ISO 7218 et
l’ISO 8199. Sauf indication contraire, les ingrédients sont ajoutés au volume d’eau spécifié, plutôt que de
compléter ce volume.
4.3.5 Dissolution et dispersion
Les milieux déshydratés, exigeant une dispersion rapide, doivent être agités à intervalles réguliers ou
en continu, puis chauffés si nécessaire pour être dissous. Il convient de laisser s’humidifier les milieux
contenant de la gélose pendant plusieurs minutes avant de les chauffer tout en homogénéisant pour

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favoriser la dissolution puis à les répartir si nécessaire avant autoclavage. Éviter toute surchauffe du
milieu.
4.3.6 Mesure et ajustement du pH
Mesurer le pH à l’aide d’un pH-mètre et l’ajuster avant stérilisation, si nécessaire, de sorte qu’après
stérilisation et refroidissement jusqu’à 25 °C le milieu soit au pH demandé à ± 0,2 unité pH près, sauf
indication contraire. L’ajustement est en général effectué avec une solution d’hydroxyde de sodium
(NaOH) à environ 40 g/l [c (NaOH) = 1 mol/l] ou avec une solution d’acide chlorhydrique dilué (HCl) à
environ 36,5 g/l [c (HCl) environ 1 mol/l]. Si l’ajustement est effectué après la stérilisation, utiliser une
solution stérilisée. Des informations supplémentaires relatives au mesurage du pH sont données dans
l’ISO 7218 et l’ISO 8199.
NOTE Les milieux de culture commerciaux peuvent subir des changements de pH significatifs avant et après
le passage en autoclave. Toutefois, si une eau distillée ou déionisée de bonne qualité est utilisée, l’ajustement du
pH avant autoclavage n’est généralement pas nécessaire.
4.3.7 Répartition
Répartir le milieu dans des contenants appropriés afin de s’assurer qu’un espace de tête suffisant est
laissé pour éviter un débordement durant le processus de refroidissement après traitement thermique
par autoclavage ou régénération ou un débordement après l’ajout de suppléments.
NOTE Cet espace de tête peut ne pas être nécessaire si la pression dans l’autoclave est maintenue durant le
processus de refroidissement.
4.3.8 Stérilisation
4.3.8.1 Généralités
Stériliser les milieux de culture préparés le jour de la préparation.

La stérilisation des milieux de culture et des réactifs est en général réalisée par chaleur humide (4.3.8.2)
ou par filtration (4.3.8.3).
Certains milieux ne nécessitent pas d’autoclavage mais peuvent être utilisés après avoir été portés
à ébullition. Par exemple, les milieux pour Enterobacteriaceae contenant du vert brillant sont
particulièrement sensibles à la chaleur et à la lumière. Il convient de les refroidir rapidement après
ébullition et de les protéger contre toute lumière vive. Certains réactifs peuvent être utilisés sans
stérilisation. Dans tous les cas, se référer à la Norme internationale appropriée ou aux instructions du
fabricant.
4.3.8.2 Stérilisation par chaleur humide
La stérilisation par chaleur humide est effectuée en autoclave ou dans un préparateur de milieux.
Pour les contenants ayant des volumes supérieurs à 1 000 ml, adapter le cycle de stérilisation de
l’autoclave si nécessaire afin de garantir un traitement thermique adéquat. Dans tous les cas, suivre les
instructions données dans la Norme internationale appropriée ou par le fabricant.
NOTE Une surchauffe peut se produire lorsque de grandes quantités de milieu (> 1 000 ml) sont autoclavées.
Après la phase de chauffage, il est essentiel de refroidir le milieu de manière à empêcher tout débordement.
Cela est particulièrement important pour les grandes quantités de milieu et les milieux contenant des
ingrédients sensibles à la chaleur, par exemple, les milieux contenant du vert brillant.
Des informations supplémentaires relatives à la stérilisation par chaleur humide sont données dans
l’ISO 7218 et dans la Référence [11].

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Il convient d’évaluer la stérilisation par la chaleur en utilisant les valeurs F0, en tenant compte du
traitement thermique pendant le chauffage et le refroidissement. Il est recommandé de définir le
traitement thermique pour la charge spécifique à traiter afin de garantir un traitement approprié aux
contenants, indépendamment de leur emplacement dans l’autoclave.
4.3.8.3 Stérilisation par filtration
La stérilisation par filtration peut être réalisée sous vide ou sous pression. Utiliser un équipement stérile
et des membranes de 0,2 μm de porosité. Stériliser l’appareil de filtration conformément à l’ISO 7218 ou
à l’ISO 8199 ou utiliser un équipement stérilisé au préalable.
Certaines membranes filtrantes peuvent retenir les protéines ou d’autres substances (comme les
antibiotiques). Pour obtenir la bonne concentration, il convient que l’utilisateur choisisse un type
de membrane adéquat, par exemple, une membrane à faible taux d’adsorption des protéines et qu’il
humidifie préalablement le filtre.
4.3.9 Préparation des suppléments
ATTENTION — Les suppléments contenant des agents toxiques, en particulier des antibiotiques,
doivent être soigneusement manipulés en évitant toute dispersion de poudre, laquelle pourrait
entraîner des réactions allergiques ou d’autres réactions parmi le personnel de laboratoire.
Prendre les précautions de securité nécessaires et suivre les instructions du fabricant lors de la
préparation des solutions.
Ne pas dépasser la durée de conservation indiquée, qui est en général le jour-même pour les solutions de
travail constituées d’antibiotiques. Dans certaines conditions, les solutions contenant des antibiotiques
peuvent être stockées congelées en aliquotes, mais il convient de ne pas les recongeler après décongélation.
La perte potentielle d’activité due à la congélation doit être établie avec le fabricant ou évaluée par
l’utilisateur.
4.4 Stockage et durée de conservation des milieux préparés
4.4.1 Milieux commerciaux
Suivre les instructions du fabricant concernant les conditions de stockage, la date de péremption et
l’utilisation.
4.4.2 Milieux préparés en laboratoire
Identifier tous les milieux de façon à garantir leur traçabilité.

La durée de conservation de différents milieux est variable. Les Normes nationales ou les Normes
internationales spécifiques peuvent stipuler des conditions et une durée de conservation particulières,
mais celles-ci doivent faire l’objet d’une vérification par le laboratoire. La fréquence de vérification doit
être spécifiée par le laboratoire.
Stocker les milieux dans des conditions empêchant la modification de leur composition, à savoir à l’abri
de la lumière et de la dessiccation. S’ils ne sont pas utilisés immédiatement ou sauf spécification contraire
dans la norme spécifique, stocker dans un réfrigérateur à (5 ± 3) °C.
En cas de réfrigération, il est en général recommandé de ne pas dépasser une durée de stockage comprise
entre deux et quatre semaines, pour les boîtes, et entre trois et six mois, pour les flacons et les tubes
scellés, sauf indication contraire dans les normes spécifiques ou si des résultats d’évaluation de la durée
de conservation obtenus en laboratoire indiquent qu’il est possible de les conserver plus longtemps. Des
informations supplémentaires relatives aux durées de stockage maximales des milieux préparés sont
données dans l’ISO 8199, la Référence [17] et la Référence [21].

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Il est recommandé d’utiliser extemporanément les milieux auxquels ont été ajoutés des suppléments
labiles, sauf indication contraire dans les normes spécifiques ou si des résultats d’évaluation de la
durée de conservation obtenus en laboratoire confirment qu’une durée de conservation plus longue est
appropriée (4.4.2.2). Il convient de ne pas stocker en vrac les milieux solides contenant des substances
labiles et/ou des composés chimiquement réactifs dans le but d’une régénération ultérieure.
Avant utilisation ou chauffage ultérieur, il est recommandé de laisser les milieux de culture revenir à la
température ambiante.
4.4.2.2 Évaluation de la durée de conservation
La date de péremption des milieux stockés doit être établie en vérifiant les caractéristiques de
performance physique, chimique et microbiologique des milieux décrites dans la présente Norme
internationale, une fois écoulée la durée de stockage définie. La fréquence des vérifications doit être
spécifiée par le laboratoire.
Vérifier l’absence de variation de couleur, de signe d’évaporation/déshydratation, de changement de
pH ou de productivité ou sélectivité et spécificité inacceptables, le cas échéant. La date de péremption
doit être fondée sur la durée de stockage pendant laquelle toutes les caractéristiques de performance
décrites ci-dessus restent acceptables.
NOTE Ces vérifications sont également adaptées lors de la première utilisation de milieux commerciaux.
4.4.2.3 Stockage des milieux en boîte de Petri
Utiliser immédiatement le milieu solidifié ou le conserver à l’envers dans des conditions évitant toute
détérioration et déshydratation, c’est-à-dire à l’abri de la lumière et/ou au réfrigérateur à (5 ± 3) °C.
Marquer les boîtes sur la partie inférieure ou la tranche en indiquant la date de préparation et/ou de
péremption et l’identité du milieu. D’autres systèmes de codage répondant à ces exigences peuvent être
utilisés.
La durée de conservation des boîtes coulées est prolongée lorsqu’elles sont stockées dans des sacs
étanches ou des sacs en cellophane. Afin de minimiser la condensation, les boîtes doivent être refroidies
avant d’être placées dans les sacs. Ne pas sécher la surface des géloses avant un stockage réfrigéré.
4.5 Préparation avant utilisation
4.5.1 Fusion des milieux de culture gélosés
Faire fondre les milieux de culture en les plaçant dans un bain d’eau bouillante ou par tout autre procédé
donnant des résultats identiques (par exemple, en autoclave à vapeur fluante, comme spécifié dans
l’ISO 7218, dans l’ISO 8199). Il convient de régénérer les milieux ayant déjà été autoclavés pendant une
durée minimale afin de maintenir leur qualité. Éviter de surchauffer les milieux et les retirer dès qu’ils
sont fondus. Laisser reposer sur une surface thermorésistante à température ambiante pendant un
court instant, par exemple 2 min, avant de le refroidir dans un bain d’eau afin d’éviter de casser le verre.
Il convient de dévisser légèrement les bouchons des contenants avant le chauffage et de les revisser
après retrait de la source de chaleur.
Laisser refroidir le milieu en surfusion dans un bain d’eau thermostaté à une température comprise
entre 47 °C et 50 °C. Le temps nécessaire à l’obtention d’une température comprise entre 47 °C et 50 °C
dépend du type de milieu, du volume et du nombre de récipients dans le bain d’eau. Il convient d’utiliser
les milieux en surfusion aussi vite que possible et de ne pas les conserver plus de 4 h. Dans le cas de
milieux particulièrement sensibles, la durée de maintien des milieux en surfusion doit être réduite,
comme spécifié dans la Norme internationale applicable. Les milieux inutilisés ne doivent pas être
solidifiés et réutilisés ultérieurement.

ISO 11133:2014(F)

Déterminer et consigner la température de régénération en plaçant un thermomètre dans le milieu

gélosé contenu dans un conditionnement distinct mais semblable à celui utilisé pour le milieu d’essai. Le
choix du thermomètre dépendra du nombre et de la taille des récipients dans le bain d’eau.
NOTE Les milieux utilisés dans les méthodes d’ensemencement en profondeur qui sont ajoutés à l’échantillon
sont régénérés à une température comprise entre 44 °C et 47 °C, ou comme spécifié dans la Norme internationale
applicable. Utiliser un bain d’eau à une température comprise entre 44 °C et 47 °C. Des informations supplémentaires
relatives à l’utilisation et à la vérification de bain d’eau sont données dans l’ISO 7218.
4.5.2 Désaération des milieux de culture
Si nécessaire pour fournir la teneur correcte en air/oxygène, juste avant l’utilisation, chauffer le milieu
de culture dans l’eau bouillante ou sous un courant de vapeur pendant 15 min, avec les couvercles ou
les bouchons légèrement dévissés. Après chauffage, revisser les bouchons et refroidir rapidement les
milieux à la température d’utilisation.
4.5.3 Ajout de suppléments
Il convient d’ajouter les suppléments thermolabiles dans un milieu revenu à une température inférieure
à 50 °C. Si le milieu contient de la gélose, laisser le supplément stérile revenir au moins à la température
ambiante avant de l’ajouter au milieu gélosé. L’ajout de suppléments liquides froids peut entraîner une
gélification du milieu ou la formation d’agrégats transparents et empêcher la bonne dispersion. Suivre
les instructions du fabricant. Bien mélanger tous les suppléments au milieu avec précaution, puis répartir
dans les contenants finaux aussi vite que possible.
4.5.4 Préparation des milieux solides en boîtes de Petri
Couler le milieu de culture gélosé en surfusion dans les boîtes de Petri de façon à obtenir une épaisseur
d’au moins 3 mm (pour des boîtes d’un diamètre de 90 mm, 18 ml à 20 ml de gélose sont normalement
nécessaires) ou selon les spécifications de la Norme internationale appropriée. Si les boîtes sont stockées
ou si l’incubation est prolongée au-delà de 72 h ou bien si la température d’incubation est supérieure
à 40 °C, une quantité plus importante de milieu de culture peut être nécessaire. Laisser refroidir et
solidifier le milieu gélosé en plaçant les boîtes avec les couvercles en place sur une surface fraîche et
horizontale.
Il convient de stocker et d’utiliser les milieux gélosés commerciaux prêts à l’emploi selon les instructions
du fabricant.
4.5.5 Préparation des milieux en boîtes pour l’ensemencement
Pour l’ensemencement en surface de milieux de culture solides, sécher les boîtes rapidement avant
utilisation jusqu’à disparition des gouttelettes à la surface du milieu. Ne pas dessécher les boîtes.
Les points suivants sont importants pour le séchage des boîtes.
— Le degré d’humidité dans les milieux de culture est important car la croissance optimale des
bactéries dépendra des conditions d’humidité dans le milieu et en surface. Une perte d’humidité
importante peut par exemple entraîner une augmentation des concentrations d’inhibiteurs dans les
milieux de culture sélectifs et une réduction de l’activité de l’eau à la surface du milieu.
— Lorsque des bactéries qui ne se propagent pas facilement sont cultivées et que les boîtes semblent
sèches après acclimatation, les circonstances sont telles qu’un séchage n’est pas toujours nécessaire.
Dans ce cas, le séchage peut être omis, car il ne fait qu’augmenter la probabilité de contamination et
de perte d’humidité inutile.
— Sélectionner la température et le temps de séchage de sorte que la probabilité de contamination
reste aussi faible que possible et que le chauffage n’ait pas d’influence négative sur la qualité du
milieu de culture. Le temps de séchage dépendra du degré de condensation présente dans la boîte
de Petri, mais doit rester aussi court que possible.

ISO 11133:2014(F)

— Afin d’éviter toute contamination et si les boîtes ne sont pas séchées sous une hotte à flux d’air
laminaire, les boîtes doivent toujours être séchées avec la surface du milieu de culture à ensemencer
orientée vers le bas.
Dans la pratique, les boîtes peuvent être séchées en les plaçant avec les surfaces de la gélose vers le bas
et avec les couvercles à moitié ouverts dans une hotte réglée à une température comprise entre 25 °C
et 50 °C. Sécher les boîtes jusqu’à disparition des gouttelettes à la surface des couvercles. Ne pas sécher
davantage. Les boîtes de gélose peuvent également être séchées avec la surface de la gélose vers le haut
dans une hotte de sécurité à flux laminaire (à température ambiante) pendant 30 min à 60 min, ou toute
une nuit à température ambiante avec les couvercles en place.
4.6 Incubation des milieux solides en boîtes de Petri

Durant l’incubation, il se produit une perte d’humidité des milieux gélosés. Cette perte peut, dans
certaines circonstances, altérer la croissance des micro-organismes. Les facteurs influençant la perte
d’humidité sont la composition du milieu, la quantité de milieu dans les boîtes, le type d’incubateur
(c’est-à-dire ventilé ou autre), l’humidité de l’atmosphère dans l’incubateur, la position et le nombre de
boîtes dans l’incubateur ainsi que la température d’incubation. La perte d’humidité peut être réduite
en empilant les boîtes (jusqu’à 6 boîtes par pile) dans des sacs plastiques ouverts (afin d’éviter une
condensation excessive). L’humidité de l’air peut également être augmentée en plaçant un contenant
d’eau ouvert dans le fond des incubateurs. Il convient de changer l’eau et de désinfecter fréquemment les
contenants afin d’éviter toute contamination fongique.
4.7 Mise au rebut des milieux

Les milieux contaminés et inutilisés doivent être éliminés d’une manière sûre et qui respecte les
réglementations locales ou nationales.
5 Souches test pour essais de performance
5.1 Généralités
Les nouvelles normes et les normes révisées doivent spécifier les essais de performance des milieux de
culture, y compris la spécification des souches de contrôle et les critères d’acceptation, conformément
aux exigences de l’Annexe J.
5.2 Sélection des souches test

Il convient qu’un panel de souches test contienne uniquement des micro-organismes présentant des
caractéristiques stables, représentatives de leur espèce et dont l’adéquation a été démontrée pour
soumettre à essai les performances optimales d’un milieu particulier préparé en laboratoire. Il convient
que ces souches test comprennent principalement des souches largement disponibles dans des collections
de cultures de référence, mais il est également possible d’y ajouter des souches bien caractérisées isolées
par le laboratoire. Il est préférable d’utiliser des souches d’origine alimentaire ou provenant d’eaux, bien
que toutes les collections de culture ne fournissent pas ces données relatives à l’origine des souches.
Le laboratoire doit examiner et enregistrer les caractéristiques principales du stock de référence. Si une
variabilité des souches est détectée, étudier les effets possibles du milieu de culture en se procurant le
même milieu auprès d’un fabricant différent et se procurer une culture de référence supplémentaire
issue de la collection de cultures dans laquelle elle a été déposée à l’origine.
IMPORTANT — Les utilisateurs sont tenus de fournir toutes les informations pertinentes relatives
à la variabilité des souches au GT 5, Milieux de culture, de l’ISO/TC 34/SC 9 via le secrétariat de
l’ISO/TC 34/SC 9.
Les micro-organismes test pour chaque milieu peuvent comprendre:
— des souches robustes positives présentant des caractéristiques typiques de l’organisme cible,

ISO 11133:2014(F)

— des souches faiblement positives,

— des souches négatives ne présentant pas les caractéristiques attendues de l’organisme cible
(caractéristiques négatives),
— des souches partiellement ou complètement inhibées.
L’Annexe E indique les micro-organismes test à utiliser dans les Normes internationales spécifiées de
microbiologie alimentaire et l’Annexe F indique les micro-organismes test à utiliser dans les Normes
internationales spécifiées de microbiologie des eaux.
NOTE Certaines restrictions et directives nationales exigent d’utiliser de sérovars différents de ceux spécifiés
dans ces tableaux. Se référer aux exigences nationales relatives au choix des sérovars de Salmonella.
5.3 Conservation et entretien des souches test
Plusieurs méthodes, telles que la lyophilisation, le stockage sur billes à – 70 °C ou sous azote liquide,
permettent de conserver et d’entretenir correctement l’ensemble des micro-organismes utilisés en
microbiologie alimentaire et des eaux. Une même méthode peut ne pas être appropriée à toutes les
souches. Des méthodes supplémentaires de conservation des micro-organismes sont données.[14][15][36]
[37][38]
Il convient de documenter le nombre de transferts des souches test afin d’empêcher un nombre de
repiquages excessif augmentant le risque d’altération phénotypique. Un passage est défini comme un
transfert d’une culture viable à un milieu frais avec croissance des micro-organismes. Toute forme de
repiquage est considérée comme une forme de transfert/passage. Des informations supplémentaires
sont disponibles.[27][28][35][38]
Voir les logigrammes (Figures B.1 et B.2) et les informations supplémentaires concernant l’entretien et
la préparation données à l’Annexe B.
5.3.2 Souches test provenant de sources commerciales
Si les souches test sont obtenues à partir de collections de référence ou auprès de fournisseurs certifiés
ISO 9001[2] ou ayant obtenu une autre certification appropriée et qu’elles sont conservées dans leur
contenant d’origine, les instructions des fabricants relatives à leur culture et à leur utilisation doivent
être appliquées.
Il convient que le laboratoire vérifie si la souche fournie est une souche de référence ou un stock de
référence ainsi que le nombre de passages subis avant sa réception et la documentation des informations.
Il est également recommandé que le laboratoire vérifie que les caractéristiques attendues sont présentes.
5.3.3 Stocks de référence préparés au laboratoire
Les cultures de stocks de référence préparées à partir de souches de référence (voir Figure B.1) destinées
aux essais de performance doivent être conservées et manipulées de façon à réduire au minimum les
risques de contamination croisée, de mutation ou d’altération des caractéristiques typiques. Il convient
de conserver les stocks de référence en plusieurs aliquotes, en général soit surgelées, par exemple en
dessous de – 70 °C, soit lyophilisées. À une température plus élevée, la durée de viabilité peut être réduite
et une modification génétique peut survenir.
Il convient de documenter leurs caractéristiques de croissance pour chacun des milieux sur/dans
lesquels ils seront utilisés comme souches test.
Les stocks de référence ne doivent pas être utilisés pour préparer des souches de référence.

ISO 11133:2014(F)

5.3.4 Cultures mères
Les cultures mères sont habituellement préparées à partir de stocks de référence lyophilisés ou surgelés
(voir Figure B.2). Les aliquotes doivent être manipulées de manière à éviter la contamination croisée
du stock de référence et/ou sa détérioration. Il convient de préparer les cultures mères en remettant en
suspension une aliquote du stock de référence dans un milieu de croissance non sélectif; incuber jusqu’à
la phase stationnaire.
Voir 5.3.3 pour les exigences de stockage et de documentation.
Pour les systèmes de conservation disponibles dans le commerce, les instructions du fabricant doivent
être rigoureusement suivies.
Les cultures mères ne doivent pas être utilisées pour préparer des souches de référence ou des stocks
de référence.
5.3.5 Cultures de travail
Les cultures de travail sont préparées à partir de cultures mères ou de stocks de référence et utilisées
afin de préparer des inocula pour les essais.
Les cultures de travail ne doivent pas être utilisées pour préparer des souches de référence, des stocks
de référence ou des cultures mères, ou pour produire d’autres cultures de travail.
5.4 Micro-organismes pour essais de performance
Les micro-organismes adaptés aux essais de performance de routine sont listés aux Annexes E et F.
Les volumes d’inocula et le nombre d’organismes utilisés sont critiques, voir 5.4.2.4 et 5.4.2.5.
Les indications suivantes sont données à titre d’exemple de modes opératoires adaptés à la production
d’inocula normalisés pour le contrôle qualité des milieux. Ces modes opératoires s’appliquent en règle
générale, mais certains organismes peuvent nécessiter des conditions spéciales de préparation, par
exemple les anaérobies, les moisissures, les organismes halophiles, osmophiles ou xerophiles ainsi que
les organismes ayant une croissance ou des exigences nutritionnelles spéciales.
5.4.2 Préparation
5.4.2.1 Préparation des cultures mères
Lorsque cela est nécessaire, ensemencer un milieu solide, par exemple gélose tryptone soja (TSA) ou TSA
au sang, à partir du stock de référence de sorte à obtenir des colonies individuelles. Faire incuber dans
des conditions adéquates, par exemple, entre 18 h et 24 h à 37 °C pour la plupart des bactéries aérobies.
Inspecter la pureté de cette culture mère solide et l’utiliser pendant une durée déterminée (par exemple,
pendant 14 jours à une température appropriée afin d’empêcher tout changement significatif, selon
l’organisme).
5.4.2.2 Préparation des cultures de travail
Les cultures de travail doivent être préparées à partir du stock de référence (ou lorsque cela est
nécessaire, à partir de la culture mère) comme une culture pure en phase stationnaire dans un bouillon
non sélectif. Pour la plupart des bactéries aérobies, cette préparation est normalement obtenue par une
incubation pendant 18 h à 24 h.

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La culture de travail peut être préparée à partir d’un matériau de référence commercial, MR ou MRC, ou
être préparée par le laboratoire. La concentration de la suspension préparée doit être stable et homogène
pendant sa période d’utilisation.[7][10][11][21][29][30]
Différentes techniques peuvent être utilisées, mais la pureté de l’inoculum doit être garantie et l’inoculum
doit être normalisé, ce qui permet de l’utiliser ultérieurement.
En fonction de la taille des colonies, prélever une ou deux colonies du milieu de culture mère à l’aide
d’une anse de prélèvement. Il est recommandé d’utiliser une anse de 1 µl pour éviter un inoculum trop
lourd.
Transférer l’inoculum au milieu liquide non sélectif, par exemple bouillon de trytone soja (TSB) et
mélanger soigneusement à l’aide d’un agitateur vortex.
Faire incuber dans des conditions adéquates et pendant une durée appropriée (par exemple, entre 18 h
et 24 h à 37 °C pour la plupart des bactéries aérobies).
Utiliser cette culture de travail pendant une durée déterminée (par exemple, pendant trois jours
maximum à une température appropriée afin d’empêcher tout changement significatif, selon l’organisme).
Pour la préparation et le stockage de spores bactériennes et fongiques en tant que cultures de travail,
voir Références [10][11][24][25][30]
5.4.2.3 Préparation de suspensions (inocula) pour l’essai
Préparer des dilutions en série dans un diluant approprié (par exemple, solution de Ringer diluée au
quart, solution peptone-sel) et utiliser l’étape de dilution la plus appropriée pour le nombre d’organismes
souhaité (UFC) dans un volume spécifié.
Il convient de déterminer la dilution appropriée à utiliser en tant qu’inoculum d’essai à partir d’essais
antérieurs effectués dans des conditions strictement standardisées pour toutes les étapes.
Utiliser les suspensions (inocula) pendant une durée déterminée (par exemple jusqu’à 2 h à température
ambiante ou dans les 24 h si elles sont stockées à (5 ± 3) °C. Des périodes de stockage plus longues
peuvent être acceptables si elles sont validées [10][21]).
Des inocula congelés peuvent être utilisés s’il peut être démontré que les micro-organismes peuvent
survivre pendant la période choisie.
5.4.2.4 Volumes d’inocula
Les volumes d’inocula utilisés pour les essais de performance quantitatifs doivent refléter ceux utilisés
dans les conditions d’essai pour les milieux en question.
Pour les diluants et les milieux liquides utilisés pour les essais quantitatifs, le volume de l’inoculum
doit être dans les mêmes proportions que celles utilisées dans la Norme internationale spécifique. En
général, il représente 10 % du milieu soumis à essai.
5.4.2.5 Niveau d’inoculum
5.4.2.5.1 Niveau d’inoculum pour les essais de productivité
5.4.2.5.1.1 Essais quantitatifs
Pour l’essai de dénombrement quantitatif, un niveau d’environ 102 UFC est nécessaire afin d’obtenir une
précision suffisante (voir Tableau 1). Cela peut nécessiter l’utilisation de plusieurs replicats de boîtes.
Il convient d’utiliser une plage de 80 UFC à 120 UFC par boîte avec un nombre minimal de 50 UFC par
boîte. Pour les filtres, le même nombre d’UFC est nécessaire en utilisant un ou plusieurs filtres. Le
Tableau 1 montre les intervalles de confiance à 95 % relatifs aux nombres de colonies.

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Pour les essais quantitatifs des diluants et des milieux de transport liquides, un inoculum de 103 UFC
à 104 UFC est nécessaire afin d’obtenir un inoculum d’environ 100 UFC dans le volume réparti dans les
boîtes.
Tableau 1 — Intervalles de confiance à 95 % environ relatifs aux nombres de colonies dans
l’hypothèse de la loi de distribution de Poisson[21][26]
Limite de précision
Nombre de colonies
(au % le plus proche) Limites de confiance à 95 % environ
dénombrées
%
500 ±9 455 à 545
400 ± 10 360 à 440
320 ± 11 284 à 356
200 ± 14 172 à 228
100 ± 20 80 à 120
80 ± 22 62 à 98
50 ± 28 36 à 64
30 ± 37 19 à 41
20 ± 47 11 à 29
16 ± 50 8 à 24
10 ± 60 4 à 16
6 ± 83 1 à 11
5.4.2.5.1.2 Essais qualitatifs
Il convient que le volume utilisé pour les essais contienne

— 103 UFC à 104 UFC pour les essais qualitatifs des milieux en boîtes,
— ≤ 100 UFC pour les essais de productivité des milieux de pré-enrichissement et d’enrichissement,
— 104 UFC à 106 UFC pour les essais qualitatifs des milieux de transport solides.
5.4.2.5.2 Niveau d’inoculum pour les essais de sélectivité
Pour évaluer la sélectivité d’un milieu de culture, une suspension du micro-organisme non cible
contenant 104 UFC à 106 UFC est utilisée pour ensemencer les boîtes ou les tubes.
5.4.2.5.3 Niveau d’inoculum pour les essais de spécificité
Pour les essais qualitatifs de spécificité des milieux en boîtes, un inoculum de 103 UFC à 104 UFC est
nécessaire.
5.4.2.6 Incubation
Incuber les milieux de culture ensemencés conformément aux conditions décrites dans la Norme
internationale applicable. L’Annexe E indique les conditions d’incubation à utiliser dans les Normes
internationales de microbiologie alimentaire spécifiées et l’Annexe F indique les conditions d’incubation
à utiliser dans les Normes internationales de microbiologie des eaux spécifiées.
Pour éviter la perte d’humidité dans les milieux gélosés pendant l’incubation, voir 4.6.

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Il convient d’utiliser le temps d’incubation admissible le plus court possible indiqué dans la Norme
internationale pour le ou les organismes cibles. Il est en revanche recommandé d’utiliser le temps
d’incubation le plus long pour déterminer la sélectivité.[10]
6 Contrôle qualité et essais de performance des milieux de culture
6.1 Exigences générales

Les paragraphes suivants décrivent les exigences relatives à l’ensemble des milieux de culture. Ils
s’appliquent indépendamment de la taille du lot.
Dans la pratique, les échantillons peuvent contenir des micro-organismes stressés. Il convient de prendre
en compte l’aptitude du milieu à récupérer les cellules stressées.[21][31][32][33]
La qualité des milieux dépend de la qualité de leurs ingrédients de base, de leur bonne formulation, de
la qualité des modes opératoires de préparation, de l’élimination de la contamination microbienne et de
l’adéquation de l’emballage et des conditions de stockage.
Le contrôle qualité des milieux doit être adapté à leur usage prévu (par exemple, qualitatif ou quantitatif).
Avant utilisation, les performances de chaque lot de milieu de culture doivent être soumises à essai en
fonction des catégories de milieux décrites en 6.4. Si les essais avant l’utilisation ne sont pas possibles en
raison de la labilité du milieu ou du supplément, des essais de performance parallèlement aux essais des
échantillons doivent être effectués.
6.2 Contrôle de la qualité physique et chimique

Les milieux de culture finis doivent être conformes aux caractéristiques physico-chimiques spécifiées
dans les normes applicables. En outre, l’évaluation de la qualité par examen visuel doit permettre de
garantir la conformité de chaque milieu de culture aux recommandations établies, par exemple
— le volume de remplissage et/ou l’épaisseur,
— l’aspect, la couleur et l’homogénéité,
— la consistance du gel, et
— le taux d’humidité,
De plus, la valeur du pH doit être déterminés.
Les composants individuels et les suppléments nutritifs ou sélectifs doivent également être soumis à des
modes opératoires d’évaluation de la qualité appropriés.
6.3 Contrôle de la qualité microbiologique
Les essais de performance microbiologique doivent être effectués sur un échantillon représentatif du lot
du produit fini.[6][8][9][21]
6.3.2 Milieu de référence
Afin de garantir la fiabilité des résultats des essais de performance, le milieu de référence utilisé doit
être de haute qualité.
Des exemples des aspects à prendre en compte par l’utilisateur sont les suivants:
— utilisation d’un MR quantitatif (voir 3.4.6) contenant un nombre bien défini d’organismes lors de
l’évaluation d’un milieu de référence,

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— utilisation d’un processus de production défini incluant la régénération, le cas échéant,

— approvisionnement auprès du même fabricant/de la même source pour la fourniture du milieu/des
ingrédients,
— utilisation d’une gamme plus large de souches test à la première utilisation (pour couvrir la gamme
d’organismes recherchée),
— choix du «milieu de référence» à des fins d’évaluation,
— méthodes appropriées afin de garantir la qualité lors d’une utilisation en tant que milieu de référence.
Il pourrait ne pas être nécessaire d’inclure tous les aspects mentionnés ci-dessus lors de l’évaluation de
l’adéquation du milieu de référence. Le laboratoire doit justifier la méthode choisie.
Des souches test, une méthode de contrôle et des critères d’acceptation appropriés pour le milieu de
référence gélose tryptone soja (TSA) sont décrits aux Annexes E et F. D’autres milieux de référence non
sélectifs peuvent être utilisés si les critères ci-dessus sont satisfaits.
6.3.3 Contamination microbienne
Une quantité de chaque lot de milieu adaptée à sa taille doit être soumise à essai pour évaluer l’absence
de contamination microbienne (stérilité) par incubation dans des conditions appropriées.
Au moins une boîte ou un tube doit être soumis à essai pour les petits lots (< 100 unités). Pour les lots plus
importants, les producteurs doivent établir des spécifications, par exemple, fondées sur les composants
des milieux, les paramètres et les limites liés aux procédés et le type d’emballage en utilisant un niveau
de qualité acceptable approprié. Des informations supplémentaires sont données dans l’ISO 2859-1,[6],
dans d’autres normes nationales ou d’autres sources.[9][21]
Les critères d’acceptation doivent être établis et justifiés pour chaque milieu.
6.4 Exigences générales relatives aux essais de performance microbiologique
Pour le contrôle d’un lot de milieu de culture complet, d’ingrédients nutritifs ou de suppléments, la
croissance doit être évaluée de façon adéquate par des méthodes quantitatives ou qualitatives comme
décrit dans la présente Norme internationale.
Des milieux de culture solides, semi-solides ou liquides doivent être ensemencés avec un volume
approprié (5.4.2.4) de la culture de travail de chaque micro-organisme test défini à l’aide d’un instrument
adapté et en suivant la technique d’ensemencement décrite dans les Normes internationales applicables,
voir Annexes E et F.
Des méthodes d’essai quantitatives et qualitatives pour les milieux de culture solides et liquides sont
données à titre d’exemple dans la présente Norme internationale. Chacune des méthodes décrites peut
être choisie et il n’est pas nécessaire d’utiliser l’ensemble des méthodes.
Lorsque les milieux de culture sont prévus à des fins de dénombrement, des méthodes d’essai
quantitatives doivent être appliquées.
Lorsqu’un nouveau milieu ou un nouveau fournisseur est évalué, il est recommandé d’appliquer des
méthodes d’essai quantitatives afin de fournir des informations supplémentaires permettant de justifier
le changement.
Les interactions conduisant à la croissance de micro-organismes sur des milieux sélectifs liquides sont
plus complexes. C’est pourquoi il est plus difficile de définir des méthodes d’essai de performance pour
ces milieux que pour les milieux solides.
Pour les essais de combinaisons de milieux solides avec membranes filtrantes, utiliser l’ISO 7704.

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Les techniques microbiologiques générales sont supposées connues et les méthodes ne sont donc pas
décrites en détail de façon exhaustive.
Des micro-organismes test, des méthodes de contrôle et des critères d’acceptation appropriés sont listés
aux Annexes E et F.
La fréquence des essais doit être justifiée par l’utilisateur final, en prenant en compte les divers types de
préparation utilisés dans le laboratoire utilisateur final et le niveau d’assurance qualité en place.
6.4.2 Milieux prêts à l’emploi
Les fabricants de milieux prêts à l’emploi commerciaux, en particulier s’ils sont conformes à l’ISO 9001,
ont un programme qualité en place et peuvent délivrer un certificat qualité accompagnant le produit
qu’ils fournissent. Dans ces conditions, l’utilisateur peut ne pas être obligé d’effectuer les essais
approfondis sur ces milieux, mais il doit s’assurer que les conditions de stockage recommandées par les
fabricants sont respectées.
Pour les milieux finis prêts à l’emploi auxquels des suppléments ont été ajoutés et qui ont été contrôlés
par le fabricant conformément à la présente Norme internationale, il est recommandé d’effectuer au
moins un essai qualitatif.
L’utilisateur doit s’assurer que les fabricants de milieux prêts à l’emploi commerciaux ont bien un
programme qualité en place pour cette gamme de produits et délivrent des certificats de contrôle qualité
satisfaisant aux exigences de la présente Norme internationale en spécifiant les résultats attendus et
obtenus. Le laboratoire utilisateur doit également vérifier les preuves documentaires pour s’assurer
que les critères d’acceptation des fabricants relatifs aux essais de performance satisfont à leurs propres
exigences internes.
Des contrôles périodiques doivent être effectués afin de démontrer que la qualité des milieux a été
maintenue pendant le transport.
Des contrôles doivent également être effectués après le stockage et la manipulation ultérieure dans le
laboratoire utilisateur, par exemple la régénération des milieux solides. La fréquence doit être justifiée.
Pour les milieux incomplets auxquels des suppléments sont ajoutés par le laboratoire utilisateur
(voir 3.3.5.1), il convient d’effectuer un contrôle supplémentaire, soit en vérifiant les enregistrements
de production, soit en effectuant un essai qualitatif, afin de s’assurer que le supplément adéquat a été
ajouté.
6.4.3 Milieux préparés à partir de formules déshydratées commerciales
Pour les milieux de dénombrement, des essais quantitatifs doivent être effectués. Pour les autres
milieux, les essais qualitatifs peuvent suffire. Des essais quantitatifs fourniront une meilleure garantie
de la qualité des milieux.
Pour les milieux non décrits dans les Annexes E et F, il convient de spécifier le contrôle qualité
conformément aux recommandations suivantes.
Pour les milieux ne contenant pas d’indicateurs ou d’agents sélectifs, il est possible d’utiliser un nombre
restreint de souches. Pour les milieux contenant des indicateurs ou des agents sélectifs, il convient
d’utiliser des souches démontrant le fonctionnement du ou des indicateurs et la sélectivité. Pour les
milieux complexes, c’est-à-dire contenant des suppléments, il convient de vérifier chaque lot avec des
souches présentant les caractéristiques énoncées en 5.2.
6.4.4 Milieux préparés à partir de composants individuels de base
Des essais quantitatifs doivent être effectués en plus des exigences décrites en 6.4.3, de façon à évaluer
les tendances en matière de qualité des ingrédients de base, la productivité des milieux et les protocoles
internes de fabrication du laboratoire.

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6.5 Évaluation de performance et interprétation des résultats

Un lot de milieu de culture est satisfaisant si tous les micro-organismes test se comportent conformément
aux spécifications données. Il doit être accepté si à la fois les critères de qualité généraux et les critères
de qualité microbiologiques sont remplis.
En cas de performances non satisfaisantes, voir l’Annexe H pour en connaître les raisons possibles.
6.6 Milieux et réactifs de confirmation
6.6.1 Milieux de confirmation
La performance des milieux de culture utilisés pour les essais de confirmation doit faire l’objet d’une
vérification avant utilisation. Des souches test positives et négatives appropriées doivent être utilisées
pour la vérification d’une manière similaire à celle décrite dans la Norme internationale spécifique.[9]
[16]
6.6.2 Réactifs de confirmation
La performance des colorants de Gram, des réactifs tels que le réactif de Kovacs, le réactif Voges-Proskauer
(VP), le nitrite, l’oxydase, la catalase et autres réactifs utilisés pour démontrer une caractéristique
biochimique, doit faire l’objet d’une vérification avant utilisation. Des souches positives et négatives
appropriées doivent être utilisées pour la vérification et il convient d’établir une durée de conservation.
Il est recommandé d’utiliser des réactifs de qualité analytique pour les essais de confirmation. Si
des réactifs commerciaux sont utilisés, suivre les instructions du fabricant relatives au stockage et à
l’utilisation.[18][19]
7 Méthodes pour les essais de performance des milieux de culture solides
7.1 Généralités
Le présent Article décrit les essais de performance quantitatifs et qualitatifs des milieux de culture
solides spécifiés dans les normes alimentaires et de l’eau. Les méthodes décrites sont des méthodes
générales adaptées à la plupart des milieux de culture. Ces méthodes peuvent ne pas être adaptées
aux essais de certains types de milieux destinés à la récupération de moisissures. Des logigrammes de
chaque méthode sont disponibles en Annexe C.
7.2 Méthodes pour les essais quantitatifs
7.2.1 Méthodes pour les essais quantitatifs — Définitions
7.2.1.1 Productivité
La productivité doit atteindre une limite minimale fixée (voir Norme internationale spécifique
correspondante ou Annexes E et F).
Voir l’Annexe G pour l’utilisation de cartes de contrôle dans le cadre de la surveillance de la performance
des milieux de culture solides en tant qu’alternative au mode opératoire décrit ci-dessous.

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Pour les méthodes quantitatives, le ratio de productivité, PR[21] est déterminé en utilisant la Formule (1):
NS
PR = (1)
NO
où
Ns est le nombre total de colonies obtenu sur ou dans le milieu de culture soumis à essai, par
exemple, nombre de colonies dans les boîtes,
NO est le nombre total de colonies obtenu sur ou dans le milieu de culture de référence défini,
obtenu sur une ou plusieurs boîtes, et doit être d’environ 100 UFC, voir 5.4.2.5.1.
Pour l’interprétation des résultats, voir 7.2.2.1.2.
7.2.1.2 Sélectivité
Les milieux de culture sélectifs et un milieu de référence non sélectif sont ensemencés avec différentes
dilutions d’un ou plusieurs organismes non cibles.
Le facteur de sélectivité, SF,[22]est calculé comme indiqué par la Formule (2):
S F = DO − DS (2)
où
DO est la dilution la plus élevée présentant une croissance sur le milieu de référence non
sélectif,
DS est la dilution la plus élevée présentant une croissance comparable sur le milieu
sélectif soumis à essai,
SF, DO et DS sont exprimés en log à base 10.
NOTE Par exemple, si Do 10−4 = log10 4,0 et DS 10−3 = log10 3,0 alors le facteur de sélectivité SF = 1,0.
Pour l’interprétation des résultats, voir 7.2.2.1.2.
7.2.2 Méthode quantitative pour les milieux de culture solides
Le présent protocole requiert l’utilisation d’une suspension bactérienne quantifiée (qui peut être un
matériau de référence quantitatif/une suspension d’essai) avec une concentration appropriée d’une
souche cible. La récupération à partir du nouveau lot de milieu de culture est comparée à la récupération
à partir d’un milieu de culture non sélectif (milieu de référence) ou, dans certains cas particuliers, à
partir d’un lot précédemment accepté présentant la même composition de milieu.
7.2.2.1.1 Mode opératoire
a) Utiliser des cultures de travail et des inocula ayant une concentration connue appropriée d’une
souche cible et, le cas échéant, d’une souche non cible comme décrit en 5.3.2, ou un MR approprié.
b) Il convient d’utiliser une ou plusieurs boîtes par organisme. Le nombre utilisé dépend de la taille
du lot, de la confiance dans le processus d’assurance qualité et de la fiabilité et de la quantité
d’organisme dans la suspension d’essai. Le laboratoire utilisateur doit justifier le nombre utilisé.
c) S’assurer que les surfaces des boîtes sont correctement séchées, voir 4.5.5.

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d) Ensemencer en étalant l’inoculum sur les milieux ou en utilisant la méthode par filtration sur
membrane de sorte que le dénombrement des colonies se situe dans les limites recommandées
données en 5.4.2.5.1 pour les essais quantitatifs.
Il est également possible d’utiliser la méthode de Miles-Misra modifiée, d’autres systèmes d’ensemencement
par gouttes ou un ensemencement par spirales afin d’obtenir des colonies dénombrables.
— La méthode d’ensemencement en profondeur doit être utilisée pour les milieux de culture
normalement utilisés pour le dénombrement par cette méthode.
— Ensemencer le milieu de référence ou les boîtes d’un lot précédemment accepté en utilisant la même
méthode.
— Incuber les boîtes dans les conditions définies dans les Normes internationales individuelles.
— Dénombrer les colonies présentes dans chaque boîte. Évaluer la taille et l’aspect des colonies sur ou
dans le milieu soumis à essai par comparaison avec la récupération sur un milieu de culture non
sélectif (milieu de référence) ou un lot précédemment accepté présentant la même composition de
milieu.
7.2.2.1.2 Calcul et interprétation des résultats
Pour l’essai de dénombrement quantitatif, un niveau d’environ 100 UFC est nécessaire afin d’obtenir une
précision suffisante (voir Tableau 1). Cela peut nécessiter l’utilisation de plusieurs doublons de boîte.
Les résultats seront considérés conforme si les conditions suivantes sont remplies:
— chaque replicat doit donner un résultat quantitatif positif (croissance bactérienne cible);
— chaque résultat rapporté est inclus dans la plage d’analyse normalisée (jusqu’à 100 colonies pour les
méthodes par filtration et jusqu’à 150 colonies pour les méthodes de surface).
Pour interpréter les résultats, calculer le ratio de productivité, PR (voir 7.2.1.1), et, le cas échéant, le
facteur de sélectivité, SF (voir 7.2.1.2).
a) Le PR doit être ≥ 0,50 pour la comparaison d’un milieu sélectif avec le milieu de référence non sélectif
spécifié aux Annexes E et F. Le PR doit être ≥ 0,70 pour la comparaison d’un milieu non sélectif avec
un milieu de référence non sélectif ou comme spécifié dans la norme ou aux Annexes E et F. Cela
s’applique également aux cas spécifiques où une comparaison est effectuée avec le lot précédent.
b) Si le PR dépasse 1,4, identifier la raison.
c) Le SF des micro-organismes non cibles est au moins de 2.
Pour les cas particuliers, voir les Annexes E, F et J. Ces critères peuvent ne pas s’appliquer aux milieux
non spécifiés aux Annexes E et F, par exemple, ceux décrits dans les normes locales.
7.2.2.2 Par récupération à partir de matériaux de référence
Le présent protocole utilise des matériaux de référence (MR), des matériaux de référence certifiés (MRC)
ou des matériaux de référence produits en interne afin de fournir une suspension bactérienne stable
contenant un nombre connu d’unités formant colonies de la souche cible ou indésirable. La récupération
à partir d’un nouveau lot de milieu de culture est comparée au nombre attendu d’UFC du matériau de
référence, du matériau de référence certifié ou du matériau de référence produit en interne.
Il est possible d’utiliser la différence critique pour le calcul des limites de tolérance (voir ISO 5725-6[34]).
Voir Tableau 1.
Pour la préparation et l’évaluation des matériaux de référence internes, voir Références [21] et [29].
La qualité du MR doit faire l’objet d’une vérification sur le milieu de référence.

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7.3 Essais des milieux de culture utilisés pour la filtration sur membrane
La qualité des membranes filtrantes utilisées doit être préalablement évaluée afin de démontrer leur
aptitude à l’emploi, utiliser l’ISO 7704.
Pour évaluer la performance d’un milieu de culture destiné à être utilisé dans une méthode par filtration
sur membrane, utiliser des cultures de travail et des inocula comme décrit en 5.4.2. Ensemencer le milieu
de suspension, par exemple liquide de dilution ou eau stérile, avec un niveau d’inoculum approprié donné
en 5.4.2.5.
Filtrer le liquide conformément aux exigences de la Norme internationale spécifique. Placer la
membrane sur la surface de la gélose soumise à essai. Ensemencer suffisamment de membranes/boîtes
afin d’obtenir un total d’environ 100 UFC pour les essais de productivité. Recommencer avec une
nouvelle membrane et placer la deuxième membrane sur la surface du milieu de référence, en utilisant
des dilutions si nécessaire pour les essais de sélectivité. Incuber les boîtes conformément à la norme
spécifique applicable.
Répéter le processus à chaque changement de lot de membranes et pour chaque nouveau lot de milieu.
Si nécessaire, afin d’évaluer l’influence de la membrane sur le résultat, étaler également l’inoculum
d’essai sur le milieu d’essai et sur le milieu de référence sans les membranes.
7.4 Méthodes pour essais qualitatifs
7.4.1 Méthode qualitative d’ensemencement en stries
7.4.1.1 Mode opératoire
Utiliser des cultures de travail et des inocula comme décrit en 5.4.2.

Pour la productivité et la spécificité, utiliser une boîte de milieu d’essai et ensemencer en stries chaque
micro-organisme d’essai de sorte à obtenir des colonies distinctes.
Pour la sélectivité, utiliser une boîte de milieu d’essai et ensemencer chaque micro-organisme d’essai en
une seule strie en utilisant une anse de 1 μl sur la surface du milieu d’essai. Différents micro-organismes
test peuvent être ensemencés sur la même boîte sans que les stries ne se croisent. Il convient que les
stries soient distinctes afin de permettre l’observation d’une morphologie caractéristique. D’autres
méthodes normalisées d’ensemencement peuvent être utilisées.
Incuber les boîtes dans les conditions définies dans les Normes internationales spécifiques.
7.4.1.2 Interprétation des résultats
La quantité de croissance dans les boîtes après incubation est évaluée comme suit:
— 0 correspond à une croissance nulle,
— 1 correspond à une faible croissance (réduction de la croissance ou de la taille des colonies),
— 2 correspond à une bonne croissance.
Le résultat pour les micro-organismes cibles doit être de 2. En outre, la croissance des micro-organismes
cibles doit être caractéristique du point de vue de l’aspect, de la taille et de la morphologie des colonies.
Pour les essais de sélectivité, le degré d’inhibition dépend du type de milieu. La croissance des micro-
organismes non cibles doit être inhibée partiellement ou complètement.
7.4.2 Détermination de la spécificité
Une définition de la spécificité est donnée en 3.2.6. La spécificité du milieu de culture est indiquée par des
caractéristiques physiologiques indicatives essentielles afin de différencier les organismes apparentés

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par la présence, l’absence et/ou le degré d’expression des réactions biochimiques et par les tailles et la
morphologie des colonies. Pour les exigences des cultures de travail et des inoculas, voir 5.4.2.
7.4.3 Autres méthodes qualitatives pour les milieux solides
D’autres méthodes qualitatives peuvent être utilisées.[9][21]
8 Méthodes pour les essais de performance des milieux de culture liquides
8.1 Généralités
Le présent Article décrit les méthodes quantitatives et qualitatives permettant d’évaluer la performance
des milieux de culture liquides. Des logigrammes de chaque méthode sont disponibles à l’Annexe C.
8.2 Méthode quantitative en tubes pour les essais de performance des milieux
d’enrichissement liquides (méthode de dilution jusqu’à extinction)
Cette méthode est une méthode générale qui peut être utilisée pour les milieux liquides non sélectifs ou
sélectifs. Elle est également adaptée aux essais de performance des milieux de culture utilisés pour le
dénombrement, par exemple dans les méthodes du nombre le plus probable.
8.2.2 Préparation de la série de dilutions
— Sélectionner un nombre représentatif de tubes, voir 6.3.1.

— Préparer une série de dilutions appropriée à partir de la culture de travail de l’organisme cible ou
non cible dans un diluant adapté comme décrit dans l’ISO 6887-1 et l’ISO 8199afin de parvenir à une
absence d’organismes dans la dilution la plus élevée (extinction), par exemple allant d’un facteur
de 10−1 à 10−10. Une série de dilutions décimale est plus couramment utilisée, mais des étapes de
dilution au 1/5 ou 1/2 sont également appropriées.
— Utiliser la série de dilutions dans un délai spécifié, voir 5.4.2.3.
— Au moment de l’utilisation, transférer un volume connu, par exemple 0,1 ml de chaque dilution, sur
la surface d’une gélose non sélective et étaler.
— Incuber dans des conditions adaptées à l’organisme concerné.
— Dénombrer les colonies sur les boîtes gélosées de la dilution la moins élevée contenant jusqu’à
150 colonies et les colonies pour les dilutions supérieures et les consigner.
8.2.3 Mode opératoire d’essai pour le milieu liquide
— Sélectionner le même nombre de tubes de milieu soumis à essai afin de correspondre au nombre de
tubes pour la série de dilution.
— En utilisant les dilutions préparées conformément à 8.2.2 et en commençant avec la dilution la
moins concentrée, ensemencer un volume connu de suspension de souche test, par exemple 0,1 ml,
dans le tube de milieu correspondant.
— Incuber les tubes dans les conditions décrites dans la Norme internationale applicable; voir 5.4.2.6.
— Après incubation, utiliser une anse de 10 µl différente pour chaque tube de milieu incubé afin de
procéder à un repiquage sur un milieu gélosé non sélectif.
— Incuber les boîtes ensemencées dans des conditions adaptées à l’organisme.

ISO 11133:2014(F)

— Après incubation, examiner chaque boîte afin de vérifier la présence ou l’absence de croissance.
NOTE Pour l’organisme cible, il suffit normalement d’utiliser les dilutions allant d’un facteur de 10–5 à 10 –8.
Pour les organismes non cibles, il suffit normalement d’utiliser les dilutions allant d’un facteur de 10–1 à 10 –4.
8.2.4 Calcul et interprétation des résultats
La productivité d’un milieu d’enrichissement liquide est satisfaisante si une bonne croissance (au moins
10 UFC pour une anse de 10 µl) du micro-organisme cible est obtenue à partir de la dilution produisant
moins de 100 UFC (dans 0,1 ml) sur la boîte gélosée.
Pour les milieux liquides sélectifs, déterminer le facteur de sélectivité, SF, à partir de la dilution la plus
élevée de la culture de travail présentant une bonne croissance (au moins 10 UFC) sur la boîte gélosée
et de la dilution la plus élevée du milieu liquide sélectif ensemencé présentant une croissance nulle (ou
moins de 10 UFC) du micro-organisme non cible sur la boîte de gélose non sélective. Il convient que le SF
soit au moins de 2.
NOTE Des méthodes supplémentaires pour les essais quantitatifs de milieux liquides destinées à être utilisées
dans le cadre de l’évaluation des milieux en développement ou d’études comparatives sont décrites à l’Annexe I.
8.3 Méthode qualitative en tubes pour les essais de performance des milieux liquides
sélectifs
Cette méthode utilise des organismes cibles, des organismes non cibles ou un mélange d’organismes
cibles et non cibles dans le même tube.
8.3.2 Mode opératoire
— Sélectionner un nombre de tubes contenant chacun 10 ml de milieu ou de fractions de 10 ml dans
chaque lot à soumettre à essai (voir 3.1.2 et 6.3.1). Procéder comme décrit ci-après conformément
aux exigences spécifiées aux Annexes E et F.
— Préparation des inocula: voir 5.4.2.3.
— Ensemencement des organismes cibles: ensemencer un tube de bouillon d’essai avec un inoculum
contenant ≤ 100 UFC du micro-organisme cible et mélanger.
— Ensemencement des micro-organismes non cibles: ensemencer un tube de bouillon d’essai
par micro-organisme avec un inoculum contenant un nombre plus élevé de micro-organismes
(> 1 000 UFC) et mélanger.
— Ensemencement des organismes cibles et non cibles dans le même tube lorsque requis à
l’Annexe E ou F ou lors de l’évaluation d’un nouveau milieu ou d’un nouveau fournisseur. Ensemencer
un tube de bouillon d’essai avec ≤ 100 cellules de micro-organisme cible et le même tube avec un
nombre plus élevé de micro-organismes non cibles (≥ 1 000 cellules pour chaque tube) et mélanger.
— Incuber les tubes dans les conditions définies dans les Normes internationales individuelles; voir
5.4.2.6.
— Prélever une anse (10 µl) dans le tube contenant l’organisme cible et ensemencer en stries sur une
boîte contenant un milieu non sélectif (par exemple, TSA).
— Si une culture d’un mélange de micro-organismes cibles et non cibles a été utilisée, prélever une
anse (10 µl) et ensemencer en stries sur une boîte contenant le milieu spécifique pour le micro-
organisme cible.
— Prélever une anse (10 µl) dans la culture de micro-organisme non cible et ensemencer en stries sur
une boîte contenant un milieu sélectif (par exemple, XLD).

ISO 11133:2014(F)

— Incuber les boîtes dans les conditions définies dans les Normes internationales individuelles.
Si un volume plus important de milieu est utilisé, l’utilisateur peut choisir d’ajuster proportionnellement
la taille de l’inoculum afin d’obtenir des résultats équivalents.
8.3.3 Calcul et interprétation des résultats
La productivité d’un bouillon d’essai liquide est satisfaisante si une bonne croissance (au moins 10 UFC
ou une ligne de croissance confluente) du micro-organisme cible est obtenue sur le milieu spécifique
pour cet organisme.
La sélectivité du bouillon d’essai liquide est satisfaisante si aucune croissance (ou moins de 10 UFC) des
micro-organismes non cibles n’est observée sur la boîte de gélose non sélective.
8.4 Méthode qualitative dans un seul tube (turbidité) pour les essais de performance
des milieux liquides
Cette méthode est adaptée aux essais de performance des milieux de culture liquides non sélectifs
et des milieux sélectifs utilisés pour les essais de confirmation, par exemple bouillon lactosé bilié au
vert brillant (BLBVB).[41] Cette méthode est exclusivement qualitative et les résultats ne sont donc
qu’indicatifs. Les milieux intrinsèquement troubles ne peuvent être soumis à essai via cette méthode
que s’ils sont repiqués sur un milieu solide afin de démontrer la croissance.
Pour les milieux limpides, la notation suivante est utilisée:
— 0 = turbidité nulle;
— 1 = turbidité faible;
— 2 = turbidité marquée.
8.4.2 Mode opératoire
8.4.2.1 Milieux de pré-enrichissement
— Sélectionner un nombre de tubes contenant chacun 10 ml de milieu ou de fractions de 10 ml dans
chaque lot à soumettre à essai (voir 3.1.2 et 6.3.1).
— Pour les essais de performance des milieux de pré-enrichissement, par exemple eau peptonée
tamponnée (EPT), ensemencer le milieu avec un volume approprié d’inoculum (voir Norme
internationale spécifique) contenant ≤ 100 UFC directement dans le milieu soumis à essai.
— Préparation des inocula: voir 5.4.2.3.
— Incuber le tube dans les conditions définies dans la Norme internationale spécifique; voir 5.4.2.6.
— Examiner la croissance dans le milieu.
8.4.2.2 Milieux de confirmation
— Pour les essais de performance des milieux de confirmation liquides, ensemencer le milieu soumis à
essai avec la suspension de culture de travail (contenant > 106 UFC/ml) en utilisant une anse de 1 µl.
— Incuber le tube dans les conditions définies dans les Normes internationales individuelles; voir
5.4.2.6.

ISO 11133:2014(F)

— Si le milieu non ensemencé est intrinsèquement trouble, procéder à un repiquage sur un milieu
solide, incuber les boîtes dans les conditions définies dans les normes individuelles et examiner la
croissance.
8.4.3 Interprétation des résultats
— Une évaluation qualitative doit être effectuée visuellement en recherchant une turbidité marquée (2)
représentative d’une bonne croissance, voir 8.4.1. Une évaluation qualitative des milieux opaques
est indiquée par la présence de croissance sur le milieu solide.
NOTE 1 Parfois, la croissance des micro-organismes peut prendre la forme d’un agglomérat de cellules au fond
du tube ou du flacon. Dans ce cas, mélanger le contenu avec précaution pour améliorer l’évaluation et faciliter
l’interprétation.
NOTE 2 Cette méthode permet également d’évaluer d’autres caractéristiques comme la formation de gaz et la
variation de couleur.
9 Méthodes pour les essais de performance des diluants et des milieux de trans-
port
9.1 Généralités
Les essais de performance microbiologique doivent être effectués sur un échantillon représentatif du lot
du produit fini, voir 6.3.1.
9.2 Méthode d’évaluation des diluants
9.2.1 Méthode pour les essais quantitatifs des diluants
Cette méthode détermine l’aptitude du diluant à permettre la survie des micro-organismes en empêchant
toute multiplication ou réduction indésirables durant la période de contact avant l’ensemencement sur
la gélose ou dans des milieux liquides.
Ensemencer une prise d’essai (par exemple 9 ml) du diluant avec 1 ml de la suspension du micro-
organisme test contenant environ 104 UFC/ml et mélanger. Pour la préparation de l’inoculum, voir 5.4.2.
Prélever immédiatement 0,1 ml du diluant ensemencé et l’étaler sur la surface d’une gélose non sélective
(milieu de référence) telle que TSA (t0).
Maintenir le diluant ensemencé à température ambiante pendant le laps de temps spécifié dans la partie
appropriée de l’ISO 6887 (toutes les parties) ou de l’ISO 8199 s’écoulant entre la fin de la préparation de
la suspension mère et l’entrée en contact de l’inoculum avec le milieu de culture (généralement 45 min).
Mélanger puis prélever le même volume (0,1 ml) et ensemencer à nouveau sur le milieu de référence (t1).
Incuber le milieu de référence à une température et pendant une durée appropriées, par exemple
30 °C/72 h.
9.2.1.3 Lectures et interprétation des résultats
Après incubation, dénombrer les colonies dans les boîtes t0 et t1.

Le nombre de micro-organismes, t1, après incubation du diluant doit être à ± 30 % près égal au nombre
initial (t0).

ISO 11133:2014(F)

9.3 Méthode d’évaluation des milieux de transport
Cette méthode détermine l’aptitude d’un milieu de transport à garantir la viabilité du micro-organisme
ensemencé qu’il contient durant la période de transport en empêchant toute multiplication ou réduction
indésirables du niveau inoculé.
Si les systèmes de transport sont pourvus d’un dispositif d’échantillonnage, ce dernier doit être utilisé
pour l’ensemencement du milieu de transport. Sinon, l’ensemencement doit être effectué dans des
conditions correspondantes à celles utilisées dans la pratique.
Incuber le milieu de transport à une température et pendant une durée appropriées conformément à la
pratique courante ou à la Norme internationale spécifiée.[12][13]
EXEMPLE Les systèmes de transport pour le transport réfrigéré des échantillons sont soumis à essai
à une température de (5 ± 3) °C pendant la durée normale de transport, par exemple 24 h, avant de répéter
l’ensemencement.
9.3.2 Méthode pour les essais quantitatifs des milieux de transport liquides
Ensemencer une prise d’essai (par exemple 10 ml) du milieu de transport liquide avec le micro-
organisme test approprié auquel le milieu est destiné. Utiliser un inoculum de 103 cellules à 104 cellules
dans chaque tube de 10 ml tube. Pour la préparation de l’inoculum (voir 5.4.2). Prélever immédiatement
0,1 ml de milieu ensemencé et l’étaler sur la surface d’un milieu gélosé non sélectif (milieu de référence)
tel que TSA (t0).
Pour l’ensemencement de systèmes de transport pourvus de dispositifs d’échantillonnage, placer le
dispositif d’échantillonnage dans un volume approprié (par exemple 0,1 ml pour les écouvillons) de
la dilution de la culture de travail (contenant 103 cellules à 104 cellules) pendant environ 10 s, puis
ensemencer le milieu de transport à l’aide du dispositif d’échantillonnage. Prélever immédiatement
0,1 ml de milieu de transport liquide ensemencé et l’étaler sur la surface d’un milieu gélosé non sélectif
(milieu de référence) tel que TSA (t0).
Incuber le milieu de transport ensemencé et le milieu de référence à une température et pendant une
durée appropriées conformément à la pratique courante ou à la Norme internationale spécifiée, par
exemple 25 °C/5 jours pour le milieu de transport et 30 °C/3 jours pour le milieu de référence, puis
répéter l’ensemencement sur le milieu de référence (t1).
Après incubation, dénombrer les colonies dans les boîtes t0 et t1.

Le nombre de micro-organismes, t1, après incubation du milieu de transport doit être à ± 30 % près égal
au nombre initial (t0).
9.3.3 Méthode pour les essais qualitatifs des milieux de transport solides
Ensemencer une prise d’essai du milieu de transport solide avec le micro-organisme test approprié
auquel le milieu est destiné. Utiliser un inoculum de 104 cellules à 106 cellules. Pour la préparation de
l’inoculum (voir 5.4.2).
Pour l’ensemencement de systèmes de transport pourvus de dispositifs d’échantillonnage, placer le
dispositif d’échantillonnage dans un volume approprié (par exemple 100 µl pour les écouvillons) de

ISO 11133:2014(F)

la dilution de la culture de travail (contenant 104 cellules à 106 cellules) pendant environ 10 s, puis

ensemencer le milieu de transport à l’aide du dispositif d’échantillonnage.
Incuber le milieu de transport à une température et pendant une durée appropriées conformément à la
pratique courante ou à la Norme internationale spécifiée. Procéder à un repiquage sur le milieu gélosé
non sélectif (milieu de référence) tel que TSA et incuber conformément à la pratique courante ou à la
norme spécifiée.
Après incubation, examiner la présence de croissance sur la gélose non sélective.

Il doit y avoir une croissance visible des micro-organismes après incubation.
10 Documentation des résultats d’essai
10.1 Informations fournies par le fabricant

Le fabricant ou le fournisseur des milieux de culture doit fournir, sur demande, les caractéristiques
de croissance microbiologique spécifiques et les informations générales relatives au lot spécifique de
milieu de culture.
10.2 Traçabilité
Il convient de documenter convenablement toutes les données obtenues lors des essais de performance
de routine et de les conserver pendant suffisamment de temps conformément au système qualité. Il est
recommandé d’utiliser des fiches de contrôle pour documenter et évaluer les résultats des essais (voir
Annexe D).

ISO 11133:2014(F)

Annexe A
(informative)
Dénomination des composants des milieux de culture dans les

Normes internationales d’analyse microbiologique des aliments,
des aliments pour animaux et des eaux
A.1 Généralités
Afin d’harmoniser la description des différents composants des milieux de culture dans les Normes
internationales microbiologiques normalisées, l’ISO/TC 34/SC 9 a convenu des dénominations suivantes.
A.2 Peptones
— digestion enzymatique de caséine,
NOTE 1 Y compris digestion pancréatique ou pepsique de caséine, digestion trypto-caséine et tryptone.
— digestion enzymatique de soja ou de tourteau de soja,

— digestion enzymatique de tissus animaux,
NOTE 2 Y compris peptone de viande, digestion pepsique de viande, digestion pancréatique de viande.
— digestion enzymatique de cœur,

— digestion enzymatique de gélatine,
— digestion enzymatique de tissus animaux et végétaux,
NOTE 3 Y compris tryptose.
— hydrolyse acide de caséine.
A.3 Extraits et infusions

— extrait de viande et infusion de viande,
— extrait de cœur-cervelle (ou cerveau-cœur) et infusion cœur-cervelle,
— extrait de levure.
A.4 Gélose
Gélose bactériologique.
A.5 Autres
— émulsion de jaune d’œuf,
— poudre de lait écrémé,
— sang total, défibriné ou lysé, poudre de sang, plasma, fibrinogène, hémine, d’animaux spécifiés,

ISO 11133:2014(F)

— bile de bœuf à usage bactériologique,

— sels biliaires.
NOTE Y compris sels biliaires n° 3.

ISO 11133:2014(F)

Annexe B
(normative)
Préparation du stock de référence et de la culture de travail

ISO 11133:2014(F)

B.1 Constitution du stock de référence à partir d’une souche de référence

ISO 11133:2014(F)

a En général, remise en suspension dans un bouillon nutritif avec maintien pour la revivification.
b Vérifier la morphologie des colonies à gram positif ou procéder à l’identification en effectuant les
essais biochimiques.
c Par exemple, un milieu cryoprotecteur comme le bouillon TSB supplémenté avec 10 % à 15 % de
glycérol.
d Les tubes cryogéniques peuvent contenir des billes.
e La surgélation à une température inférieure à −70 °C permet de prolonger le stockage. La durée de
stockage à une température supérieure est limitée.[36]
f Peut aussi directement servir de culture de travail.
Figure B.1 — Logigramme de la constitution du stock de référence à partir d’une souche

de référence

ISO 11133:2014(F)

B.2 Constitution de la culture de travail à partir du stock de référence
a Vérifier et archiver les documents, y compris contrôler la traçabilité de la souche de référence et

ses caractéristiques pertinentes, si le stock de référence est d’origine externe.
b Ce mode opératoire est préférable.
c Ce mode opératoire peut être nécessaire pour certaines souches, par exemple pour les essais quan-
titatifs. Documenter toutes les étapes.
d Ensemencer, par exemple, un tube de gélose TSA ou de TSA au sang de mouton en pente ou tout
autre milieu adapté, faire incuber pendant 24 h et stocker à une température appropriée (de 18 °C
à 25 °C ou de 2 °C à 8 °C, en fonction des micro-organismes) pendant jusqu’à quatre semaines.[36]
e Par exemple, un milieu cryoprotecteur tel que le bouillon TSB supplémenté avec de 10 % à 15 % de
glycérol. La surgélation à une température inférieure à −70 °C permet de prolonger le stockage. La
durée de stockage à une température supérieure est limitée.[36]

ISO 11133:2014(F)

Figure B.2 — Logigramme de la constitution de la culture de travail à partir du stock de

référence

ISO 11133:2014(F)

Annexe C
(normative)
Logigrammes des méthodes pour les essais de performance
C.1 Généralités
Voir Article 7.

ISO 11133:2014(F)

C.2 Méthode quantitative pour les milieux de culture solides: productivité et

sélectivité (voir 7.2.2 et Figure C.1)
Légende
PR ratio de productivité
SF facteur de sélectivité
Le ratio de productivité, PR, peut être utilisé pour comparer:
a) un milieu non sélectif avec un milieu de référence non sélectif,
b) un milieu sélectif avec un milieu de référence non sélectif,
c) un milieu sélectif avec un milieu de référence sélectif.
Pour l’incubation (voir le troisième niveau/carré de cette figure), voir 5.4.2.6.
Figure C.1 — Logigramme relatif aux essais quantitatifs des milieux de culture solides

ISO 11133:2014(F)

C.3 Méthode quantitative en tubes pour les essais de performance des milieux
d’enrichissement liquides — Méthode de dilution jusqu’à extinction (voir 8.2 et
Figure C.2)
Note Pour l’incubation (le cinquième niveau/carré de cette figure), voir 5.4.2.6.
Figure C.2 — Logigramme relatif aux essais de performance des milieux d’enrichissement

liquides (méthode de dilution jusqu’à extinction)

ISO 11133:2014(F)

C.4 Méthode qualitative dans un seul tube pour les milieux d’enrichissement liq-
uides sélectifs (avec les micro-organismes cibles, les micro-organismes non cibles
ou un mélange de micro-organismes cibles et non cibles dans le même tube) (voir
8.3 et Figure C.3)
Note Pour l’incubation (le cinquième niveau/carré de cette figure), voir 5.4.2.6.
Figure C.3 — Logigramme relatif à la méthode qualitative dans un seul tube pour les milieux
d’enrichissement liquides sélectifs

ISO 11133:2014(F)

C.5 Méthode qualitative dans un seul tube pour les milieux liquides non sélectifs
et sélectifs: turbidité (voir 8.4 et Figure C.4)
Vérifier, en général, les caractéristiques de la croissance bactérienne pour chaque milieu liquide, par
exemple production de gaz, variation de couleur, le cas échéant.
Note Pour l’incubation (le troisième niveau/carré de cette figure), voir 5.4.2.6.
Figure C.4 — Logigramme relatif aux essais qualitatifs des milieux liquides utilisant un seul
tube (turbidité)

ISO 11133:2014(F)

Annexe D
(informative)
Exemple de fiche de contrôle pour l’enregistrement des résultats

des essais des milieux de culture
Tableau D.1 — Exemple de fiche de contrôle
Fiche de contrôle pour les essais de qualité internes des milieux de culture
milieu de culture: volume préparé: date de répar- numéro de lot
tition: interne:
milieu déshydraté fournisseur: lot: quantité: date/signature:
(et référence):
Supplément: fournisseur: lot: quantité: date/signature:
Détails de fabrication:
Contrôle de qualité physique
Aspect attendu du milieu Couleur normale qualité défauts: date/signature:
de culture déshydraté conforme:
fluide
oui ⧠ non ⧠
pH attendu: pH mesuré: qualité défauts: date/signature:
conforme:
oui ⧠ non ⧠
quantité répartie et/ou observé(e): qualité défauts: date/signature:
épaisseur de gélose atten- conforme:
due:
oui ⧠ non ⧠
couleur attendue: observé(e): qualité défauts: date/signature:
conforme:
oui ⧠ non ⧠
limpidité/présence d’arte- observé(e): qualité défauts: date/signature:
facts optiques attendue: conforme:
oui ⧠ non ⧠
stabilité/consistance/taux observé(e): qualité défauts: date/signature:
d’humidité de la gélose conforme:
attendu(e):
oui ⧠ non ⧠
Contamination microbienne
Nombre de boîtes ou de résultat: qualité Nombre de boîtes ou date/signature:
tubes soumis à essai: conforme: de tubes contaminé(e)
s:
Incubation: oui ⧠ non ⧠
Croissance microbiologique – Productivité Méthode de contrôle Quantitative ⧠ Qualitative ⧠
souches: critères: résultat: qualité conforme: date/signature:
incubation: oui ⧠ non ⧠
milieu de référence:
Croissance microbiologique – Sélectivité Méthode de contrôle: Quantitative ⧠ Qualitative ⧠

ISO 11133:2014(F)

Tableau D.1 (suite)
Croissance microbiologique – Spécificité Méthode de contrôle: Quantitative ⧠ Qualitative ⧠
Libération du lot
Détails sur les conditions de stockage: libération du lot oui ⧠ non ⧠ date/signature:

ISO 11133:2014(F)

Annexe E
(normative)
Micro-organismes test et critères de performance pour les milieux

de culture couramment utilisés en microbiologie alimentaire
La présente annexe donne des informations sur le milieu de culture, les conditions de culture, les micro-
organismes test, le numéro de collection des souches test et les réactions attendues lors des essais de
performance des milieux de culture.
Des souches spécifiques ont été sélectionnées pour les essais afin de garantir l’homogénéité entre les
laboratoires et afin de faciliter la démonstration des différences entre les milieux (d’un lot à l’autre,
entre les fabricants). Ces souches ont été entièrement évaluées afin de garantir leur adéquation et leur
cohérence en termes de performance.
Lorsque plus d’une souche est répertoriée pour chaque aspect des essais de performance (productivité,
sélectivité, spécificité), les souches à utiliser au minimum ont été indiquées par la lettre b. On s’attend
à ce que les fournisseurs commerciaux et non commerciaux utilisent des souches supplémentaires, par
exemple celles indiquées dans le Tableau E.1 pour s’assurer de la qualité des milieux de culture qu’ils
fournissent.
Le Tableau E.1 a été établi en tenant compte des souches de contrôle utilisées dans la Pharmacopée
européenne (PE) et les recommandations concernant la microbiologie alimentaire pour les milieux de
culture du groupe de travail de l’ICFMH (International Committee on Food Microbiology and Hygiene,
Comité international de microbiologie et d’hygiène alimentaires). Les critères doivent être inclus
dans les Normes internationales spécifiques qui seront élaborées ou révisées. Un lot validé de milieu
de culture est un lot dont il a été démontré que les performances sont satisfaisantes. Les numéros de
souches spécifiés dans le Tableau E.1 sont ceux du catalogue des numéros d’identification universels de
souches compilés par le World Data Centre for Microorganisms (WDCM) (Centre de données mondial
sur les micro-organismes).[20] Ce catalogue contient les détails des souches de références représentées
par chaque numéro WDCM et les coordonnées des collections de cultures. Tous les milieux mentionnés
sont décrits dans des Normes européennes et internationales.
Si une variabilité de souches est détectée, étudier l’effet du milieu de culture (par exemple, en se procurant
le même milieu auprès d’un fabricant différent) et obtenir une culture de référence supplémentaire issue
de la collection de cultures où la souche a été déposée à l’origine. Les utilisateurs sont tenus de fournir
toutes les informations pertinentes relatives à la variabilité des souches au GT 5, Milieux de culture, de
l’ISO/TC 34/SC 9 via le secrétariat de l’ISO/TC 34/SC 9.

ISO 11133:2014(F)

Les notes de bas de tableau utilisés dans le Tableau E.1 sont les suivants:
a Les noms complets des milieux abrégés sont donnés dans le Tableau E.2.
b Souches à utiliser au minimum.
c Pour plus d’informations sur les numéros d’identification des souches de collection de culture et
pour les coordonnées, se référer au catalogue de souche de référence disponible sur http://www.
wfcc.info.
d Souche au choix; une des souches, au minimum, doit être utilisée.
e L: milieu liquide, S: milieu solide, SS: milieu semi-solide.
f croissance/turbidité est classée en: 0 — croissance/turbidité nulle, 1 — croissance/turbidité
faible, 2 — croissance/turbidité marquée (voir 7.4.1.2, 8.4.1).
g Escherichia coli WDCM 00013 est celui donné par la norme spécifique.
h Escherichia coli WDCM 00013 est un fort producteur de β-D-glucuronidase et WDCM 00202 est
un faible producteur de β-D-glucuronidase.
i Certaines restrictions nationales et directives peuvent nécessiter l’utilisation d’un sérovar diffé-
rent. Se référer aux exigences nationales relatives au choix des sérovars de Salmonella.
j Dans le cas d’une utilisation à la fois quantitative et qualitative du milieu, seuls les résultats des
essais quantitatifs sont requis (voir Tableau E.1).
k De plus amples détails concernant le contrôle qualité du milieu MSRV, y compris la concentration
finale de l’inoculum et les critères, sont donnés dans l’ISO 6579.
l Si la gélose nutritive est destinée à deux ou trois applications différentes: procéder au minimum
à l’essai de croissance de Salmonella (si le laboratoire teste ce micro-organisme).
m Si l’EPT est destinée à deux ou trois applications différentes: procéder au minimum à l’essai
d’enrichissement de Salmonella (si le laboratoire teste ce micro-organisme).
n Choisir la ou les souches en fonction de la méthode pour laquelle TSA est utilisé comme milieu de
référence.

Tableau E.1 — Micro-organismes test et critères de performance pour les milieux de culture couramment utilisés en microbiologie
alimentaire
Milieux sélectifs pour le dénombrement des micro-organismes
Méthode
Micro-orga- Norme inter- Numéro Milieu de
Fonction Incubation Souche de contrôle de Critères Réaction caractéristique
nisme nationale référence
contrôle
Milieua Typee
WDCMc
Listeria Listeria
monocytogenes monocytogenes 4b
Gélose Lis- S ISO 11290-2 Producti-

00021b
Listeria
teria selon vité Quantita- Colonies bleu-vert
monocytogenes 1/2a
Ottaviani et TSA P R ≥ 0,5
tive avec halo opaque
© ISO 2014 – Tous droits réservés

Agosti 00109
(44 ± 4) h /
Escherichia colid
Sélectivité 00012
ou 00013
(37 ± 1) °C Inhibition
— Qualitative —
totale (0)
Enterococcus faecalisd
00009
ou 00087
Listeria innocua
Spécificité Colonies bleu-vert sans halo
00017 — Qualitative —
opaque
Staphylococcus aureus
Baird- S Staphylocoques ISO 6888-1 Producti- (24 ± 2) h
00034b Quantita- Colonies noires ou grises avec
Parker à coagulase vité à (48 ± 2) h/ TSA P R ≥ 0,5
00032 tive halo d’éclaircissement
positive (37 ± 1) °C

Sélectivité (48 ± 2) h /
Escherichia colid
00012 Inhibition
— Qualitative —
ou 00013 totale (0)
Staphylococcus
(37 ± 1) °C
saprophyticus
Spécificité 00159b
(24 ± 2) h
Staphylococcus
à (48 ± 2) h / Colonies noires ou grises sans
epidermidis
— Qualitative —
halo d’éclaircissement
(37 ± 1) °C 00036
Escherichia coli
BLBVB L Coliformes ISO 4831 Producti- 00012b Turbidité
Citrobacter freundii
vité 00013 (2)f et gaz
— Qualitative Formation de gaz et turbidité
dans tube de
(24 ± 2) h 00006 Durham
à (48 ± 2) h /
Sélectivité Inhibition
(30 ± 1) °C
00009 partielle sans
— Qualitative —
ou 00087 formation de
Pseudomonas Pseudomonas fluorescens

gaz
spp.
Pseudomonas fragi
CFC S ISO 13720 Producti- 00115b Quantita-
vité TSA P R ≥ 0,5 —
(44 ± 4) h / 00116 tive
(25 ± 1) °C
Escherichia colid
Sélectivité 00012 Inhibition
— Qualitative —
ou 00013 totale (0)
ISO 11133:2014(F)
49

50
Tableau E.1 — (suite)
Méthode
contrôle
Milieua Typee
WDCMc
Saccharomyces cerevisiae
Wallemia sebi
DG18 S Levures et moi- ISO 21527-2 Producti- 00058b
sissures vité
ISO 11133:2014(F)
Aspergillus restrictus
00182b Colonie/propagules caractéris-
Quantita-
SDA P R ≥ 0,5 tiques correspondant à chaque
tive
Eurotium rubrum
00183 espèce
5 jours /
00184
Escherichia coli
(25 ± 1) °C
Sélectivité 00012
Bacillus subtilis ssp.
ou 00013g Croissance
spizizenii
— Qualitative —
nulle
00003
Saccharomyces cerevisiae
Aspergillus brasiliensis
DRBC S Levures et ISO 21527-1 Producti- 00058b

moisissures vité
Candida albicans
00053b Colonie/propagules caractéris-
Quantita-
SDA P R ≥ 0,5 tiques correspondant à chaque
tive
Mucor racemosus
00054 espèce
5 jours /

00181
Escherichia coli
(25 ± 1) °C
Sélectivité 00012
ou 00013g Croissance
spizizenii
— Qualitative —
nulle
00003
Escherichia coli
EC L Escherichia coli ISO 7251 Producti- Turbidité
vité 00012b (2)f et gaz
(24 ± 2) h — Qualitative Formation de gaz et turbidité
00013 dans tube de
à (48 ± 2)h / Durham
Pseudomonas aeruginosa
(44 ± 1) °C
Sélectivité Croissance
nulle
IS («TS») S Bactéries ISO 15213 Producti- TSA ou
Clostridium perfringens
sulfito- vité autre
réductrices (24 ± 3) h 00007 b milieu non Quantita-
P R ≥ 0,5 Colonies noires
à (48 ± 2) h / 00080 sélectif tive
(37 ± 1) °C pour les
en anaérobiose anaérobies
Escherichia colid
Spécificité 00012
— Qualitative — Aucun noircissement
ou 00013

Méthode
contrôle
Milieua Typee
WDCMc
Escherichia coli
LST L Coliformes ISO 4831 Producti- 00012b Turbidité
vité 00013 (2)f et gaz

dans tube de
à (48 ± 2) h / 00006 Durham
(30 ± 1) °C

Sélectivité 00009 Croissance
— Qualitative —
ou 00087 nulle
Escherichia coli
Escherichia coli ISO 7251 Producti- Turbidité
vité 00012b (2)fi et gaz


00013 dans tube de
à (48 ± 2) h / Durham
(37 ± 1) °C
— Qualitative —
Campylobacter Campylobacter jejuni

00087 nulle
mCCDA S ISO 10272-2 Producti- 00156b Gélose Quantita- P R ≥ 0,5 Colonies grisâtres, plates et
Campylobacter coli
vité 00005 au sang tive humides, parfois avec un reflet
métallique

00004
Selectivité (44 ± 4) h/ Escherichia colid 00012 Qualitative Inhibition
(41,5 ± 1) °C or 00013 — totale ou par- —
en micro-aéro- tielle (0-1)
biose
— Qualitative Inhibition —
Lactobacillus sakei
00034 totale (0)
Lactococcus lactis
MRS S Bactéries ISO 15214 Producti- 00015b
lactiques vité Lot de
(72 ± 3) h Quantita- Colonies caractéristiques cor-
Pediococcus pentosaceus
00016b milieu MRS P R ≥ 0,7
(30 ± 1) °C tive respondent à chaque espèce
déjà validé
00158
Escherichia colid
Sélectivité 00012
Bacillus cereus
(72 ± 3) h / ou 00013 Inhibition
— Qualitative —
(30 ± 1) °C totale (0)
Bacillus cereus
00001
Bacillus cereus PR ≥ 0,5
MYP S ISO 7932 Producti- (24 ± 3) h
Quantita- Colonies roses avec halo de
vité à (44 ± 4) h / 00001 TSA
tive précipitation
(30 ± 1) °C
Escherichia colid
— Qualitative —
(44 ± 4) h / ou 00013 totale (0)
spizizenii
Spécificité (30 ± 1) °C Colonies jaunes sans halo de
précipitation
ISO 11133:2014(F)
51

52
Méthode
contrôle
Milieua Typee
WDCMc
RPFA S Staphylocoques ISO 6888-2 Producti- (24 ± 2) h
00034b Quantita- Colonies noires ou grises avec
à coagulase vité à (48 ± 2) h / TSA P R ≥ 0,5
ISO 11133:2014(F)
00032 tive halo opaque

Escherichia colid
Sélectivité (48 ± 2) h / 00012 Inhibition
— Qualitative —
Staphylococcus
(37 ± 1) °C ou 00013 totale (0)
saprophyticus
Spécificité
00159b
Staphylococcus
(24 ± 2) h
Colonies noires ou grises sans
epidermidis
à (48 ± 2) h / — Qualitative —
halo opaque
(37 ± 1) °C 00036
Pseudomonas Pseudomonas fluorescens

spp.
PPA S ISO/TS 11059 Producti- 00115b
Quantita-
vité TSA P R ≥ 0,5 —

(48 ± 2) h / 00025 tive
(25 ± 1) °C
Escherichia colid
— Qualitative —
Escherichia
ou 00013 totale (0)

TBX S ISO 16649-1 et Producti- 00012d
Escherichia colih
Quantita-
coli β-d- ISO 16649-2 vité 00013d TSA P R ≥ 0,5 Colonies bleues
tive
glucuronidase 00202b
positive
(21 ± 3) h /
Qualitative —
(44 ± 1) °C ou 00087 totale (0)
Qualitative — Colonies blanches à vert-beige
Clostridium
00025
perfringens
TSC (SC) S ISO 7937 Producti- TSA ou
vité autre
00007 b milieu non Quantita-
(20 ± 2) h / P R ≥ 0,5 Colonies noires
00080 sélectif tive
(37 ± 1) °C pour les
en anaérobiose anaérobies
Escherichia colid
— Qualitative —
ou 00013 totale (0)

Méthode
contrôle
Milieua Typee
WDCMc
Escherichia coli
VRBG S Enterobacteria- ISO 21528-2 Producti- 00012b
Salmonella
ceae vité 00013
Quantita- Colonies roses à rouges avec ou
Salmonella
TSA P R ≥ 0,5
(24 ± 2) h / Typhimuriumd,i 00031 tive sans halo de précipitation

(37 ± 1) °C 00030
Enteritidisd,i
— Qualitative —
ou 00087 totale (0)

Escherichia coli
VRBL S Coliformes ISO 4832 Producti- 00012b Quantita- Colonies rouge pourpre avec ou
TSA P R ≥ 0,5
vité 00013 tive sans halo de précipitation
Sélectivité (24 ± 2) h / 00009 Inhibition
— Qualitative —
Pseudomonas
(30 ± 1) °C ou 00087 totale (0)
aeruginosa
Spécificité
00025 Qualitative — Colonies incolores à beiges
Milieux non sélectifs pour le dénombrement des micro-organismes

Micro-orga- Norme inter- Fonction Incubation Souches de contrôle Numéros Milieu de Méthode Critères Réactions caractéristiques
nismes nationale de
Milieua Typee
contrôle
WDCMc référence
spizizenii
PCA S Dénombrement ISO 4833 Producti-
00003b
des colonies vité
Escherichia coli
MPCA
(72 ± 3) h / Quantita-
00012b TSA P R ≥ 0,7 —
(30 ± 1) °C tive
00013
00034
ISO 11133:2014(F)
53

54
Méthode
Micro-orga- Norme inter- Numéros Milieu de Réactions caractéristiques
Fonction Incubation Souches de contrôle de Critères
nismes nationale des micro-organismes cibles
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Campylobacter jejunid
Bolton L Campylobacter ISO 10272-1 Producti- 00156
vité ou 00005
ISO 11133:2014(F)
+ Escherichia coli d
00012
+ Proteus mirabilis
ou 00013
Colonies grisâtres, plates et
Campylobacter coli
(5 ± 1) h / 00023 > 10 colonies
— Qualitative humides, parfois avec un reflet
(37 ± 1) °C sur mCCDA
00004 métallique
puis
(44 ± 4) h /
00012
(41,5 ± 1) °C
+ Proteus mirabilis
ou 00013
micro aérobiose
00023
Escherichia coli d
Proteus mirabilis
ou 00013 — Qualitative totale (0) sur —
TSA
Enterobacter-
00023
Escherichia coli
iaceae

EE L ISO 21528-1 Producti- 00012b
vité 00013
00009
+ Enterococcus faecalis d
Salmonella
ou 00087
> 10 colonies Colonies roses à rouges avec ou
— Qualitative
00031 sur VRBG sans halo de précipitation
(24 ± 2) h / Typhimuriumd,i
00030
(37 ± 1) °C Salmonella Enteritidisd,i
00009
ou 00087
00009
— Qualitative totale (0) sur —
ou 00087
TSA

Méthode
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Listeria Listeria
Fraser L ISO 11290-1 Producti-
00021b
vité
00012
ou 00013

> 10 colonies
00009
Listeria
ou 00087 sur gélose Lis-
(48 ± 2) h / Colonies bleu-vert avec halo
monocytogenes 1/2a
— Qualitative teria selon
(37 ± 1) °C opaque
Ottaviani et
00109
Agosti
00012
ou 00013
00009
ou 00087
Escherichia colid
00012

ou 00013
TSA
00009 < 100 colonies
— Qualitative —
ou 00087 sur TSA
Giolitti L Staphylocoques ISO 6888-3 Producti- (24 ± 2) h 00034b
Cantoni à coagulase vité à (48 ± 2 h) /
Colonies caractéristiques
+ Escherichia colid
positive (37 ± 1) °C 00012
ou 00013 > 10 colonies correspondant à chaque milieu
— Qualitative sur Baird-Par- (voir ISO 6888-1 pour Baird-
00032 ker ou RPFA Parker et ISO 6888-2 pour
RPFA)
00012
ou 00013
Sélectivité (48° ± °2) h / Inhibition
Escherichia colid
00012
(37 ± 1) °C — Qualitative totale (0) sur —
ou 00013
TSA
ISO 11133:2014(F)
55

56
Méthode
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Listeria Listeria
Fraser demi L ISO 11290-1 Producti-
00021b
vité
ISO 11133:2014(F)
00012
ou 00013
> 10 colonies
00009
Listeria monocy-
ou 00087 sur gélose Lis-
Colonies bleu-vert avec halo
togenes 1/2a
— Qualitative teria selon
opaque
00109 Ottaviani et
Agosti
(24 ± 2) h /
(30 ± 1) °C 00012
ou 00013
00009
ou 00087
Escherichia colid
00012

ou 00013
TSA
00009 < 100 colonies
— Qualitative —
Yersinia Yersinia enterocolitica

ou 00087 sur TSA
enterocolitica
ITC L ISO 10273 Producti- 00038b
vité
00012
+ Pseudomonas aerugi-
ou 00013
nosa
00025
Yersinia enterocolitica
> 10 colonies Colonies caractéristiques
— Qualitative sur CIN ou correspondant à chaque milieu
00160 SSDC (voir ISO 10273)
(44 ± 4) h /
(25 ± 1) °C
+ Escherichia colid
00012
+ Pseudomonas
ou 00013
aeruginosa
00025
Proteus mirabilis
00023 TSA

Méthode Réactions caractéristiques

Micro-orga- Norme inter- Numéros Milieu de
Fonction Incubation Souches de contrôle de Critères des micro-organismes
nismes nationale
contrôle cibles
Milieua Typee
WDCMc référence
Salmonella
Salmonella
MKTTn L ISO 6579 Producti- Salmonella Enteritidisd,i
00030
vité
00031
Typhimuriumd,i > 10 colonies
Colonies caractéristiques cor-
sur XLD ou sur
00012 — Qualitative respondant à chaque milieu
un autre milieu

ou 00013 (voir ISO 6579)
au choix
nosa
(24 ± 3) h /
00025
(37 ± 1) °C
Sélectivité Inhibition totale

Escherichia colid
00012
— Qualitative ≤ 100 colonies —
ou 00013
sur TSA
00009 < 10 colonies
— Qualitative —
Salmonella
ou 00087 sur TSA
MSRV k SS ISO 6579 Producti- Salmonella Enteritidisd,i 00030 Zone trouble
vité gris-blanc

s’étendant
hors de la ou
des gouttes
Salmonella
ensemencées.
Autre réaction possible: colo-
Après 24 h à
— Qualitative nies caractéristiques après
00031 48 h, la migra-
Typhimuriumd,i repiquage sur XLDk
tion de la ou des
zones troubles
des gouttes
2 × (24 ± 3) h / dans la boîte
(41,5 ± 1) °C sera (presque)
totale.
Sélectivité Croissance pos-
sible à l’endroit
Escherichia colid
00012 de la ou des
— Qualitative —
ou 00013 gouttes ense-
mencées sans
zone trouble.
00009
— Qualitative Croissance nulle —
ou 00087
ISO 11133:2014(F)
57

58
Méthode
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Escherichia
Escherichia coli
MMG L ISO 16649-3 Producti- 00012b Production
coli β-d- vité — Qualitative Couleur passant au jaune
ISO 11133:2014(F)
(24 ± 2) h / 00013 d’acide

glucuronidase
— Qualitative —
Yersinia Yersinia enterocolitica

ou 00087 nulle
enterocolitica
PSB L ISO 10273 Producti- 00038b
vité
00012
ou 00013
nosa
00025
> 10 colonies Colonies caractéristiques
— Qualitative sur CIN ou correspondant à chaque milieu

00160 SSDC (voir ISO 10273)

3 à 5 jours /
(25 ± 1) °C
00012
ou 00013
nosa

00025
Proteus mirabilis
Sélectivité 00025b Inhibition
Salmonella
00023 TSA
Salmonella
RVS L ISO 6579 Producti- Salmonella Enteritidisd,i
00030
vité
00031
sur XLD ou
00012 — Qualitative correspondant à chaque milieu
sur un autre
ou 00013 (voir ISO 6579)
milieu au choix
nosa
(24 ± 3) h / 00025
(41,5 ± 1) °C
Escherichia colid
00012 partielle
— Qualitative —
ou 00013 ≤ 100 colonies
sur TSA
00009 < 10 colonies
— Qualitative —
ou 00087 sur TSA

Méthode
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Bacillus cereus
Bacillus cereus
TSPB L ISO 21871 Producti- > 10 colonies Colonies caractéristiques
vité 00001 — Qualitative sur PEMBA ou correspondant à chaque milieu
(48 ± 4) h / MYP (voir ISO 21871)

Sélectivité (30 ± 1) °C Inhibition
Escherichia colid
00012

ou 00013

TSA
Méthode
Fonction Incubation Souches de contrôle de Critères Réactions caractéristiques

nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
BHI L Staphylocoques ISO 6888-1 Producti-
(24 ± 2) h /
à coagulase ISO 6888-3 vité 00034 — Qualitative Turbidité (1-2)f —
(37 ± 1) °C
Campylobacter
positive
Brucella L ISO 10272 Producti- 2 à 5 jours / 00156

(toutes les vité (41,5 ± 1) °C 00005
— Qualitative Turbidité (1-2)f —
parties) en microaéro-
biose Campylobacter colid 00004
Escherichia colid
Diluants L Liquides de ISO 6887 Diluant 00012 ou
pour dilution (toutes les 00013
applications parties) ± 30 % près
particu- du nombre
lières, par de colonies à
45 min à 1 h / Quantita-
exemple TSA l’instant T0 —
(20 à 25) °C tive
00034b (à ± 30 % près
EPT avec du nombre
pourpre de d’origine)
bromocré-
sol
Solution L Liquides de ISO 6887 Diluant
Escherichia colid
de Ringer dilution (toutes les 00012
diluée au parties) ou 00013
quart ± 30 % près
du nombre
Solution de colonies à
peptonée 45 min à 1 h / Quantita-
TSA l’instant T0 —
(20 à 25) °C tive
Solution (à ± 30 % près
peptone-sel 00034b du nombre
d’origine)
Solution
tampon de
phosphate
ISO 11133:2014(F)
59

60
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Clostridium
perfringens
Thioglyco- L ISO 7937 Producti- (21 ± 3) h /
00007 — Qualitative Turbidité (1-2)f —
Listeria Listeria
late vité (37 ± 1) °C
ISO 11133:2014(F)
monocytogenes 4b
TSYEB L ISO 11290 Producti-
00021b
Listeria
monocytogenes (toutes les vité (21 ± 3) h /
monocytogenes 1/2a
parties) — Qualitative Turbidité (1-2)f —
(25 ± 1) °C
00109

Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Listeria Listeri monocytogenes 4b

monocytogenes
Listeria
Gélose Lis- S ISO 11290-1 Producti- 00021b
monocytogenes 1/2a
teria selon vité Bonne crois- Colonies bleu-vert avec halo
— Qualitative
Ottaviani et 00109 sance (2) opaque
Agostij

Escherichia colid
Sélectivité 00012
(44 ± 4) h /
ou 00013 Inhibition
(37 ± 1) °C — Qualitative —
totale (0)
00009
ou 00087
Listeria innocua
Spécificité Colonies bleu-vert sans halo
opaque

Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Campylobacter Campylobacter
jejuni
mCCDAj S ISO 10272 Producti- 00156b Colonies grisâtres, plates et
Campylobacter coli
(toutes les vité 00005 Bonne crois-
— Qualitative humides, parfois avec un reflet

parties) sance (2)
00004 métallique
(44 ± 4) h /

(41,5 ± 1) °C
totale ou par-
Escherichia colid
en micro-aéro- 000012
— Qualitative tielle Aucune colonie caractéristique
biose ou 00013
(0 − 1)
Inhibition
totale (0)
CT-SMAC S Escherichia coli ISO 16654 Producti- 00014
Escherichia coli O157:H7
O157 vité Colonies transparentes avec un
(souche Bonne crois-
non — Qualitative aspect brun-jaunâtre pâle et un
sance (2)
toxino diamètre d’environ 1 mm
(21 ± 3) h /

gène)
(37 ± 1) °C
Staphylococcus aureusd
— Qualitative —
ou 00034 totale (0)
Escherichia colid
00012 Inhibition Croissance de quelques colo-
— Qualitative
Yersinia
ou 00013 partielle (1) nies roses
enterocolitica Yersinia enterocolitica

CIN S ISO 10273 Producti- Colonies caractéristiques
00038b Bonne crois-
vité — Qualitative correspondant à chaque milieu
SSDC 00160 sance (2)
(voir ISO 10273)
(21 ± 3) h / totale ou par-
Escherichia colid
00012
(30 ± 1) °C — Qualitative tielle Aucune colonie caractéristique
ou 00013
(0 − 1)
Inhibition
totale (0)
ISO 11133:2014(F)
61

62
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Vibrio spp.
Vibrio vulnificus
CPC S ISO/ Producti- Colonies jaunes entourées
Vibrio para-
Bonne crois-
autres que TS 21872-2 vité 00187 b — Qualitative d’une coloration jaune dans le
haemolyticus /
ISO 11133:2014(F)
mCPC sance (2)
Vibrio cholerae
milieu
V. cholerae (24 ± 3) h / Bonne crois-

Colonies violettes entourées
00203b — Qualitative d’une coloration violette dans
(37 ± 1) °C non-O1/non-O139 sance (2)

le milieu
Sélectivité 00012
Escherichia colid
Inhibition
ou 00013 — Qualitative —
totale (0)
Bacillus cereus
ou 00090
Bacillus cereus
MYP j S ISO 21871 Producti- (21 ± 3) h Bonne crois- Colonies roses avec halo de
00001 — Qualitative
vité à 48 h / (30 ± 1) °C sance (2) précipitation

Escherichia colid
— Qualitative —
(44 ± 4) h / ou 00013 totale (0)
spizizenii
Spécificité (30 ± 1) °C Colonies jaunes sans halo de

Bacillus cereus
précipitation
Bacillus cereus
PEMBA S ISO 21871 Producti- (21 ± 3) h
Bonne crois- Colonies bleu turquoise avec
vité à (44 ± 4) h / 00001 — Qualitative
sance (2) halo de précipitation
(37 ± 1) °C
Escherichia colid
— Qualitative —
(44 ± 4) h / ou 00013 totale (0)
spizizenii
Spécificité (37 ± 1) °C Colonies blanches sans halo de
Vibrio spp.
précipitation
Vibrio vulnificus
SDS S ISO/ Producti- Bonne crois- Colonies violettes/vertes avec
Vibrio parahae-
00187 b — Qualitative
Vibrio cholerae
autres que TS 21872-2 vité sance (2) un halo opaque
molyticus / V.
cholerae
Bonne crois- Colonies jaunes avec un halo
(24 ± 3) h / 00203b — Qualitative
non-O1/non-O139 sance (2) opaque
(37 ± 1) °C
Sélectivité 00012
Escherichia colid
Inhibition
totale (0)
ou 00090

Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
TBXj S Escherichia ISO 16649-3 Producti- 00012d

Escherichia colih
Bonne crois-
coli β-d- vité 00013d — Qualitative Colonies bleues
sance (2)
glucuronidase 00202b
positive
(21 ± 3) h /
— Qualitative —

(44 ± 1) °C ou 00087 totale (0)
— Qualitative — Colonies blanches à vert-beige
00025
Vibrio parahaemolyticus
TCBS S Vibrio parahae- ISO/ Producti- Bonne crois- Colonies vertes (néga-
cholerae
00185b — Qualitative
molyticus / V. TS 21872-1 vité sance (2) tives à l’essai au sucrose)
Vibrio furnissii
Bonne crois- Colonies jaunes (posi-
(24 ± 3) h / 00186b — Qualitative
sance (2) tives à l’essai au sucrose)
(37 ± 1) °C
Sélectivité 00012
Escherichia colid
Inhibition
totale (0)

ou 00090
Escherichia coli
ceae
VRBGj S Enterobacteria- ISO 21528-1 Producti- 00012b
Salmonella
vité 00013
Bonne crois- Colonies roses à rouges avec ou
00031 — Qualitative
Salmonella
(24 ± 2) h / Typhimuriumd,i sance (2) sans halo de précipitation
(37 ± 1) °C
00030
Enteritidisd,i
— Qualitative —
ou 00087 totale (0)
ISO 11133:2014(F)
63

64
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
XLD S Salmonella ISO 6579 Producti- Salmonella Colonies avec un centre noir

00031
vité Typhimuriumd,i et une zone légèrement trans-
ISO 11133:2014(F)
Bonne crois-
— Qualitative parente de couleur rougeâtre
sance (2)
Salmonella Enteritidisd,i 00030 due à la variation de couleur
du milieu
Sélectivité (24 ± 3) h / Croissance

(37 ± 1) °C ou inhibition
Escherichia colid
00012
— Qualitative partielle Colonies jaunes
ou 00013
(0 − 1)
00009 Inhibition
— Qualitative —
Milieux d’isolement non sélectifs

ou 00087 totale (0)

Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence

ceae Escherichia coli
Gélose S Enterobacteria- ISO 21528 Producti-
(24 ± 2) h / 00012b
nutritivel (toutes les vité
(37 ± 1) °C 00013
Salmonella Salmonella
parties)
ISO 6579 Bonne crois-
(24 ± 2) h / 00031 — Qualitative —
Typhimuriumd,i sance (2)
(37 ± 1) °C
Yersinia
Salmonella Enteritidisd,i 00030
enterocolitica
ISO 10273 (24 ± 2) h / 00038b
Listeria Listeria
(30 ± 1) °C 00160
monocytogenes 4b
TSYEA S ISO 11290 Producti-
00021b
Listeria
monocytogenes (toutes les vité (21 ± 3) h / Bonne crois-
monocytogenes 1/2a
parties) — Qualitative —
(37 ± 1) °C sance (2)
00109

Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Escherichia coli
EPTm L Diluant pour ISO 6887 Dilution 00012b ± 30 % près
tout dénombre- (toutes les 00013 du nombre
ment de micro- parties), de colonies à
organismes ISO 6887-5 TSA l’instant T0 —
(20 à 25) °C tive
(à ± 30 % près

00034b
du nombre
Listeria
d’origine)
monocytogenes 4b
Diluent pour le ISO 11290-2 Dilution ± 30 % près
00021b
dénombrement du nombre
monocytogenes
de Listeria de colonies
Listeria
(1 h ± 5 min) / Quantita- à l’instant
monocytogenes 1/2a
TSA —
(20 ± 2) °C tive T0(à ± 30 %
00109 près du
nombre d’ori-
Salmonella
gine)
Pré-enrichis- ISO 6579 Producti-
00031

sement pour vité Typhimuriumd,i
recherche de (18 ± 2) h /
Salmonella (37 ± 1) °C
00030
Salmonella Enteritidisd,i
Escherichia coli
Pré-enrichis- ISO 21528-1 Producti- 00012b
Salmonella
sement pour vité 00013
recherche (18 ± 2) h /
riaceae
d’Enterobacte- (37 ± 1) °C 00031
Typhimuriumd,i
ou 00030
ISO 11133:2014(F)
65

66
Milieux de référence pour le dénombrement des micro-organismes
Méthode
Milieua Fonction Incubation Souches de contrôle de Critères Réactions caractéristiques
nismes nationale
contrôle
Typee
WDCMc référence
Campylobacter
Gélose au S ISO 10272-2 Producti- 00156 Lot de
sang vité 00005 milieu
ISO 11133:2014(F)
(44 ± 4) h/ (41,5 Quantita-

gélose au P R ≥ 0,7 —
± 1) °C tive
Campylobacter colid 00004 sang déjà
Bacillus cereus
valide
TSA n S Dénombrement — Producti- 00001
spizizenii
des colonies vité
Comme spécifié 00003
Escherichia coli
dans la méthode
Lot de
dans laquelle Quantita- Colonie caractéristique corres-
Listeria
00012 milieu TSA P R ≥ 0,7
TSA est utilisé tive pondant à chaque espèce
monocytogenes 4b
déjà validé
comme milieu de
00021
référence
00034
SDA S Dénombrement — Producti- Comme spécifié Saccharomyces cerevisiae 00058b

des colonies vité dans la méthode
Aspergillus brasiliensis
Lot de Colonie/propagules/germes
dans laquelle Quantita-
milieu SDA P R ≥ 0,7 caractéristiques correspon-
SDA est utilisé 00053b tive
déjà validé dant à chaque espèce
comme milieu de
référence

a Les noms complets des milieux abrégés sont donnés dans le Tableau E.2.
c Pour plus d’informations sur les numéros d’identification des souches de collection de culture et pour les coordonnées, se référer au catalogue de souche de référence disponible sur http://
www.wfcc.info.
d Souche au choix; une des souches, au minimum, doit être utilisée.

f La croissance/turbidité est classée en: 0 — croissance/turbidité nulle, 1 — croissance/turbidité faible, 2 — croissance/turbidité marquée (voir 7.4.1.2, 8.4.1).

g Escherichia coli WDCM 00013 est celui donné par la norme spécifique.
h Escherichia coli WDCM 00013 est un fort producteur de β-D-glucuronidase et WDCM 00202 est un faible producteur de β-D-glucuronidase.
i Certaines restrictions nationales et directives peuvent nécessiter l’utilisation d’un sérovar différent. Se référer aux exigences nationales relatives au choix des sérovars de Salmonella.
j Dans le cas d’une utilisation à la fois quantitative et qualitative du milieu, seuls les résultats des essais quantitatifs sont requis (voir Tableau E.1).
k De plus amples détails concernant le contrôle qualité du milieu MSRV, y compris la concentration finale de l’inoculum et les critères, sont donnés dans l’ISO 6579.
l Si la gélose nutritive est destinée à deux ou trois applications différentes: procéder au minimum à l’essai de croissance de Salmonella (si le laboratoire teste ce micro-organisme).
m Si l’EPT est destinée à deux ou trois applications différentes: procéder au minimum à l’essai d’enrichissement de Salmonella (si le laboratoire teste ce micro-organisme).

n Choisir la ou les souches en fonction de la méthode pour laquelle TSA est utilisé comme milieu de référence.
ISO 11133:2014(F)
67

ISO 11133:2014(F)

Tableau E.2 — Abréviations utilisées pour les milieux dans le Tableau E.1
Abréviation du milieu Nom complet du milieu Norme internationale

Baird-Parker Gélose Baird-Parker ISO 6888-1
BLBVB Bouillon lactosé bilié au vert brillant ISO 4831
ISO 6888-1 et
BHI Bouillon à l’infusion cœur-cervelle
ISO 6888-3
Bolton Bouillon Bolton ISO 10272-1
ISO 6887 (toutes les parties)
ISO 6579
EPT Eau peptonée tamponnée
ISO 11290-2
ISO 21528-1
Brucella Bouillon Brucella ISO 10272 (toutes les parties)
CFC Gélose cétrimide, fucidine, céphaloridine ISO 13720
CIN Gélose cefsulodine, irgasan, novobiocine ISO 10273
CPC Gélose cellobiose-polymyxine B-colistine ISO/TS 21872-2
CT-SMAC Gélose MacConkey-sorbitol avec tellurite-cefixime ISO 16654
DG18 Gélose dichloran glycérol ISO 21527-2
DRBC Gélose dichloran rose bengale chloramphénicol ISO 21527-1
EC Bouillon EC ISO 7251
Bouillon glucosé tamponné à la bile de bœuf et au
EE ISO 21528-1
vert brillant
Fraser Bouillon Fraser ISO 11290-1
Fraser demi Bouillon Fraser-demi ISO 11290-1
IS («TS») Gélose au sulfite de fer («gélose tryptose sulfite») ISO 15213
ITC Bouillon irgasan ticarcilline chlorate de potassium ISO 10273
ISO 4831 et
LST Bouillon tryptosé au lauryl-sulfate
ISO 7251
Gélose modifiée à la céfopérazone, au charbon et au
mCCDA ISO 10272 (toutes les parties)
désoxycholate
mCPC Gélose cellobiose polymyxine B colistine modifiée ISO/TS 21872-2
Bouillon Müller-Kauffmann tétrathionate-novobio-
MKTTn ISO 6579
cine
MMG Bouillon minéral glutamate modifié ISO 16649-3
Gélose pour dénombrement au lait écrémé/gélose
MPCA ISO 4833
pour dénombrement au lait
MRS Milieu MRS (de Man, Rogosa et Sharpe) ISO 15214
MSRV = Milieu Rappaport-Vassiliadis semi‑solide modifié ISO 6579
MYP Gélose mannitol, jaune d’œuf, polymyxine ISO 7932
PCA Gélose pour dénombrement ISO 4833
Gélose polymyxine, pyruvate, jaune d’œuf, manni-
PEMBA ISO 21871
tol, bleu de bromothymol
PPA Gélose à la pénicilline et à la pimaricine ISO/TS 11059
PSB Bouillon peptone, sorbitol, sels biliaires ISO 10273
RPFA Gélose au plasma de lapin et au fibrinogène ISO 6888-2

ISO 11133:2014(F)

Tableau E.2 (suite)
RVS Bouillon peptoné de Rappaport‑Vassiliadis au soja ISO 6579
SDA Gélose Sabouraud dextrose —
Gélose dodécyl sulfate de
SDS ISO/TS 21872-2
sodium polymyxine saccharose
Gélose Salmonella Shigella au désoxycho-
SSDC ISO 10273
late de sodium
TBX Gélose tryptone bile X glucuronide ISO 16649 (toutes les parties)
Gélose thiosulfate – citrate – sels biliaires –
TCBS ISO/TS 21872-1
saccharose
Thioglycolate Milieu liquide au thioglycolate ISO 7937
TSA Gélose tryptone soja —
Gélose sulfite cyclosérine/ Gélose tryptose sul-
TSC/SC ISO 7937
fite cyclosérine sans jaune d’œuf
TSPB Bouillon de tryptone, soja et polymyxine ISO 21871
TSYEA Gélose à la tryptone de soja et à l’extrait de levure ISO 11290 (toutes les parties)
TSYEB Bouillon à la tryptone de soja et à l’extrait de levure ISO 11290 (toutes les parties)
Gélose glucosée biliée au cristal violet et au rouge
VRBG ISO 21528 (toutes les parties)
neutre
Gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge
VRBL ISO 4832
neutre
XLD Gélose xylose-lysine-désoxycholate ISO 6579

ISO 11133:2014(F)

Annexe F
(normative)
Micro-organismes test et critères de performance pour les milieux

de culture couramment utilisés en microbiologie des eaux
Des souches spécifiques ont été sélectionnées pour les essais afin de garantir l’homogénéité entre les
laboratoires et afin de faciliter la démonstration des différences entre les milieux (d’un lot à l’autre,
entre les fabricants). Les souches spécifiées dans le Tableau F.1 ont été entièrement évaluées afin de
garantir leur adéquation et leur homogénéité en termes de performance.
Lorsque plus d’une souche est répertoriée pour chaque aspect des essais de performance (productivité,
sélectivité, spécificité), les souches minimales à utiliser ont été indiquées par la lettre b. On s’attend à
ce que les fournisseurs commerciaux et non commerciaux utilisent des souches supplémentaires, par
exemple celles indiquées dans le Tableau F.1 pour s’assurer de la qualité des milieux de culture qu’ils
fournissent.
Les critères mentionnés doivent être inclus dans les normes spécifiques en cours d’élaboration (nouvelles
normes ou révisions). Un lot validé de milieux est un lot dont il a été démontré que les performances sont
satisfaisantes. Les numéros de souches spécifiés dans le Tableau F.1 sont ceux du catalogue des numéros
d’identification universels de souches compilé par le World Data Centre for Microorganisms (WDCM)
(Centre de données mondial sur les micro-organismes).[20] Ce catalogue contient les détails des souches
de références représentées par chaque numéro WDCM et les coordonnées des collections de cultures.
Tous les milieux mentionnés sont décrits dans des normes EN et ISO.
Si une variabilité des souches est détectée, étudier l’effet du milieu de culture (par exemple, en se procurant
le même milieu auprès d’un fabricant différent) et obtenir une culture de référence supplémentaire issue
de la même collection de cultures que la souche sujette à variabilité. Les utilisateurs sont tenus de fournir
toutes les informations pertinentes relatives à la variabilité des souches au GT 5, Milieux de culture, de
l’ISO/TC 34/SC 9 via le secrétariat de l’ISO/TC 34/SC 9.

ISO 11133:2014(F)

Les notes de bas de tableau utilisés dans le Tableau F.1 sont les suivants:
a Les noms complets des milieux abrégés sont donnés dans le Tableau F.2.
c Pour plus d’informations sur les numéros d’identification des souches de collection de culture
et pour les coordonnées, se référer au catalogue de souche de référence disponible sur http://
www.wfcc.info.
d Souche au choix: une des souches au minimum doit être utilisée.
f De plus amples détails concernant le contrôle qualité des milieux destinés à la Legionella, y com-
pris le stockage des souches de contrôle, sont donnés dans l’ISO 11731.
g De plus amples détails concernant le contrôle qualité et les critères de qualité du milieu MUG/EC
sont donnés dans l’’ISO 9308-3:1998, Annexe E. La sélectivité n’est pas spécifiée dans la norme.
h De plus amples détails concernant le contrôle et les critères de qualité du milieu MUD/SF sont
donnés dans l’ISO 7899-1:1998, Annexe E.
i Certaines restrictions nationales et directives peuvent nécessiter l’utilisation d’un sérovar diffé-
rent. Se référer aux exigences nationales relatives au choix des sérovars de Salmonella.
j La croissance/turbidité est classée en: 0 — croissance/turbidité nulle, 1 — croissance/turbidité
faible, 2 — croissance/turbidité marquée (voir 7.4.1.2, 8.4.1).
k Si l’EPT est utilisée pour deux applications différentes: procéder au minimum à l’essai d’enrichis-
sement de Salmonella (si le laboratoire teste ce micro-organisme).
l Choisir la ou les souches en fonction de la méthode pour laquelle TSA est utilisé comme milieu de
référence.

Tableau F.1 — Micro-organismes test et critères de performance pour les milieux de culture couramment utilisés en microbiologie des
72
eaux
Milieux sélectifs pour le dénombrement des micro-organismes par comparaison avec un milieu de référence non sélectif
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Escherichia Escherichia coli
ISO 11133:2014(F)
Colilert-18 L ISO 9308-2 Producti- 00013b TSA Quantita- P R ≥ 0,5 Couleur jaune et fluorescence
Klebsiella pneumoniae
coli / bactéries vité 00090 tive pour E. coli
coliformes
00206 TSA Quantita- P R ≥ 0,5 Couleur jaune supérieure ou
(20 ± 2) h /
tive égale au comparateur pour les

(36 ± 2) °C
bactéries coliformes
Pseudomonas aeruginosad
00024 Inhibition Moins jaune que le compara-
Sélectivité — Qualitative
Legionella Legionella pneumophila

ou 00025 totale (0) teur
GVPCf S ISO 11731 et Producti- 2 à 5 jours / 00107 b Colonies blanches-grises-
ISO 11731-2 vité (36 ± 2) °C 00180
Legionella anisa
Quantita- bleues-violettes avec un bord
BCYE P R ≥ 0,5
5 à 10 jours / tive entier et présentant un aspect

00106 en verre dépoli caractéristique
(36 ± 2) °C
— Qualitative —
ou 00087 totale (0)

3 jours / Pseudomonas aeruginosad 00026 Inhibition
(36 ± 2) °C ou 00025 totale ou
— Qualitative partielle —
Escherichia colid
00012
Escherichia coli /
ou 00013 (0-1)
Escherichia coli
Gélose S ISO 9308-1 Producti- 00179b
lactosée bactéries coli- vité 00012
Enterobacter aerogenes
au TTC formes 00013 Quantita- Couleur jaune dans le milieu
TSA P R ≥ 0,5
tive sous la membrane
00175
(21 ± 3) h /
00006
(36 ± 2) °C
— Qualitative —
ou 00087 totale (0)
Spécificité 00025 Colonies rouges, couleur bleue
— Qualitative —
ou 00026 dans le milieu

Tableau F.1 — (suite)
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Clostridium
perfringens
mCP S Directive du Producti- TSA ou
Conseil vité autre
00007 b
98/83/CE milieu non Quantita- Colonies jaunes, essai à la phos-
00080 P R ≥ 0,5
sélectif tive phatase positif
00174
(21 ± 3) h / pour les

(44 ± 1) °C anaérobies
Clostridium bifermentans
en anaérobiose
Spécificité Colonies bleues, essai à la phos-
phatase négatif
Escherichia colid
— Qualitative —
Pseudomonas
ou 00013 totale (0)
aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

Pseudo- S ISO 16266 Producti- 00024b Colonies bleu-vert avec
Quantita-
monas CN vité 00025 TSA P R ≥ 0,5 fluorescence sous lumière UV
tive
00026 (360 ± 20 nm)
(44 ± 4) h /
Escherichia colid
Sélectivité 00012 —
(36 ± 2) °C
ou 00013

Inhibition
— Qualitative
totale (0)
00009
ou 00087
Slanetz et S Entérocoques ISO 7899-2 Producti- 00009b
Bartley intestinaux vité Enterococcus faecalisd 00087
00176 Quantita- Colonies rouges, marron ou
TSA P R ≥ 0,5
tive roses
Enterococcus faeciumd
00177
(44 ± 4) h / 00178
(36 ± 2) °C
Escherichia colid
Sélectivité 00012
ou 00013 Inhibition
— Qualitative —
totale (0)
00032
ou 00034
Sulfite de S Anaérobies ISO 6461-2 Producti- TSA ou
fer sulfito-réduc- vité autre
teurs (clostridia) milieu non
Tryptose- 00007 b sélectif Quantita-
sulfite (TS) (44 ± 4) h / P R ≥ 0,5 Colonies noires
00080 pour les tive
(37 ± 1) °C anaérobies
en anaérobiose ou gélose
au sang
Escherichia colid
Spécificité 00012
ou 00013
ISO 11133:2014(F)
73

74
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Clostridium
perfringens
TSC S ISO 14189 Producti- TSA ou
vité autre
ISO 11133:2014(F)
milieu non
00007 b
sélectif Quantita-
(21 ± 3) h / 00080 P R ≥ 0,5 Colonies noires
pour les tive
(44 ± 1) °C 00174
anaérobies
en anaérobiose ou gélose
au sang
spizizenii
Spécificité Inhibition
Milieux sélectifs pour le dénombrement des micro-organismes par comparaison avec un lot précédemment accepté (à utiliser dans des cas spécifiques)
totale (0)
Méthode

nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Colilert-18 L Escherichia ISO 9308-2 Producti- Escherichia coli 00013b Lot de Quantita- P R ≥ 0,7

coli / bactéries vité 00090 milieu Coli- tive Couleur jaune et fluorescence
coliformes lert déjà pour E. coli
Klebsiella pneumoniae
validé
(20 ± 2) h / 00206 Lot de Quantita- P R ≥ 0,7
Couleur jaune supérieure ou
(36 ± 2) °C milieu Coli- tive
égale au comparateur pour les
lert déjà
bactéries coliformes
validé
00024 Inhibition Moins jaune que le compara-
Sélectivité — Qualitative
Legionella
ou 00025 totale (0) teur
Legionella pneumophila
GVPCf S ISO 11731 et Producti- 2 à 5 jours / 00107 b Lot de
ISO 11731-2 vité (36 ± 2) °C 00180 milieu Colonies blanches-grises-

Legionella anisa
Quantita- bleues-violettes avec un bord
00106 Lot de P R ≥ 0,7
5 à 10 jours / tive entier et présentant un aspect
milieu GVPC en verre dépoli caractéristique
(36 ± 2) °C
déjà validé
— Qualitative —
ou 00087 totale (0)
3 jours / 00026 Inhibition
(36 ± 2) °C ou 00025 totale ou par-
— Qualitative tielle —
Escherichia colid
00012
ou 00013 (0 - 1)

Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Gélose S Escherichia ISO 9308-1 Producti- Escherichia coli 00179b Lot de

lactosée au coli /bactéries vité 00012
milieu
Enterobacter aerogenes
TTC coliformes 00013 gélose Quantita- Couleur jaune dans le milieu
P R ≥ 0,7
lactosée au tive sous la membrane
00175
TTC déjà

(21 ± 3) h / validé
00006
(36 ± 2) °C
— Qualitative —
ou 00087 totale (0)

Spécificité 00025 Colonies rouges, couleur bleue
— Qualitative —
ou 00026 dans le milieu
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Clostridium
perfringens Clostridium perfringens

mCP S Directive du Producti- 00007 b Lot de
Quantita- Colonies jaunes; essai à la phos-
Conseil 98/83/ vité 00080 milieu mCP P R ≥ 0,7
(21 ± 3) h / tive phatase positif
CE 00174 déjà validé
Clostridium bifermentans
(44 ± 1) °C
Spécificité en anaérobiose Colonies bleues, essai à la phos-
phatase négatif

Escherichia colid
— Qualitative —
Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa

ou 00013 totale (0)
aeruginosa
Pseudo- S ISO 16266 Producti- Lot de
monas CN vité 00024b milieu Colonies bleu-vert avec
Quantita-
00025 Pseudomo- P R ≥ 0,7 fluorescence sous lumière UV
tive
00026 nas CN déjà (360 ± 20 nm)
(44 ± 4) h / validé
(36 ± 2) °C
Escherichia colid
Sélectivité 00012
ou 00013 Inhibition
— Qualitative —
totale (0)
00009
ou 00087
ISO 11133:2014(F)
75

76
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Enterococcus faecalis
Slanetz et S Entérocoques ISO 7899-2 Producti- 00009b Lot de
Bartley intestinaux vité 00087
ISO 11133:2014(F)
milieu
00176 Quantita- Colonies rouges, marron ou
Slanetz et P R ≥ 0,7
tive roses
Bartley
Enterococcus faeciumd
00177
(44 ± 4) h / 00178 déjà validé
(36 ± 2) °C
Escherichia colid
Sélectivité 00012
ou 00013 Inhibition
— Qualitative —
totale (0)
00032
ou 00034
Méthode


nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence

Sulfite de S Anaérobies sul- ISO 6461-2 Producti- Lot de
fer fito-réducteurs vité milieu au
00007 b Quantita-
(clostridia) (44 ± 4) h / sulfite de P R ≥ 0,7 Colonies noires
Tryptose- 00080 tive
(37 ± 1) °C fer ou TS
sulfite (TS) déjà validé
en anaérobiose
Escherichia colid
Spécificité 00012
Clostridium
ou 00013
perfringens Clostridium perfringens

TSC S ISO 14189 Producti- 00007 b Lot de
Quantita-
vité (21 ± 3) h / 00080 milieu TSC P R ≥ 0,7 Colonies noires
tive
(44 ± 1) °C 00174 déjà validé
spizizenii
Sélectivité en anaérobiose Inhibition
Milieux non sélectifs pour le dénombrement des micro-organismes

totale (0)
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Escherichia colid
YEA S Flore totale ISO 6222 Producti- 00012
vité ou 00013 Lot de
(44 ± 4) h / Quantita-
spizizenii
milieu YEA P R ≥ 0,7 —
(36 ± 2) °C 00003 tive
déjà validé

Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Campylobacter
Campylobacter jejuni
Bolton L ISO 17995 Producti- 00156b
Preston vité 00005
00012
+ Proteus mirabilis
ou 00013

Petites colonies plates ou
Campylobacter coli
00023 > 10 colonies
— Qualitative convexes avec une surface
(44 ± 4) h / sur mCCDA
00004b brillante
(37 ± 1) °C
en microaéro-
00012
biose + Escherichia coli d
+ Proteus mirabilis
ou 00013
00023
Escherichia colid
Proteus mirabilis
ou 00013 — Qualitative totale (0) sur —
TSA
Escherichia
00023
Escherichia coli

MUG/ECg L ISO 9308-3 Producti-
48 h/ Les détails de la méthode de contrôle et des critères de qualité du milieu
coli /bactéries vité 00179
(44 ± 0,5) °C MUG/EC sont donnés dans l’ISO 9308-3:1998, Annexe E.
coliformes
Enterococcus hirae
MUD/SF h L Entérocoques ISO 7899-1 Producti- 00176
intestinaux vité
Enterococcus faecium
00089
Aerococcus viridans
00178
(44 ± 4) h / Les détails de la méthode de contrôle et des critères de qualité du milieu
Lactococcus lactis
Sélectivité (44 ± 0,5) °C 00061 MUD/SF sont donnés dans l’ISO 7899-1:1998, Annexe E.
Staphylococcus epider-
00016
midis
00132
ISO 11133:2014(F)
77

78
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Salmonella
Salmonella
RVS L ISO 19250 Producti- Salmonella Enteritidisd,i
00030
vité
ISO 11133:2014(F)
00031

sur XLD ou
— Qualitative correspondant à chaque milieu
sur un autre
(voir norme)
00012
milieu au choix
ou 00013
nosa
(24 ± 3) h /
(41,5 ± 1) °C 00025
Escherichia colid
00012 partielle
— Qualitative —
ou 00013 ≤ 100 colonies
sur TSA
00009 < 10 colonies
— Qualitative —

ou 00087 sur TSA

Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
DRCM L Anaérobies sul- ISO 6461-1 Producti- 00007 b
(44 ± 4) h / — Qualitative Turbidité (1-2)j Noircissement
fito-réducteurs vité 00080
(clostridia) (36 ± 1) °C
Escherichia colid
Spécificité en anaérobiose 00012
— Qualitative Turbidité (0-1)j Aucun noircissement
ou 00013
Escherichia colid
Solution L Liquides de ISO 8199 Diluant 00012
saline dilution ou 00013
Diluant
peptoné
À ± 30 % près
Solution du nombre
peptone-sel de colonies à
TSA l’instant T0(à —
Solution (20 à 25) °C tive
00034b ± 30 % près
de Ringer du nombre
(diluée au d’origine)
quart)
Solution
tampon de
phosphate

Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Campylobacter
Campylobacter jejuni
mCCDA S ISO 17995 Producti- 00156b
Campylobacter coli
Petites colonies plates ou
vité 00005 Bonne crois-
— Qualitative convexes avec une surface

sance (2)
00004 brillante
(44 ± 4) h /

(41,5 ± 1) °C
totale ou par-
Escherichia colid
en microaéro- ou 00013
— Qualitative tielle Aucune colonie caractéristique
biose ou 00179
ou 00090 (0−1)
00032 Inhibition
— Qualitative —
Salmonella Salmonella
ou 00034 totale (0)
XLD S ISO 19250 Producti- Colonies avec un centre noir
00031
vité Typhimuriumd,i et une zone légèrement trans-
Bonne crois-
— Qualitative parente de couleur rougeâtre
sance (2)
Salmonella Enteritidisd,i 00030 due à la variation de couleur
du milieu

Sélectivité (24 ± 3) h / Croissance
(36 ± 2) °C ou inhibition
Escherichia colid
00012
— Qualitative partielle Colonies jaunes
ou 00013
(0−1)
00009 Inhibition
— Qualitative —

ou 00087 totale (0)
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
dénombrement
EPT k L Diluant pour ISO 6887 Dilution À +/- 30 %
Escherichia colid
près du
de tous les 00012 nombre de
micro-orga- ou 00013 colonies à
nismes TSA l’instant T0 —
(20 à 25) °C tive
(à +/- 30 %
00034 près du
nombre d’ori-
Salmonella
gine)
Pré-enrichis- ISO 19250 Producti-
00031
sement pour vité Typhimuriumd,i
Salmonella
recherche de (18 ± 2) h /
— Qualitative Turbidité (1-2)j —
(36 ± 2) °C
ISO 11133:2014(F)
79

00030

80
Milieux de référence pour le dénombrement des micro-organismes
Méthode
nismes nationale
contrôle
Milieua Typee
WDCMc référence
Legionella pneumophila
BCYE S Dénombrement ISO 11731 et Producti- Lot de Quantita- P R ≥ 0,7 Colonies blanches-grises-
des colonies ISO 11731-2 vité 2 à 5 jours / milieu tive bleues-violettes avec un bord
ISO 11133:2014(F)
00107 b
(36 ± 2) °C BCYE déjà entier et présentant un aspect
validé en verre dépoli caractéristique
TSA l S Dénombrement — Producti- 00012
Escherichia colid
des colonies vité 00013
Comme spécifié
00090
dans la méthode
00179 Lot de
dans laquelle Quantita- Colonie caractéristique corres-
milieu TSA P R ≥ 0,7
TSA est utilisé 00007 tive pondant à chaque espèce
déjà validé
comme milieu de
référence 00024
00087
a Les noms complets des milieux abrégés sont donnés dans le Tableau F.2.

c Pour plus d’informations sur les numéros d’identification des souches de collection de culture et pour les coordonnées, se référer au catalogue de souche de référence disponible sur http://
www.wfcc.info.
d Souche au choix: une des souches au minimum doit être utilisée.
f De plus amples détails concernant le contrôle qualité des milieux destinés à la Legionella, y compris le stockage des souches de contrôle, sont donnés dans l’ISO 11731.
g De plus amples détails concernant le contrôle qualité et les critères de qualité du milieu MUG/EC sont donnés dans l’ISO 9308-3:1998, Annexe E. La sélectivité n’est pas spécifiée dans la
norme.
h De plus amples détails concernant le contrôle et les critères de qualité du milieu MUD/SF sont donnés dans l’ISO 7899-1:1998, Annexe E.
i Certaines restrictions nationales et directives peuvent nécessiter l’utilisation d’un sérovar différent. Se référer aux exigences nationales relatives au choix des sérovars de Salmonella.
j La croissance/turbidité est classée en: 0 — croissance/turbidité nulle, 1 — croissance/turbidité faible, 2 — croissance/turbidité marquée (voir 7.4.1.2, 8.4.1).
k Si l’EPT est utilisée pour deux applications différentes: procéder au minimum à l’essai d’enrichissement de Salmonella (si le laboratoire teste ce micro-organisme).
l Choisir la ou les souches en fonction de la méthode pour laquelle TSA est utilisé comme milieu de référence.

ISO 11133:2014(F)

Tableau F.2 — Abréviations utilisées pour les milieux dans le Tableau F.1

Milieu gélosé tamponné à l’extrait de levure et au char-
BCYE ISO 11731 et ISO 11731-2
bon actif
Bolton Bouillon Bolton ISO 17995
ISO 6887
EPT Eau peptonée tamponnée
ISO 19250
DRCM Milieu différentiel renforcé pour Clostridium ISO 6461-1
Gélose tamponnée à l’extrait de levure et au charbon
GVPC actif avec glycine, vancomycine, polymyxine B, cyclo- ISO 11731 et ISO 11731-2
heximide
Gélose lactosée au chlorure de triphényltétrazolium
Gélose lactosée au TTC ISO 9308-1
avec sulfate sodique d’heptadécyle
Gélose modifiée à la céfopérazone, au charbon et au
mCCDA ISO 17995
désoxycholate
Directive du Conseil
mCP Gélose clostridium perfringens sur membrane
98/83/CE
MUD/SF Milieu 4-méthylumbelliféryl-α-D-glucopyranoside/SF ISO 7899-1
MUG/EC Milieu 4- méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide/EC ISO 9308-3
Preston Bouillon Preston ISO 17995
Pseudomonas CN Gélose Pseudomonas cétrimide acide nalidixique ISO 16266
RVS Bouillon peptoné de Rappaport-Vassiliadis au soja ISO 19250
Slanetz et Bartley Milieu de Slanetz et Bartley ISO 7899-2
Sulfite de fer Gélose de sulfite de fer ISO 6461-2
Tryptose Sulfite (TS) Gélose tryptose sulfite ISO 6461-2
TSA Gélose tryptone soja —
TSC Gélose tryptose sulfite cyclosérine (sans jaune d’œuf) ISO 14189
XLD Gélose xylose-lysine-désoxycholate ISO 19250
YEA Gélose à l’extrait de levure ISO 6222

ISO 11133:2014(F)

Annexe G
(normative)
Utilisation de cartes de contrôle pour le suivi des essais

quantitatifs des milieux de culture solides
G.1 Généralités
La présente annexe décrit l’utilisation de cartes de contrôle afin de suivre les résultats, en particulier
ceux exprimés sous forme de ratio de productivité, PR , comme détaillé en 7.2, dans le cas des essais sur
géloses sélectives ou non sélectives par rapport à des géloses de référence non sélectives appropriées ou
aux lots précédemment acceptés de la même gélose sélective.
Une attention particulière devra être portée dans le cas de l’application des cartes de contrôle pour des
géloses testées contre un lot précédemment validé de la même gélose, car une dérive de la qualité des lots
successifs peut ne pas être détectée sauf si les suspensions d’essai ont été soigneusement contrôlées afin
d’obtenir des valeurs d’inocula standardisés, ou si des matériaux de référence (voir 3.4.6) sont utilisés.
Tout système de contrôle qualité des milieux de culture, basé sur des contrôles de lots par rapport à des
lots précédemment validés doit faire l’objet d’une vérification avant sa mise en place.
Chaque source et lot d’une gélose d’essai est susceptible de présenter des niveaux de productivité
variables et les laboratoires individuels peuvent utiliser des géloses de référence différentes pour leur
comparaison. Par conséquent, les laboratoires individuels doivent établir et justifier leurs propres limites
et/ou plages d’acceptabilité (tolérances acceptables) des ratios de productivité pour chaque gélose test,
couramment utilisées en routine, comprises dans la plage des valeurs de ratio de productivité spécifiées
en 7.2.2.1.2. Les cartes de contrôle sont préparées à partir des données de validation initiale, les limites
acceptables sont établies en utilisant l’analyse statistique, puis les cartes sont utilisées pour contrôler
les lots suivants. Les limites acceptables sont revues périodiquement (par exemple après chaque série
de 30 essais) et les limites sont ajustées si nécessaire (plus d’informations sont données en G.2.6).
Ces procédures nécessitent l’utilisation d’une suspension microbienne de concentration connue de la
souche cible spécifiée pour le milieu d’essai à l’Annexe E ou à l’Annexe F. Cette concentration constitue la
valeur cible pour l’essai. Il convient que la suspension d’essai soit un MR commercial (voir 3.4.6), ou qu’elle
soit préparée par le laboratoire à partir de cultures de travail des souches de référence soigneusement
standardisées. La stabilité et l’homogénéité de la concentration en micro-organismes dans la suspension
du laboratoire (valeur cible) pendant la période d’utilisation doivent être démontrées.
Afin d’optimiser le contrôle, ces suspensions doivent contenir environ 100 UFC (plage comprise entre
80 UFC et 120 UFC) par volume d’inoculum à appliquer sur les géloses et il convient normalement
d’effectuer les essais au moins en double. Le Tableau 1 (voir5.4.2.5.1) donne les données de fidélité pour
différents niveaux d’ensemencement afin de montrer l’importance du maintien de cet inoculum optimal.
Les géloses doivent être ensemencées en utilisant la technique par étalement, la technique
d’ensemencement en profondeur ou la technique de filtration sur membrane, selon la méthode indiquée
dans la norme de référence pour laquelle la gélose est utilisée, et être incubées dans les conditions
définies dans les normes individuelles.
Les colonies présentes sur ou dans chaque boîte doivent être dénombrées conformément aux méthodes
normalisées de référence et les rapports de productivité doivent être calculés comme indiqué en 7.2.1.1.

ISO 11133:2014(F)

G.2 Utilisation de cartes de contrôle

G.2.1 Mode opératoire général
Afin d’établir une nouvelle carte de contrôle, au moins 10 essais sur différents lots de la même gélose
d’essai doivent être effectués, de préférence en double, sur des jours différents et par différents
techniciens (conditions de reproductibilité intralaboratoire). L’utilisation de 20 essais (comme dans la
méthode en G.2.2) permet d’obtenir des limites plus fiables. Une carte préparée en utilisant 10 essais
initiaux (le nombre minimal) doit donc être recalculée lorsque 20 résultats sont disponibles. Des cartes
individuelles doivent être suivies sur une base glissante, d’au moins 30 essais retenus pour chaque
évaluation continue de la qualité des milieux (voir G.2.6).
G.2.2 Production d’une carte de contrôle

Cette méthode est basée sur un inoculum normalisé contenant (100 ± 20) UFC dans l’inoculum de 0,1 ml
utilisé pour un essai effectué à l’aide de la technique par étalement. Elle est également appropriée
lorsque d’autres volumes d’inoculum sont utilisés pour d’autres méthodes d’ensemencement, telles que
l’ensemencement en profondeur ou la filtration sur membrane, à condition que l’inoculum contienne un
nombre de colonies situé dans la plage acceptable de (100 ± 20) UFC.
La moyenne des deux ensembles de dénombrements en double au ième essai est de xi UFC/0,1 ml pour le
milieu d’essai et de yi UFC/0,1 ml pour le milieu de référence. Le ratio de productivité pour le ième essai
est de xi/yi = ri. Pour une série d’essais avec i = 1, 2, …., n, où n est au minimum de 10, de préférence de 20,
utiliser la Formule (G.1) pour calculer la valeur moyenne PR r :
n
r + r + r + ... rn
∑
1
r= ri = 1 2 3 (G.1)
n i =1 n
Utiliser ensuite la Formule (G.2) pour déterminer la plage moyenne, R , des valeurs PR:
n
∑
1
R= r −r (G.2)
( n − 1) i =2 i i −1
où
i est le nombre d’essais,
n est le nombre total d’essais,
ri est la ième valeur PR .
Déterminer ensuite l’écart-type (s):
R
s = 0, 886 5 × R = (G.3)
1, 128
NOTE La constante 0,886 5 (ou sa réciproque 1,128) est la norme recommandée par l’ASTM pour déterminer
l’écart-type de la plage moyenne des valeurs d’essai en double.
Calculer les limites pour l’intervalle de confiance de 95 % (± 2s) et de 99 % (± 3s) de la distribution des
résultats.
Sur l’axe des ordonnées de la carte de contrôle, indiquer les positions de la valeur PR moyenne globale,
r , et de chacune des deux limites supérieures (+2s et +3s) et inférieures (–2s et –3 s) puis tracer des
lignes parallèles à l’axe des abscisses. Reporter le résultat de chaque valeur PR individuelle pour
i = 1, 2, …. n sur l’axe des abscisses (voir exemple).

ISO 11133:2014(F)

Chaque fois qu’un nouveau lot de milieu est préparé, il est soumis à essai à l’aide d’un inoculum standard
et le PR est calculé à partir du rapport du nombre d’UFC dénombrées après incubation sur le milieu
d’essai sur celui dénombré après incubation sur le milieu de référence, comme décrit ci-dessus. Cette
valeur est reportée sur la carte de contrôle et vérifiée par rapport aux limites dérivées.
G.2.3 Exemple pratique de production d’une carte de contrôle utilisant 20 résultats

Le Tableau G.1 présente les résultats de 20 vérifications successives du ratio de productivité sur des lots
de la même gélose d’essai non sélective utilisant un inoculum normalisé de 110 UFC/0,1 ml dénombrées
sur le milieu de référence non sélectif (dans la pratique, les dénombrements effectifs sur le milieu de
référence seront différents de ceux présentés ci-dessous, les données n’étant utilisées que pour présenter
le principe d’établissement de la carte de contrôle à partir des ratios de productivité calculés).
Tableau G.1 — Enregistrement de 20 vérifications successives du ratio de productivité sur

une gélose d’essai non sélective utilisées pour établir une carte de contrôle(montrant les
dénombrements effectifs sur le milieu d’essai uniquement, les dénombrements sur le milieu de
référence yi sont toujours de 110 UFC)
Résultat du numéro d’essai (i)
i = 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
UFC (gélose d’essai - xi) 95 102 94 97 105 68 98 105 103 116
ri 0,86 0,93 0,85 0,88 0,95 0,62 0,89 0,95 0,94 1,05
|ri – r i–1| – 0,07 0,08 0,03 0,07 – 0,06 0,06 0,01 0,11
i = 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
UFC (gélose d’essai - xi) 95 90 89 116 114 110 114 98 88 102
ri 0,86 0,82 0,81 1,05 1,04 1,00 1,04 0,89 0,80 0,93
|ri – r i–1| 0,19 0,04 0,01 0,24 0,01 0,04 0,04 0,15 0,09 0,13
Il est important de noter que le faible résultat de l’essai 6 dans cet exemple pour une gélose non sélective
était inférieur à la plage autorisée pour la valeur PR acceptable comprise entre 0,70 et 1,40 pour les
géloses non sélectives (voir 7.2.2.1.2) et que tous les résultats de ce type sont exclus en tant que «valeurs
aberrantes» lors du calcul de la moyenne et de l’écart-type pour la carte de contrôle.
Il convient de rechercher les raisons pour lesquelles les résultats d’essai du PR sont en-dessous de la
plage autorisée, car ils sont souvent associés à une mauvaise performance de l’essai plutôt qu’à une
mauvaise qualité des milieux. Ce phénomène est fréquent lorsque l’inoculum utilisé est en dehors de la
plage de précision spécifiée de 80 UFC à 120 UFC.
La valeur PR moyenne est égale à:
r= ∑ ri n = ( 0, 86 + 0, 93 + 0, 85 + ... + 0, 80 + 0, 93) 19 = 17, 5 19 = 0, 92 (G.4)
(représentée par la droite en trait plein sur la Figure G.1).
Les valeurs de plage ( R = ri − ri −1 ) sont définies comme les différences absolues des valeurs séquentielles,
sauf dans le cas d’une valeur exclue (par exemple, essai numéro 6 dans le Tableau G.1 ci-dessus), c’est-à-
dire:
0,93 – 0,86 = 0,07, 0,85 – 0,93 = 0,08, 0,88 – 0,85 = 0,03, etc.

ISO 11133:2014(F)

La plage moyenne est égale à:

−
R= ∑ Ri (n − 1) = (0, 07 + 0, 08 + 0, 03 + ... + 0, 09 + 0,13) 18 = 1, 43 18 = 0, 08 (G.5)
Par conséquent, l’écart-type, s = 0,8865 × 0,08 = 0 071.
Les limites de confiance à 95 % (représentées par les droites en pointillés fins sur la Figure G.1) sont:
0,92 ± 2 × 0,071 = 0,92 ± 0,14 = 0,78 à 1,06
(G.6)
Les limites de confiance à 99 % (représentées par les droites en pointillés épais sur la Figure G.1) sont:
0,92 ± 3 × 0,071 = 0,92 ± 0,21 = 0,71 à 1,13
(G.7)
Légende
Y ratio de productivité, PR
X numéro d’essai
Figure G.1 — Carte de contrôle établie à partir des ratios de productivité obtenus à partir des
20 premières vérifications données dans le Tableau G.1 (le résultat aberrant 6 a été exclu)
G.2.4 Évaluation de performance et interprétation des résultats

Un lot de milieu de culture doit être accepté si à la fois les critères de qualité généraux (voir 6.2) et les
critères de qualité microbiologiques sont remplis.

ISO 11133:2014(F)

Un nouveau lot de milieu doit être rejeté si l’un des résultats suivants est obtenu pour les essais
quantitatifs effectués comme décrit ci-dessus, car il s’agit de situations «hors de contrôle»:
— un seul dépassement de la limite d’action de ± 3s,
— deux observations sur trois consécutives dépassent la limite de surveillance de ± 2s,
— six observations consécutives augmentant ou diminuant régulièrement,
— neuf observations consécutives se situant du même côté inférieur ou supérieur de la moyenne.
NOTE Un critère de 4 observations consécutives dépassant un niveau de ± 1 s peut également être indicateur
d’un problème en développement.
G.2.5 Autres approches pour le contrôle de la performance des milieux

Le mode opératoire d’utilisation d’une carte de contrôle pour surveiller la performance des milieux
donné ci-dessus est spécifiquement établi pour représenter les valeurs PR sans conversion en log10 des
colonies dénombrées.
D’autres approches basées sur la représentation directe des valeurs de dénombrement des colonies
ou des dénombrements de colonies convertis en log10 sont acceptables s’il est démontré qu’elles sont
appropriées. Des méthodes permettant de vérifier si les distributions des données de dénombrement des
colonies sont conformes ou non à la normalité sans conversion en log10 à l’aide du test de Kolmogorov-
Smirnov ou du test du khi-deux, ainsi que des exemples pratiques de ces méthodes sont donnés dans le
document NEN 6603.[39]
Il convient toutefois de noter que si les dénombrements n’incluent pas le facteur de dilution, alors il
est peu probable qu’une conversion en log10 soit appropriée. Il est recommandé de baser la conversion
des dénombrements directs (par exemple 100 UFC/boîte) sur une distribution de Poisson pour laquelle
la transformation du dénombrement x est √x. De plus, dans toute situation où les dénombrements de
colonies sont représentés directement, il est essentiel de garantir que le niveau de l’inoculum d’essai est
constant entre les différents essais, sous peine d’obtenir des résultats trompeurs.
G.2.6 Revue périodique des cartes de contrôle

La première carte de contrôle ainsi que les cartes de contrôle suivantes, pour un milieu particulier testé,
doivent être revues périodiquement pour garantir que les limites fixées restent acceptables malgré la
dérive des cartes de contrôle. La première carte contenant un minimum de 20 points de données est
revue pour fixer (rétablir) les limites initiales et les cartes suivantes peuvent ensuite être revues à la
fréquence suggérée, c’est-à-dire tous les 30 points de données, par les modes opératoires indiqués ci-
dessous.
Dès qu’une carte de contrôle est remplie, calculer de nouveau la moyenne et l’écart-type s, en enlevant
les résultats situés en dehors de la tolérance acceptable ou des limites fixées. Si une transformation en
log10 a été utilisée, tous les calculs doivent être effectués en utilisant les résultats transformés en log10.
Comparer l’écart-type de la carte actuelle à celui de tous les résultats précédents, stot, et vérifier la
variation à l’aide du critère suivant:
s2
< F ( 0, 975; n − 1, ntot − 1) (G.8)
s tot
2
où, F (0,975; n – 1, ntot – 1) est la valeur de l’essai F à une probabilité de α = 0,025 à n observations de s,
et ntot observations de stot .
La variation est significativement augmentée si s ne remplit pas ce critère et il convient d’en rechercher
la cause probable.
Si l’écart-type de la carte de contrôle qui en résulte remplit ce critère, combiner, pour la carte de contrôle
suivante, les données avec les observations précédentes [voir Formule (G.9) pour un exemple des calculs].

ISO 11133:2014(F)

Comparer également la moyenne, x , de la carte actuelle avec la moyenne de toutes observations

précédentes, x tot , et procéder à l’essai à l’aide critère suivant:
s 2 s tot
2
x − x tot < 2 + (G.9)
n ntot
où
x est la valeur moyenne de la carte de contrôle actuelle,
x tot est la valeur moyenne de toutes les cartes de contrôle précédentes,
s est l’écart-type de la carte de contrôle,
stot est l’écart-type de toutes les cartes de contrôle précédentes,
n est le nombre total d’observations de la carte de contrôle actuelle,
ntot est le nombre total d’observations de toutes les cartes de contrôle précédentes.
Si la moyenne de la carte de contrôle actuel remplit le critère, combiner les données avec les observations
précédentes pour la carte de contrôle suivante.
Démarrer une recherche de la cause probable si le critère n’est pas rempli. Si la cause ne peut pas
être élucidée, commencer une nouvelle carte de contrôle et fixer de nouvelles limites basées sur les
observations précédentes en recalculant les limites à partir de la moyenne et de l’écart-type de toutes
les observations.
EXEMPLE Exemple de calcul:
Des exemples de données sont fournis dans le Tableau G.2, basé sur trois cartes de contrôle contenant
chacune 30 observations. xtot, stot et s tot
2
se rapportent aux données combinées des cartes 1 et 2.
Une des observations de la deuxième carte (numéro 22, indiquée en italique) dépasse la limite acceptable
fixée par le laboratoire à partir de ses propres données et cette observation n’est donc pas utilisée dans
les calculs.

ISO 11133:2014(F)

Tableau G.2 — Données pour 3 cartes de contrôle pour l’évaluation par rapport aux limites
fixées par un laboratoire (tirées de la norme NEN 6603[39])
Résultats de l’essai
Mesure 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Carte 1 100 77 108 75 83 92 70 81 90 88
Carte 2 74 81 60 66 109 83 73 82 74 89
Carte 3 89 75 67 63 90 77 90 75 53 91
Mesure 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Carte 1 78 82 90 95 75 86 100 98 75 92
Carte 2 80 83 95 71 98 74 76 92 84 88
Carte 3 99 74 88 68 100 81 97 89 80 71
Mesure 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Carte 1 74 80 98 79 82 91 78 90 65 60
Carte 2 67 130 97 98 64 85 101 73 67 82
Carte 3 63 84 82 84 99 79 86 70 72 98
Calculs pour les données des cartes indivi-

duelles
x s s2 xtot s tot s tot
2 À partir des don-
nées combinées
Carte 1 84,4 11,1 122,7 83,0 11,7 136,1 des Cartes 1 et 2
Carte 2 81,6 12,3 150,8 − − −

Carte 3 81,1 12,1 147,5 − − −
L’analyse de la variation de l’écart-type par comparaison de l’écart-type, s, de la dernière carte (Carte 3)

et celui des deux premières cartes (s tot) comme spécifié ci-dessous donne le résultat suivant:
s 2 147, 5
= = 1, 084 (G.10)
s tot
2 136, 1
La valeur critique est F (0,975; 29,58) = 1,83. La valeur observée est inférieure à la valeur critique, il n’y
a donc pas de différence significative entre l’écart-type de la Carte 3 et celui des cartes précédentes (1
et 2).
L’analyse de la variation de la valeur moyenne pour ces données comme décrit ci-dessus donne le résultat
suivant:
Les données pour la Carte 3 donnent |81,1 − 83,0| = 1,9 et la valeur critique donne:
147, 5 136, 1
2 + = 5,4 (G.11)
30 59
La valeur calculée pour la Carte 3 est inférieure à la valeur critique, il n’y a donc pas de différence
significative entre la moyenne de la Carte 3 et celle des cartes précédentes (Cartes 1 et 2).
L’analyse de la variation étant également valable, les données de la Carte 3 sont combinées à celles des
cartes précédentes pour calculer les nouvelles limites. La nouvelle carte est donc conçue à partir d’une
valeur moyenne de 82,4 et d’un écart-type de 11,80.

ISO 11133:2014(F)

Annexe H
(informative)
Assurance qualité des milieux de culture — Diagnostic d’anomalie
Tableau H.1
Anomalie Cause probable

Le milieu gélosé ne se solidifie pas Surchauffe du milieu pendant la préparation
pH faible causant une hydrolyse acide
Poids incorrect de gélose utilisée
Gélose pas entièrement dissoute
Mauvais mélange des ingrédients
pH incorrect Surchauffe du milieu pendant la préparation
Mauvaise qualité de l’eau
Contamination chimique extérieure
pH mesuré à une température incorrecte
pH-mètre mal étalonné
Mauvaise qualité du milieu déshydraté
Couleur anormale Surchauffe du milieu pendant la préparation
Absence d’un ou de plusieurs ingrédients
Ingrédients incorrects utilisés
pH incorrect
Contamination extérieure
Formation de précipités Surchauffe du milieu pendant la préparation
Mauvaise régulation du pH
En cas de préparation à partir de composants individuels – impuretés
dans les matières premières
Productivité du milieu faible/nulle Surchauffe du milieu pendant la préparation
Formule incorrecte utilisée, par exemple ingrédients incorrectement
pesés, mauvaise concentration des suppléments ajoutés
Résidus toxiques présents dans les récipients de préparation ou dans
l’eau
Organisme(s) de contrôle préparés de façon incorrecte

ISO 11133:2014(F)

Tableau H.1
Anomalie Cause probable
Mauvaise sélectivité/spécificité Surchauffe du milieu pendant la préparation
Formule incorrecte utilisée
Suppléments ajoutés incorrectement, par exemple lorsque le milieu
est trop chaud ou à une mauvaise concentration
Supplément contaminé
Organisme(s) de contrôle préparés de façon incorrecte
Contamination Mauvaise stérilisation
Mauvaises techniques aseptiques
Supplément contaminé

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Annexe I
(informative)
Essais quantitatifs des milieux liquides
I.1 Généralités
La présente annexe comprend des méthodes pour les essais quantitatifs des milieux liquides pouvant
fournir des informations supplémentaires par rapport aux méthodes de routine décrites à l’Article 8.
Les méthodes sont surtout applicables pour l’évaluation des milieux en développement et dans le cadre
d’études comparatives.
La qualité d’un milieu liquide, en termes de propriétés optimales de croissance, est montrée de façon
plus appropriée au début de la phase de croissance. La durée de la phase de latence et la croissance au
début de la phase exponentielle donnent les informations les plus importantes sur la productivité et
la sélectivité des micro-organismes cibles et non cibles respectivement dans les bouillons test et de
référence. Par conséquent, si uniquement des différences mineures (peu importantes) de qualité sont
recherchées, il convient de réaliser l’ensemencement du milieu liquide, par strie sur une boîte gélosée,
après une incubation plus courte, par exemple après 6 h ou 12 h.
I.2 Méthode pour les essais quantitatifs des milieux de culture liquides non
sélectifs utilisant des micro-organismes cibles
I.2.1 Mode opératoire
— Sélectionner un certain nombre de tubes contenant chacun au moins 10 ml de milieu ou des portions
de 10 ml du lot à tester (voir 3.1.2).
— Utiliser des cultures de travail comme décrit en 5.4.2.2.
— Ensemencement des micro-organismes cibles: ensemencer le bouillon à tester et le milieu de
référence solide pour chaque souche test avec ≤ 100 cellules.
— Incuber les milieux ensemencés dans les conditions définies dans les normes individuelles.
— Réaliser un nombre de dilutions suffisantes à partir des milieux incubés afin d’obtenir un nombre
comptable de colonies (voir 5.4.2.5).
— Étaler un volume mesuré, par exemple 10 µl, sur une gélose non inhibitrice comme décrit en 7.2.2.1.1.
I.2.2 Dénombrement et interprétation des résultats

Après l’incubation, dénombrer le nombre de colonies sur les boîtes (voir 7.2.2.1.1 et 7.2.2.1.2).
L’interprétation des résultats dépend de l’objectif de l’essai, par exemple comparaison avec le lot
précédent, le milieu de référence ou le matériel de référence (MR).
Il convient que les micro-organismes cibles atteignent 106 UFC/ml à 108 UFC/ml.
I.2.3 Logigramme relatif à la méthode quantitative pour les milieux de culture liquides
non sélectifs utilisant des micro-organismes cibles
La Figure I.1 est le logigramme relatif à la méthode quantitative pour les milieux de culture liquides non
sélectifs utilisant des micro-organismes cibles.

ISO 11133:2014(F)

Figure I.1 — Logigramme relatif à la méthode quantitative pour les milieux de culture liquides
non sélectifs utilisant des micro-organismes cibles (voir I.2.1 et I.2.2)
I.3 Méthode pour les essais quantitatifs de milieux de culture liquides sélectifs
utilisant des micro-organismes cibles et non cibles
I.3.1 Mode opératoire
— Sélectionner un certain nombre de tubes contenant chacun au moins 10 ml de milieu ou des portions
de 10 ml du lot tester (voir 3.2.2).
— Utiliser des cultures de travail comme décrit en 5.4.2.
— Ensemencement des micro-organismes cibles: ensemencer le bouillon à tester, le bouillon de
référence et le milieu de référence solide pour chaque souche test avec ≤ 100 cellules. Le milieu de
référence solide est utilisé afin de dénombrer les UFC dans l’inoculum.
— Ensemencement des micro-organismes non cibles: ensemencer le bouillon à tester et le milieu de
référence solide pour chaque souche test avec ≥ 1 000 cellules.

ISO 11133:2014(F)

— Ensemencement des micro-organismes cibles et non cibles en tant que culture mixte: pour les essais
de cultures mixtes dans des milieux sélectifs, ensemencer le bouillon à tester, le bouillon de référence
et le milieu de référence solide avec ≤ 100 cellules de micro-organisme cible et ≥ 1 000 cellules de
micro-organismes non cibles dans le même tube/dans la même boîte. Afin de tester des cultures
mixtes, lorsque cela est possible, il convient d’effectuer l’étalement sur des géloses non sélectives
permettant la différenciation des micro-organismes de la culture mixte (par exemple gélose pour
dénombrement avec MUG pour le dénombrement d’Escherichia coli et de Salmonella spp.). Lorsqu’il
n’est pas possible de distinguer les cultures mixtes sur une gélose non sélective, il convient d’utiliser
des géloses sélectives dont les performances ont été préalablement soumises à essai.
— Incuber les milieux dans les conditions définies dans les normes individuelles.
Prélever un volume mesuré ou, si nécessaire, un volume après dilution de chaque bouillon et étaler sur
une gélose non inhibitrice pour les tubes ne contenant que des micro-organismes cibles ou des micro-
organismes non cibles, comme décrit en 8.2.2. Pour les tubes contenant à la fois des micro-organismes
cibles et des micro-organismes non cibles, étaler sur une boîte du même milieu sélectif utilisé ci-dessus.
Il est également possible d’utiliser la méthode de Miles-Misra modifiée, d’autres systèmes d’ensemencement
par gouttes ou un ensemencement par spirales afin d’obtenir des colonies dénombrables.
I.3.2 Lectures, calcul et interprétation des résultats

Dénombrer les colonies de micro-organismes cibles et non cibles dans chaque boîte et calculer la
récupération par rapport au bouillon de référence, en prenant en compte la dilution utilisée pour le
dénombrement (si nécessaire). Dans le cas des cultures mixtes, distinguer les différents types.
Le calcul et l’interprétation dépendent de la finalité de l’examen. L’interprétation des résultats dépend
de l’objectif de l’essai, par exemple comparaison avec le lot précédent, le milieu de référence ou le MR.
Il convient que le micro-organisme cible atteigne 106 UFC/ml à 108/ml et soit l’organisme prédominant
présent dans les milieux sélectifs.
Pour les cultures mixtes, il convient que la récupération de l’organisme cible ne soit pas réduite par
rapport à la récupération à partir de la culture pure d’organisme cible.
I.3.3 Logigramme relatif à la méthode quantitative pour les milieux de culture liquides
sélectifs utilisant des micro-organismes cibles et non cibles
La Figure I.2 est le logigramme relatif à la méthode quantitative pour les milieux de culture liquides
sélectifs utilisant des micro-organismes cibles et non cibles.

ISO 11133:2014(F)

Figure I.2 — Logigramme relatif à la méthode quantitative pour les milieux de culture liquides
sélectifs utilisant des micro-organismes cibles et non cibles (voir I.3.1 et I.3.2)

ISO 11133:2014(F)

Annexe J
(normative)
Détermination des essais de performance microbiologique pour

les milieux de culture normalisés
J.1 Généralités
La présente annexe fournit aux chefs de projet des groupes de travail de normalisation, des instructions
leur permettant de définir des critères de performance microbiologique, des méthodes et des souches
de contrôle, lors de l’élaboration ou de la révision de Normes internationales relatives à l’analyse
microbiologique (microbiologie alimentaire et microbiologie des eaux).
J.2 Généralités
Les exigences de performance microbiologique (critères de performance, méthode de contrôle et
objectifs) applicables aux milieux de culture normalisés doivent être incluses dans chaque Norme
internationale relative à l’analyse microbiologique.
Ces spécifications de performance peuvent être:
— soit importées et révisées si nécessaire, de la présente Norme internationale pour les milieux de
culture décrits dans le présent document,
— soit établies, pour tout nouveau milieu de culture, conformément aux principes définis dans la
présente annexe.
NOTE La présente définition des exigences de performance microbiologique ne concerne pas les réactifs ou
les milieux de confirmation.
J.3 Critères de performance, méthodes et objectifs

Les critères à évaluer (productivité, sélectivité, spécificité), les méthodes d’essai à utiliser (quantitative,
et qualitative) et les objectifs à atteindre doivent être définis en fonction des caractéristiques de chaque
milieu de culture, comme indiqué dans le Tableau J.1 ci-dessous:
— sa forme (bouillon, gélose),
— sa composition (milieu sélectif, non sélectif),
— sa fonction dans la méthode normalisée (enrichissement, dilution, recherche, dénombrement).
Tableau J.1 — Critères, méthodes et objectifs
Milieu Critère et méthode d’essai

Bouillon sélectif de dénombrement Productivité (méthode quantitative)e
Sélectivité (qualitative)f
Gélose sélective de dénombrement Productivité (quantitative)b
Sélectivité (qualitative)g
Spécificité (qualitative)i

ISO 11133:2014(F)

Tableau J.1 (suite)
Milieu Critère et méthode d’essai
Bouillon sélectif d’enrichissement Productivité (qualitative)c
Sélectivité (qualitative)h
Gélose sélective de recherche Productivité (qualitative)d
Sélectivité (qualitative)g
Spécificité (qualitative)i
Gélose non sélective de dénombrement Productivité (quantitative)b
Bouillon non sélectif d’enrichissement Productivité (qualitative)a
Bouillon non sélectif de dilution Productivité (quantitative)e
Gélose non sélective de recherche Productivité (qualitative)d
1. Productivité: la finalité de ce critère de performance est de vérifier la croissance satisfaisante des souches
cibles (et la morphologie des colonies) sur des milieux gélosés.
a) Productivité qualitative (milieu liquide): voir 8.4.
Objectif: le résultat doit être de 2 (bonne croissance) pour un inoculum de ≤ 100 UFC des micro-organismes
cibles (8.4.1).
b) Productivité quantitative (milieu gélosé): voir 7.2.1.1.
— Objectif: le P R doit être ≥ 0,50 pour la comparaison d’un milieu sélectif avec le milieu de référence non sélec-
tif spécifié aux Annexes E et F. Le PR doit être ≥ 0,70 pour la comparaison d’un milieu non sélectif avec un milieu
de référence non sélectif ou comme spécifié dans la norme ou aux Annexes E et F. Cela s’applique également aux
cas spécifiques où une comparaison est effectuée avec le lot précédent.
Les colonies du micro-organisme cible doivent présenter un aspect caractéristique.
c Qualitative (milieu liquide): voir 8.3.
Objectif: au moins 10 colonies du micro-organisme cible doivent être observées sur le milieu d’isolement sélec-
tif utilisé pour la recherche après l’ensemencement avec ≤ 100 UFC.
d Productivité qualitative (milieu gélosé): voir 7.4.
Objectif: le résultat doit être de 2 (bonne croissance) pour les micro-organismes cibles.
Les colonies du micro-organisme cible doivent présenter un aspect caractéristique.
e Productivité quantitative (milieu liquide): voir 8.2.
Objectif: pour les diluants, le nombre de micro-organismes, après le temps de contact, doit être à ± 30 % près
égal au nombre initial.
2. Sélectivité: la finalité de ce critère de performance est de vérifier que les souches interférentes (non cibles)
sont partiellement ou totalement inhibées par le milieu sélectif.
f Sélectivité qualitative (milieu liquide): voir 8.3.
Objectif: les micro-organismes (indésirables) soumis à essai doivent être totalement inhibés.
g Sélectivité qualitative (milieu gélosé): voir 7.4.
Objectif: les micro-organismes (indésirables) soumis à essai doivent être partiellement ou totalement inhibés.
h Sélectivité qualitative (milieu liquide): 8.3.
Objectif: une croissance nulle (ou < 10 UFC) des micro-organismes (non cibles) doit pouvoir être observée sur
la gélose non sélective utilisée pour la recherche.
3. Spécificité: la finalité de ce critère de performance est de vérifier que les souches interférentes (non cibles)
qui ne sont pas inhibées ne produisent pas de colonies caractéristiques.
i Spécificité qualitative (milieu gélosé): 7.4.
Objectif: les colonies des souches non cibles soumises à essai ne doivent pas présenter l’aspect caractéristique
des micro-organismes cibles dans la méthode normalisée.
Les critères doivent être vérifiés par rapport aux durées et aux températures d’incubation standardisées.

ISO 11133:2014(F)

J.4 Choix des souches de contrôle en fonction de leur performance

J.4.1 Généralités
Les objectifs des différents critères de performance et le domaine d’application de la méthode normalisée
doivent déterminer le choix des souches de contrôle, c’est-à-dire
— les souches cibles (productivité) recherchées ou dénombrées dans la méthode, et
— les souches non cibles (sélectivité, spécificité) appartenant à la flore interférente se trouvant
couramment dans les matrices en cours d’analyse.
Les souches de contrôle décrites à l’Annexe E et à l’Annexe F, qui ont déjà été soumises à essai sur un
milieu donné, doivent si possible être utilisées.
Si justifié (instabilité génétique, reproductibilité insuffisante des souches de contrôle qualité
précédemment définies, etc.), le chef de projet peut proposer une modification des souches requises,
conformément aux instructions données dans le présent paragraphe.
J.4.2 Évaluation de l’adéquation de nouvelles souches de contrôle

Avant l’introduction d’une nouvelle souche, sa pertinence en vue d’une utilisation dans les essais de
performance doit être vérifiée et documentée. Cela requiert une démonstration de la reproductibilité
du contrôle de performance par au moins deux (de préférence trois) laboratoires indépendants
via l’utilisation de deux ou trois lots différents de la formule normalisée ou provenant de différents
producteurs commerciaux dans chaque laboratoire.
J.4.3 Nouveaux milieux

Pour chaque nouveau milieu, les souches de contrôle doivent être:
— sélectionnées de préférence à partir de celles déjà décrites à l’Annexe E ou à l’Annexe F,
— préalablement évaluées et leur adéquation doit être démontrée (voir J.4.2),
— ou nouvellement introduites dans les conditions suivantes:
— elles doivent être, de préférence, d’origine alimentaire ou obtenues à partir d’échantillons d’eau,
— elles doivent être disponibles dans au moins deux collections de souches internationales
(mutuellement équivalentes), à un prix acceptable,
— elles doivent être préalablement évaluées et leur pertinence doit être démontrée (voir J.4.2).
J.4.4 Nombre de souches par critère

Note de pied de page a du tableau Productivité qualitative (milieu liquide): voir 8.4.
Deux souches cibles: type de souche A et type de souche B
Type A: souche soumise à essai dans le contrôle qualité de performance par le fabricant du milieu
et l’utilisateur final
Type B: souche à ne soumettre à essai que par le fabricant du milieu.
Note de pied de page b du tableau Productivité quantitative (milieu gélosé): voir 7.2.1.1.
Deux souches cibles: souche A et souche B
Note de pied de page c du tableau Productivité qualitative (milieu liquide): voir 8.3.
Deux souches cibles: souche A et souche B chacune associée à deux souches non cibles

ISO 11133:2014(F)

Note de pied de page d du tableau Productivité qualitative (milieu gélosé): voir 7.4

Note de pied de page e du tableau Productivité quantitative (milieu liquide): voir 8.2
Note de pied de page f du tableau Sélectivité qualitative (milieu liquide): voir 8.3
Deux souches non cibles: souche A et souche B
Note de pied de page g du tableau Sélectivité qualitative (milieu gélosé): voir 7.4
Note de pied de page h du tableau Sélectivité qualitative (milieu liquide): 8.3
Note de pied de page i du tableau Sélectivité qualitative (milieu gélosé): 7.4
Une souche non cible: souche A

ISO 11133:2014(F)

Bibliographie
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[2] ISO 9001, Systèmes de management de la qualité — Exigences
[3] ISO Guide 30:1992/Amd,1:2008, Termes et définitions utilisées en rapport avec les matériaux de
référence — Amendement 1: révision des définitions de matériau de référence et de matériau de
référence certifié.
[4] ISO 6222, Qualité de l’eau — Dénombrement des micro-organismes revivifiables — Comptage des
colonies par ensemencement dans un milieu de culture nutritif gélosé
[5] ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
[6] ISO 2859-1, Règles d’échantillonnage pour les contrôles par attribut — Partie 1: Procédures
d’échantillonnage pour les contrôles lot par lot, indexés d’après le niveau de qualité acceptable (NQA)
[7] ISO/TS 22117, Microbiologie des aliments — Exigences spécifiques et lignes directrices pour les
essais d’aptitude par comparaison interlaboratoires
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[12] DIN 58942-4:2003, Microbiologie médicale — Milieux de culture — Systèmes de transport pour
spécimens qui contiennent des bactéries
[13] DIN 58942-4, Suppl. 1:2003, Microbiologie médicale — Milieux de culture — Systèmes, milieux, et
conditions pour le transport de bactéries pathogènes sélectionnés dans les matériaux cliniques
[14] DIN 58959-6, Suppl. 1:1997, Management de la qualité en microbiologie médicale — Exigences pour
souches contrôles — Exemples pour la préparation et conservation de bactéries utilisées comme
cultures stock et cultures de travail
[15] DIN 58959-6, Suppl. 2:1997, Management de la qualité en microbiologie médicale — Exigences pour
souches contrôles — Examples for production and preservation of fungi used as stock cultures and
working cultures
[16] DIN 58959-9, Suppl. 1:1997, Management de la qualité en microbiologie médicale — Exigence pour
l’utilisation de souches contrôles pour l’examination de milieux de culture — Control strains for
commonly used culture media
[17] DIN 58959-9, Suppl. 2:1997, Management de la qualité en microbiologie médicale — Exigence pour
l’utilisation de souches contrôles pour l’examination de milieux de culture — Maximum storage times
for ready-to-use culture media
[18] DIN 58959-10:1997, Management de la qualité en microbiologie médicale — Exigences pour
l’utilisation de souches contrôles pour l’examination de réactifs, de substances colorantes et de
matières biologiques

ISO 11133:2014(F)

[19] DIN 58959-10, Suppl. 1:1997, Management de la qualité en microbiologie médicale — Exigences

pour l’utilisation de souches contrôles pour l’examination de réactifs, de substances colorantes et de
matières biologiques — Control strains for commonly used materials
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[39] NEN 6603, Environmental and Food — Internal quality control by the use of control charts with
chemical and microbiological analysis
[40] ISO 4831, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement
des coliformes — Technique du nombre le plus probable
[41] ISO 4832, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des coliformes —
Méthode par comptage des colonies
[42] ISO 4833, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des micro-
organismes — Comptage des colonies à 30 °C
[43] ISO 6461-1, Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des spores de micro-organismes
anaérobies sulfito-réducteurs (Clostridia) — Partie 1: Méthode par enrichissement dans un milieu
liquide
[44] ISO 6461-2, Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des spores de micro-organismes
anaérobies sulfito-réducteurs (Clostridia) — Partie 2: Méthode par filtration sur membrane
[45] ISO 6579, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.
[46] ISO 6579:2002/Amd.1:2007, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche
des Salmonella spp. — Amendement 1: Annexe D: Recherche de Salmonella spp. dans les matières
fécales des animaux et dans des échantillons environnementaux au stade de la production primaire
[47] ISO 6888-1, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des
staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces) — Partie 1: Technique
utilisant le milieu gélosé de Baird-Parker
staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces) — Partie 2: Technique
utilisant le milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène
staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces) — Partie 3: Recherche
et méthode NPP pour les faibles nombres
[50] ISO 7251, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement d’Escherichia
coli présumés — Technique du nombre le plus probable
[51] ISO 7899-1:1998, Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des entérocoques intestinaux dans
les eaux de surface et résiduaires — Partie 1: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) par
ensemencement en milieu liquide
[52] ISO 7899-2, Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des entérocoques intestinaux — Partie 2:
Méthode par filtration sur membrane
[53] ISO 7932, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement de Bacillus
cereus présomptifs — Technique par comptage des colonies à 30 °C
[54] ISO 7937, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement de Clostridium
perfringens — Technique par comptage des colonies
[55] ISO 9308-1, Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries
coliformes — Partie 1: Méthode par filtration sur membrane dans des eaux contenant peu de flore
bactérienne de fond
[56] ISO 9308-2, Qualité de l’eau — Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes —
Partie 2: Méthode du nombre le plus probable

ISO 11133:2014(F)

[57] ISO 9308-3:1998, Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries
coliformes dans les eaux de surface et résiduaires — Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus
probable) pour ensemencement en milieu liquide
[58] ISO 10272-1, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement
des Campylobacter spp. — Partie 1: Méthode de recherche
[59] ISO/TS 10272-2, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement des Campylobacter spp. — Partie 2: Technique par comptage des colonies
de Campylobacter spp. — Partie 3: Détection semi-quantitative
[61] ISO 10273, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche de Yersinia
enterocolitica présumées pathogènes
[62] ISO/TS 11059|IDF/RM 225, Lait et produits laitiers — Méthode de dénombrement des Pseudomonas
spp
de Listeria monocytogenes — Partie 1: Méthode de recherche
[64] ISO 11290-2, Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogènes —
Partie 2: Méthode de dénombrement
[65] ISO 11731, Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des Legionella
[66] ISO 11731-2, Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des Legionella — Partie 2: Méthode par
filtration directe sur membrane pour les eaux à faible teneur en bactéries
[67] ISO 13720, Viande et produits à base de viande — Dénombrement de Pseudomonas spp. présomptifs
[68] ISO 14189, Qualité de l’eau — Dénombrement de Clostridium perfringens — Méthode de filtration
sur membrane
[69] ISO 15213, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des bactéries
sulfito-réductrices se développant en conditions anaérobies
[70] ISO 15214, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des bactéries
lactiques mésophiles — Technique par comptage des colonies à 30 degrés Celsius
[71] ISO 16266, Qualité de l’eau — Détection et dénombrement de Pseudomonas aeruginosa — Méthode
par filtration sur membrane
Escherichia coli bêta-glucuronidase positive — Partie 1: Technique de comptage des colonies à 44° C
au moyen de membranes et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl bêta-D glucuronate
Escherichia coli B-glucuronidase positive — Partie 2: Technique de comptage des colonies à 44 °C au
moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl B-D-glucuronate
Escherichia coli bêta-glucuronidase positive — Partie 3: Technique du nombre le plus probable
utilisant le bromo-5-chloro-4-indolyl-3 beta-D glucuronate
[75] ISO 16654, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Escherichia coli
O157
[76] ISO 17995, Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement d’espèces thermotolérantes du genre
Campylobacter
[77] ISO 19250, Qualité de l’eau — Recherche de Salmonella spp.

ISO 11133:2014(F)

[78] ISO 21527-1, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des levures
et moisissures — Partie 1: Technique par comptage des colonies dans les produits à activité d’eau
supérieure à 0,95
[79] ISO 21527-2, Microbiologie des aliments —Méthode horizontale pour le dénombrement des levures
et moisissures — Partie 2: Technique par comptage des colonies dans les produits à activité d’eau
inférieure ou égale à 0,95
[80] ISO 21528-1, Microbiologie des aliments — Méthodes horizontales pour la recherche et le
dénombrement des Enterobacteriaceae — Partie 1: recherche et dénombrement à l’aide de la
technique NPP avec préenrichissement
[81] ISO 21528-2, Microbiologie des aliments — Méthodes horizontales pour la recherche et le
dénombrement des Enterobacteriaceae — Partie 2: Méthode par comptage des colonies
[82] ISO 21871, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement de Bacillus
cereus présumés en petit nombre — Technique du nombre le plus probable et méthode de recherche
[83] ISO/TS 21872-1, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Vibrio
spp. potentiellement entéropathogènes — Partie 1: Recherche de Vibrio parahaemolyticus et Vibrio
cholerae
[84] ISO/TS 21872-2, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Vibrio
spp. potentiellement entéropathogènes — Partie 2: recherche des espèces autres que Vibrio
parahaemolyticus et Vibrio cholerae
[85] European Culture Collections’ Organisation (ECCO), disponible à l’adresse http://www.ecosite.
org
[86] Directive européenne du Conseil 98/83/CE du 3 novembre 1998 relative à la qualité des eaux
destinées à la consommation humaine. Disponible (visualisée le 14-10-2013) à l’adresse http://
eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:1998:330:0032:0054:EN:PDF
[87] World Federation for Culture Collections (WFCC). Disponible à htpp://www.wfcc.info

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Microbiologie des aliments, des

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internationales d’analyse microbiologique des aliments, des aliments pour animaux et

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Milieux d’enrichissement sélectifs

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NORME INTERNATIONALE ISO 11133:2014(F)

Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et

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3.1 Termes généraux et définitions

3.2 Terminologie relative aux essais de performance

2 ﻿ © ISO 2014 – Tous droits réservés

3.3 Terminologie relative aux milieux de culture

3.3.2 Milieux de culture classés par composition

3.3.3 Milieux de culture classés par consistance

© ISO 2014 – Tous droits réservés ﻿ 3

3.3.4 Milieux de culture classés selon leur application

4 ﻿ © ISO 2014 – Tous droits réservés

© ISO 2014 – Tous droits réservés ﻿ 5

3.3.5 Milieux de culture classés selon la méthode de préparation

6 ﻿ © ISO 2014 – Tous droits réservés

3.4 Terminologie relative aux micro-organismes test

© ISO 2014 – Tous droits réservés ﻿ 7

4 Gestion de l’assurance qualité

4.1.1 Documentation fournie par le fabricant ou par le producteur

4.1.2 Acceptation des produits à la livraison

Pour chaque lot de produit (ingrédient ou milieu de culture), vérifier:

8 ﻿ © ISO 2014 – Tous droits réservés

Dans tous les cas, suivre les instructions du fabricant.

4.2.2 Contrôle qualité et contrôle des milieux déshydratés et des suppléments

4.3 Préparation des milieux en laboratoire

4.3.2 Qualité des composants de base de milieux

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4.3.4 Pesée et réhydratation

En suivant les précautions de sécurité appropriées, peser soigneusement la quantité nécessaire de

4.3.5 Dissolution et dispersion

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4.3.6 Mesure et ajustement du pH

Stériliser les milieux de culture préparés le jour de la préparation.

4.3.8.2 Stérilisation par chaleur humide

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4.3.8.3 Stérilisation par filtration

4.3.9 Préparation des suppléments

4.4 Stockage et durée de conservation des milieux préparés

4.4.1 Milieux commerciaux

4.4.2 Milieux préparés en laboratoire

Identifier tous les milieux de façon à garantir leur traçabilité.

12 ﻿ © ISO 2014 – Tous droits réservés

4.4.2.2 Évaluation de la durée de conservation

4.4.2.3 Stockage des milieux en boîte de Petri

4.5 Préparation avant utilisation

4.5.1 Fusion des milieux de culture gélosés

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