Ddoc T 2020 0114 Bourkaib

Procédé enzymatique intensifié et durable de
N-acylation d’acides aminés en milieux écocompatibles :

caractérisation, cinétiques et immobilisation de
nouveaux biocatalyseurs
Mohamed Chafik Bourkaib
To cite this version:

Mohamed Chafik Bourkaib. Procédé enzymatique intensifié et durable de N-acylation d’acides aminés
en milieux écocompatibles : caractérisation, cinétiques et immobilisation de nouveaux biocatalyseurs.
Génie des procédés. Université de Lorraine, 2020. Français. �NNT : 2020LORR0114�. �tel-03004673�
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UNIVERSITÉ DE LORRAINE (UL)
École Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires (ENSAIA)
École Doctorale Sciences et ingénierie des molécules, des produits, des procédés, et de
l'énergie (SIMPPÉ)
Laboratoire Réactions et Génie des Procédés (LRGP)
THÈSE
Soutenance le 12 octobre 2020
Par
Mohamed Chafik BOURKAIB
En vue de l’obtention du titre de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE LORRAINE
Mention Procédés Biotechnologiques
Sujet
PROCEDE ENZYMATIQUE INTENSIFIE ET DURABLE DE N-
ACYLATION D'ACIDES AMINÉS EN MILIEUX ECOCOMPATIBLES :
CARACTERISATION, CINETIQUES ET IMMOBILISATION DE
NOUVEAUX BIOCATALYSEURS
Membres du jury
Rapporteurs : Mr Pedro Lozano Professeur, Université de Murcia, ESPAGNE
Mr Éric Dubreucq Professeur, SupAgro, Montpellier
Examinateurs : Mme Catherine Sarazin Professeur, Université de Picardie, GEC, Amiens
Mlle Caroline Paul Prof. assistante, TU Delft, Delft, PAYS-BAS
Mme Catherine Humeau Professeur, UL, LRGP, Nancy
Mr Stéphane Delaunay Professeur, UL, LRGP, Nancy
Directrice : Mme Isabelle Chevalot Professeur, UL, LRGP, Nancy
Co-directeur : Mr Yann Guiavarc’h Maitre de conférences, UL, LRGP, Nancy
Remerciements
J’adresse mes sincères remerciements à Mr Pedro Lozano et Mr Eric Dubreucq de m’avoir

fait l’honneur d’accepter de juger ce travail en tant que rapporteurs ainsi que Mme Catherine
Sarazin et Mlle Caroline Paul d’avoir accepté d’examiner ce travail.
Les travaux présentés dans ce manuscrit ont été menés au sein de l’équipe BioProMo du
laboratoire des réactions et génies des procédés (LRGP). Je souhaite donc remercier Mr Laurent
Falk directeur du LRGP de m’avoir accueilli dans son laboratoire. Je tiens aussi tout
particulièrement à présenter toute ma reconnaissance et remerciements particuliers à Mme
Isabelle Chevalot, (directrice de thèse), Mr Yann Guiavarc’h, (co-directeur) ainsi qu’à Mr
Stéphane Delaunay, Mme Catherine Humeau et Mr Xavier Framboisier pour votre encadrement
scientifique avisé, votre présence, vos conseils et votre soutien. Un grand merci à Mr Fabrice
Blanchard pour ta disponibilité, ton soutien et tes conseils techniques et analytiques ainsi qu’à
Mr Arnaud Aymes pour ton soutien moral et technique, en particulier sur SVS.
Je souhaite également remercier l’Agence Nationale de la Recherche (ANR) d’avoir financé le

projet ISEAPIM3 dont fait partie ainsi que toutes les personnes qui ont contribué au travail de
thèse et avec qui nous avons collaboré. Je pense notamment à Cédric pour les analyses, à
Brigitte, Jean-Luc, Pierrick, Francois et Armand pour les matériaux et les immobilisations
d’enzymes ainsi qu’à Cecile, Estelle, Jerome et toute l’équipe de SEPPIC pour les analyses
biologiques et pour votre accueil chaleureux pendant les quelques jours très enrichissants.
Je remercie aussi tous les membres du laboratoire en particulier mes collègues et amis anciens
et nouveaux thésards, poste doc et technicien du LRGP site ENSAIA, ENSIC et SVS ainsi que
du L2CM, sans cité de nom afin de n’oublier personne, pour votre soutien moral et pour tous
les rire, les blagues et les beaux moments passer ensemble. Je suis très heureuse de vous avoir
rencontré et j’espère qu’on restera toujours en contact.
Un remerciment particulier à mes collègues enseignants Jérémy, Jénifer, Latifa et Bruno qui
m’ont soutenu lors de la période d’enseignement et à tous mes stagiaires pour leur rigueure et
leur sérieux.
Finalement, un très grand merci aux personnes qui me sont très chères (ma famille et mes amis),
sans qui, les choses n’auraient que peu de sens.
Sommaire
Introduction générale ..............................................................................................................1
1 Chapitre I : Étude bibliographique ...............................................................................7
1.1 Acylation d’acides aminés ....................................................................................7
1.1.1 Les acides aminés acylés ................................................................................7
1.1.2 Activités biologiques des surfactants à base d’acides aminés..........................9
1.1.3 Caractéristiques structurales des AAS et paramètres influençant leur efficacité

………... .................................................................................................................... 11
1.1.4 Toxicité et biodégradabilité des AAS ........................................................... 12
1.1.5 Synthèse in vivo de surfactants à base d’acides aminés ................................. 14
1.1.6 Synthèse in vitro de surfactants à base d’acides aminés ................................ 15
1.1.6.1 Acylation des acides aminés par voie chimique ........................................ 15
1.1.6.2 Acylation des acides aminés par voie enzymatique ................................... 17
1.1.6.3 Acylation des acides aminés par voie chimio-enzymatique ....................... 18
1.2 Réaction d’acylation enzymatique en milieu non aqueux..................................... 19
1.2.1 Enzymes catalysant la réaction d’acylation en milieu non aqueux ................ 19
1.2.2 Structure et mécanisme catalytique des lipases .............................................21
1.2.3 Paramètres influençant les réactions en milieu non-aqueux .......................... 23
1.2.3.1 Influence de la teneur en eau .................................................................... 23
1.2.3.2 Influence de l’état d’ionisation ................................................................. 25
1.2.3.3 Impact de la température ..........................................................................26
1.2.3.4 Influence du substrat et du choix du solvant réactionnel ........................... 26
1.2.4 Acylation enzymatique sous CO2 supercritique ............................................ 29
1.2.4.1 Les fluides supercritiques et le CO2 .......................................................... 29
1.2.4.2 Paramètres influençant les réactions sous CO2 supercritique ..................... 31
1.2.4.2.1 Solubilité et solubilisation des composés ............................................ 31
1.2.4.2.2 Influence de l’eau sur l’activité enzymatique......................................33

1.2.4.2.3 Influence des conditions opératoires (température, pression et cycle de
dépressurisation) ................................................................................................. 35
1.2.5 Acylation enzymatique dans les liquides ioniques ........................................ 38
1.2.6 Acylation enzymatique en solvants eutectiques profonds ............................. 40
1.3 Réaction d’acylation enzymatique en milieu aqueux ...........................................45
1.3.1 Enzymes catalysant la réaction d’acylation en milieu aqueux ....................... 45
1.3.2 Influence des conditions opératoires sur les performances catalytiques des
acylases . ................................................................................................................... 48
1.3.2.1 Influence du pH........................................................................................ 49
1.3.2.2 Influence de la température ......................................................................50
1.3.2.3 Influence des coactivateurs métalliques et inhibition de l’activité

enzymatique ...........................................................................................................50
1.3.3 Acylation enzymatique d’acides aminés par les aminoacylases en milieu

aqueux … .................................................................................................................. 52
1.3.3.1 Les pénicillines acylases (EC 3.5.1.11) ..................................................... 52
1.3.3.2 L’epsilon lysine acylase (EC 3.5.1.17)...................................................... 53
1.3.3.3 Les aminoacylases I (EC 3.5.1.14)............................................................ 54
1.4 Immobilisation d’enzymes .................................................................................. 57
1.4.1 Matériaux utilisés pour l’immobilisation d’enzymes .................................... 58
1.4.1.1 Matériaux à base de polymères naturels.................................................... 58
1.4.1.2 Matériaux à base de polymères synthétiques.............................................59
1.4.1.3 Matériaux à base de silice ......................................................................... 60
1.4.1.4 Matériaux à base de carbone..................................................................... 60
1.4.1.5 Les supports magnétiques ......................................................................... 62
1.4.2 Caractéristiques du support ..........................................................................62
1.4.3 Techniques d’immobilisation ....................................................................... 65
1.4.3.1 Immobilisation par adsorption .................................................................. 65
1.4.3.2 Immobilisation par chimisorption ............................................................. 68

1.4.3.3 Encapsulation ........................................................................................... 71
1.4.3.4 Immobilisation par réticulation ................................................................. 72
1.5 Approches utilisées pour l’intensification de procédés enzymatiques .................. 72
1.5.1 Le type de réacteur....................................................................................... 73
1.5.2 Procédés assistés par micro-ondes ................................................................ 79
2 Chapitre II : Matériels et méthodes.............................................................................83
2.1 Biocatalyseurs utilisés ......................................................................................... 83
2.1.1 Production des aminoacylases ......................................................................84
2.1.2 Traitement des surnageants de culture .......................................................... 85
2.1.2.1 Lyse des cellules ...................................................................................... 85
2.1.2.2 Précipitation des protéines ........................................................................ 85
2.1.2.3 Diafiltration et concentration des protéines ............................................... 86
2.1.3 Expression hétérologue des aminoacylases de S. ambofaciens chez E. coli

Origami B (DE3) ....................................................................................................... 86
2.2 Immobilisation des aminoacylases de S. ambofaciens et de CALB ...................... 89
2.2.1 Synthèse des matériaux à base de silice ........................................................ 90
2.2.2 Fonctionnalisation des matériaux ................................................................. 90
2.2.3 Immobilisation des enzymes ........................................................................ 91
2.2.4 Caractérisation des matériaux ......................................................................93
2.2.5 Autres types d’immobilisation ..................................................................... 93
2.3 Mise en œuvre des réactions enzymatiques ......................................................... 93
2.3.1 Réactifs utilisés ............................................................................................ 94
2.3.2 Réactions en continu sous CO2 supercritique (scCO2) .................................. 94
2.3.3 Réaction en batch dans des réacteurs agités mécaniquement ........................ 96
2.3.3.1 Synthèse enzymatique .............................................................................. 96
2.3.3.1.1 Solvant organique en réacteur agité .................................................... 96
2.3.3.1.2 En milieu aqueux ............................................................................... 97

2.3.3.2 Hydrolyse enzymatique ............................................................................ 98
2.4 Méthodes analytiques .......................................................................................... 98
2.4.1 Réactifs et solvants ...................................................................................... 98
2.4.2 Chromatographie sur couche mince (CCM ; analyse qualitative).................. 99
2.4.3 Dosage de la lysine issue des réactions d’hydrolyse ................................... 100
2.4.4 Dosage des acides aminés acylés produits et des acides gras consommés lors
des réactions de N-acylation..................................................................................... 103
2.4.5 Identification de la régiosélectivité et de la chimio-sélectivité des enzymes par

CL-SM-SM .............................................................................................................. 104
2.4.6 Dosage de l’acétate de géraniol issu des réactions de O-acylation sous scCO2
…………….. .................................................................................................................. 105
2.4.7 Dosages des protéines ................................................................................ 105
2.4.7.1 Bradford ................................................................................................. 105
2.4.7.2 BCA ....................................................................................................... 106
2.5 Construction des structures ............................................................................... 107
2.5.1 Structure des ligands .................................................................................. 107
2.5.2 Structure de CALB et de l’acyl-CALB ....................................................... 107
2.5.2.1 Minimisation de l’énergie du système..................................................... 108
2.5.2.2 Simulations de dynamique moléculaire .................................................. 108
2.5.2.2.1 Analyses des résultats ...................................................................... 109
2.5.2.2.2 Définition du site actif...................................................................... 110
2.5.2.3 Simulation de docking ............................................................................ 110
3 Chapitre III : Performances des lipases pour la réaction d’acylation enzymatique des
acides aminés .................................................................................................................. 115
3.1 Introduction : .................................................................................................... 115
3.2 Acylation enzymatique catalysée par les lipases en solvant organique ............... 116
3.3 Acylation enzymatique sous CO2 supercritique ................................................. 121
3.4 Acylation enzymatique en solvants eutectiques ................................................. 127

3.5 Acylation enzymatique en milieu biphasique .................................................... 131
3.6 Étude par modélisation moléculaire de l’acylation enzymatique des acides aminés,
catalysée par CALB ..................................................................................................... 133
3.6.1 Modélisation de l’acylation de la phénylalanine par l’acide oléique, catalysée

par CALB ................................................................................................................ 135
3.6.2 Modélisation de l’acylation des acides aminés par l’acide undécénoïque,

catalysée par CALB ................................................................................................. 139
3.6.2.1 Construction du modèle d’acyl-enzyme C11’- CALB et sélection de la

meilleure cible ...................................................................................................... 139
3.6.2.2 Etude des modes d’interaction entre les acides aminés et l’acyl-enzyme
C11’-CALB.......................................................................................................... 142
3.7 Conclusions ...................................................................................................... 146
4 Chapitre IV : Performances des acylases de Streptomyces ambofaciens comme

catalyseurs de la réaction d’acylation enzymatique des acides aminés ............................. 151
4.1 Introduction ...................................................................................................... 151
4.2 Evaluation des performances catalytiques des aminoacylases de S. ambofaciens

pour l’acylation d’acides aminés .................................................................................. 151
4.3 Contribution de l’article .................................................................................... 165
4.4 Résultats complémentaires ................................................................................ 166
4.4.1 Production hétérologue des aminoacylases ................................................. 166
4.4.1.1 Evaluation de l’expression hétérologue des différentes aminoacylases de S.

ambofaciens chez E. coli Origami B(DE3) ........................................................... 168
4.4.1.2 Evaluation de l’activité des extraits protéiques issus des souches d’E. coli
Origami B(DE3) transformées .............................................................................. 171
4.4.1.3 Purification de Sam-AA recombinante ................................................... 174
4.4.2 Comparaison des performances catalytiques entre des extraits bruts d’une
souche mutante n’exprimant que Sam-AA et de la souche sauvage de S. ambofaciens
…………. .................................................................................................................. 175
4.4.2.1 Evaluation et comparaison de la spécificité de substrat envers les acides

aminés … ............................................................................................................. 177
4.4.2.2 Comparaison de la spécificité de substrat envers les acides gras ............. 178
4.5 Conclusion ........................................................................................................ 181
5 Chapitre V : Evaluation des performances des aminoacylases de Streptomyces

ambofaciens immobilisées .............................................................................................. 185
5.1 Introduction ...................................................................................................... 185
5.3 Résultats complémentaires ................................................................................ 219
5.3.1 Performances des aminoacylases de S. ambofaciens immobilisées sur différents

supports silicatés ...................................................................................................... 219
5.3.2 Performances de la lipase B de C. antarctica immobilisée sur différents

supports silicatés ...................................................................................................... 226
5.4 Conclusion ........................................................................................................ 235
6 Chapitre VI : mise en œuvre d’un procédé de production et de purification de

l’undécénoyl-phénylalanine ............................................................................................ 241
6.1 Introduction ...................................................................................................... 241
6.2 Evaluation des performances catalytiques des aminoacylases de Streptomyces

ambofaciens pour l’acylation de la phénylalanine ........................................................ 241
6.4 Conclusion ........................................................................................................ 269
Conclusion générale et perspectives .................................................................................... 273
Références .......................................................................................................................... 283

Abréviations
CALB Lipase B Candida antarctica
M2B2 2-méthyl-2-butanol
CCM Chromatographie sur couche mince
HPLC High performance liquid chromatography
MS Mass spectrometry
MS2 Fragmentation mass spectrometrie
TEA Triéthylamine
TFA Acide trifluoroacétique
PDB Protein Data Bank
RMSD Root Mean Square Deviation
SBA-15 Santa Barbara amorphous 15
MMS Mesoporous-macroporous support
SiHIPE High Internal Phase Emulsion
scCO2 CO2 supercritique
MEP ou DES Mélanges Eutectiques Profonds ou Deep Eutectic solvents
ILs Liquides ioniques
ChCl Chlorure de cholinium
U Urée
Gly Glycérol
Liste des figures
Chapitre I :
Figure 1.1 : structure des surfactants à base d’acides aminés ...................................................9
Figure 1.2 : réaction chimique (Schotten-Baumann) d’acylation d’une fonction amine ......... 15
Figure 1.3 : procédure de synthèse de l’-acyl-lysine (Shi et al., 2019) ................................ 16
Figure 1.4 : représentation graphique de la structure secondaire de CALB, en jaune : la triade
catalytique, en bleu : les résidus du trou oxyanion, flèches grises : les feuillets β, et les cylindres
grenade : les hélices α (Stauch et al., 2015) ...........................................................................22
Figure 1.5 : Mécanisme d'acylation catalysé par la triade catalytique de CALB selon le modèle
bi-bi ping-pong: A) conformation native et approche du substrat donneur d'acyle ; B) premier
intermédiaire tétraédrique ; C) relargage de l'alcool et formation de l’acyl-enzyme ; D) approche
de l'accepteur d’acyle ; E) formation du second intermédiaire tétraédrique ; F) relargage du
produit et retour à la conformation initiale de l’enzyme (Ferrari, 2014a). .............................. 23
Figure 1.6 : diagramme de phase du CO2 (www.EngineeringToolbox.com) .......................... 30
Figure 1.7 : observation du passage de l’état liquide (a) à l’état supercritique (c) au cours du
temps en passant par une étape de transition (b) suite à l’augmentation de la pression et de la
température (Hobbs, Thomas, 2007) ..................................................................................... 30
Figure 1.8 : représentation de la structure de CALB sous scCO2 (Silveira et al., 2012)..........33
Figure 1.9 : schéma de la formation de liaisons carbamate entre la lysine en surface de l’enzyme
et le CO2 (A) et de la formation d’acide carbonique par dissolution de CO2 dans le
microenvironnement aqueux de l’enzyme (Budisa, Schulze-Makuch, 2014) ......................... 35
Figure 1.10 : évolution de la conformation des protéines selon la pression et la température du
scCO2 utilisé, A : faible pression et température, B : faible température et pression élevé, C :
faible pression et température élevé, D : pression et température élevé (Hoang et al., 2018). . 36
Figure 1.11 : Schéma du diagramme de phase d’un mélange eutectique (A) et un exemple
d’interaction hydrogène possible dans le MEP chlorure de cholinium / urée (B) (Pätzold et al.,
2019) .................................................................................................................................... 41
Figure 1.12 : mécanisme catalytique de la pénicilline G acylase (Srirangan et al., 2013) ....... 47
Figure 1.13 : mécanisme catalytique de l’aspartoacylase (Bitto et al., 2007) ......................... 48
Figure 1.14 : taux de synthèse des acides aminés N-lauroylés. Conditions réactionnelles : acide
laurique (7,5 mM), acides aminés (200 mM), 10 unités/mL de l’extrait de S. mobaraensis dans
du tampon Tris-HCl 100 mM pH 7,5 contenant 0.5 mM CoCl2 et 78% de glycérol à 37°C durant
2 jours (Koreishi et al., 2006a) .............................................................................................. 53
Figure 1.15 : couple pH/température d'hydrolyse optimale des N-α et ε-acétyl-L-lysine de
l’extrait brut de S. ambofaciens. A : effet du pH à T = 37°C ; B : effet de la température à pH
8. Conditions expérimentales : tampon tris HCl 25 mM, NaCl 50 mM, 2 g/L d’extrait
enzymatique et 4 mM du substrat pendant 24h (Ferrari, 2014a). ...........................................56
Figure 1.16 : représentation schématique des principaux supports d’immobilisation .............58
Figure 1.17 : facteurs influençant les propriétés physicochimiques lors de l’immobilisation des
enzymes sur du biochar (Pandey et al., 2020)........................................................................ 59
Figure 1.18 : représentation de l’organisation moléculaire des oxydes de graphène et des oxydes
de graphène réduits (Jiali Zhang et al., 2010 ; Duan et al., 2015)...........................................62
Figure 1.19 : classification des matériaux selon le diamètre des pores (A) et comparaison du
diamètre des pores des supports mésoporeux ordonnés et du diamètre des enzymes (B ; (Zhou,
Hartmann, 2013)). ................................................................................................................ 64
Figure 1.20 : organisation d’un support avec une structure de pores hiérarchiquement ordonnés
(Blin et al., 2006).................................................................................................................. 64
Figure 1.21 : les principales techniques d’immobilisation d’enzymes (à partir de Chapman,
Stenzel, 2019)....................................................................................................................... 65
Figure 1.22 : méthode de Co-condensation (A) et de greffage (B) des groupements organiques
sur les supports à base de silice (R = groupement organique fonctionnel) et groupement
fonctionnels généralement utilisé pour la modification de la surface des supports (C)
(Hartmann, Kostrov, 2013a ; Hoarau et al., 2017) ................................................................. 68
Figure 1.23 : interactions possibles entre l’enzyme et le support fonctionnalisé avec de l’APTES
(Bernal, Poveda-Jaramillo, et al., 2018) ................................................................................ 68
Figure 1.24 : schéma des différents point d’ancrage possibles de l’enzyme sur un support, A :
un seul vs plusieurs points d’encrage, B : ancrage avec des spacers de différentes longueurs
(Hoarau et al., 2017) .............................................................................................................69
Figure 1.25 : représentation schématique du système de type SpinChem® ............................ 74
Figure 1.26 : A. représentation schématique de quelques configuration internes de mélangeurs
stationnaires : (a) structures simples de mise en contact, (b) structure multi-laminaire, (c)
structure courbée ou sous forme d’hélicoïdale, (d) structures en split-recombiné et (e) structure
statique périodique (Zhang et al., 2017), B. configuration des microréacteurs simples, C.
réacteur microstructuré sous forme de goutte optimisé par Mielke et al., 2018, D. réacteur
microstructuré commercialisé sous le nom de Corning Advanced Flow Reactor (a) vue
d’ensemble du réacteur avec entré des substrats et enzymes en solution (point rouge), sortie du
réacteur (point vert) et entré et sortie de l’échangeur de chaleur (point bleu), (b) structure du
mélangeur statique sous forme de cœur, (c) schéma d’une coupe transversale du réacteur
(Nieves-Remacha et al., 2012) .............................................................................................. 76
Chapitre II :
Figure 2.1 : carte plasmidique de pET-15b avec ses principales caractéristiques ................... 87
Figure 2.2 : influence de la concentration du tampon par rapport à la concentration d’enzyme
initiale sur le pourcentage d’immobilisation..........................................................................92
Figure 2.3: Equipements utilisés pour la mise en œuvre des réactions enzymatiques sous scCO2
dans les conditions standards ................................................................................................ 96
Figure 2.4 : A. Réacteur Wheaton® B. Réacteur Optimax® ................................................. 98
Figure 2.5 : Schéma de la chaine CLHP et des équipements utilisés pour le dosage des acides
aminés ................................................................................................................................ 101
Figure 2.6 : Réaction de dérivatisation des acides aminés ................................................... 102
Figure 2.7 : Représentation des orientations du ligand au niveau du site actif (Venkatachalam
et al., 2003) ........................................................................................................................ 111
Chapitre III :
Figure 3.1 : analyse LC-MS-MS des produits de la réaction d’acylation de la lysine A. suivi MS
de l’élution du produit monoacylé (313 m/z) au cours du temps B. fragmentation MS2 du
produit issu de la réaction (temps de rétention 9,26 min) correspondant à l’-10-undécénoyl-
lysine C. fragmentation MS2 de l’-undécénoyl-lysine à titre de comparaison. ................... 118
Figure 3.2 : fragmentation MS2 du 10-undécénoyl-glycine A. fragmentation MS2 du produit
de la réaction de synthèse en présence de CALB B. fragmentation MS2 du produit de référence
........................................................................................................................................... 120
Figure 3.3 : configuration du système sous scCO2 utilisé A. configuration initiale B.
configuration modifiée........................................................................................................ 123
Figure 3.4 : spectre FTIR de CALB immobilisé non traité et traité avec du scCO2 pendant 1 h
à 10 MPa et 6 h à 20 MPa et à 40°C a. spectre FTIR complet b. spectre FTIR normalisé à un
intervalle de nombre d’ondes de 1800-1500 cm-1 (Dos Santos, Rezende, et al., 2016b) ...... 126
Figure 3.5 : A. spectre FTIR normalisé à un intervalle de nombre d’ondes de 1800-1500 cm-
1de CALB immobilisée (Lipozyme 435) avant et après traitement (55°C 200 Bar) avec du
scCO2 pendant 30 min à 200 Bar et à 55°C B. spectre FTIR caractéristique de l’acétate de
géraniol .............................................................................................................................. 127
Figure 3.6 : suivi de l’évolution de l’activité de l’eau du mélange eutectique profond choline
chloride / urée (ratio molaire 1 / 2) en fonction de la quantité d’eau ajoutée. ....................... 129
Figure 3.7: chromatogrammes HPLC-fluorimètre des mélanges réactionnels a. Réaction
d’acylation de la phénylalanine en présence de 0,5 g/L de CALB libre dans de la choline
chloride / urée réalisé à 45  5°C, b. Réaction d’acylation de la phénylalanine en présence de
10 g/L de CALB immobilisé dans de la choline chloride / urée réalisé à 55  5°C, c. a. Réaction
chloride / glycérol réalisé à 55  5°C .................................................................................. 131
Figure 3.8 : analyse des poses issues du docking moléculaire de la phénylalanine avec l’oléoyl-
CALB comme cible a. localisation et répartition des ligands générés au niveau de la cavité du
site actif b. interactions moléculaires observées entre la phénylalanine et l’entrée du site actif
(1 et 2) ; interactions moléculaires entre le site actif et la phénylalanine présentant son cycle
aromatique vers les résidus catalytiques (3 et 4) (--- : interactions hydrophobes, --- : interactions
hydrogènes) c. poses présentant la fonction amine de la phénylalanine à proximité des résidus
catalytiques ; analyse des distances impliquées dans le mécanisme catalytique ................... 138
Figure 3.9 : suivi de l’évolution de l’énergie totale du système (a) et de la température (b) au
cours de la dynamique moléculaire ..................................................................................... 140
Figure 3.10 : distribution des cibles générées au cours de la trajectoire de dynamique
moléculaire selon le nombre de critères de distance respectés au sein du trou oxyanion (a) ; un
exemple de conformation respectant l’ensemble des critères de distance assurant un
positionnement et une stabilisation corrects de l’acyl-enzyme (b) ....................................... 141
Figure 3.11 : exemple d’une conformation de l’acyl-enzyme présentant une bonne accessibilité
des molécules d’eau aux résidus catalytiques ...................................................................... 141
Figure 3.12 : Nombre de poses générées au cours des simulations de docking moléculaire de
différents acides aminés sur la cible C11’-CALB ................................................................ 142
Figure 3.13 : localisation des ligands au sein des poses générées au cours des simulations de
docking de différents acides aminés dans la cible C11’-CALB. .......................................... 143
Figure 3.14 : interactions observées entre l’arginine (a), ou la phénylalanine (b) et les résidus
de l’entrée de la cavité catalytique (--- et --- interactions hydrogènes, --- interactions
hydrophobes, --- interactions électrostatiques) .................................................................... 145
Figure 3.15 : pourcentage des poses respectant les critères de distance soit avec la fonction
amine de la chaine principale, soit avec le groupement nucléophile de la chaine latérale de
l’acide aminé (histogrammes en jaune : ligands classés en premier suite au scoring) ........... 146
Chapitre IV :
Figure 4.1 : Suivi de la densité optique du milieu de culture, à 600nm, lors de l’expression
protéique chez les souches E. coli Origami B(DE3) transformées par les plasmides pET15b/
SamAA, pET-15b/ SamPVA ou pET-15b/ SamELA ; et la souche non transformée. Le moment
d’induction est indiqué par la flèche noire (pour pET-15b/ SamAA, pET-15b/ Sam PVA, et E.
coli Origami B (DE3)), et la flèche rouge (pour pET-15b/ SamELA). ................................. 169
Figure 4.2 : Électrophorèses SDS-PAGE des mélanges protéiques issues des cultures d’E. coli
Origami B (DE3) non transformée (A), transformée avec le plasmide pET-15b/ sam-ELA (B),
transformée avec le plasmide pET-15b/ sam-PVA (C), et transformée avec le plasmide pET-
15b/ sam-AA (D). MW : Marqueur de taille (Unstained Precision Plus Protein Standards ;
BioRad) ; I- : avant induction ; I+Xh : X heures après induction à 0,1mM IPTG. Les flèches
rouges indiquent la position des protéines exprimées. ......................................................... 170
Figure 4.3 : Électrophorèse SDS-PAGE des mélanges protéiques issues des cultures d’E. coli
Origami B (DE3) transformé avec le plasmide pET-15b/ sam-AA obtenus 24h après induction
avec différentes concentrations d’IPTG. MW : Marqueur de taille (Unstained Precision Plus
Protein Standards ; BioRad) ; I- : avant induction. La flèche rouge indique la position de Sam-
AA exprimée. ..................................................................................................................... 171
Figure 4.4 : Électrophorèse SDS-PAGE des protéines issues de l’élution à différentes
concentrations d’imidazole (élution 1 : 80 mM, élution 2 : 160 mM et élution 3 : 250 mM). MW
: Marqueur de taille (Unstained Precision Plus Protein Standards ; BioRad). La flèche rouge
correspond à la bande de la taille de Sam-AA. .................................................................... 175
Figure 4.5 : suivi cinétique de la réaction de synthèse de l’-lauroyl-lysine en présence de
l’extrait protéique issu de la souche sauvage et mutante. Réaction réalisée dans du tampon tris
HCl 25 mM, 50mM NaCl pH 8 à 45°C, agitation à 500 rpm contenant 0.1 M des deux substrats
et 1 g/L de protéines ........................................................................................................... 176
Figure 4.6 : pourcentage de conversion de l’acide 10-undécénoique en présence des 20 acides
aminés. Réaction réalisée pendant 24 h dans du tampon tris HCl 25 mM, 50 mM NaCl pH 8 à
45°C, agitation à 500 rpm contenant 0,1 M des deux substrats et 1 g/L de protéines (n=2) .. 178
Figure 4.7 : pourcentage de conversion d’acides gras en présence de la lysine comme accepteur
d’acyle. Réaction réalisée pendant 24 h dans du tampon tris HCl 25 mM, 50 mM NaCl pH 8 à
45°C, agitation à 500 rpm contenant 0,1 M des deux substrats et 1 g/L de protéines ........... 179
Figure 4.8 : suivi et spectre MS2 après fragmentation de l’acyl-lysine : A: souche sauvage de
S. ambofaciens ; B : souche mutante de S. ambofaciens, pour la synthèse de (1) l’octanoyl-
lysine ou (2) phénylpropionyl-lysine................................................................................... 180
Chapitre V :
Figure 5.1 : schéma des interactions hydrogènes possibles entre les fonctions amines de
l’APTES et l’enzyme (Kołodziejczak‐Radzimska et al., 2018)............................................ 218
Figure 5.2 : distribution de taille des mésopores par la méthode BJH (A) et des macropores par
l’analyse de porosité au mercure (B) des SiHIPE ................................................................ 220
Figure 5.3 : observation en microscopie électronique à balayage (A) et à transmission (B) des
SiHIPE ............................................................................................................................... 220
Figure 5.4 : quantité d’enzyme immobilisée sur les différents types de support (A), taux de
conversion de l’ -acétyl-lysine en lysine (B) et suivi de l’évolution de l’activité suite à 2
recyclages des enzymes immobilisées (C). H : cycle d’hydrolyse de l’-acétyl-lysine en lysine
........................................................................................................................................... 222
Figure 5.5 : taux de conversion de l’-acétyl-lysine en lysine (A) et activité hydrolytique
relative suite à 2 recyclages des enzymes immobilisées, H : cycle d’hydrolyse de l’-acétyl-
lysine en lysine ................................................................................................................... 224
Figure 5.6 : A. Activité de CALB immobilisée sur les différents SBA15 fonctionnalisés vs
CALB commerciale immobilisée par adsorption sur des supports de polyméthacrylate
divinylbenzène macroporeux (cycle : une réaction de synthèse de l’acétate de géraniol sous
scCO2 à 55°C et 200 bar suivi d’une dépressurisation rapide) B. composition de la solution de
lipase utilisée pour l’immobilisation sans standardisation. .................................................. 228
Figure 5.7 : A. Activité de CALB immobilisée sur les différents supports SBA15
fonctionnalisés vs CALB commerciale immobilisée sur des supports de méthacrylate
divinylbenzène macroporeux (cycle : une réaction de synthèse d’acétate de géraniol sous scCO2
à 55°C et 200 bars suivie d’une dépressurisation rapide), B. image de la structure 3D des deux
faces de CALB obtenue par l’utilisation du logiciel Discovery studio ................................. 230
Figure 5.8 : Activité de CALB immobilisée sur les monolithes fonctionnalisés avec de
l’isocyanate à différentes concentrations vs Lipozyme 435® (cycle : une réaction de synthèse
de l’acétate de géraniol sous scCO2 à 55°C et 200 bars pendant 30 min suivi d’une
dépressurisation rapide) ...................................................................................................... 232
Chapitre VI :
Figure 6.1 : procédures de purification évaluées et sélectionnées pour la purification du C11’F
........................................................................................................................................... 269
Liste des tableaux
Chapitre I :
Tableau 1-1 : Réactions catalysées par les lipases ................................................................. 21
Tableau 1-2 : propriétés thermo-physiques des liquides, gaz et fluides supercritiques (Attard,
Hunt, 2018a)......................................................................................................................... 30
Tableau 1-3 : évolution de la viscosité des MEP après ajout de 10% v/v d’eau (Guajardo et al.,
2017) .................................................................................................................................... 44
Tableau 1-4 : caractéristiques et spécificités de différentes aminoacylases ............................ 51
Tableau 1-5 : activité de synthèse de différents lauroyl-acides aminés par les aminoacylases de
Burkholderia sp. (Takakura, Asano, 2019) ............................................................................ 55
Tableau 1-6 : exemples d’utilisation de réacteurs intensifiés ................................................. 77
Tableau 1-7 : exemple d’utilisation des micro-ondes et influence de l’utilisation des réacteurs à
micro-ondes sur les performances enzymatiques ................................................................... 80
Chapitre II :
Tableau 2-1 : Composition de la solution de CALB utilisée .................................................. 83
Tableau 2-2 Composition des milieux utilisés lors des différentes étapes de culture de S.
ambofaciens ......................................................................................................................... 85
Tableau 2-3 : Composition des gels et solutions utilisés pour les SDS-PAGE ....................... 89
Tableau 2-4: réactifs utilisés lors des réactions enzymatique ................................................. 94
Tableau 2-5: Liste des produits utilisés pour les analyses des produits des réactions
enzymatiques ........................................................................................................................ 99
Tableau 2-6 : Composition des réactifs utilisés pour la dérivatisation .................................. 100
Tableau 2-7 : Gradient de phases et composition des solvants d’élution .............................. 101
Tableau 2-8 : Gradient des solvants utilisés ........................................................................ 102
Tableau 2-9 : conditions d’analyse des acides aminés avec la LC-MS ................................. 103
Tableau 2-10 : Composition et gradient des solvants d’élution pour les colonnes C18 amide et
Biphényl ............................................................................................................................. 104
Tableau 2-11 : Composition et gradient des solvants d’élution des analyses en CL-SM-SM 105
Tableau 2-12 : Conditions implémentées lors des étapes de minimisation de l’énergie du
système .............................................................................................................................. 108
Tableau 2-13: Conditions implémentées lors des étapes de dynamique moléculaire ............ 109
Chapitre III :
Tableau 3-1 : conditions réactionnelles lors de la synthèse du C11’F et du C8G sous scCO2
........................................................................................................................................... 123
Tableau 3-2 : Résultats en solvants eutectiques après 24h, à une activité d’eau de 0,2 ......... 130
Tableau 3-3 : logP des différentes molécules utilisées lors des réactions ............................. 132
Tableau 3-4 : Protocole de minimisation du système acyl-enzyme et résultats associés ....... 139
Tableau 3-5 : Résumé des résultats expérimentaux obtenus avec les lipases en milieux non-
conventionnels et hypothèses sur les phénomènes mis en jeu. ............................................. 148
Chapitre IV :
Tableau 4-1 : Activités spécifiques des extraits bruts des cultures d’E. coli Origami B (DE3)
transformées et non transformée. ........................................................................................ 173
Chapitre V :
Tableau 5-1 : tableau de synthèse des résultats de l’immobilisation des aminoacylases de S.
ambofaciens sur les différents supports ............................................................................... 225
Tableau 5-2 : tableau récapitulatif des résultats de l’immobilisation de CALB sur les différents
supports .............................................................................................................................. 234
INTRODUCTION GÉNÉRALE
1
2
Introduction générale
Le marché mondial des tensioactifs (surfactants), en particulier ceux issus de ressources
naturelles, est en pleine croissance. En 2017, le chiffre d’affaire mondial des tensioactifs
biosourcés était estimé à 13,5 milliards avec une croissance attendue de 5% d'ici 2022 (Le
Guenic et al., 2019). Les acides aminés acylés constituent l'une des classes les plus importantes
de molécules tensioactives naturelles. Ils proviennent de la condensation d'un acide aminé
(accepteur d'acyle) et d'une molécule apolaire telle qu’un acide gras (donneur d'acyle). On parle
alors de Lipo Acides Aminés (LAA) ou d’Amino-Acid-based Surfactants (AAS). Un LAA est
une molécule amphiphile présentant une activité de surface élevée avec, dans certains cas, une
activité biologique. En outre, les LAA biosourcés sont des biosurfactants souvent facilement
biodégradables et leur éco-compatibilité font de ces derniers des molécules de choix pour les
industries cosmétiques et pharmaceutiques, mais aussi dans le domaine du nettoyage et de
l’agroalimentaire.
La voie privilégiée de production de ces LAA à l’échelle industrielle est la réaction chimique
de Schotten-Baumann. Dans ce cas, l’acide aminé réagit avec un chlorure d’acide gras à pH
fortement alcalin dans du TFA / eau ou en utilisant d’autres solvants organiques ce qui, malgré
des rendements de synthèse élevés, entraîne des étapes de purification, générant de grands
volumes d'effluents salins très coûteux à retraiter. De plus, aussi bien pour répondre à une
pression sociétale et environnementale croissante qu’à des fins économiques, de plus en plus
d’industries tentent de développer des technologies durables en passant de la dépollution en fin
de procédé à la réduction de la quantité d’effluents polluants générés durant le procédé. D’une
manière générale, les enzymes sont des biocatalyseurs qui, par leur spécificité de substrat, leur
régio-, chimio- voire énantiosélectivité, et leur aptitude à fonctionner dans des conditions de
pH et de température modérées, permettent d’éviter l’usage d’étapes de protection-déprotection
chimique de groupements fonctionnels non-visés et de limiter les coûts de production associés.
Les enzymes ont été largement décrites pour catalyser des réactions d'acylation, en particulier
pour des réactions de O-acylation (estérification), mais beaucoup moins pour des réactions de
N-acylation (amidation) d’acides aminés.
Dans ce contexte, la présente thèse a été financée dans le cadre d’un projet ANR dans l’appel à
projet générique 2014-2015. Le projet, intitulé « Intensified & Sustainable Enzymatic
Acylation Processes on Innovative Macroporous/Mesoporous Materials » (ISEAPIM3),
s’inscrit dans le défi prioritaire 3.3. de l’ANR “stimuler le renouveau industriel ” au travers de
l’axe thématique 3.3.4 “Chimie Durable, produits, procédés associés”. L’idée générale des
1
projets ANR associés à ces objectifs est de remplacer, quand cela est possible, des procédés
chimiques de synthèse présentant des inconvénients (risques/coûts associés aux réactifs, aux
procédés, aux produits secondaires et aux effluents à retraiter) par des procédés chimiques ou
biologiques alternatifs plus respectueux de l’environnement. L’objectif principal de cette thèse
était de développer un procédé de N-acylation enzymatique compétitif par rapport au procédé
chimique actuellement utilisé pour la synthèse de lipoaminoacides (LAA).
Afin d’atteindre cet objectif, plusieurs aspects ont été étudiés et les résultats ont été répartis en
plusieurs chapitres
Dans un premier temps, l’étude du meilleur couple enzyme / solvant réactionnel permettant
l’acylation d’acides aminés en utilisant des solvants dits « verts » a été réalisée. Les travaux ont
visé à :
• l’évaluation des performances de lipases en milieu non aqueux pour la réaction
d’acylation d’acides aminés
• l’étude par modélisation moléculaire des interactions enzyme (CALB) / substrat (acides
aminés)
• l’évaluation des performances des acylases en milieu aqueux pour la réaction de
synthèse d’acide aminés acylés
• la comparaison des performances des deux types d’enzymes
Le choix du biocatalyseur et du milieu réactionnel le plus approprié à ce type de réaction est
une étape cruciale pour la suite de cette étude. Les lipases font partie des enzymes les plus
disponibles et les plus étudiées pour les réactions de O-acylation mais très peu pour les réactions
de N-acylation d’acides aminés. Lors de cette étude, plusieurs couples lipases / solvants
réactionnels tels que le CO2 supercritique, les solvants eutectiques et les milieux bi-phasiques
en plus des solvants organiques ont été évalués. Etant donné que la structure des lipases telles
que CALB est bien connue, l’usage de la modélisation moléculaire peut permettre d’expliquer
les résultats obtenus à l’échelle réactionnelle par l’étude des interactions entre l’enzyme et les
substrats à l’échelle moléculaire. Cela constitue un outil très intéressant permettant de limiter
les coûts (financiers, temps, énergie) pour l’identification et la compréhension des phénomènes
catalytiques. Les acylases, contrairement aux lipases, ont été beaucoup moins décrites pour la
réaction d’acylation d’acides aminés. Lors d’un travail antérieur (Ferrari 2014), des
aminoacylases provenant du surnageant de culture de Streptomyces ambofaciens, espèce
sélectionnée parmi plusieurs Streptomyces, ont été découvertes au sein du laboratoire. Ces
dernières avaient montré de très intéressantes activités d’acylation de la lysine et de certains
2
peptides avec une régiosélectivité vis-à-vis de la fonction amine en position . Cependant, les
performances de ces enzymes pour la N-acylation d’acides aminés, autres que la lysine, n’ont
jamais été étudiées. L’objectif de cette étude a été également d’étudier ces enzymes en termes
de chimio et de régio-sélectivité. Pour cela, plusieurs accepteurs d’acyles dont les 22 acides
aminés proteinogéniques et plusieurs donneurs d’acyles de différentes longueurs de chaine et
propriétés ont été utilisés. La comparaison de la spécificité de substrat entre l’extrait brut issu
de la souche sauvage de S. ambofaciens et l’extrait brut issu d’une souche mutante exprimant
uniquement certaines aminoacylases d’intérêt a également été réalisée, pour mieux comprendre
la chimio et la régiosélectivité des différentes aminoacylases.
La faible stabilité d’un biocatalyseur libre ainsi que sa non recyclabilité peuvent être des verrous
pour l’extrapolation du procédé à l’échelle industrielle. Afin de remédier à cela, plusieurs
techniques d’immobilisation peuvent être utilisées. C’est pourquoi les objectifs de la deuxième
partie de cette thèse concernent l’évaluation des performances des aminoacylases de S.
ambofaciens immobilisées sur différents supports en milieu aqueux.
Afin d’atteindre ces objectifs, plusieurs supports d’immobilisation ont été développés en
collaboration avec les partenaires du projet ANR ISEAPIM3 qui sont le Centre de Recherche
Paul Pascal (CRPP) de Bordeaux et le Laboratoire Lorrain de Chimie Moléculaire (L2CM) de
Nancy. Des supports mésoporeux, méso-macroporeux et macroporeux à base de silice ont été
développés permettant l’immobilisation des enzymes soit par adsorption (physisorption) ou par
des liaisons covalentes (chimisorption) avant d’étudier les performances de ces enzymes dans
les milieux adaptés à chaque enzyme.
Enfin, dans la troisième partie de cette thèse, le procédé enzymatique identifié comme étant le
plus adapté à la production d’acides aminés acylés a été intensifié pour la production d’un acyl-
acide aminé particulier à fort intérêt industriel. Ce dernier a été purifié et son activité biologique
a été évaluée et comparée à celle de la molécule commerciale, synthétisée par voie chimique.
3
4
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
5
6
Chapitre I : Étude bibliographique
1 Chapitre I : Étude bibliographique

1.1 Acylation d’acides aminés
1.1.1 Les acides aminés acylés
Les tensioactifs font partie des produits chimiques les plus utilisés au monde. Selon Acmite
Market Intelligence 2016, une croissance continue du marché mondial des agents de surface a
été enregistrée, avec des prévisions de croissance de 4,4% entre 2015 et 2024 et une
augmentation des volumes de 3,9% au cours de la même période, passant de 16,35 millions de
tonnes à 22,97 millions de tonnes (Acmite Market Intelligence, 2016). En raison de leur
diversité structurelle et de leurs propriétés (anioniques, cationiques, amphotères et non
ioniques), les tensioactifs ont trouvé une large gamme d’applications dans les industries
cosmétiques, des détergents et autres. Cette augmentation importante de la demande
s'accompagne d'un accroissement de la production de tensioactifs, en particulier ceux dérivés
de composés pétrochimiques peu respectueux de l'environnement. De nos jours, une forte
demande des consommateurs et des autorités règlementaires est observée afin de remplacer, du
moins en partie, les surfactants à base pétrochimique par des surfactants moins toxiques et issus
de ressources renouvelables produites par des technologies durables (Marchant, Banat, 2012).
En effet, ce groupe de surfactants regroupe ceux obtenus par fermentation (biosurfactant) et
ceux synthétisés à partir de matières premières renouvelables (surfactants biosourcés ou
naturels). Les surfactants à base d'acides aminés (SAA) provenant de la condensation d'un acide
aminé et d'une ou de plusieurs longues chaînes apolaires telles que les acides gras constituent
l'une des classes les plus importantes de molécules tensioactives naturelles (Infante et al., 2010).
Cela permet d’obtenir une molécule avec des propriétés de surface élevées et, dans certains cas,
d’acquérir une activité biologique et une résistance plus importante aux contraintes
physicochimiques faisant de ces surfactants des molécules de choix pour les industries
alimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques (Gleeson et al., 2015 ; Rondel et al., 2009).
Classification et utilisation des surfactants à base d’acide aminé :
L’étude des AAS pour les applications industrielles a commencé en 1909 avec l’étude de Bondi
et la synthèse de la N-acylglycine et de la N-acylalanine. Cependant, ce n’est qu’en 1936 que
Hentrich et al. ont déposé le premier brevet sur l'application des AAS dans des produits de
nettoyage ménagers tels que les détergents, les shampooings et les dentifrices (Hentrich et al.,
1936). Étant donné la diversité structurelle des 22 acides aminés naturels qui se trouvent dans
la partie radicalaire de la molécule, un grand nombre de surfactants aux propriétés et activités
7
diverses peuvent être synthétisés. En effet, selon le radical de l’acide aminé et le groupement
acylé : O-acylation avec le groupement hydroxyle, N-acylation avec le groupement amine, S-
acylation avec le groupement thiol, les AAS peuvent être classés sur la base du type du
groupement fonctionnel libre en bout de chaine avec des applications industrielles
différentes (Tripathy et al., 2018 ; Yea et al., 2018a ; Le Guenic et al., 2019):
• Les AAS cationiques : ce sont des AAS qui possèdent une charge positive libre sur leur
partie hydrophile. Ils contiennent en général de la lysine ou de l’arginine. Ils peuvent être
utilisés comme agents antimicrobiens ou agents antistatiques comme l'ester éthylique de
cocoyl arginine utilisé comme désinfectants. Ils sont aussi utilisés dans des textiles comme
adoucissant et additif antistatique.
• Les AAS anioniques : ce sont des AAS qui possèdent une charge négative libre sur leur
partie hydrophile. Deux exemples sont le N-cocoyl-L-glutamate et le N-cocoyl glycinate
de potassium utilisé en cosmétique et dans des produits d’entretien.
• Les AAS non ioniques : ce sont des AAS qui ne possèdent pas de charge. Ils sont utilisés
pour leur pouvoir de détergence et leurs propriétés moussantes (ex : dérivés de
phénylalanine et de leucine). L’absence de charge les rend peu influencés par la présence
d’ions calcium et magnésium dans les eaux dures. Cela permet leur utilisation comme
agent de surface dans les domaines de la cosmétique, du textile, de la papeterie et des
agroproduits,
• Les AAS zwittérioniques ou amphotères : ce sont des AAS qui possèdent des fonctions
cationiques et anioniques comme l'-lauroyl-lysine, largement utilisée dans les crèmes et
les revitalisants capillaires en raison de sa faible solubilité en milieu aqueux.
Une autre classification de ces molécules se base sur le nombre de chaines hydrophobes acylées
sur l’acide aminé (figure 1.1). On y trouve :
- les AAS linéaires : ils sont le résultat de l’acylation d’un acide aminé par un seul acide
gras. C’est la forme la plus retrouvée naturellement qui englobe les AAS décrits
précédemment,
- les AAS dimériques appelés aussi gemini : ils proviennent de l’association de deux AAS
linéaires à l’aide d’un espaceur de longueur de chaine variable,
- les AAS de type glycérolipides : cette classe englobe les mono- et di-acyl-glycérol à base
d’acides aminés tels que l’arginine pour la production d’AAS cationiques,
8
- Les AAS bolaamphiphiles : ils proviennent de la condensation de deux acides aminés

avec une seule chaine hydrophobe contenant deux sites réactifs (acides gras
dicarboxyliques tels que l’acide succinique et azélaique),
Figure 1.1 : structure des surfactants à base d’acides aminés
1.1.2 Activités biologiques des surfactants à base d’acides aminés
Plusieurs travaux ont été réalisés afin d’identifier et de caractériser l’activité des acides aminés
acylés dans les matrices biologiques (annexe 1). Tous les acides aminés protéinogéniques N-
acylés ont été identifiés dans les organismes vivants en particulier les mammifères (Farrell,
Merkler, 2008). Ces derniers interviennent comme des molécules à l’état de trace dans la
régulation de plusieurs fonctions biologiques. L’acide aminé qui rentre dans la composition des
acides aminés acylés le plus répandu dans les matrices biologiques est la glycine. Elle intervient,
ainsi que la taurine, dans la formation de la bile à partir de l’acide biliaire permettant ainsi la
solubilisation de ce dernier afin de protéger le foie de l’action agressive de l’acide initial. Cela
explique pourquoi 98% de l’acide biliaire est transformé. De plus, ces acides aminés acylés
présentent un caractère hydrophobe et des propriétés de surface très importantes permettant une
solubilisation et une meilleure absorption intestinale des lipides et des vitamines (Trottier et al.,
2006). Les AAS à base de glycine tels que le N-oléoyl ou l’arachidonoyl-glycine jouent aussi
le rôle de molécule signal intervenant dans la thermorégulation du corps et la locomotion
(Chaturvedi et al., 2006). L’arachidonoyl-glycine a aussi été identifiée dans le cerveau comme
un analgésique. Ce dernier intervient dans la réduction de la douleur en supprimant
9
l'hyperactivité induite par la formaline dans les voies nociceptives en agissant soit directement
sur le nerf ou indirectement en modulant leur environnement interstitiel immédiat (Huang et
al., 2001). Il joue aussi le rôle d’anti-inflammatoire en agissant comme molécule signal
(Takenouchi et al., 2012). D’autres AAS présentent la même activité mais le mécanisme n’a
pas été décrit. Le N-acétyl-glutamate est aussi un AAS très important dans la régulation des
fonctions urinaires. Il joue le rôle d’un activateur allostérique obligatoire de la carbamyl
phosphate synthétase I qui intervient dans l’uréogénèse (Caldovic et al., 2006). Le N-
arachidonoyl-L-sérine a aussi été décrit comme ayant des propriétés vasodilatatrices et pro-
angiogéniques, en activant les protéines intervenant dans la voie de signalisation conduisant à
cet effet biologique (Milman et al., 2006). Il a montré d’excellentes propriétés pro-neurogènes
et neuro-protectrices dans le cas de lésion cérébrale (Cohen-Yeshurun et al., 2013). Ces études,
entre autres, démontrent l’intérêt et les possibilités d’utilisation des AAS comme actifs dans les
produits pharmaceutiques en plus de leur possible utilisation comme molécules cibles dans le
diagnostic de certaines maladies (Goldstein, 1963 ; Loots et al., 2005).
A part les AAS endogènes à l’organisme, certains AAS produits par des microorganismes ou
par voie chimique présentent aussi des activités biologiques très attractives pour des
applications industrielles. Les AAS chargés positivement tels que les acyl-lysine et acyl-
arginine ont été largement décrits dans la littérature comme ayant d’importantes activités
antimicrobiennes. La présence du NH3+ libre provoque une dépolarisation et une perturbation
de la membrane des microorganismes causant la destruction des cellules (Pinazo et al., 2016).
Le N-10-undécénoyl-L-phénylalanine a été décrit comme étant capable de réduire
l’hyperpigmentation de la peau en association avec la niacinamide. Cet AAS joue le rôle d’une
molécule antagoniste au récepteur de l’hormone de stimulation de l’-mélanocyte réduisant
ainsi la production de mélanine par les mélanocytes (Bissett et al., 2009a). D’autres AAS
présentant des activités très variables sur la peau et les cellules adipocytaires (activités antirides,
antimicrobiennes, antioxydantes, anti-inflammatoires, antistress) sont actuellement produits et
commercialisés par plusieurs sociétés industrielles. Toutes ces activités biologiques font de ces
AAS des molécules très attractives pour des utilisations dans la formulation de produits
cosmétiques et de produits d’entretien. Par ailleurs, il est à noter que leur utilisation doit aussi
être régulée à cause de possibles effets secondaires de ces molécules tels que l’irritation de la
peau. C’est l’exemple du capryloylglycine utilisé pour le traitement de l’acné (Mangodt et al.,
2019).
10
1.1.3 Caractéristiques structurales des AAS et paramètres influençant

leur efficacité
L’utilisation des AAS dans les produits cosmétiques est conditionnée par leur efficacité et leur
stabilité. L’objectif lors du développement de telles molécules est de trouver les paramètres
permettant d’améliorer leurs propriétés physicochimiques et leur efficacité afin de réduire la
quantité utilisée dans la formulation, diminuant ainsi l’impact environnemental (consommation
moins importante de matière et d’énergie). Greber et al., 2017 ont étudié l’influence du nombre
de charges positives et de la longueur de la chaine aliphatique sur l’activité antimicrobienne de
surfactants à base de lysine. Ils ont démontré que l’activité biologique était étroitement liée à la
longueur de la chaine grasse où la réduction du nombre de carbone a conduit à une diminution
de l’activité avec de meilleures activités en présence de l’acide palmitique (C16). D’autre part,
le nombre de charges positives influence aussi l’efficacité des AAS où un minimum de deux
charges positives est nécessaire pour améliorer l’activité (Greber et al., 2017a). Par contre, les
propriétés de surface de ces molécules sont négativement affectées par l’augmentation de la
longueur de la chaine grasse et du nombre de charges, ce qui limite leur utilisation comme
agents de surface (Greber, 2017b). Shi et al., 2019 ont évalué les propriétés de surface de la
lysine acylée avec des acides gras de différentes longueurs de chaine. La détermination de la
concentration micellaire critique (CMC) et des paramètres liés aux propriétés de surface a
montré une meilleure efficacité en présence d’acide laurique (C12) que celles obtenues avec
des acides gras de plus courtes chaines (C8 et C10). Cela permet la formation d’émulsions avec
des gouttelettes de plus faible diamètre et donc d’envisager leur utilisation dans le domaine
pharmaceutique et cosmétique (Shi et al., 2019).
En plus de la longueur de la chaine grasse, la présence ou l’absence d’insaturation peut aussi

jouer un rôle sur les propriétés des AAS. Joondan et al., 2017 ont étudié l’influence de la
tyrosine acylée par différents acides gras sur les propriétés de surface et l’activité
antimicrobienne. Les résultats ont montré une diminution de la valeur de CMC avec
l’augmentation de la longueur de la chaine aliphatique traduisant de meilleures propriétés de
surface, ce qui est en accord avec les résultats obtenus avec la lysine par Shi et al., 2019. Par
ailleurs, la présence d’une double liaison, pour la même longueur de chaine, a engendré une
augmentation de la CMC. D’autre part, l’activité antimicrobienne la plus élevée a été obtenue
en présence de C12 comme acide gras saturé. La présence d’insaturation a permis une
amélioration de 5 à 10 fois de l’activité antimicrobienne pour le même acide gras (Joondan et
al., 2017).
11
L’acide aminé utilisé joue aussi un rôle dans les propriétés de surface des AAS produits. Brito
et al., 2009 ont étudié les propriétés de différents acides aminés (tyrosine, sérine,
hydroxyproline et lysine) acylés avec de l’acide laurique. Selon leur étude, les meilleures
propriétés de surface ont été obtenues en présence de lysine comme acide aminé comparé à
ceux des surfactants conventionnels (dodécyltriméthylammonium bromide ou DTAB) (Brito et
al., 2009).
Parmi les acides aminés, la lysine représente un cas particulier lié à la présence d’un NH2 réactif
au bout de la chaine latérale qui permet la formation de liaison amide en position  en plus de
la position . La position de N-acylation dans ce cas joue un rôle important dans la propriété et
l'activité de l’AAS synthétisé. Pérez et al. ont étudié l'influence du groupe N-acylé de l'ester
méthylique et éthylique de la lysine sur l'activité antimicrobienne. Ils ont démontré que
l'acylation en position  diminuait considérablement l'activité antimicrobienne par rapport à la
lysine acylée en position  en raison de la différence importante entre les deux pKa de la
fonction amine (8,8 pour l’-lauroyl-lysine et 6,2 pour l’-lauroyl-lysine) (Pérez et al., 2009 ;
Pinazo et al., 2016).
1.1.4 Toxicité et biodégradabilité des AAS

L’intérêt principal de la production et de l’utilisation des AAS est leur faible impact
environnemental et sanitaire. La toxicité et la biodégradabilité des AAS sont donc très
importantes. En général, la toxicité d’un surfactant est liée à ses propriétés de surface qui vont
perturber la membrane cellulaire via un positionnement à l’interface cellule/eau. La toxicité est
étroitement liée à la longueur de la chaine aliphatique car plus la longueur de la chaine est
augmentée plus la CMC est réduite et donc la tension de surface est accrue (Tripathy et al.,
2018). L’écotoxicité des AAS a été largement décrite dans la littérature. Infante et al., (2010)
ont comparé la toxicité de plusieurs catégories d’AAS cationiques (linéaires, gémini et
glycérolipides) à base de lysine et d’arginine en utilisant Daphnia magna comme espèce
aquatique cible. Toutes les valeurs obtenues ont indiqué que ces AAS ont une toxicité inférieure
à l’hexadécyltriméthyl-ammonium bromide (HTAB) pris comme référence (Infante et al.,
2010). Brito et al., 2009 ont aussi étudié la toxicité aquatique de la tyrosine, la sérine et la lysine
acylées en utilisant la même espèce. La toxicité de tous ces AAS était inférieure à celle du
HTAB pris comme référence. L’association de DTAB avec un acyl-lysine a par ailleurs permis
de réduire son écotoxicité (Brito et al., 2009).
12
L’évaluation de l’activité hémolytique est aussi un paramètre très important lors du

développement des AAS pour des applications pharmaceutiques et cosmétiques. Nogueira et
al., 2011 ont étudié l’activité hémolytique de surfactants à base de lysine en modifiant le contre-
ion utilisé et le pH lors des essais. Les résultats ont montré que tous les AAS présentent une
activité hémolytique mais cette dernière est de 4 à 17 fois inférieure à celle obtenue avec le
sodium-dodécyl-sulfate (SDS) avec la plus faible activité en présence du Tris comme contre-
ion. Ils ont aussi démontré l’influence négative de la réduction du pH du milieu (Nogueira et
al., 2011). Pérez et al., 2009 ont comparé l’activité hémolytique des AAS à base de lysine
méthyl-ester acylé en position  et  et en changeant la longueur de la chaine d’acide gras.
L’activité hémolytique de la lysine acylée en position  était plus de six fois plus importante à
celle observée via l’acylation en position . Cela peut être lié à la nature de la charge positive
de l’AAS qui s’adsorbe à la surface cellulaire (érythrocytes), par interaction avec les molécules
chargées négativement présentes sur la membrane, ce qui augmente la perméabilité
membranaire causant ainsi une lyse cellulaire. L’augmentation de la longueur de la chaine de
l’acide gras a permis de réduire l’activité hémolytique de l’AAS (Pérez et al., 2009). A l’inverse
de ces auteurs, d’autres études ont montré une augmentation de l’effet hémolytique avec
l’augmentation de la longueur de la chaine grasse en utilisant de l’histidine comme acide aminé.
Ils ont expliqué ces résultats par l’augmentation de l’accessibilité des AAS dans la bicouche
lipidique (Pinazo et al., 2019).
La biodégradabilité d’un composé est définie comme la possible décomposition chimique par
les organismes vivants du sol d’une molécule en molécules plus simplement assimilables. C’est
un paramètre très important afin de revendiquer l’éco-compatibilité d’une molécule. Les AAS
sont reconnus comme étant des molécules biodégradables. En effet, étant donné qu’ils sont
issus de la condensation d’un acide aminé (ou peptide) et d’une chaine aliphatique par une
liaison ester ou amide, ces derniers sont facilement clivés par l’action d’enzymes naturellement
présentes dans les organismes vivants. Certains auteurs se sont intéressés à l’évaluation du
caractère biodégradable de différentes catégories d’AAS à base d’arginine. Selon ces auteurs,
une bonne biodégradabilité de ces AAS a été obtenue après quelques jours avec 90% de l’AAS
linéaire, 87% de l’AAS dimérique et 79% de l’AAS de type glycérolipidique (Pérez et al.,
2005 ; Infante et al., 2010). Shahzadi et al., 2019 ont simulé la biodégradation d’AAS à base
d’arginine avec différentes longueurs de chaines aliphatiques par les enzymes digestives dans
la perspective de leur utilisation en industrie pharmaceutique. Ils ont démontré que la quasi-
totalité des AAS était dégradée après 48h sauf dans le cas d’utilisation d’AAS à longue chaine
13
aliphatique et à haute concentration où 50% du produit a été dégradé (Shahzadi et al., 2019).
Les AAS à base de glycine ont aussi été décrits par plusieurs auteurs comme ayant une très
bonne biodégradabilité (Zhang et al., 2016 ; Yea et al., 2018b).
1.1.5 Synthèse in vivo de surfactants à base d’acides aminés

La synthèse de surfactants à base d’acides aminés est réalisée par la condensation d’une chaine
aliphatique sur un des groupements fonctionnels libre d’un acide aminé. On parle de N-
acylation ou amidation quand l’acylation d’un acide aminé, par le transfert d’un groupe acyle à
partir d’un acide gras, se fait sur une fonction amine libre permettant la formation d’une liaison
amide. Cette liaison amide présente une meilleure stabilité que les liaisons esters (Infante et al.,
2010).
La voie de biosynthèse des AAS in-vivo a été étudiée par plusieurs auteurs. Elle se fait en
général par la condensation d’un acyl-CoA et d’un acide aminé permettant de synthétiser un N-
acyl-acide aminé et la libération d’un CoA-SH par intervention d’une ou plusieurs enzymes.
Plusieurs enzymes ont été décrites comme étant impliquées dans l’acylation des acides aminés
in-vivo :
• la N-Acetyl-glutamate synthase (NAGS, EC 2.3.1.1) : c’est une enzyme mitochondriale qui
catalyse la réaction de synthèse du N-acétyl-glutamate (NAG) à partir du glutamate et de
l’acétylcoenzyme A (Caldovic et al., 2006),
• l’acide biliaire et l’acyl-CoA acide aminé N-transférase : c’est une enzyme du foie qui
permet la condensation de l’acide biliaire avec la glycine et la taurine (Falany et al., 1994 ;
Kelley, Vessey, 1994),
• L’acyl-CoA : L-glutamine N-acyltransferase: c’est un enzyme mitochondriale qui catalyse
la réaction d’acylation de la glutamine avec le phenylacetyl-CoA ou indoleacetyl-CoA
(Webster et al., 1976).
• La N-myristoyltransférase (NMT, EC 2.3.1.97) : elle permet l’ajout d’un acide myristique à
une glycine terminale d’une protéine (Raju et al., 2000),
• Le Cytochrome c : il permet la condensation de l’oléoyl-CoA et l’arachidonoyl-CoA avec la
glycine en présence de peroxyde d’hydrogène (Mueller, Driscoll, 2007 ; McCue et al., 2008),
Ces voies de synthèse sont très importantes pour la compréhension de la provenance des acides
aminés acylés impliqués dans les différentes activités biologique in-vivo. Par ailleurs, il est très
difficile de reproduire ce genre de réaction dans une perspective de production industrielle
d’AAS. De plus, les enzymes impliquées dans la biosynthèse de ces molécules présentent une
14
chimiosélectivité importante. C’est pourquoi plusieurs procédés chimiques ont été développés
pour la production à grande échelle.
1.1.6 Synthèse in vitro de surfactants à base d’acides aminés

1.1.6.1 Acylation des acides aminés par voie chimique
La voie chimique d’acylation des acides aminés ou peptides (N-acylation ou O-acylation) la

plus utilisée à l’échelle industrielle fait appel à la réaction de Schotten-Baumann. Dans ce cas,
une réaction est réalisée entre une molécule contenant un groupement amine ou hydroxyle libre
avec un chlorure d’acyle en milieux aqueux (Figure 1.2). Cela conduit à la libération d’un
proton d’où la nécessité d’ajouter le donneur d’acyle graduellement (goutte à goutte) et de
maintenir le pH du milieu réactionnel à des valeurs très élevées (pH 10) par l’utilisation de
soude ou de carbonate de sodium. L’arrêt de la réaction se fait en général par l’acidification du
milieu par ajout d’une solution diluée d’acide sulfurique qui permet aussi la précipitation du
produit et des composés résiduels (chlorure d’acyle et acide aminé). La diminution importante
du pH durant la réaction et le manque de maîtrise du procédé (ratio accepteur d’acyle/donneur
d’acyle) peut conduire à un changement de l’équilibre thermodynamique au profit de la réaction
d’hydrolyse pouvant aboutir à la présence d’acide gras résiduel dans le milieu réactionnel. A la
fin de la réaction, l’importante quantité de sel produite lors de la réaction ainsi que les substrats
résiduels, acide aminé et chlorure d’acyle, sont éliminés par filtration et lavage. Malgré la
quantité importante d’effluents générée à la fin de la réaction, qui nécessite un retraitement en
bassin, cette réaction permet d’avoir un rendement d’acylation très élevé (entre 75 et >90%)
d’où sa large utilisation à l’échelle industrielle. D’autre part, un autre inconvénient important
de cette réaction est qu’elle n’est ni régio- ni chimio-sélective ce qui nécessite une étape de
protection/déprotection dans le cas des acides aminés contenant un ou plusieurs groupements
fonctionnels conduisant à des coûts de production plus importants (Joondan et al., 2018).
Figure 1.2 : réaction chimique (Schotten-Baumann) d’acylation d’une fonction amine

Afin d’éviter les étapes de protection/déprotection par le greffage de groupement sur la partie à
protéger, certains auteurs ont réalisé une cyclisation de l’acide aminé (lysine) par chauffage
dans du n-hexyl alcohol pour obtenir de l’-amino--caprolactam (figure 1.3). Ce dernier est
mis en réaction avec de l’acyl-chloride dans de l’eau en présence de dichlorométhane et du
15
Na2CO3 puis une réouverture du cycle est réalisée par hydrolyse en conditions alcalines (Shi et
al., 2019).
Figure 1.3 : procédure de synthèse de l’-acyl-lysine (Shi et al., 2019)
A part la réaction de Schotten-Baumann, l’acylation chimique peut se faire en milieu organique.

Joondan et al., 2017 ont réalisé la réaction de N-acylation de l’ester de tyrosine avec plusieurs
chlorures d’acyle dans un mélange de tétrahydrofurane et de la triméthylamine en présence du
4-diméthylaminopyridine. Des rendements de conversion proches de 70% ont été obtenus après
18h de chauffage sous reflux (Joondan et al., 2017). Par ailleurs, ces méthodes nécessitent une
ou plusieurs étapes de purification afin de récupérer le produit. De plus, la production de
chlorure d’acyle nécessite le mélange de l’acide gras avec de l’oxalyl chloride qui est dangereux
pour le manipulateur et l’environnement (toxique, inflammable, irritant) (Sreenu et al., 2015)
La méthode de synthèse en phase-solide est une méthode utilisée pour la production de peptide
par greffage des acides aminés sur une résine ce qui facilite la récupération du produit par
clivage de la liaison avec le support. Certains auteurs l’ont utilisé pour l’acylation d’acide aminé
(lysine) et peptides (poly-lysine) avec des acides gras (pas d’utilisation de chlorure d’acyle).
Dans ce cas, la lysine dont la partie epsilon est protégée avec du tert-butyloxycarbonyle (Boc)
et du 9-fluorenyl-méthoxycarbonyle (Fmoc) en position  est fixée par son groupement
carboxylique sur la résine. Le groupement Fmoc est ensuite enlevé avec une solution de
pipéridine dans du N,N-diméthylformamide (DMF) libérant le groupement amine. La
formation de la liaison amide est réalisée en présence de l’acide gras dans un mélange de DMF,
dichlorométhane (DCM), diisopropylocarbodiimide (DIC) et du 1-hydroxybenzotriazole
(HOBt). Enfin, l’AAS est libéré avec un mélange de trifluoroacetate (TFA), de tri-
isopropylsilane (TIS) et de l’eau. Le rendement de la synthèse dans ce cas est supérieur à 80%
(Greber, 2017b).
En résumé, les voies chimiques de synthèse des AAS présentent des rendements de conversion
très élevés, en particulier par l’utilisation de la réaction de Schotten-Baumann, mais l’impact
environnemental et sanitaire du procédé reste un problème majeur. En effet, tous ces procédés
chimiques utilisent soit un substrat activé et/ou un ou des solvant(s) organique(s) que l’on peut
retrouver dans les effluents en plus des sels chlorés générés, nécessitant un traitement post-
production. De plus, l’absence de sélectivité de ces procédés impose l’ajout d’étapes
16
supplémentaires afin d’orienter la réaction. Tout cela augmente le coût de production

industrielle des AAS (mais aussi des peptides acylés). Ces dernières années, des groupes
industriels soutenus par des organismes étatiques visent à développer des technologies durables
permettant de passer de la dépollution en bout de chaine à une stratégie de réduction de
génération de déchets durant le procédé de production lui-même. Cela permet non seulement
de réduire l’impact environnemental lié à la production, mais aussi de promouvoir la
compétitivité économique en utilisant au mieux les matières premières (Sheldon, Woodley,
2018a). L’une des voies de développement la plus attractive afin d’atteindre ces objectifs est la
bioconversion enzymatique.
1.1.6.2 Acylation des acides aminés par voie enzymatique

L’utilisation des enzymes comme catalyseurs pour les réactions d’acylation attire de plus en
plus l’attention des industriels. Ces biocatalyseurs sont produits par une très grande variété
d’organismes vivants (microorganismes, champignons, levures, plantes, animaux, …) dans des
conditions vertes, sans génération de molécules toxiques. Ils peuvent catalyser les réactions
d’hydrolyse ou de synthèse dans des conditions de pression et température modérées, en général
dans de l’eau, sans nécessité absolue de substrats activés. De plus, ces catalyseurs ont des régio-
, énantio- et chimio-sélectivité propres à chaque enzyme dans des conditions données
permettant d’éviter les étapes de protection / déprotection des groupements non ciblés réduisant
le nombre d’étapes de production et le coût du procédé. Ces avantages environnementaux et
économiques permettent de classer ce genre de voie de production dans les procédés respectant
les principes de la chimie verte (Sheldon, 2012).
L’utilisation des enzymes pour les réactions d’acylation (amidation ou estérification) a été
largement décrite dans la littérature dans une perspective de production de molécules pour la
cosmétique, de synthons pour l’industrie pharmaceutique ainsi que d’autres biomolécules à
intérêt industriel (Pitzer, Steiner, 2016 ; Dorr, Fuerst, 2018 ; Manova et al., 2018 ; Contente et
al., 2018 ; Lima et al., 2019 ; Mestrom et al., 2019 ; Perdomo et al., 2019). Par ailleurs,
l’acylation enzymatique des acides aminés, en particulier la N-acylation, a été très peu décrite
par rapport aux autres types de molécules malgré son intérêt industriel indéniable. Dans un but
de développement de procédé enzymatique durable, le choix adapté du couple enzyme/milieu
réactionnel et l’étude des conditions expérimentales (concentration de substrat, température,
pH, force ionique, immobilisation ou non de l’enzyme …) sont des éléments cruciaux afin de
bien contrôler la réaction. Ce choix permet d’une part d’augmenter l’efficacité de la synthèse
17
mais aussi d’orienter la régio- et la chimio-sélectivité selon l’objectif visé. Plusieurs enzymes
décrites dans la littérature seront présentées ultérieurement.
1.1.6.3 Acylation des acides aminés par voie chimio-enzymatique

Etant donné que la réaction d’acylation enzymatique est conditionnée par une certaine
compatibilité enzyme/substrat et la nécessité d’un bon contact entre les deux, plusieurs auteurs
ont proposé l’association des deux voies de synthèse afin de moduler et d’améliorer la synthèse
d’AAS. En effet, la faible solubilité des acides aminés dans les solvants organiques utilisés pour
orienter l’équilibre thermodynamique de la réaction, lors de l’utilisation de lipases en
particulier, peut être un frein au bon transfert du substrat vers le site actif, engendrant ainsi de
faibles taux de conversion (Montet et al., 1990 ; Villeneuve, 2007). Afin d’augmenter la
solubilité des substrats, plusieurs auteurs ont utilisé des acides aminés sur lesquels des
groupements méthyl, éthyl, tert butyl ou carbobenzyloxy (Cbz) ont été greffés afin de protéger
les groupements non concernés par l’acylation (Valivety et al., 1997 ; Izumi et al., 1997 ;
Goujard et al., 2004). Cependant, cela nécessite une étape supplémentaire d’hydrolyse chimique
pour la libération du groupement protecteur. Goujard et al., 2004 ont utilisé la voie chimio-
enzymatique pour la synthèse de N-arachidonoyl glycine en utilisant la lipase B de Candida
antarctica comme enzyme. Ils ont comparé les performances de l’enzyme en présence de la
glycine et de la glycine tert-butyl ester comme accepteur d’acyle et de l’acide arachidonique et
du méthyl-arachidonoate comme donneur d’acyle. L’utilisation de la glycine tert-butyl ester a
permis d’augmenter le taux de conversion de 5,7 à 52 % en présence de l’acide arachidonique
et de 10 à 75 % en présence du méthyl-arachidonoate après 24h de réaction. Le tert-butyle est
ensuite libéré dans une solution de dichlorométhane et d’acide trifluoroacétique (Goujard et al.,
2004). L’augmentation du taux de conversion après ajout du groupement alkyl peut être aussi
expliquée par l’amélioration de l’accessibilité et de l’interaction du substrat avec le site actif,
augmentant ainsi la réactivité de l’enzyme (Dettori, 2017). Valivety et al., (1997) ont utilisé la
même voie pour la synthèse de dérivés de la serine. Ces derniers ont utilisé la sérine et la lysine
ainsi que leurs dérivés methyl / ethyl ester et amide et Cbz amide comme accepteur d’acyle et
de l’acide myristique et son dérivé méthyl-ester comme donneur d’acyle dans des conditions
sans solvant. L’utilisation du N-Cbz-L-sérine a permis d’avoir un taux de O-acylation de 92%
contrairement aux autres substrats où le taux de conversion ne dépasse pas les 10% (Valivety
et al., 1997).
L’utilisation de la voie chimio-enzymatique a aussi été mise en œuvre pour la synthèse d’AAS
de type gemini et bolaamphiphile nécessitant la protection et déprotection du groupement
18
fonctionnel non concerné par l’acylation (Clapés, Infante, 2002). Piera et al., 2000 ont mis en
place une procédure de synthèse d’AAS de type gémini à base d’arginine. Pour cela, ils ont
utilisé du N--lauroyl-L-arginine éthyl ester monohydrochloride comme unité de base, du 1,3
diaminoalkane comme espaceur et la papaïne comme enzyme. Afin d’éviter l’inhibition de
l’enzyme par le diamine de l’espaceur, une étape chimique a été réalisée pour fixer la première
unité avec l’espaceur puis une deuxième étape, enzymatique, permettant de relier la deuxième
unité et former le produit final (Piera et al., 2000).
Cette voie de synthèse est très attractive pour améliorer les performances d’un procédé en
faisant face aux problèmes de solubilité des substrats et en modulant et contrôlant la réactivité
de l’enzyme. Cependant, cela présente un coût additionnel étant donné la nécessité de passer
par deux étapes supplémentaires de protection/déprotection.
1.2 Réaction d’acylation enzymatique en milieu non aqueux

1.2.1 Enzymes catalysant la réaction d’acylation en milieu non aqueux
Les hydrolases (amylases, protéases, lipases, …) constituent les enzymes les plus utilisées à
l’échelle industrielle en raison de leur disponibilité, de leur faible coût, de leur spécificité de
substrat et de leurs propriétés de régio-, énantio- et stéréo-sélectivité. Parmi ces dernières les
lipases ou triacylglycérol acyl hydrolases (EC 3.1.1.3) sont les plus représentées, la lipase B
de Candida antarctica (CALB) étant la plus utilisée industriellement. Elles sont extraites de
différentes sources (microbiennes, végétales, animales, aquatiques, ou terrestres,…) et utilisées
dans différents domaines : traitement de déchets, production de détergents, d’ingrédients
cosmétiques et alimentaires, d’actifs pharmaceutiques sans oublier dans le domaine de
l’énergie avec la production de biodiesel (Javed et al., 2018 ; Filho et al., 2019).
Elles appartiennent à la famille des -hydrolases qui ont une structure commune constituée
de 8 feuillets  connectés par 6 hélices  avec un site actif formé d’une triade catalytique
composé d’un résidu nucléophilique (sérine), d’un résidu catalytique acide (acide aspartique
ou acide glutamique) qui forme une liaison hydrogène avec un histidine (Holmquist, 2000 ;
Bordes et al., 2010 ; Schreck, Grunden, 2014). Elles sont capables de catalyser la réaction
d’hydrolyse d’esters carboxyliques (triglycérides,…) en glycérol, ou mono- et di-glycérides,
et acide gras en milieux aqueux et à l’interface eau/substrat hydrophobe insoluble (émulsion)
une fois que la concentration micellaire critique est atteinte ; on parle alors du phénomène
d’activation interfaciale. Ce phénomène se traduit par une augmentation très importante de
l’activité lipolytique lorsqu’une certaine concentration de substrat est atteinte, ce qui les
différencie des estérases qui ne présentent pas d’activation interfaciale (Verger, de Haas, 1976 ;
19
Sarda, 2009). Ce phénomène est étroitement lié à la structure des lipases, en particulier à la
présence d’un volet moléculaire amphiphile ou lid, formé du repliement d’une hélice , qui
couvre l’entrée de la cavité du site actif (Brady et al., 1990 ; Kohno et al., 1996). Ce phénomène
ne concerne cependant pas toutes les lipases. En effet, CALB ne présente pas de phénomène
d’activation interfaciale, principalement en raison de l’absence de lid qui régule l’accessibilité
au site actif (Uppenberg et al., 1995). Stauch et al. (2015) ont réalisé une cristallographie de la
structure de CALB à une résolution de 0,91 Å permettant de mettre en évidence la relation
entre l’état de protonation des résidus Asp145 et Lys290 et la conformation ouverte et fermée
du site actif par un changement conformationnel de l’enzyme. Cette étude a permis d’expliquer
l’absence d’activation interfaciale efficace chez CALB (Stauch et al., 2015).
Les lipases ont été décrites dans la littérature comme étant capables de catalyser plusieurs types
de réactions avec une large gamme de substrats sans utilisation de coenzyme. En effet, le
contrôle des conditions opératoires, en particulier la réduction de l’activité de l’eau libre (aW)
du milieu réactionnel, engendre un changement de l’équilibre thermodynamique de la réaction
vers la réaction de synthèse. Afin que cette réaction soit faisable, des solvants non aqueux tels
que les solvants organiques, le CO2 supercritique (scCO2), les milieux fondus (milieux sans
solvant avec acide gras en large excès) et les solvants néotériques (liquides ioniques et solvants
eutectiques) sont utilisés. Cette particularité des lipases a été décrite pour la première fois par
Zaks et Klibanov (1985) ce qui a permis d’étendre leurs utilisations pour d’autres types de
réactions et applications industrielles plus attractives (tableau 1.1) (Zaks, Klibanov, 1985 ;
Fukui, Tanaka, 1985 ; Zaks, Russell, 1988). Parmi ces lipases, CALB fait partie des enzymes
les plus utilisées en industrie et les plus décrites dans la littérature pour ses performances
catalytiques. Cette enzyme a donc été prise comme principale référence dans cette thèse.
20
Tableau 1-1 : Réactions catalysées par les lipases

Réaction Référence
Réaction dans l’eau (aW élevé)
R1COOR2 + HOH  R1COOH +
Hydrolyse (Salihu et al., 2011 ; Grbavčić et al., 2011)
R2OH
Réaction en milieu non-aqueux (aW faible)
R1COOH + R2OH  R1COOR2 + (Lortie, 1997 ; Krishna, Karanth, 2002 ;
Estérification
HOH Kraai et al., 2008 ; Hommes et al., 2019)
R1COOR2 + R3COOR4  (Narwal, Gupta, 2013 ; Tiosso et al., 2014 ;

Transestérification
R1COOR4 + R3COOR2 Canet et al., 2016)
R1COOR2 + R3NH2 
Aminolyse (Zeng et al., 2018)
R1CONHR3 + R2OH
R1COOH + R2NH2 
Amidation (Manova et al., 2018)
R1CONHR2 + HOH
1.2.2 Structure et mécanisme catalytique des lipases
Les lipases sont principalement des protéines monomériques d’une taille entre 20 et 60 kDa.
La conformation de la cavité du site actif de ces enzymes présente une architecture similaire
formée d’une large poche catalytique avec une partie hydrophobe permettant l’attraction de
l’acide gras et au fond de laquelle se trouvent les résidus catalytiques (Pleiss et al., 1998). Ces
derniers sont répartis en plusieurs sous-groupes selon la différence de forme et la taille de la
cavité du site actif qui change d’une lipase à l’autre. Cette diversité structurale au niveau du
site actif peut expliquer les différentes propriétés de de spécificité de substrats et de sélectivité
des lipases (De Oliveira et al., 2009). CALB est une protéine monomérique de 33 kDa formée
de 317 résidus d’acides aminés dont la structure cristallographique a été élucidée par
Uppenberg et al (1994). L’enzyme est constituée de 7 feuillets β séparés par 10 hélices α et 15
segments de boucle ainsi que 2 autres brins β situés à l’extrémité C-terminale de la protéine
(Figure 1.4). Les résidus catalytiques de cette enzyme sont situés au fond d’une cavité étroite
et profonde d’une largeur de 10 Å x 4 Å et d’une profondeur de 12 Å. En plus de la triade
catalytique constituée d’une sérine (Ser105), d’une histidine (His224) et d’un acide aspartique
(Asp187), l’implication du trou oxyanionique formé d’une glutamine (Gln106) et d’une
thréonine (Thr40), lors de la réaction, est importante. Ces derniers résidus permettent de
stabiliser les intermédiaires tétraédriques formés lors du processus catalytique par des liaisons
hydrogène (Uppenberg et al., 1994a ; 1995 ; Ferrari et al., 2014a). La cavité catalytique
comporte deux zones dont une hydrophobe permettant l’attraction du donneur d’acyle et une
21
deuxième hydrophile formée des résidus Asp134, Gln106 et Thr40 proche de la Ser105 (Pleiss
et al., 1998).
Figure 1.4 : représentation graphique de la structure secondaire de CALB, en jaune : la triade

catalytique, en bleu : les résidus du trou oxyanion, flèches grises : les feuillets β, et les
cylindres grenade : les hélices α (Stauch et al., 2015)
Le mécanisme catalytique des lipases, dont CALB, est similaire à celui des sérines hydrolases
(Fuentes et al., 2004). En général, c’est le mécanisme bi-bi ping-pong, qui passe par plusieurs
intermédiaires tétraédriques, qui décrit le mécanisme catalytique de CALB (figure 1.5) (Arcos
et al., 2001 ; Husson et al., 2010a). Ce mécanisme débute par la déprotonation de la sérine
catalytique (Ser105) formant ainsi un résidu nucléophile qui attaque le groupement ester ou
amide (cas de l’hydrolyse) ou un groupement réactif (hydroxyle, carboxyle ou amine). Le
proton libéré est ensuite récupéré par l’His 224. Le résidu Ser 105 déprotoné est stabilisé par
deux groupements NH, ou autres groupements similaires, des résidus aux alentours avant
attaque de la liaison ester ou autre, dans le cas de l’hydrolyse, ou du groupement carboxylique
ou autre du donneur d’acyle, dans le cas de la synthèse. Cela conduit à la formation du premier
intermédiaire tétraédrique, appelé acyl-enzyme, par la formation d’une liaison covalente entre
l’acide et l’enzyme et la libération de l’alcool ou l’amine, dans le cas de l’hydrolyse. L’eau ou
l’accepteur d’acyle est par la suite déprotoné par le cycle imidazole de l’histidine qui transfère
22
cette charge vers le groupement carboxylique de l’acide aspartique. Cela engendre la formation
d’une liaison covalente entre l’acide et le groupement déprotoné et la libération du produit final
ainsi que la récupération de l’état initial de l’enzyme (Ferrari et al., 2014a ; Hanefeld, Lefferts,
2018).
Afin de déplacer l’équilibre thermodynamique de la réaction vers une réaction de synthèse et
de maintenir l’activité et la stabilité de l’enzyme, le contrôle des conditions opératoires et des
paramètres influençant les performances des lipases est important. En effet, les propriétés
physicochimiques des solvants réactionnels et des substrats influencent énormément les
performances catalytiques des lipases lors des réactions de synthèse.
Figure 1.5 : Mécanisme d'acylation catalysé par la triade catalytique de CALB selon le modèle
bi-bi ping-pong: A) conformation native et approche du substrat donneur d'acyle ; B) premier
intermédiaire tétraédrique ; C) relargage de l'alcool et formation de l’acyl-enzyme ; D) approche
de l'accepteur d’acyle ; E) formation du second intermédiaire tétraédrique ; F) relargage du
produit et retour à la conformation initiale de l’enzyme (Ferrari, 2014a).
1.2.3 Paramètres influençant les réactions en milieu non-aqueux

1.2.3.1 Influence de la teneur en eau
Afin de déplacer l’équilibre thermodynamique des réactions catalysées par les lipases vers la
synthèse et de stabiliser la réaction dans ce sens, le contrôle de la quantité d’eau libre dans le
23
milieu réactionnel et au cours de la réaction est primordial. De très faibles variations de teneur
en eau du milieu réactionnel peuvent aboutir à une absence totale de synthèse ou à l’hydrolyse
des produits de synthèse (Dorr, Fuerst, 2018). Cette influence est dépendante des lipases et du
solvant utilisés mais la présence d’une certaine quantité d’eau est essentielle au maintien d’une
flexibilité conformationnelle et à la présence d’une couche d’hydratation nécessaire à
l’activation de l’enzyme (Klibanov, 1989 ; Daniel, Finney, Stoneham, Clark, 2004 ; Daniel,
Finney, Stoneham, Halling, 2004). Dans tous les cas, la quantité optimale d’eau libre, évaluable
via la mesure de l’activité de l’eau (aw), doit si possible être connue ou évaluée. L’évolution de
l’activité en fonction de la teneur en eau suit une courbe en cloche avec un maximum d’activité
généralement aux faibles aW et variable selon l’enzyme utilisée (Villeneuve, 2007).
Kontogianni et al. (2001) ont étudié l’influence de l’activité de l’eau sur la réaction
d’estérification des flavonoïdes (naringin) avec l’acide décanoïque dans du tert-butanol en
présence de CALB immobilisée (Novozyme435). Ils ont démontré qu’une aW inférieure à 0,11
était la plus adaptée à l’activité d’acylation et qu’au-delà de cette valeur une importante perte
d’activité est enregistrée jusqu'à arrêt complet de la synthèse à 0,75 d’aW (Kontogianni et al.,
2001). La valeur de l’aW optimale vis-à-vis de l’activité enzymatique dépend aussi du solvant
organique utilisé en particulier de sa polarité. Vaisali et al., (2017) ont ainsi observé que pour
la réaction d’estérification de la rutine avec l’acide décanoïque, l’aW optimale était de 0,07 dans
l’acétone alors qu’elle était de 0,23 dans le tert-butanol qui est un solvant plus polaire (Vaisali
et al., 2017).
La présence d’une quantité d’eau très importante dans le milieu réactionnel conduit au
déplacement de l’équilibre thermodynamique de la réaction vers une réaction d’hydrolyse.
L’eau peut aussi causer des limitations diffusionnelles des substrats vers le site actif suite à la
formation de plusieurs couches d’hydratation à leur surface (Mora‐Pale et al., 2007). Afin de
contrôler la quantité d’eau présente dans le milieu réactionnel, plusieurs moyens peuvent être
envisagés tels que l’utilisation de tamis moléculaire ou de polymères super-absorbants qui
permettent de retenir les molécules d’eau au fur et à mesure de leur apparition lors des réactions
d’estérification (Duan et al., 2006 ; Husson et al., 2009a ; Nguyen et al., 2018). Une fois leur
capacité d’adsorption d’eau maximale atteinte, ils doivent être récupérés et regénérés.
L’immobilisation des lipases sur des supports très hydrophobes peut aussi améliorer les
performances enzymatiques en réduisant le contact entre l’eau et les enzymes (Graebin et al.,
2012). Ces dernières méthodes peuvent aussi être associées à l’utilisation des ultrasons qui
permettent de décrocher les molécules d’eau en excès autour de l’enzyme (Alves et al., 2014 ;
24
Paludo et al., 2015). L’élimination de l’eau en continu en réalisant la réaction sous vide est aussi
une manière très attractive permettant d’éviter son accumulation (Tufvesson et al., 2007).
1.2.3.2 Influence de l’état d’ionisation

Les accepteurs d’acyle tels que les acides aminés et peptides et les donneurs d’acyle tels que
les acides gras utilisés lors des réactions d’acylation en particulier pour la réaction de N-
acylation comportent tous des groupements (amine ou carboxylique) potentiellement
ionisables. La présence de substrats ionisés lors des réactions en milieux non aqueux peut
influencer le taux de conversion en agissant sur la solubilité du substrat ou la disponibilité des
groupements nucléophiles nécessaires à la réaction. Il est possible d’observer des interactions
électrostatiques entre le groupement amine protoné de l’accepteur d’acyle et le groupement
carboxylique de l’acide gras conduisant à la formation de complexes ioniques. L’influence de
l’état d’ionisation des substrats sur la réaction a été décrite par Maugard et al., (1997) lors de
l’acylation du N-méthyl-glucamine avec de l’acide oléique par la lipase de Rhizomucor miehei
dans l’hexane. La formation d’un complexe ionique entre les substrats, appelé paire d’ions, a
permis une amélioration de leur solubilité et ainsi la faisabilité de la réaction (Maugard et al.,
1997 ; 1998). Ils ont aussi décrit une relation entre le ratio accepteur/donneur d’acyle et la
chimio-sélectivité de cette lipase. Plus ce ratio est faible, plus il y a de molécules aminées
favorisant l’amidation du substrat. Par ailleurs, dans plusieurs autres cas, la formation de paires
d’ions ne contribue pas à une meilleure solubilisation du substrat mais, au contraire, à leur
précipitation réduisant ainsi leurs taux de conversion (Fernández-Pérez, Otero, 2001 ; 2003).
Husson et al. (2008) n’ont pas montré d’influence de l’état d’ionisation sur la solubilité du 6-
amino-1-hexanol et de l’acide oléique ou de son ester éthylique dans les différents milieux
réactionnels (2-méthyl-2-butanol ou M2B2, liquide ionique et milieu fondu) mais un effet très
important sur la réactivité de CALB par la modification de la chimio-sélectivité en fonction du
milieu utilisé et donc de l’état d’ionisation (Husson et al., 2008a). Dans une autre étude, les
auteurs ont observé une influence négative de la formation de paires d’ions sur l’activité de
CALB lors de l’acylation du dipeptide Lys-Ser avec l’acide oléique (Husson et al., 2009a).
L’ajout d’une base organique (triéthylamine = TEA) en excès (20 fois la concentration molaire
de l’accepteur d’acyle) a permis d’améliorer la réactivité de l’enzyme et ainsi d’augmenter le
taux de conversion. En effet, l’ajout de TEA dans le milieu réactionnel permet de neutraliser
les charges, en particulier celles de l’accepteur d’acyle, permettant la réactivité de la sérine
catalytique de l’enzyme avec les groupements nucléophiles du substrat aminé (acide aminé ou
peptide). Dettori et al. (2018) ont réalisé la réaction de N-acylation de la lysine avec l’acide
25
laurique en présence de CALB dans le solvant organique M2B2 avec ou sans ajout de cette
base. Ils ont observé une perte presque totale de l’activité enzymatique (présence de trace de
produit) en l’absence de TEA dans le milieu réactionnel alors que la présence de 2,4 M de ce
dernier a permis d’augmenter le taux de conversion de l’acide gras à environ 40% (Dettori, et
al., 2018a).
1.2.3.3 Impact de la température

La température est l’un des paramètres les plus importants lors de la mise en œuvre des réactions
enzymatiques. Le choix de la température de la réaction dépend de la lipase, du milieu
réactionnel et des substrats utilisés pour la réaction de synthèse (Sá et al., 2017). En effet,
chaque lipase est active dans une gamme de température spécifique dans laquelle un optimum
est souvent défini en fonction de la capacité d’échange de chaleur, de la polarité du milieu
réactionnel et des quantités de substrat et d’enzyme utilisées (Nguyen et al., 2018 ; Soo et al.,
2004a).
Plusieurs auteurs ont décrit une augmentation du taux de conversion en fonction de la
température lors des réactions d’acylation avec une différence importante selon l’acide gras
utilisé (Soo et al., 2003a). Cet effet est lié à la température de fusion de l’acide gras.
L’augmentation de la température permet une solubilisation plus importante de l’acide gras et
une réduction de la viscosité du milieu améliorant l’accessibilité du substrat au site actif,
permettant d’augmenter considérablement le taux de conversion en particulier lors de la N-
acylation des acides aminés (Montet et al., 1990 ; Husson et al., 2009a ; Dettori, 2017 ; Salvi et
al., 2018). Plusieurs auteurs ont choisi une température de 55°C lors des réactions d’acylation
des acides aminés et peptides par CALB afin d’avoir une bonne activité tout en évitant la
dénaturation de cette lipase (Husson et al., 2008a ; Dettori et al., 2018a). En effet, Yu et al.
(2020) ont étudié l’influence de la température sur la réaction de N-acylation du tripeptide Lys-
His-Ala avec l’acide laurique à un ratio molaire de 1 dans du 2-méthyl-2-butanol. Ils ont
observé une augmentation de l’activité enzymatique à des températures comprises entre 35 et
55°C liée à la diminution de la viscosité du milieu réactionnel suivie d’une perte d’activité à
des températures supérieures à 55°C due à la dénaturation de l’enzyme (Yu et al., 2020).
1.2.3.4 Influence du substrat et du choix du solvant réactionnel

Le choix du substrat est un paramètre critique pour la bonne mise en œuvre des réactions
d’acylation. Les lipases présentent toutes une spécificité de substrat très variable qui dépend de
plusieurs paramètres tels que leur conformation tridimensionnelle et en particulier celle du site
actif ainsi que la nature des résidus qui forment sa cavité, la nature des substrats et du solvant
26
réactionnel utilisés. En effet, l’activité enzymatique des lipases dépend de l’affinité du substrat
pour les résidus d’acides aminés formant le site actif en particulier ceux autour des résidus
catalytiques. La présence du substrat au niveau du site catalytique va générer des modifications
structurales réduisant la flexibilité de certaines zones de l’enzyme (Yagnik et al., 1997 ; Peters
et al., 1997 ; 1998 ; Peters, Bywater, 1999 ; Lee et al., 2000). Certains auteurs ont utilisé les
outils de modélisation moléculaire afin de justifier l’absence d’acylation de certains flavonoïdes
(quercétine) en présence de CALB en comparaison avec la lipase de Pseudomonas cepacia
(PCL) qui était capable de catalyser cette réaction (Chebil et al., 2007a ; Bidouil, Eduardo, et
al., 2011). La comparaison des interactions entre la quercétine et les résidus formant le site
catalytique des deux lipases a montré que l’absence d’acylation de la quercétine par CALB était
due à la formation d’interactions hydrophobes avec les résidus Ile189 et Ile285 qui empêchent
l’entrée du substrat vers les résidus catalytiques de CALB présents au fond d’une cavité étroite
et profonde. D’autre part, l’absence d’interactions défavorables avec les résidus catalytiques et
le positionnement des résidus catalytiques de la PCL dans une cavité moins profonde réduit les
limitations de transfert du substrat vers la triade catalytique permettant une bonne activité
enzymatique (Pleiss et al., 1998 ; Bidouil et al., 2011). De même, la chimio- et régiosélectivité
des lipases est influencée par les interactions moléculaires (liaison hydrogène, hydrophobe et
électrostatique) entre le substrat et les résidus d’acides aminés de la cavité catalytique (Syren
et al., 2013 ; Ferrari et al., 2014a ; Dettori, et al., 2018a). Cette sélectivité dépend aussi du milieu
réactionnel, de la forme du substrat (i.e. protection des groupements carboxyliques par
l’utilisation d’ester d’acide aminé), de l’état d’ionisation des groupements nucléophiles du
substrat (groupement carboxylique ou amine) et de la nature et de la longueur du groupement
en position  du groupement nucléophile de l’accepteur d’acyle (Kontogianni et al., 2001 ;
Pedersen et al., 2002 ; Goujard et al., 2004 ; Husson et al., 2008a ; Le Joubioux et al., 2013 ;
Jiang et al., 2015). Dans le cas de l’acylation des acides aminés et peptides en présence de
CALB, plusieurs auteurs ont démontré que cette enzyme catalysait la réaction de N-acylation
de la lysine et de peptides contenant la lysine avec plusieurs acides gras en solvant organique,
spécifiquement sur l’amine de la chaine latérale de l’accepteur d’acyle avec très peu de réaction
sur les autres groupements potentiellement acylables (Ferrari et al., 2014a ; Dettori et al.,
2018a). Les études par modélisation moléculaire ont permis d’expliquer ces résultats par le
positionnement préférentiel du groupement amine de la chaine latérale de l’accepteur d’acyle
très proche de la triade catalytique permettent une bonne réactivité du substrat. Par ailleurs,
l’étude par modélisation moléculaire des possibles interactions entre la glycine et les résidus
catalytiques a montré une instabilité de celle-ci au niveau de la cavité catalytique expliquant
27
l’absence d’acylation de cet acide aminé. La modification de la structure de ce dernier en

utilisant des dérivés esters a permis l’établissement de meilleures interactions et a conduit à
l’obtention d’un produit d’acylation confirmée expérimentalement (Dettori, 2017). Par ailleurs,
très peu d’études ont été menées sur la N-acylation des autres acides aminés.
La concentration des substrats utilisés joue un rôle important dans les performances catalytiques
des enzymes. Plusieurs auteurs ont montré que l’augmentation du ratio molaire des substrats en
faveur de l’acide gras permettait une amélioration significative du taux de conversion mais une
très importante concentration de ce dernier peut être inhibitrice de l’activité enzymatique (Soo
et al., 2003a ; Husson et al., 2010b ; Ren, Lamsal, 2017 ; Yu et al., 2020).
La solubilité des substrats dans le milieu réactionnel est l’un des paramètres les plus importants
lors de l’acylation en milieu non aqueux. Lors des réactions en solvants apolaires tels que les
solvants organiques et le CO2 supercritique, la solubilité du donneur d’acyle (acide gras) va
dépendre de son LogP (coefficient de partage octanol/eau) par rapport à celui du solvant et sa
température de fusion (Montet et al., 1990 ; Soo et al., 2003a). Plusieurs auteurs ont montré que
l’augmentation de la polarité du solvant organique permet une augmentation de l’activité des
lipases en améliorant la solubilité des substrats et en stabilisant la conformation active de
l’enzyme en particulier quand le LogP du solvant est supérieur à 3 (Soo et al., 2004a ;
Villeneuve, 2007 ; Salihu, Alam, 2015 ; Li et al., 2015). L’usage d’acide gras à plus de 12
carbone réduit considérablement leur solubilité dans le milieu réactionnel conduisant à des
limitations de transfert de ce dernier vers le site actif. C’est pourquoi une optimisation des
conditions opératoires (solvant organique et température) doit être réalisée pour chaque type de
réaction, de substrat et d’enzyme (Vaysse et al., 2002 ; Pedersen et al., 2002 ; Salem et al.,
2010). La solubilité de l’accepteur d’acyle joue un rôle prépondérant lors des réactions
d’acylation surtout lors de la réaction de N-acylation des molécules très hydrophiles telles que
les acides aminés et les peptides. Afin de pouvoir solubiliser au moins partiellement les deux
substrats lors de ces réactions, l’utilisation d’alcools tertiaires tels que le 2-méthyl-2-butanol
s’avère intéressante (Villeneuve, 2007 ; Husson et al., 2010b ; Yu et al., 2020). Par ailleurs, la
faible solubilité de ces molécules a souvent été décrite comme un frein au développement de
procédés d’acylation enzymatique des acides aminés en solvants non aqueux tels que les
solvants organiques et le CO2 supercritique (Needham et al., 1971 ; Sheldon, 2016). Afin de
remédier à ce problème, plusieurs stratégies ont été adoptées soit par la modification des
propriétés physicochimiques du substrat ou par le développement de nouveaux solvants ou
l’utilisation de milieux biphasiques permettant la solubilisation des deux substrats (Sheldon,
Woodley, 2018b). Plusieurs auteurs ont utilisé des esters d’acides aminés comme accepteurs
28
d’acyle lors des réactions de N-acylation avec des acides gras dans des solvants organiques et
milieu fondu (Valivety et al., 1997 ; Piera et al., 2000 ; Goujard et al., 2004). Les solvants
néoteriques (liquides ioniques et solvants eutectiques) présentent aussi une alternative très
attractive dans une perspective de développement industriel. Leurs propriétés
physicochimiques peuvent être modulées afin de permettre une bonne solubilisation des deux
substrats (Yang, Pan, 2005 ; Durand et al., 2015a). L’utilisation de milieux biphasiques
combinant un solvant hydrophile (milieux aqueux, liquides ioniques, …) solubilisant le substrat
hydrophile et un solvant hydrophobe (solvants organiques, CO2 supercritique, …) solubilisant
le substrat hydrophobe a aussi été décrite comme un moyen très efficace pour augmenter
l’activité enzymatique et faciliter la séparation et la récupération du produit final (Lozano,
Alvarez, et al., 2017 ; Gérard et al., 2017 ; Villa et al., 2019). En conclusion, le choix du solvant
organique le plus adapté à chaque réaction et à chaque enzyme est une étape critique dans le
développement de procédé durable d’acylation enzymatique. Par ailleurs, l’éco-compatibilité
du procédé enzymatique dépend de l’impact du solvant réactionnel sur l’environnement en
incluant sa production, son utilisation, son recyclage et sa dégradation en fin de vie (Sheldon,
2012). Les différents solvants présentent tous des avantages et des inconvénients lors des
réactions enzymatiques qui seront présentées ultérieurement.
1.2.4 Acylation enzymatique sous CO2 supercritique

1.2.4.1 Les fluides supercritiques et le CO2
On parle de fluide supercritique lorsqu'un fluide est chauffé au-delà de sa température critique
et lorsqu'il est comprimé au-dessus de sa pression critique. Comme indiqué dans le diagramme
d’état du CO2 supercritique dans la Figure 1.6, le point critique se trouve à l’extrémité de la
courbe de transition liquide-gaz. À ce niveau et au-delà de ce point la limite entre phase liquide
et phase gazeuse n’est plus claire et une seule phase homogène reste visible (figure 1.7)
(Andrews, 1869 ; Hobbs, Thomas, 2007). Dans le cas du CO2 supercritique, la température et
la pression critiques sont 31,1°C et 73,8 bars respectivement. Au-delà de ces valeurs critiques
le solvant présente une densité similaire à celle d’un liquide mais une viscosité comparable à
celle d’un gaz et une diffusivité intermédiaire. On parle ainsi de gaz dense ou de liquide expansé
permettant un très bon transfert de matière lors de son utilisation (tableau 1.2) (Attard, Hunt,
2018a). En jouant sur le couple pression-température on peut aisément contrôler la densité et la
viscosité du fluide supercritique et ainsi contrôler son potentiel solubilisant vis-à-vis d’un soluté
donné ainsi que la constante diélectrique du fluide (Leitner, 2000 ; Attard, Hunt, 2018a). Les
conditions critiques sont propres à chaque molécule et solvant (annexe 2).
29
Figure 1.6 : diagramme de phase du CO2 (www.EngineeringToolbox.com)
Figure 1.7 : observation du passage de l’état liquide (a) à l’état supercritique (c) au cours du
temps en passant par une étape de transition (b) suite à l’augmentation de la pression et de la
température (Hobbs, Thomas, 2007)
Tableau 1-2 : propriétés thermo-physiques des liquides, gaz et fluides supercritiques (Attard,
Hunt, 2018a)
Fluide Densité (kg / m3) Coefficient de diffusion (m2 / s) Viscosité (Pa * s)
Liquide 800 - 1200 10-8 - 10-9 10-3 – 10-2
Fluide supercritique 250 - 800 10-7 - 10-8 10-4 - 10-3
Gaz 1 - 100 10-4 - 10-5 10-5 – 10-4
Aujourd’hui, le CO2 supercritique et l’eau supercritique sont de loin les fluides les plus étudiés
et utilisés. Par ailleurs, les conditions critique de l’eau (220°C et 374 bars) ne sont pas
compatibles avec le domaine de la catalyse enzymatique ou de l’extraction de molécules à partir
de matériaux biologiques végétaux ou animaux contrairement au CO2 supercritique. Pour ce
dernier, son faible coût, sa non inflammabilité, sa forte inertie chimique, sa non toxicité dans
des conditions normales d’emploi, sa recyclabilité, la facilité de réglage fin de sa densité, de sa
viscosité et diffusivité par contrôle de la pression et de la température en font un solvant
particulièrement respectueux de l’environnement, dit « vert », et technologiquement intéressant
(Ghanem, 2007 ; Sheldon, Woodley, 2018a). C’est ce qui explique le succès croissant du CO2
supercritique pour toute une gamme d’applications (analyse par chromatographie supercritique,
30
extraction, cristallisation, précipitation par effet anti-solvant, encapsulation des molécules et

comme solvant réactionnel en catalyse enzymatique).
Ces propriétés permettent de répondre aux exigences règlementaires en termes de restriction
d’utilisation de solvants volatiles toxiques pour la production de molécules à intérêt
pharmaceutique et alimentaire (Badgujar et al., 2013 ; Attard, Hunt, 2018b). Il est considéré
comme « Generally Recognized As Safe » (GRAS) et présente le gros avantage d’être « food
compatible ». Enfin, comme il devient gazeux à pression atmosphérique, sa simple
dépressurisation permet la séparation du produit et du CO2, qui peut être recyclé pour plusieurs
utilisations, permettant une très importante économie de temps et une réduction des étapes de
production ou d’extraction de molécules (Badgujar et al., 2013).
1.2.4.2 Paramètres influençant les réactions sous CO2 supercritique

1.2.4.2.1 Solubilité et solubilisation des composés
La solubilité d’un soluté assez apolaire et/ou suffisamment volatile dans le CO2 supercritique
est fonction de la densité de ce CO2. L’Equation d’Etat (EoS) développée par Span et Wagner
en 1996 permet de calculer la densité du CO2 pur et son état (gaz, liquide ou supercritique)
(Span, Wagner, 1996). En pratique, certains sites gratuits et fiables peuvent être utilisés pour
calculer directement certaines propriétés du CO2 à partir de sa pression et de sa température
(http://www.energy.psu.edu/tools/CO2-EOS/index.php).
La solubilité des composés sous scCO2 est exprimée soit en concentration (S : g soluté / L de
scCO2) ou en fraction molaire soluble d’un soluté dans le scCO2 à température ambiante et à
pression atmosphérique (g / L) (Ying Li et al., 2013). Des modèles semi-empiriques, basés sur
des régressions non-linéaires à partir de points expérimentaux et permettant de prévoir la
solubilité d’un soluté à partir de la densité du CO2 et de sa température ont été générés. Le plus
connu et encore largement utilisé pour sa fiabilité est celui de Chrastil (Chrastil, 1982). D'autres
modèles, selon les types de solutés et plus ou moins inspirés de celui de Chrastil ont ensuite été
proposés dont certains sont présentés dans l’annexe 3 (Kumar, Johnston, 1988 ; Bartle et al.,
1991 ; Jiang et al., 1998 ; Méndez-Santiago, Teja, 1999 ; Sung, Shim, 1999 ; Jouyban et al.,
2002). Plusieurs auteurs ont utilisé ces équations pour la prédiction de la solubilité des
molécules sous scCO2 (Tang et al., 2012 ; Ying Li et al., 2013 ; Lamba et al., 2016). Sparks et
al. (2010), ont par ailleurs utilisé le modèle d’Adachi et al. (1982) pour modéliser avec succès
la solubilité des acides gras à courte chaîne (7, 8 et 9 carbones) (Adachi, Lu, 1983 ; Sparks et
al., 2010)
31
Le caractère hydrophobe du scCO2 permet une bonne solubilisation des molécules hydrophobes
qui est améliorée par l’augmentation de la pression qui permet d’augmenter la densité du
solvant (Chrastil, 1982 ; Jiang et al., 1998 ; Arenas-Quevedo et al., 2017). La température
influence aussi la solubilité de ces composés, en particulier dans le cas des acides gras par la
réduction de la viscosité de ces derniers facilitant leur entrainement. Arenas-quesvedo et al.
(2017) ont étudié la solubilité de plusieurs molécules dont l’acide palmitique et la capsaïcine
sous scCO2 à différentes températures (35 et 55°C) et différentes pressions (de 10 à 35 MPa).
Ils ont démontré que l’augmentation de la température pour la même pression a permis
d’augmenter la fraction molaire soluble de l’acide palmitique de 0,82 à 15,37 × 103 et de 0,142
à 0.529 × 103 pour la Capsaïcine à 35 MPa (Arenas-Quevedo et al., 2017). Cette différence est
due à la différence d’hydrophobie des deux molécules. Par ailleurs, l’augmentation de la
température en maintenant la même pression conduit à une diminution de la densité du scCO 2
ce qui peut conduire à une réduction de son pouvoir solvant en particulier lorsque les molécules
présentent une faible température de fusion. Le maintien d’une densité par ajustement de la
pression en augmentant la température permet d’améliorer la solubilisation des molécules
(Ashraf-Khorassani et al., 1995). Par ailleurs, il ne faut pas négliger la possible oxydation des
molécules contenant une insaturation, solubilisée dans le scCO2 due à la présence d’oxygène
qui peux modifier la structure des molécules récupérées à la fin du procédé (Cocero et al., 2000).
D’autre part, le scCO2 ne permet pas la solubilisation des molécules hydrophiles telles que les
sucres, les protéines et les acides aminés. Plusieurs auteurs ont étudié la solubilité des acides
aminés dans le scCO2 et ont déterminé des valeurs de fraction molaire soluble de ces molécules
de l’ordre de 10-8 (Stahl et al., 1978 ; Vedaraman et al., 2004a). Afin de remédier à ce problème,
plusieurs stratégies peuvent être testées. Plusieurs auteurs ont proposé une réduction du
caractère hydrophile des acides aminés en greffant des groupements hydrophobes par
estérification, amidation ou les deux avant leur utilisation (Lou et al., 1990 ; Vedaraman et al.,
2004a ; Freitag et al., 2007). Vedaraman et al. (2003) ont décrit une augmentation de la
solubilité de la valine, de la proline et de l’acide aspartique d’une fraction molaire soluble de
l’ordre de 10-8 à 10-4 en rajoutant un carboxybenzyle (CBZ) sur le groupement amine. Freitag
et al. (2007) ont réussi à augmenter la fraction soluble de la N-acétyl-phénylalanine et de la N-
acétyl-tyrosine en utilisant leurs dérivés éthyle-esters passant ainsi d’un ordre de grandeur de
10-5 à 10-3 et de de 10-6 à 10-5 respectivement. La deuxième stratégie consiste à ajouter des co-
solvants tels que le méthanol, en l’occurrence le plus utilisé et le plus efficace, l’éthanol,
l’acétonitrile, l’acétone, le dichlorométhane ou même l’eau, ce a qui permis une amélioration
considérable de la solubilité des molécules hydrophiles (Ashraf-Khorassani et al., 1995 ;
32
Smallridge et al., 2002 ; Shen et al., 2008 ; Arnáiz et al., 2012 ; Varaee et al., 2019). Enfin, la
formation de micelles formées d’eau et de tensioactifs dans lesquels les acides aminés ou
peptides sont piégés peut aussi être envisagée (Soriano et al., 2008). Mais la présence d’eau
peut être impliquée dans d’autres mécanismes qui perturbent l’activité enzymatique et qui
seront présentés par la suite.
1.2.4.2.2 Influence de l’eau sur l’activité enzymatique
La présence d’une certaine quantité d’eau à la surface de l’enzyme est essentielle à son activité
(Habulin, Zeljko Knez, 2001). Cette eau va permettre la solvatation des sites contenant les
résidus hydrophiles, les résidus hydrophobes seront occupés par le scCO2, conduisant à une
stabilisation de la structure tridimensionnelle de l’enzyme dans une conformation active.
Silveira et al. (2012) ont étudié la solvatation de CALB sous scCO2 en présence d’eau par
modélisation moléculaire (figure 1.8). En présence de la première couche de solvatation, ils ont
démontré que le scCO2 recouvre tous les résidus hydrophobes de la surface de l’enzyme dont
sa cavité catalytique permettant l’amélioration de l’accessibilité des substrats hydrophobes. Par
ailleurs, en augmentant la quantité d’eau présente, cette dernière tente de recouvrir plus de
surface bloquant ainsi l’accès du scCO2 aux résidus catalytiques (Silveira et al., 2012).
Figure 1.8 : représentation de la structure de CALB sous scCO2 (Silveira et al., 2012)
La solubilité de l’eau dans le scCO2 est faible (entre 0,3 et 0,5 % massique d’eau) mais cela
reste supérieur à sa solubilité dans les solvants organiques tels que le décane (1,3 g / L à 32°C
et 100 bar) (Marty, Condoret, 2001 ; Knez, Habulin, 2002). Cette solubilité est très variable
selon la pression et la température utilisées (Marty, Condoret, 2001). Ceci peut être très
bénéfique lors de la mise en œuvre en continus des procédés d’estérification et d’amidation de
molécules mais une élimination trop importante de l’eau présente à la surface de l’enzyme peut
induire une perte d’activité enzymatique (Oliveira et al., 2006 ; Dos Santos, Zabot, et al., 2016).
Par ailleurs, une accumulation d’eau autour de l’enzyme peut conduire à la perturbation de
l’activité enzymatique par implication de différents phénomènes. La dissolution du CO2 dans
le microenvironnement aqueux cause la formation d’acide carbonique H2CO3 réduisant ainsi le
33
pH autour de l’enzyme et contribuant à la formation de carbamate avec les amines pouvant

alors affecter négativement l’activité enzymatique (Kamat et al., 1992). En effet, l’acidification
du milieu favorise la présence des amines sous forme protonée NH3+ incompatible avec la
réaction d’acylation. De plus les fonctions amines des acides aminés sont fortement susceptibles
de former des ions carbamates (RNHCO−
2 ) en particulier si une base est ajoutée pour
contrebalancer le phénomène d’acidification (Yamamoto et al., 2012). Caplow, (1968) a

démontré la possible apparition de cette réaction, qui est très étudiée depuis pour piéger le CO2
des fumées post-combustion industrielles par des amines suivant la formule :
𝐶𝑂2 + 𝑅𝑁𝐻2 ↔ 𝑅𝑁𝐻2+ 𝐶𝑂2−
Puis, en présence d’une base,

𝑅𝑁𝐻2+ 𝐶𝑂2− + 𝐵 ↔ 𝑅𝑁𝐻𝐶𝑂2− + 𝐵𝐻 +
Les enzymes et les protéines en général sont très susceptibles de former des liaisons covalentes
réversibles (carbamate instable) entre le CO2 et l’amine de la chaine latérale de la lysine ou
potentiellement le groupement imidazole de l’histidine (figure 1.9). Les protéines retrouvent
leur état initial suite à la dépressurisation (Hobbs, Thomas, 2007). Ces liaisons sont stables à
basse température mais l’augmentation de la température conduit à la libération du CO2. L’effet
de la formation de carbamates sur l’activité enzymatique est très variable selon l’enzyme, la
réaction ciblée et les conditions de mise en œuvre. Certains auteurs ont décrit une amélioration
de l’activité et de la sélectivité des enzymes après interaction du CO2 avec les amines des résidus
présents à l’opposé du site actif (Matsuda et al., 2003 ; Mase et al., 2003). D’autres auteurs ont
décrit une inactivation de l’enzyme par interaction du CO2 avec les amines des résidus autour
de la cavité catalytique conduisant au blocage du site actif (Kamat et al., 1995 ; Habulin, Zeljko
Knez, 2001 ; Dos Santos, Rezende, et al., 2016a). Dans le même cadre, la présence de
groupements amine libres lors de l’acylation de molécules telles que les acides aminés et
peptides sous scCO2 peut aussi réagir avec le CO2 suivant la même réaction réduisant ainsi la
disponibilité de ces groupements amines pour la réaction. La diminution du pH de l’eau en
présence du scCO2 due à la formation d’acide carbonique a été mesurée par plusieurs auteurs
estimant un pH aux alentours de 3 ce qui peut perturber fortement l’activité enzymatique due à
la protonation des amines des résidus catalytiques (Toews et al., 1995 ; Niemeyer, Bright,
1998 ; Fontes et al., 2001). Plusieurs auteurs ont pu contrôler la formation d’acide carbonique
par ajout de sels tels que du bicarbonate de sodium ou du phosphate de sodium ou potassium
en fortes concentrations (jusqu’à 1000 mM) lors de réactions en milieu biphasique (scCO2 /
34
eau) permettant le maintien d’un pH assez élevé et conduisant à une amélioration significative
de l’activité et/ou de la sélectivité des enzymes (Harada et al., 2009a ; Gérard et al., 2017).
A.
B.
Figure 1.9 : schéma de la formation de liaisons carbamate entre la lysine en surface de l’enzyme
et le CO2 (A) et de la formation d’acide carbonique par dissolution de CO2 dans le
microenvironnement aqueux de l’enzyme (Budisa, Schulze-Makuch, 2014)
1.2.4.2.3 Influence des conditions opératoires (température, pression et cycle de

dépressurisation)
De nombreuses études ont utilisé le scCO2 comme solvant pour les réactions enzymatiques
d’estérification, d’amidation, de transestérification et de résolution énantiomérique de
molécules (Smallridge et al., 2002 ; Hobbs et al., 2006 ; Liu et al., 2007 ; Hobbs, Thomas,
2007 ; Han, Poliakoff, 2012 ; Hu et al., 2015 ; Knez, 2018a ; Dias et al., 2018a). Plusieurs
auteurs ont étudié la possible substitution de l’utilisation des solvants organiques par le scCO2
avec dans certains cas moins d’activité mais une récupération plus simple du produit réduisant
considérablement le coût associé au procédé dans sa globalité (Chulalaksananukul et al., 1993 ;
Kamat et al., 1995 ; Knez, Habulin, 2002 ; Sheldon, 2012 ; 2017). Par ailleurs, la réaction de
N-acylation des acides aminés sous scCO2 a été très peu décrite, pour des raisons de solubilité.
Lors de la catalyse enzymatique sous scCO2, il faut adapter la pression et la température afin
d’ajuster la densité, diffusivité, viscosité et la polarité du solvant à l’enzyme et aux substrats
utilisés de façon à éviter la dénaturation réversible ou irréversible de l’enzyme due à des
températures et pressions élevées (figure 1.10). En effet, l’évolution de l’activité en fonction de
la température suit une courbe en cloche dont la partie ascendante est liée à une activation
thermique de la réaction et la partie descendante est liée à une dénaturation thermique de
l’enzyme. L’évolution de l’activité en fonction de la pression est très différente selon la
résistance des enzymes à la pression mais d’une manière générale les enzymes demeurent
stables à plusieurs centaines de bars à des températures modérées (Hoang et al., 2018). Comme
35
évoqué plus haut, les propriétés thermo-physiques telles que la densité du scCO2 sont aussi très
sensibles aux variations de la pression et de la température rendant ce solvant facilement
ajustable en termes de potentiel de solubilisation des substrats et de capacité à véhiculer ces
derniers vers le site catalytique de l’enzyme grâce à la très faible viscosité du mélange
réactionnel favorisant les transferts de matière. La polarité du scCO2 est aussi un paramètre très
important lors de la catalyse enzymatique. La constante diélectrique permet d’évaluer ce
paramètre. Ce dernier évolue dans le même sens que l’évolution de la densité en fonction de la
pression et de la température (Matsuda, 2013a). En effet, l’augmentation de la densité du scCO2
par l’augmentation de la pression (i.e. de 30 à 118 bar à 50°C) permet d’avoir un solvant plus
polaire (log P de 0,9 à 2) et donc d’augmenter la capacité du solvant à solubiliser et à entrainer
les molécules hydrophobes (N.B. LogP : le logarithme du coefficient de partition d’un solvant
ou d’une molécule dans un mélange octanol / eau) (Nakaya et al., 2001).
Figure 1.10 : évolution de la conformation des protéines selon la pression et la température du

scCO2 utilisé, A : faible pression et température, B : faible température et pression élevé, C :
faible pression et température élevé, D : pression et température élevé (Hoang et al., 2018).
L’activité et la stabilité des enzymes lors des réactions sous scCO2 est très dépendante de la
structure de la lipase utilisée et des conditions opératoires (pression et température). Plusieurs
auteurs ont décrit des changements importants dans la structure tridimensionnelle de l’enzyme
sous scCO2 conduisant soit à une amélioration ou à une perte d’activité (Monhemi,
Housaindokht, 2012 ; Housaindokht et al., 2012 ; Melgosa et al., 2015 ; Peng et al., 2016). Des
variations de la structure secondaire et tertiaire similaires ont été observées avec en plus une
perte de compacité de l’enzyme lors des études par dynamique moléculaire du comportement
de CALB sous scCO2 (Monhemi, Housaindokht, 2012 ; Housaindokht et al., 2012). Dos Santos
et al. (2016) ont noté une diminution de l’activité de CALB, lors de l’estérification de l’acide
oléique avec du méthanol, avec l’augmentation de la pression et de la température de scCO2.
L’analyse des spectre FTIR a montré les mêmes modifications de la structure secondaire
36
permettant de relier les pertes d’activité à la formation de carbamates sur l’enzyme par
interaction entre des groupements amine en surface avec le CO2 (Dos Santos, Rezende, et al.,
2016a). Ces résultats peuvent expliquer les pertes d’activité observées par plusieurs auteurs lors
de l’augmentation de la pression (Kamat et al., 1992 ; Oliveira et al., 2006). Selon ces auteurs
la perte d’activité pourrait être due à l’interaction du CO2 avec l’histidine présente dans le site
actif de l’enzyme réduisant les interactions du substrat avec les résidus catalytiques.
L’augmentation de la pression est aussi accompagnée d’une augmentation de la densité du
scCO2 présentant une affinité plus importante du substrat vis-à-vis du solvant limitant ainsi
l’accessibilité au site actif de l’enzyme (Celia et al., 2005). Concernant l’influence de la
pression sur l’activité enzymatique, plusieurs auteurs ont montré une augmentation de l’activité
avec l’augmentation de la pression (Hu et al., 2015 ; Dos Santos, Zabot, et al., 2016). D’autres
auteurs ont expliqué l’amélioration de l’activité enzymatique sous scCO2 à faible pression, par
une meilleure stabilisation du complexe enzyme/donneur d’acyle lors des réactions
d’estérification (Ikushima et al., 1996). Concernant l’influence de la température, des auteurs
ont décrit une augmentation de l’activité avec l’augmentation de la température jusqu’à un
optimum (Oliveira et al., 2006 ; Liu et al., 2007). Liu et al. (2007) ont réalisé la réaction
d’amidation de la vanillylamine avec l’acide palmitique sous scCO2 avec différentes enzymes.
Il a par exemple été montré que la lipase de Mucor miehei présentait une meilleure activité lors
de l’accroissement de la température due à une amélioration du transfert du substrat vers les
résidus catalytiques de l’enzyme et à une meilleure activation de la lipase avec de possibles
changement conformationnels en faveur de la réaction de synthèse (Liu et al., 2007).
L’un des critères de choix d’un procédé est la facilité de réutilisation des enzymes après
utilisation. De ce point de vue, le scCO2 représente le solvant de choix lié à son élimination
facile après la réaction par simple dépressurisation. Mais cette dernière peut nuire à l’activité
enzymatique. Plusieurs auteurs ont décrit une perte d’activité progressive après recyclage de
l’enzyme sous scCO2. (Oliveira et al., 2006 ; Knez et al., 2012 ; Dos Santos, Rezende, et al.,
2016a ; Dos Santos, Zabot, et al., 2016). Cette perte d’activité était due soit à une dénaturation
de l’enzyme par effet de cisaillement exercé lors de la dépressurisation, en particulier lors d’une
dépressurisation rapide, soit à l’élimination de l’eau de la première couche de solvatation de
l’enzyme causant une instabilité structurale (Oliveira et al., 2006 ; Dos Santos, Zabot, et al.,
2016). Habulin et al. (2007) ont mesuré par la méthode Karl–Fischer la quantité d’eau en contact
avec CALB immobilisée avant et après traitement sous scCO2 à 60°C et 10 MPa. Ils ont
expliqué la perte d’activité enzymatique après le traitement par une réduction de la quantité
37
d’eau en contact avec l’enzyme qui est passée de 1,44 % à 0,88% après 24h de traitement
(Habulin et al., 2007).
Ces dernières années, d’autres solvants alternatifs, dit néotériques, ont été proposés dans le
domaine de la catalyse enzymatique. Ce sont les liquides ioniques (Ionic Liquide ; IL) et les
solvants eutectiques profonds (Deep Eutectic Solvents ; DES).
1.2.5 Acylation enzymatique dans les liquides ioniques

Les liquides ioniques (ILs) sont définis comme l’association d’un cation organique avec un
anion organique ou inorganique de faible masse moléculaire produisant un solvant liquide à
température ambiante en raison des interactions électrostatiques, liaisons hydrogènes et de van-
der-Waals entre les différents constituants (Choi et al., 2014). Ce sont des solvants non-
volatiles, non-inflammables, avec une conductivité ionique élevée et une importante stabilité
chimique et thermique (Vazquez et al., 2020). De plus, leur capacité de solubilisation des
substrats et leur hydrophobie peuvent-être facilement contrôlées par la modification de l’un ou
des deux constituants permettant d’améliorer l’activité enzymatique lors des réactions
d’acylation des biomolécules (Vekariya, 2017). Etant donnée la diversité des molécules qui
peuvent être utilisées, de très nombreuses combinaisons de molécules peuvent être envisagées
permettant la production de solvants avec des propriétés physicochimiques variées qui peuvent
être adaptées à l’application voulue comme par exemple l’extraction de molécules et la catalyse
chimique ou enzymatique (Pârvulescu, Hardacre, 2007 ; Lozano, 2010a ; Olivier-Bourbigou et
al., 2010 ; Qureshi et al., 2014 ; Steinrück, Wasserscheid, 2015 ; Potdar et al., 2015 ; Villa et
al., 2019). La densité et surtout la viscosité du solvant sont des paramètres très importants lors
de la catalyse enzymatique en modulant le transfert des substrats vers le site catalytique de
l’enzyme. Les ILs présentent une densité (entre 1 et 1,6 g/cm3) et une viscosité (entre 66 et 1110
cp) assez élevées par rapport à l’eau (1cp à 20°C) et aux solvants organiques (Olivier-Bourbigou
et al., 2010). Pour des réactions enzymatiques, ce problème peut être limité par l’augmentation
de la température ou par l’ajout d’une certaine quantité d’eau, permettant une réduction de la
viscosité et une amélioration de la flexibilité de l’enzyme (Yang, Pan, 2005 ; Husson, 2008 ;
De Diego et al., 2009). L’ajout d’eau dans le milieu doit être bien contrôlé et dépendra, comme
dans le cas des solvants organiques, du solvant utilisé (sa polarité), de la réaction mise en œuvre
et de l’enzyme utilisée (Yang, Pan, 2005). Selon certains auteurs, l’eau présente dans le liquide
ionique va former des liaisons hydrogène avec les constituants du solvant réduisant sa
disponibilité pour les réactions ce qui permet de maintenir l’équilibre thermodynamique de la
réaction dans le sens de la synthèse (cas des lipases) et de stabiliser la structure
38
tridimensionnelle active de l’enzyme en protégeant la première couche de solvatation (Olivier-

Bourbigou et al., 2010). Plusieurs auteurs ont comparé l’utilisation de divers solvants pour la
réaction d’acylation enzymatique (estérification, transestérification et amidation) en présence
de lipases telles que CALB et ont observé une activité similaire ou meilleure dans les liquides
ioniques par rapport aux solvants organiques (Madeira Lau et al., 2000 ; Husson et al., 2008a ;
Sheldon, 2016). Par ailleurs, la stabilité des enzymes était nettement améliorée grâce à l’effet
protecteur et stabilisateur de la structure tridimensionnelle de ces solvants (Elgharbawy et al.,
2018).
De nombreuses études ont utilisé les ILs pour les réactions d’acylation enzymatique (Husson et
al., 2008a ; 2009a ; De Diego et al., 2009 ; Hulin et al., 2015 ; Lozano et al., 2019). La possible
modulation de la polarité des ILs tout en gardant une aW faible présente un avantage pour les
réactions d’acylation de molécules hydrophiles telles que les peptide et sucres (Husson et al.,
2008a ; 2009a ; Lin et al., 2015). Husson et al. (2009) ont réalisés la réaction de N-acylation du
dipeptide Lys-Ser, HCl avec de l’acide oléique dans le liquide ionique [Bmim]+[PF6]- et
comparé les résultats de la catalyse avec ceux obtenus dans du 2-methyl-2-butanol et en milieu
fondu (acide oléique). Le liquide ionique a permis une solubilisation du dipeptide plus de 10
fois supérieure à celle obtenue dans le solvant organique passant de 1,18 à 14,05 g/L et
permettant ainsi d’améliorer le taux de conversion à l’équilibre en passant de 36 à 57 % et la
vitesse initiale de la réaction de 1 à 32 mM / h (Husson et al., 2009a). L’association des ILs et
du scCO2 comme milieu biphasique pour la catalyse enzymatique a aussi été largement utilisée
pour l’acylation des biomolécules. Ceci permet d’une part l’amélioration de l’accessibilité des
substrats au site actif par implication du scCO2 et la réduction de la viscosité, et d’autre part
facilite l’extraction des molécules produites qui ont une affinité avec le scCO2 (Keskin et al.,
2007a ; Lozano, 2010a ; Lozano et al., 2007 ; 2011 ; Lozano, Gomez, et al., 2017 ; Villa et al.,
2019).
Certains ILs sont considérés comme des solvants verts liés à leur faible volatilité et à leur
recyclabilité (Yang, Pan, 2005 ; Lozano, Alvarez, et al., 2017). Cependant plusieurs auteurs ont
décrit une faible biodégradabilité et une certaine toxicité vis-à-vis de certains organismes
vivants. Ceci a en particulier été observé avec les ILs à base de tetra-alkyl-ammonium et de di-
alkyl-imidazolium (Matzke et al., 2007 ; Coleman, Gathergood, 2010 ; Afonso, 2010 ; Oliveira
et al., 2016) ce qui a stimulé la recherche dans le domaine de l’ingénierie des solvants et le
développement de nouvelles générations d’ILs à base de molécules éco- et biocompatible tels
que les sucres et les acides aminés (Sheldon, Woodley, 2018a). Par ailleurs, le coût de
production de ces liquides ioniques par rapport aux solvants organiques (environ 240 US$ / kg
39
pour le chlorure de 1-butyl-3-methylimidazolium à 95% pureté contre environ 30 US $ / kg

pour de l’acétone ou du toluène à 99% de pureté) ainsi que la toxicité de certains de ces ILs a
représenté un frein important au développement de procédés utilisant ces milieux (Jastorff et
al., 2003 ; Gorke et al., 2008a). Les solvants eutectiques profonds ou mélanges eutectiques
profonds (MEP) sont une autre catégorie de solvants néotériques, dérivés des ILs, présentant
des propriétés similaires à celles des ILs.
1.2.6 Acylation enzymatique en solvants eutectiques profonds

Les solvants eutectiques profonds (MEP, ou DES en Anglais) sont issus de l’association d’un
sel organique, souvent un sel d’ammonium, formé d’une molécule cationique tel que la choline
et d’un contre ion tel que les chlorures ou autres molécules anioniques, et d’un donneur de
liaisons hydrogène (DLH) qui est une molécule neutre de nature très variable : sucres, acides
aminés, alcools…(Durand, 2013a). Parmi ces derniers, on retrouve les solvants eutectiques
profonds naturels (NADES) formés exclusivement de molécules issues de ressources naturelles
(Khodaverdian et al., 2018). Nombre de ces NADES ont été identifiés dans des matrices
biologiques et décrits comme impliqués dans leur mécanisme de synthèse, de solubilisation et
de stockage de molécules peu solubles dans l’eau (Choi et al., 2011 ; Dai et al., 2013 ; Vanda
et al., 2018). Ce sont des solvants considérés comme verts et éco-compatibles en raison de leur
origine naturelle, leur bonne biodégradabilité, leur faible volatilité et leur faible toxicité par
rapport aux solvants organiques (Zhao et al., 2013a ; Hayyan et al., 2012 ; 2014). La toxicité
des MEP dépend énormément de la nature de leurs constituants (Juneidi et al., 2018). Comme
les molécules utilisées pour leur préparation sont très disponibles et leur méthode de production
simple par rapport aux liquides ioniques, les MEP et en particulier les NADES présentent un
avantage important en vue d’une extrapolation de leur utilisation à l’échelle industrielle dans
plusieurs domaines tels que l’extraction de molécules, la catalyse chimique et enzymatique, la
capture de molécules volatiles, … (Juneidi et al., 2018 ; Cunha, Fernandes, 2018 ; Pätzold et
al., 2019 ; Gotor-Fernández, Paul, 2019 ; Mena-García et al., 2019). Leur production se fait par
la mise en contact des constituants, initialement sous forme solide sous agitation, à une
température donnée (i.e. 60°C pour les MEP formés de chlorure de cholinium / urée ou glycérol)
pendant un certain temps (i.e. 2 h). Durant ce temps, un réseau de liaisons hydrogène
intermoléculaires stables se forme entre le sel d’ammonium et le DLH conduisant à une
diminution de l’énergie du système, se traduisant par une réduction considérable de la
température de fusion selon les constituants définissant ainsi le point eutectique qui correspond
à cette température (i.e de 247 °C et 133 °C pour la choline chloride et urée, respectivement, à
40
12 °C pour le mélange des deux) (figure 1.11). Cela conduit à la production d’un solvant liquide
à température ambiante ou à une température très inférieure à la température de fusion de
chacun des constituants (Abbott et al., 2003). Les propriétés physiques (densité, viscosité,
température de fusion, conductivité, …) et physicochimiques (pH, polarité, …) sont très
variables et dépendent de la nature du sel cationique, du contre ion anionique et du DLH ainsi
que du ratio molaire du donneur et de l’accepteur de liaison hydrogène. La polarité de ces
solvants présente un avantage très important permettant la solubilisation de substrats
hydrophiles et ainsi d’envisager leur utilisation pour les réactions enzymatiques avec les lipases,
grâce à leur faible teneur en eau (Durand et al., 2015a ; Juneidi et al., 2018 ; Pätzold et al.,
2019 ; Gotor-Fernández, Paul, 2019). D’autre types de DES constitués de sels de phosphonium
ont aussi été développés mais ces derniers présentent une toxicité très importante par rapport
aux MEP à base de sel d’ammonium (Hayyan, Hashim, Al-Saadi, et al., 2013).
A. B.
Figure 1.11 : Schéma du diagramme de phase d’un mélange eutectique (A) et un exemple
d’interaction hydrogène possible dans le MEP chlorure de cholinium / urée (B) (Pätzold et al.,
2019)
Paramètre influençant la biocatalyse en solvant eutectique profond :

Plusieurs auteurs ont utilisé les MEP pour la réaction d’acylation enzymatique de molécules
hydrophiles dans une perspective de développement de procédés enzymatiques pour les
réactions de lipophilisation par alcoolyse, amidation ou estérification (Zhao et al., 2013a ;
Durand et al., 2013 ; Hayyan et al., 2014 ; Kleiner et al., 2016 ; Pätzold et al., 2019). Gorke et
al. (2008) ont décrit pour la première fois la possible utilisation des MEP pour les réactions
enzymatiques. Ils ont décrit de meilleures performances de CALB pour la réaction de
transestérification de l’éthyle valérate avec du butanol en présence des MEP chlorure de
cholinium (ChCl):urée (U) et glycérol (Gly) par rapport à d’autres liquides ioniques utilisés. Ils
ont aussi démontré que l’enzyme reste active malgré la présence de l’urée et des chlorures de
cholinium qui sont considérés comme des agents dénaturants de l’enzyme, s’ils sont pris
séparément. Mais la présence d’un réseau d’interactions hydrogène stables entre les DLH et le
41
sel d’ammonium utilisé permet de protéger la structure de l’enzyme induisant aussi une forte
polarité du MEP (Gorke et al., 2008a). Hammond et al. (2016) ont étudié de façon très précise
les interactions qui régissent la formation des MEP en utilisant la diffraction des neutrons en
prenant comme exemple le MEP ChCl:U. Ils ont confirmé la formation d’un réseau fort et
complexe d’interactions hydrogène entre les trois constituants du mélange (l’urée, la choline et
le chlorure) prévenant ainsi la cristallisation du mélange à température ambiante (Hammond et
al., 2016). Monhemi et al. (2014) ont étudié l’influence de ce MEP sur la structure de CALB
par modélisation moléculaire et comparé les résultats avec ceux obtenus en présence de l’urée
et de l’eau. Les auteurs ont décrit un effet protecteur de la formation du réseau d’interactions
hydrogène au sein du mélange prévenant la pénétration des constituants du MEP à l’intérieur
de la structure de l’enzyme, ce qui aurait causé la dénaturation de l’enzyme en perturbant les
liaisons hydrogène intermoléculaires en particulier en présence de l’urée. D’autre part, une forte
stabilité thermique de l’enzyme a été observée due à une stabilisation de la structure
tridimensionnelle exercée par ce réseau de liaisons hydrogène (Monhemi et al., 2014). Zeng et
al. (2016) ont aussi rapporté une stabilisation de la structure du lysozyme placé dans le solvant
eutectique bétaïne:urée protégeant la conformation de l’enzyme contre l’effet dénaturant de
l’urée en se basant sur les analyses par dichroïsme circulaire (Zeng et al., 2016). Ils ont aussi
démontré l’importance d’équilibrer le ratio molaire des constituants afin d’avoir une bonne
synergie entre eux et d’éviter leur effet négatif sur la structure des protéines. Khodaverdian et
al. (2017) ont décrits une meilleure stabilité thermique de la laccase en présence du MEP
bétaïne:glycerol (ratio 1:2) et bétaïne:sorbitol:eau (ratio 1:1:1). Ils ont aussi observé une
stabilisation de la structure 3D de l’enzyme en présence de ces MEP mais l’utilisation du MEP
bétaïne:acide malique:eau (ratio 1:1:1) a conduit à la dénaturation de l’enzyme démontrant
l’importance du choix du donneur de liaison hydrogène (Khodaverdian et al., 2018). Durand et
al. (2012) ont réalisé la réaction de transestérification du laurate de vinyle avec différents
alcools dans des MEP avec différents DLH. Les meilleures performances de CALB ont été
obtenues dans les MEP ChCl:U et ChCl:Gly. L’utilisation d’autres DLH tels que les acides
dicarboxyliques et l’éthylène glycol a montré l’apparition de produits secondaires, rentrant en
compétition avec le donneur d’acyle ce qui réduit les performances de la réaction (Durand et
al., 2012a). En effet, la réactivité du DLH est l’un des paramètres les plus importants qui peut
nuire à la bonne mise en œuvre des réactions enzymatiques dans les MEP. La possible réactivité
des constituants du MEP en présence des enzymes a été exploitée par certains auteurs en
utilisant le MEP comme solvant et substrat de la réaction en même temps. C’est le cas de l’étude
décrite par Siebenhaller et al. (2016) qui ont pu réaliser la réaction d’estérification de plusieurs
42
sucres avec différents acides gras eux même constituant du MEP utilisé pour la production de
glycolipides (Siebenhaller et al., 2016).
D’autres paramètres peuvent aussi influencer les réactions enzymatiques en MEP tels que le
choix du contre ion, la présence d’eau, le pH et les propriétés thermo-physiques du solvant.
Zhao et al, (2013) ont réalisé la réaction de transestérification de l’huile de soja avec du
méthanol dans des MEP à base de cholinium avec différents contre-ions (chlorure et acétate) et
de glycérol comme DLH à différents ratios molaires à 50°C et en présence de différentes
lipases. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant CALB immobilisée dans le MEP
chlorure de cholinium / glycérol à un ratio molaire de 1:2 (Zhao et al., 2013a). Durant et al.
(2013) ont réalisé la réaction d’alcoolyse pour la production d’ester phénolique dans des
mélanges eutectiques constitués de chlorure de cholinium (ChCl) comme sel d’ammonium et
l’urée (U) ou le glycérol (Gly) comme donneur de liaison hydrogène à un rapport molaire de
1:2 et en utilisant CALB immobilisée. Ils ont pu améliorer l’activité enzymatique par ajout
jusqu’à 10% massique d’eau dans le milieu réactionnel grâce à une meilleure solvatation de
l’enzyme et une réduction de la viscosité du milieu, ce qui a permis une meilleure flexibilité
structurale de CALB et surtout un meilleur transfert de matière (Durand et al., 2013). Par
ailleurs, l’ajout d’une quantité trop élevée d’eau change l’équilibre thermodynamique de la
réaction vers une réaction d’hydrolyse. D’autres phénomènes pourraient expliquer cette
augmentation de l’activité tels que l’aW et le pH du milieu réactionnel. Par exemple, après ajout
de 20% massique d’eau, une très faible augmentation de l’aW de 0 à 0,065 a été observée dans
le cas du ChCl:Gly alors qu’une augmentation plus forte de l’aW de 0,02 à 0,4 a été observée
dans le cas du ChCl:U avec lequel une aW entre 0,15 et 0,2 était atteinte après ajout de 8 à 10%
d’eau (Durand et al., 2013). Certains auteurs ont exploité cette caractéristique lors de leurs
réactions d’estérification. Xu et al. (2017) ont réalisés la réaction d’estérification du glycérol
avec des acides gras polyinsaturés (n-3) dans le MEP ChCl:U en comparaison avec la réaction
en milieu fondu en présence de CALB. Ils ont observé une amélioration de l’activité
enzymatique dans le MEP reliée au fait que l’eau produite lors de la réaction était piégée par le
solvant au fur et à mesure de sa production permettant de maintenir l’équilibre
thermodynamique de la réaction dans le sens de la synthèse de produit (Xu et al., 2017). En ce
qui concerne le pH, une faible évolution de 8,5 à 7,5 a été observée dans le cas du ChCl:U ce
qui pourrait influencer l’état d’ionisation des résidus d’acides aminés de l’enzyme mais aucun
changement du pH n’a été enregistré dans le MEP ChCl:Gly qui est resté à un pH d’environ 4
(Durand et al., 2013).
43
L’importance de l’ajout de l’eau à environ 8% a aussi été décrite par d’autres auteurs (Guajardo
et al., 2017). Ces auteurs ont réalisés la réaction d’estérification du glycérol avec de l’acide
benzoïque en présence de CALB et dans différents MEP (ChCl:U, ChCl:Gly, ChCl:ETA
(éthylène glycol) à un ratio molaire de 1:2 et du MA (chlorure de méthyl-ammonium):Gly à un
ratio molaire de 1:3). La meilleure activité (99% de conversion) a été observée dans du ChCl /
Gly après ajout de 8% massique d’eau. Ces résultats ont été expliqués par une très importante
baisse de la viscosité du milieu réactionnel après ajout de l’eau ce qui réduit considérablement
les limitations de transfert du solvant à l’enzyme (tableau 1.3) (Guajardo et al., 2017). Ils ont
aussi enregistré une très bonne stabilité de l’enzyme après la première utilisation.
L’augmentation de la température réduit aussi considérablement la viscosité des MEP. Abbott
et al. (2003) ont noté une diminution d’environ 10 fois de la viscosité du MEP ChCl : U en
passant de 20°C à 50°C (Abbott et al., 2003). De même, Durand et al. (2012) ont observé une
augmentation d’environ 1,5 fois l’activité de CALB dû à la réduction de la viscosité suite à
l’augmentation de la température de 40 °C à 60 °C en réalisant la réaction de transestérification
du laurate de vinyle avec l’octanol dans les MEP ChCl : U et ChCl : Gly. Par ailleurs, aucune
étude sur la N-acylation enzymatique d’acides aminés dans les MEP n’a été rapportée.
Tableau 1-3 : évolution de la viscosité des MEP après ajout de 10% v/v d’eau (Guajardo et al.,
2017)
Viscosité [cP]
Solvant ChCl:U ChCl:ETA ChCl:Gly Glycérol
Solvant pur 1602 52 469 1490
Solvant avec 10 % v /v d’eau 3 19 90 320
La principale problématique lors du développement des procédés d’acylation enzymatique de

substrats avec un écart important de polarité tels que les acides aminés avec les acides gras est
la difficulté de mettre en contact les deux molécules avec l’enzyme en même temps liée à la
faible solubilité de l’un des deux, en particulier les acides aminés dans les solvants apolaires
(solvants organique et scCO2). L’utilisation des solvants de nouvelle génération tels que les ILs
et les MEP peut permettre de faire face à ces problématiques de solubilité à condition de tenir
compte des risques de toxicité ou de réactions secondaires présents dans certains cas en adaptant
le choix des constituants et des paramètres de mise en œuvre des procédés aux réactions et aux
enzymes utilisées. Le développement de ce type de solvants étant assez récent, les phénomènes
qui régissent les interactions au sein de ces derniers ne sont pas encore complètement élucidés.
A part les lipases, d’autres types d’enzymes telles que les acylases sont capables de réaliser les
réactions d’acylation d’acides aminés. Elles ont été décrites pour catalyser ces réactions en
milieux aqueux.
44
1.3 Réaction d’acylation enzymatique en milieu aqueux

1.3.1 Enzymes catalysant la réaction d’acylation en milieu aqueux
L’acylation des acides aminés et peptides en milieux aqueux peut être assurée par des enzymes
appartenant à différentes familles telles que les acyl-transférases (EC 2.3.1), les
carboxylesterases (EC 3.1.1) et les amidohydrolases (EC 3.5.1). Ces dernières appelées
communément aminoacylases sont capables de réaliser la réaction de N-acylation/déacylation
des molécules dans des milieux aqueux (annexe 4). En général, les milieux tamponnés sont
utilisés pour ces réactions afin de pouvoir contrôler et maintenir le pH stable lors de la réaction.
Plusieurs aminoacylases provenant de différentes espèces vivantes (microorganismes,
champignons, animaux, plantes, …) ont été décrites dans la littérature. Du point de vue
réactionnel, elles sont caractérisées par des chimio-, régio- et énantio-sélectivités différentes.
La plupart d’entre elles sont très spécifiques et catalysent la réaction avec un substrat particulier
mais certaines ont un spectre d’action beaucoup plus large telles que les aminoacylases I et les
N-acyl-D-amino-acide déacylase. In vivo, étant donné que tous les organismes sont constitués
de phase aqueuse en majorité, ces enzymes interviennent dans plusieurs mécanismes naturels
tels que le catabolisme des acides aminés acylés issus du catabolisme des protéines et des
peptides (Story et al., 2001). La N-succinyl-L-glutamate amidohydrolase est l’une des enzymes
clé dans le catabolisme de l’arginine chez certaines espèces intervenant à la fin de la voie de
production du glutamate et de l’acide succinique (Wauven, Stalon, 1985 ; Lu, 2006).
L’aspartoacylase est très présente dans le système nerveux central intervenant dans la régulation
de la concentration de l’acide N-acétyl-aspartique. Plusieurs maladies neurodégénératives telles
que la maladie de Canavan sont associées à la diminution de l’activité de cette enzyme (Kots et
al., 2019). Les aminoacylases III ont aussi été décrites comme impliquées dans la neurotoxicité
du 4-hydroxy-2-nonenal intervenant dans la progression de certaines maladies
neurodégénératives (Alzheimer et Parkinson) (Tsirulnikov et al., 2012). D’autres acylases sont
utilisées comme moyens de défense contre les attaques bactériennes. Certains animaux et
plantes sécrètent des enzymes appartenant au groupe des acyl-homoserine-lactone acylases
(AHL) permettant de dégrader les molécules (homosérine lactone) qui interviennent dans la
régulation de l’expression de gène de virulence de microorganismes pathogènes (quorum
sensing). Cela permet d’envisager l’utilisation de ces enzymes dans la prévention de la
virulence des bactéries pathogènes (Lin et al., 2003 ; Kalia, 2014). En dehors des AHL,
certaines pénicillines acylases présentent aussi cette activité biologique (Mukherji et al., 2014 ;
Sunder et al., 2017). Les pénicillines acylases sont parmi les enzymes les plus caractérisées et
45
les plus utilisées en industrie pharmaceutique. Découvertes en 1950 par Sakaguchi et Murao,
elles sont produites par plusieurs microorganismes (bactéries, champignons et levures)
(Tishkov et al., 2010). Elles sont largement utilisées à l’échelle industrielle pour la production
d’antibiotiques semi-synthétiques. Elles hydrolysent la liaison amide entre l’acide carboxylique
et l’acide 6-aminopenicillanique de la pénicilline G pour la penicilline G acylase (PGA)
représentant environ 85% de la production (équivalent à environ 7650 tonnes/an) et de la
penicilline V pour la penicilline V acylase (PVA) englobant les 15% restants (Arroyo et al.,
2003 ; Spence, Ramsden, 2007).
D’un point de vue structural, les acylases présentent une diversité très importante. On y trouve
des enzymes monomériques et homo-multimériques telles que les aminoacylases I, II et III
formées d’une ou de plusieurs sous-unités identiques et hétérodimériques comme les
pénicillines acylases formées d’une grande et d’une petite sous-unité. D’autre part, deux
superfamilles peuvent être retrouvées selon la présence (métalloenzyme) ou l’absence (N-
terminal nucléophile hydrolase ou Ntn hydrolase) d’ion métallique au niveau de l’enzyme.
La superfamille des Ntn hydrolases regroupe en particulier les pénicillines acylases, les
homosérines lactone acylases et les céphalosporines acylases. Ces dernières présentent de
faibles homologies de séquence mais une organisation structurelle en feuillets  identiques
(Avinash et al., 2016). Ces enzymes deviennent actives après le clivage du peptide N-terminal,
faisant apparaitre l’acide aminé catalytique (sérine, thréonine ou cystéine), responsable de
l’hydrolyse de la liaison amide (Lodola et al., 2012). Ce résidu nucléophile N-terminal est
différent selon le type d’enzyme (la serine pour PGA et la cystéine pour PVA) (Avinash et al.,
2016). Les enzymes appartenant à cette famille présentent un mécanisme catalytique similaire
(Figure 1.12). Dans le cas de PGA, le mécanisme catalytique commence par l’attaque
nucléophile du groupement hydroxyle de la sérine catalytique (Ser1) sur le carbone du
groupement carbonyle de la liaison amide. Ce dernier est stabilisé par la formation de liaisons
hydrogènes avec les acides aminés du trou oxyanionique (Asn241 et Ala69) conduisant à un
état de transition tétraédral. La disparition de cet état de transition tétraédral s’accompagne de
la libération de l’acide 6-aminopénicillanique (6-APA) permettant la formation de l’acyle
enzyme. S’ensuit une attaque nucléophile soit par l’eau dans le cas de l’hydrolyse ou une autre
amine dans le cas de la synthèse (formation d’une liaison amide). Cette étape permet de libérer
l’enzyme et le deuxième produit (dans ce cas acide phénylacétique). Toutes ces étapes sont
réversibles, ce qui permet d’envisager une synthèse avec ces enzymes en changeant les
46
conditions réactionnelles (faible activité d’eau et pH acide) (Srirangan et al., 2013 ; E. Hassan,
2016).
Figure 1.12 : mécanisme catalytique de la pénicilline G acylase (Srirangan et al., 2013)

La deuxième superfamille d’enzymes appartient aux métalloprotéases et englobe
principalement les aminoacylases I, II et III. Ces dernières nécessitant la présence d’un ou deux
ions métalliques divalents, principalement du Zn2+ qui peux être remplacé par du Co2+, Mn2+
ou Ca2+ (Henseling, Rohm, 1988). L’implication de la présence du Zn2+ dans l’activité et la
stabilité structurale de l’enzyme a été étudiée par plusieurs auteurs. Dans le cas de
l’aminoacylase I du rein porcin, il a été démontré sur la base de l’étude par relaxation
magnétique nucléaire et par dichroïsme circulaire que le Zn2+ permet une stabilisation de la
structure active de l’enzyme sans intervenir dans l’interaction enzyme/substrat ou sur les
performances catalytiques de l’enzyme (Heese et al., 1990 ; Tang et al., 1995). D’autres auteurs
ont montré l’implication du zinc dans le processus catalytique d’une aminoacylase I humaine
contenant deux atomes de zinc au niveau du site actif (Lindner et al., 2003). Dans le cas de
l’aspartoacylase humaine, le zinc joue un rôle dans le mécanisme catalytique. Cette enzyme est
une protéine homodimérique de 36 kDa dont le site actif est situé au fond d’une cavité profonde
et étroite dans chacune des sous unités. La présence d’acides aminés chargés positivement à
l’entrée de la cavité permet une meilleure attraction de molécules chargées négativement. Elle
est formée de trois régions dont (Kots et al., 2019):
47
- une région de coordination de la molécule d’eau catalytique avec le Zn2+,

- une région de fixation et de stabilisation du substrat avec implication de plusieurs acides
aminés (Arg168, Asn70, Arg71 et Tyr288)
- une base catalytique (Glu178) qui joue le rôle d’accepteur de proton de la molécule d’eau
catalytique
Dans ce cas, le groupement carbonyle de la molécule polarisée par l’Arg63 est attaqué par le
groupement hydroxyle activé (figure 1.13.A). L’oxygène chargé négativement formé est
stabilisé par des interactions électrostatiques avec l’Arg63 et le Zn 2+ (figure 1.13.B). Cela
permet par la suite la libération de l’acide aspartique et le retour à l’état initial, après la
récupération du proton cédé par le Glu178 par la molécule formée (Bitto et al., 2007). Dans le
cas de l’aminoacylase I de rein porcin, c’est le Glu146 qui joue le rôle de base catalytique. Afin
de contrôler et d’orienter l’équilibre thermodynamique de la réaction vers la synthèse ou
l’hydrolyse, un changement des conditions opératoires (pH, température, aW,…) peut être
nécessaire (Wardenga et al., 2010)
Figure 1.13 : mécanisme catalytique de l’aspartoacylase (Bitto et al., 2007)
Les aminoacylases ont été étudiées depuis longtemps d’un point de vue structural et pour leur
activité hydrolytique de liaisons amides, mais beaucoup moins pour leur activité de synthèse en
particulier pour la N-acylation d’acides aminés.
1.3.2 Influence des conditions opératoires sur les performances

catalytiques des acylases
Les aminoacylases sont des enzymes principalement hydrolytiques, comme décrit
précédemment, mais il est possible de changer l’équilibre thermodynamique vers la réaction
d’acylation en changeant les conditions expérimentales suivant le principe de le Chatelier.
Afin de déplacer l’équilibre thermodynamique vers une réaction de synthèse plusieurs stratégies
peuvent être adoptées.
48
❖ L’utilisation de solvants organiques comme milieu réactionnel dans un but de réduire

l’activité de l’eau. Mais comme pour l’acylation avec les lipases, les substrats hydrophiles
(acides aminés) sont difficilement solubilisés dans ces systèmes réactionnels (Kosáry et al.,
1992 ; 1994 ; Youshko et al., 2001). Certains auteurs ont évalué l’utilisation des milieux
biphasiques afin de favoriser la réaction d’acylation des acides aminés avec les
aminoacylases I de rein porcin (Ferjancic-Biagini et al., 1997 ; Wada et al., 2002). Wada
et al. (2002) ont évalué l’utilisation de plusieurs co-solvants pour la réaction de synthèse
de l’acide N-lauroyl-L-glutamate. Parmi ces derniers, le glycérol à différents pourcentages,
selon l’acide aminé utilisé, a permis une augmentation importante de l’activité de synthèse
passant jusqu’à environ 30 fois l’activité initiale. Cela a été attribué à la diminution de la
constante diélectrique du milieu qui, dans ce cas, a favorisé la réaction de synthèse (Wada
et al., 2002). Par ailleurs, ce n’est pas le cas de toutes les aminoacylases. Koreishi et al.
(2005a) ont utilisé le même système (70% de glycérol) pour la réaction de synthèse avec
l’aminoacylase de Streptomyces mobaraensis. Ils ont noté une perte du taux de conversion
d’environ 15 fois en présence de glycérol. Cela est probablement lié à une diminution de
la flexibilité interne de l’enzyme à cause de la diminution de la constante diélectrique du
solvant réactionnel et de la faible quantité d’eau libre présente autour de l’enzyme
(Koreishi et al., 2005a).
❖ L’utilisation de tampon comme milieu réactionnel mais avec une modification des
conditions opératoires (pH et/ou de la température, concentration élevée de substrats, …)
(tableau 1.4).
1.3.2.1 Influence du pH
Le pH du milieu réactionnel est un paramètre crucial dans les réactions de synthèse avec les
aminoacylases. Il joue un rôle important, d’une part, sur l’état d’ionisation et la solubilité des
substrats et, d’autre part, sur l’activité enzymatique. L’influence sur l’activité enzymatique peut
être reliée à l’état d’ionisation des résidus d’acides aminés de l’enzyme impliqués dans
l’interaction ou la stabilisation du substrat ainsi que celui des résidus catalytiques (Torres-
Guzmán et al., 2001). Par exemple, dans le cas de l’aminoacylase I de rein porcin, étant donné
que l’acide aminé catalytique a un caractère acide (acide glutamique), l’enzyme a une activité
synthétique à pH acide (pH 6) et hydrolytique à pH supérieur à 7,5 (passage de l’acide
carboxylique d’un état protoné à déprotoné) (Wardenga et al., 2010). Cependant, ce n’est pas
49
le cas de toutes les aminoacylases qui peuvent être actives dans des gammes de pH variables
pour diverses réactions de synthèse (tableau 1.4).
1.3.2.2 Influence de la température

La gamme de température optimales dépend de l’environnement de l’organisme source, de la
composition en acides aminés et de la structure des aminoacylases. Par exemple, il a été
démontré par homologie de structure, dans le cas de la PGA, que la présence d’une quantité
moins importante d’acide glutamique et aspartique et plus importante d’arginine et de proline
permettait d’avoir une meilleure thermostabilité enzymatique (Singh, Goyal, 2014). Mais cela
est très variable entre les différentes enzymes (tableau 1.4).
1.3.2.3 Influence des coactivateurs métalliques et inhibition de

l’activité enzymatique
L’utilisation d’ion métallique pour augmenter les performances catalytiques des acylases a été
décrite dans plusieurs travaux. Le fait que certaines aminoacylases appartiennent à la famille
des métalloprotéases peut nécessiter la présence d’un ion métallique divalent, Zn2+ ou Co2+ en
général, au niveau de la structure. Ce type d’élément peut aussi permettre une meilleure stabilité
de l’enzyme et une augmentation de l’activité de cette dernière. D’autre part, l’utilisation de
molécules chélatrices de métaux telles que l’EDTA ou le 1.10-phénanthroline conduit
automatiquement à une perte partielle ou totale de l’activité (Koreishi et al., 2009a ; 2009b ;
2006a ; 2005a ; Takakura, Asano, 2019). Par ailleurs, l’utilisation excessive de ces derniers peut
aussi conduire à une altération de l’activité enzymatique (Koreishi et al., 2005b). Dans certains
cas, l’enzyme est inhibée par les substrats ou les produits de la réaction. Koreishi et al. (2005b)
ont montré, dans le cas de la synthèse du N--lauroyl-L-lysine avec l’epsilon lysine acylase de
S. mobaraensis, que l’acide gras utilisé avait un effet inhibiteur sur l’activité enzymatique. En
effet, un ajout progressif de ce dernier en mode fed-batch a permis une augmentation du taux
de conversion comparativement au mode batch et ainsi permis d’atténuer l’effet inhibiteur
observé. La même observation a été rapportée par Wada et al. (2002) lors de la synthèse du
lauroyl-glutamate. Le produit de la réaction peut aussi avoir un effet inhibiteur. C’est le cas de
l’acide 6-amino-penicillanique et de l’acide phénoxyacétique produit de la réaction d’hydrolyse
de la pénicilline V, décrits respectivement comme des inhibiteurs non-compétitifs et compétitifs
de la pénicilline V acylase de S. mobaraensis (Zhang et al., 2007).
50
Tableau 1-4 : caractéristiques et spécificités de différentes aminoacylases
Taille Conditions Conditions

Nom Classe Structure Cofacteurs Inhibiteurs Stabilité Spécificité Références
(kDa) réactionnelles optimales
Aminoacylases
Tampon H : pH : 7- 1 h à 45°C (Koreishi et
(SmAA) de S. 55 Zn2+ / Ni H : N--acyl-AAs
H : pH 7,5, 37°C 8, 50°C pH 7,5 al., 2009b)
mobaraensis Peptidases M20 1.10-
Aminoacylase (EC 3.5.1.14) phenanthroline Tampon H: pH : H et S : N--acyl-
1 h à 60°C (Koreishi et
de S. 100 Co2+ H : pH 7,5, 37°C 5,5-7,5, AAs
Monomère pH 7,2 al., 2005a)
mobaraensis S : pH 7,2, 37°C 60°C H: Céphalosporine
ε-lysine acylase Amidohydrolase 1.10-
Tampon
de S. metallo-dépendante, 2+ 2+ phenanthroline H : pH 8-9, 1 h à 50°C H et S : N--acyl- (Koreishi et
56 Zn / Co H : pH 8, 37°C
mobaraensis type YtcJ et l’AG (haute 55°C pH 8 lysine al., 2009a)
S : pH 7, 45°C
(Sm-ELA) (EC 3.5.1.17) concentration)
(Ferjancic-
Tampon S: pH 6, S : N-acyl-L-
N.R. Biagini et
S: pH 6, 37°C 37°C methionine
Aminoacylase I Homo- al., 1997)
45 Zn2+ N.R.
du rein porcin dimère Glycérol + 12.5%
Amidohyrolase S: pH 7,5, (Wada et
tampon N.R. S : N-acyl-AAs
metallo-dépendante 37°C al., 2002)
S : pH 7,5, 37°C
(EC 3.5.1.14)
Aminoacylase
Tampon H : pH 12, 1 h 70°C (Takakura,
de Homo- H et S : N--
42 Zn2+ / Co2+ EDTA H : pH 10, 50°C 70°C, pH 8 Asano,
Burkholderia octamère lauroyl-L-AAs
S : pH 9, 25°C S : pH 9 (pH 5 -12) 2019)
sp.
(Koreishi et
Acide 6-amino- Tampon H : β-Lactam et
Penicilline V al., 2006a ;
β-lactam acylase Hétéro- 19 + penicillanique et H : pH 7,8, 37°C 55°C pH 1 h à 55°C Capsaïcine
acylase de S. Co2+ 2007a ;
(EC 3.5.1.11) dimère 61 acide S : pH 7,5, 45°C, 7,5-8,5 pH 7,8 H et S : N-lauroyl-
mobaraensis Zhang et
phenoxyacétique 0,5 mM CoCl2 AAs
al., 2007)
N.R. : non rapporté, H : réaction d’hydrolyse, S : réaction de synthèse, AG : acide gras
51
1.3.3 Acylation enzymatique d’acides aminés par les aminoacylases en

milieu aqueux
Plusieurs enzymes ont été décrites comme étant capables de réaliser la réaction de N-acylation
en milieu aqueux mais très peu de travaux ont été rapportés pour l’acylation d’acides aminés
(tableau 1.4). Elles peuvent être regroupées en trois grands groupes : les pénicillines amidases
(EC 3.5.1.11), les aminoacylases I (EC 3.5.1.14) et les N6-acyl-L-lysine amidohydrolases (EC
3.5.1.17). Les premières études d’acylation enzymatique d’acides aminés dans l’eau ont été
réalisées à partir d’aminoacylases de S. mobaraensis identifiées par l’équipe de Koreishi
(Koreishi et al., 2005b ; 2006a ; 2005a ; 2009b) mais d’autres aminoacylases provenant
d’organismes différents ont aussi été caractérisées.
1.3.3.1 Les pénicillines acylases (EC 3.5.1.11)
Les enzymes appartenant à cette classe sont largement utilisées pour la production de dérivés
de pénicilline par des réactions d’hydrolyse et de synthèse de liaison amide entre l’acide 6-
aminopénicillanique et un donneur d’acyle. Certains auteurs se sont intéressés à la réaction
d’acylation d’acides aminés par l’utilisation de ces enzymes. Koreishi et al., 2006 ont identifié
la présence d’une enzyme hétérodimérique de 61 et 19 kDa chez S. mobaraensis en comparant
l’activité hydrolytique de la capsaïcine de différentes espèces de Streptomyces. Cette enzyme a
été identifiée comme une pénicilline V acylase (Sm-PVA) appartenant aux -lactam acylases,
présentant une activité hydrolytique vis-à-vis d’acides aminés et de peptides acylés en plus de
la Penicilline V, du NIPOAB (acide 2-Nitro-5-phenoxyacetamide benzoïque) et de la
Penicilline G ainsi qu’une absence d’activité vis-à-vis de l'ampicilline et de la céphalosporine
C (Zhang et al., 2007). Une activité acyl-transférase a aussi été identifiée (Koreishi et al.,
2007a). L’enzyme avait un pH optimal d’environ 8 et une température optimale de 55°C avec
une activité et une stabilité supérieure en présence de Co2+. Elle est capable de réaliser la
réaction d’acylation de différents acides aminés (figure 1.14) et de peptides en présence de 78%
(v/v) de glycérol. Le meilleur taux de conversion a été obtenu en présence de lysine, pré-acylée
sur l’amine en position , pour accroitre la solubilité du produit dans les conditions
réactionnelles (Koreishi et al., 2006a).
52
Figure 1.14 : taux de synthèse des acides aminés N-lauroylés. Conditions réactionnelles : acide
laurique (7,5 mM), acides aminés (200 mM), 10 unités/mL de l’extrait de S. mobaraensis dans
du tampon Tris-HCl 100 mM pH 7,5 contenant 0.5 mM CoCl2 et 78% de glycérol à 37°C durant
2 jours (Koreishi et al., 2006a)
1.3.3.2 L’epsilon lysine acylase (EC 3.5.1.17)

Décrites pour la première fois en 1957 (Paik et al., 1957), les enzymes de cette classe sont
capables de réaliser la réaction d’acylation en milieux aqueux de l’amine de la L-lysine en
position  avec la même régiosélectivité que les lipases (CALB,…) en solvants organiques :
ceci représente un avantage important. Koreishi et al., (2005b et 2009a) ont décrit les
performances de l’epsilon lysine acylase de S. mobaraensis (Sm-ELA). C’est une
métalloenzyme monomérique de 56 kDa avec des pH et température optimaux respectivement
de 8 et 55°C avec une amélioration de l’activité en présence de CoCl2. La réaction de N-
acylation de la lysine en position  a pu être réalisée en présence de donneurs d’acyles linéaires
ou cycliques avec une préférence pour les acides gras aliphatiques. L’étude de l’influence de la
longueur de la chaîne carbonée a montré que les meilleures performances ont été obtenues en
présence d’acides gras contenant entre 10 et 14 carbones avec une préférence pour l’acide
laurique avec un taux de conversion de 100% après 4 h en utilisant 10 mM d’acide gras
(Koreishi et al., 2005b). Il a aussi été démontré que l’augmentation de la concentration de
l’acide gras influençait négativement l’activité de cette enzyme (Koreishi et al., 2009a). Les
propriétés particulières de cette enzyme permettant d’envisager une utilisation industrielle pour
l’acylation sélective en milieu aqueux de la lysine en position , plusieurs brevets ont été
déposés par Ajinomoto afin de protéger cette enzyme (Nakanishi et al., 2011 ; Takakura,
Nozaki, 2018).
53
1.3.3.3 Les aminoacylases I (EC 3.5.1.14)
Toutes les enzymes faisant partie de cette classe, décrites pour leur activité d’acylation d’acides
aminés, appartiennent aux zincs métalloenzymes. Ces dernières ont une régiosélectivité et une
chimio-spécificité orientées vers l’amine en position  des acides aminés avec des
performances différentes.
L’aminoacylase I de rein porcin a été décrite par plusieurs auteurs pour l’acylation d’acides
aminés. C’est une enzyme homo-dimérique de 45 kDa capable, en présence de glycérol, de
réaliser l’acylation de plusieurs acides aminés protéinogènes avec l’acide laurique à l’exception
de l’acide aspartique, l’isoleucine et la phénylalanine où une très faible conversion a été mise
en évidence (Wada et al., 2002). Elle a aussi été capable de catalyser l’acylation de la
méthionine avec différents acides gras à courtes chaines (inférieures à 8 carbones) en l’absence
de glycérol avec des taux de conversion supérieurs à 30 % avec l’acide butyrique (Ferjancic-
Biagini et al., 1997).
Koreishi et al., 2005a, 2009b ont décrit deux aminoacylases provenant de Streptomyces
mobaraensis. La première est une enzyme monomérique de 100 kDa présentant un pH optimal
entre 5,5 et 7,5 et une température optimale de 60°C mais une stabilité moins importante au-
delà de cette température. Elle a pu catalyser l’acylation d’acides aminés protéinogènes (0.5 M)
avec l’acide férulique (0.01 M) en présence de glycérol à 37°C et à pH 7,2 à l’exception de la
proline et de la tyrosine et avec de très faibles taux de conversion pour l’acide aspartique, la
cystéine, l’histidine et la glycine. Les mêmes auteurs ont démontré que l’activité enzymatique
était beaucoup plus importante en absence qu’en présence de glycérol. Ceci a été relié à
l’amélioration de la flexibilité interne de l’enzyme en présence d’une quantité plus importante
d’eau. L’acylation de la lysine avec des dérivés d’acide férulique a aussi été réalisée montrant
une meilleure conversion avec l’acide hydro-cinnamique avec 43,2% de conversion (Koreishi
et al., 2005a). La deuxième aminoacylase (Sm-AA) est une métalloenzyme monomérique de
55 kDa. Elle a un pH optimal à 7,5 et une température optimale de 50°C. Elle permet
l’hydrolyse des acides aminés acylés avec des acides gras de courtes et longues chaines avec
de meilleurs taux de conversion avec l’acide laurique (C12). L’activité hydrolytique peut être
améliorée en présence du chlorure de zinc à faible concentration (0.5 mM) (Koreishi et al.,
2009b).
Récemment, une autre aminoacylase provenant de Burkholderia sp. isolée à partir

d’échantillons de sols a été identifiée (Takakura, Asano, 2019). L’originalité de cette enzyme
54
est sa température optimale de 70°C et son pH optimal de 12 pour l’hydrolyse et de 9 pour la

synthèse ainsi que son importante stabilité au pH (entre 5 et 12) et à la température (jusqu’à 1h
à 70°C). Ses caractéristiques se rapprochent de celles des enzymes issues des bactéries
extrémophiles probablement grâce à leur structure homo-octamérique (42 kDa l’unité) qui leur
confère une meilleure résistance aux conditions extrêmes. La production hétérologue de cette
enzyme chez E. coli BL21 (DE3) a démontré sa dépendance vis-à-vis des ions métalliques
divalents (Zn2+ et Co2+) qui améliorent l’activité enzymatique ; ce qui n’était pas le cas de
l’enzyme issue de la souche sauvage de Burkholderia sp. pour laquelle aucun effet n’a été
observé. Ces résultats mettent en évidence une différence de structure entre l’enzyme
recombinante et l’enzyme native où le zinc est bien intégré dans la structure alors qu’E. coli a
déjà été décrite comme incapable de bien intégrer le bon ion dans le cas des métalloenzymes
(Story et al., 2001). L’évaluation de l’activité synthétique des acides aminés lauroylés a montré
que cette enzyme est limitée à l’acylation de quelques acides aminés naturels avec de très bons
taux de conversion en présence d’arginine (89%) et de phénylalanine (51%) (tableau 1.5). Le
résultat avec l’arginine a été attribué au fait que le produit précipite au cours de la réaction
déplaçant ainsi l’équilibre thermodynamique vers la réaction de synthèse (Takakura, Asano,
2019).
Tableau 1-5 : activité de synthèse de différents lauroyl-acides aminés par les aminoacylases de
Burkholderia sp. (Takakura, Asano, 2019)
55
❖ Les acylases de Streptomyces ambofaciens

Ferrari (2014) a mis en évidence la présence d’acylases au niveau de l’extrait protéique d’une
culture de S. ambofaciens ATCC23877. Ces dernières étaient capables de réaliser la réaction
d’hydrolyse de l’- et de l’-acétyl-lysine ainsi que la réaction d’acylation de la lysine et de
plusieurs peptides contenant de la lysine avec l’acide oléique sur leur fonction amine en position
. L’étude des conditions d’hydrolyse a permis d’identifier une température optimale entre 40
et 45°C et un pH optimum entre 8 et 9 (figure 1.15). Les réactions d’acylation ont été réalisées
dans du tampon Tris HCl 25 mM, NaCl 50 mM pH 8, T = 45°C. L’analyse du produit de la
réaction par LC-MS-MS a permis de confirmer l’acylation en position  de la lysine ainsi que
la O-acylation de la sérine à très faible niveau dans le cas de di- et tripeptide. Ces performances
ont été comparées à celles de la lipase CALB qui s’est révélée capable de catalyser la réaction
d’acylation uniquement de la lysine sur l’amine en position  (Ferrari, 2014a).
Figure 1.15 : couple pH/température d'hydrolyse optimale des N-α et ε-acétyl-L-lysine de

l’extrait brut de S. ambofaciens. A : effet du pH à T = 37°C ; B : effet de la température à pH
8. Conditions expérimentales : tampon tris HCl 25 mM, NaCl 50 mM, 2 g/L d’extrait
enzymatique et 4 mM du substrat pendant 24h (Ferrari, 2014a).
Une étude comparative du génome de cette souche et des gènes codant pour les différentes
acylases identifiées chez S. mobaraensis (Sm-AA, Sm-ELA et Sm-PVA) a été réalisée. Cela a
permis de mettre en évidence la présence de trois gènes similaires avec 86, 80 et 69 % d’identité
de séquences, nommés Sam-AA, Sam-ELA et Sam-PVA, respectivement, en plus d’un
quatrième gène présentant 55% d’identité avec Sm-AA nommé Sam-AA like. Ces gènes étaient
répartis sur deux différentes portions du génome bactérien séparant Sam-AA et Sam-AA like
d’une part et Sam-ELA et Sam-PVA d’autre part (Ferrari, 2014a ; Dettori et al., 2017). Par
ailleurs, aucune caractérisation approfondie des performances catalytiques de cette enzyme n’a
été réalisée.
Ainsi, l’utilisation d’enzymes pour catalyser des réactions d’acylation d’acides aminés est très
attractive d’un point de vue environnemental mais cela n’est pas le cas vis-à-vis du coût du
56
procédé. Les enzymes utilisées en catalyse homogène présentent plusieurs inconvénients dont
la non-réutilisation possible du catalyseur et parfois sa faible stabilité. Afin de remédier à cela
l’utilisation de l’enzyme en système hétérogène (enzyme immobilisée sur un support) peut
s’avérer très utile.
1.4 Immobilisation d’enzymes

Afin de rendre un procédé enzymatique viable économiquement, la récupération et la
réutilisation ainsi que le maintien de la stabilité du biocatalyseur aux conditions de mise en
œuvre (température, pH, solvants, …) sont des paramètres très importants pour envisager un
développement à l’échelle industrielle (Zhao, 2010). L’immobilisation des enzymes est l’un des
moyens les plus appropriés permettant une stabilisation de la structure de l’enzyme
(rigidification) à la surface du support augmentant sa résistance aux conditions réactionnelles
et facilitant sa récupération ou son utilisation en continu, réduisant ainsi le coût du procédé
associé à la production préalable du biocatalyseur. L’usage d’enzymes immobilisées a permis
leurs utilisation à plus large échelle pour la production de nombreuses molécules d’intérêt :
acide aminé, de sucres, précurseurs d’antibiotiques… (Zhou, Hartmann, 2013). Par exemple, la
glucose isomérase immobilisée est actuellement et depuis longtemps utilisée pour la production
du D-fructose à partir du D-glucose à l’échelle industrielle avec une productivité supérieure à
10 tonnes par kg de catalyseur. De même, l’utilisation de la penicilline G amidase immobilisée
pour la production industrielle de l’acide 6-amino-penicillanique, précurseur de plusieurs
antibiotiques, a été développée et brevetée par plusieurs entreprises pharmaceutiques telles que
Bayer et Beecham (Buchholz, 2016 ; Sheldon, Pereira, 2017). La production d’esters et d’autres
molécules pour l’industrie cosmétique, alimentaire et de l’énergie par les lipases immobilisées
a aussi été largement décrite (Ansorge-Schumacher, Thum, 2013 ; Sá et al., 2017 ; Basso,
Serban, 2019 ; Filho et al., 2019). Par ailleurs, l’immobilisation est souvent accompagnée d’une
perte d’activité enzymatique causée par différents phénomènes tels que des limitations de
transfert du substrat vers le site actif, une inactivation de l’enzyme suite à l’interaction de
résidus importants pour la catalyse avec le support ou bien un changement de la conformation
3D de l’enzyme après fixation. Les conditions pour qu’un procédé utilisant des enzymes
immobilisées soit économiquement viable pour une utilisation industrielle sont : un maintien
maximum de l’activité au cours du temps, une bonne résistance mécanique, thermique et aux
solvants utilisés ainsi qu’une bonne recyclabilité avec une désorption minimale de l’enzyme
(Sheldon, Brady, 2019). A cet effet, le choix du matériau, de la technique et des conditions
57
d’immobilisation sont très importants et très variables pour chaque enzyme dans un
environnement spécifique (End, Schöning, 2004).
1.4.1 Matériaux utilisés pour l’immobilisation d’enzymes

Afin de mettre en place un procédé d’immobilisation le choix du matériau et de la méthode
d’immobilisation doit être adapté à chaque enzyme. Cela a favorisé le développement d’un
nombre très important de supports d’immobilisation de différentes natures présentant ainsi des
propriétés physicochimiques et mécaniques très variées (figure 1.16).
Figure 1.16 : représentation schématique des principaux supports d’immobilisation
1.4.1.1 Matériaux à base de polymères naturels

Les biopolymères sont des molécules biocompatibles, biodégradables et peu toxiques. Des
molécules tels que la cellulose, l’amidon, l’agarose, la gélatine, la chitine et le chitosane,
largement présentes dans l’environnement, ont été utilisées pour l’immobilisation d’enzymes
(de Albuquerque et al., 2018). Ces polymères sont soit extraits directement de ressources
naturelles ou obtenus par polymérisation, ce qui facilite le contrôle de la taille du matériau en
contrôlant les conditions de synthèse de ce dernier (température, pH, pression, agitation, temps
…) (Thangaraj, Solomon, 2019). En plus de leurs propriétés physicochimiques variées, la
présence de groupements organiques en surface facilite leur fonctionnalisation afin de moduler
par exemple leur hydrophobie (Estruch et al., 2008). Par exemple, l’utilisation du biochar
provenant de la pyrolyse de la biomasse comme support d’immobilisation est de plus en plus
attractive. Les propriétés physicochimique de ce dernier permettant l’immobilisation sont sa
porosité, sa surface spécifique intéressante et ses propriétés de la surface qui sont facilement
ajustables selon les conditions de leurs production, en particulier par le contrôle de la
température de pyrolyse (figure 1.17) (Pandey et al., 2020). Cea et al. (2019) ont utilisé ce
support pour l’immobilisation par adsorption de la lipase de Candida rugosa et évalué son
activité d’estérification de l’acide oléique avec de l’éthanol. L’évaluation des paramètres
58
influençant l’immobilisation a montré une augmentation du taux d’immobilisation avec

l’augmentation de la température permettant une activité et une stabilité thermique meilleure
que celle de l’enzyme libre (Cea et al., 2019).
Figure 1.17 : facteurs influençant les propriétés physicochimiques lors de l’immobilisation des
enzymes sur du biochar (Pandey et al., 2020)
1.4.1.2 Matériaux à base de polymères synthétiques

Ce sont des supports synthétisés par polymérisation de molécules d’origine pétrochimique
présentant une grande diversité de propriétés physicochimiques avec une résistance mécanique
et thermique importante et variable selon leurs compositions. De très nombreux supports
polymériques synthétiques ont été décrits dans la littérature. Parmi ces derniers, les billes en
acrylique (méthacrylate), propylène et styrène sont très utilisées pour l’immobilisation
d’enzymes (Graebin et al., 2012 ; De Lima et al., 2018). L’un des matériaux les plus utilisés et
décrits dans la littérature pour l’immobilisation des lipases est le polyméthacrylate divinyle-
benzène poreux (Dos Santos, Zabot, et al., 2016 ; Dias et al., 2018a). Séverac et al. (2011) ont
comparé l’utilisation de CALB immobilisée sur un matériau à base de polypropylène (Accurel
MP1001) qui est un polymère très hydrophobe à CALB immobilisée sur un support formé d’une
résine polyacrylique qui est un matériau très hydrophile (Lewatit VPOC 1600) pour la réaction
de transestérification du butanol avec de l’acide oléique dans du n-décane. Les résultats ont
montré l’importance du choix de la nature du matériau. Une accumulation du glycérol produit
lors de la réaction par affinité sur le support très hydrophile a en effet généré des limitations
diffusionnelles de l’acide oléique vers le site actif de l’enzyme, conduisant à une perte
59
importante d’activité. Par contre, l’utilisation d’un support très hydrophobe a permis une
amélioration de l’activité et de la stabilité de CALB immobilisée permettant d’envisager une
utilisation industrielle dans des réacteurs à lit fixe (Séverac et al., 2011).
1.4.1.3 Matériaux à base de silice

Les matériaux silicatés sont les matériaux très utilisés dans plusieurs domaines dont
l’immobilisation d’enzyme grâce au faible coût du précurseur et à la flexibilité d’usage des
groupements Si-O-Si facilitant leur synthèse. De très nombreux supports de cette nature aux
caractéristiques variées ont été synthétisés et utilisés pour l’immobilisation de plusieurs
enzymes permettant leur utilisation en batch ou en continu pour les réactions enzymatiques,
dont les réactions d’estérification et d’amidation (Dettori et al., 2018 ; Bernal et al., 2018a ;
Tufiño et al., 2019). Parmi ces supports, les matériaux silicatés ordonnés tels que les SBA-15
(Santa Barbara Amorphous-15), FSM-16 (Folded Sheet Materials-16), MCF (mesostructured
cellular foams) sont largement représentés en raison de la facilité et de la reproductibilité de
leur fabrication à petite échelle et du contrôle de l’uniformité de taille des pores en modifiant
la quantité et la nature du tensioactif qui rentre dans leur formulation (Zhou, Hartmann, 2013).
Les supports à base de silice seront décrits plus précisément ultérieurement.
1.4.1.4 Matériaux à base de carbone

De très nombreux matériaux non poreux (nanotubes de carbone et graphènes) et poreux à base
de carbone ont été développés et décrits pour leur efficacité lors de l’immobilisation d’enzymes
(John Kennedy et al., 2007 ; Reichardt et al., 2018 ; Liu, Dong, 2020). Parmi ces derniers, les
nanotubes de carbone sont très utilisés. Ce sont des matériaux biocompatibles présentant une
très bonne résistance mécanique, thermique et chimique avec une très importante surface
spécifique due à leur structure nanométrique ordonnée (20 à 40 nm) et leur surface hydrophobe
mais fonctionnalisable, permettant l’immobilisation d’enzymes par adsorption ou par liaison
covalente (Feng, Ji, 2011 ; Prlainović et al., 2011). Plusieurs catégories de nanotubes de carbone
ont été décrites selon leur configuration, en particulier l’agencement des feuillets et le traitement
chimique exercé sur eux (mono- ou multi-feuillet) (Lee et al., 2010 ; Singh et al., 2014 ;
Raghavendra et al., 2013 ; Ferreira et al., 2019). Parmi ces derniers, les nanotubes de carbone
en multifeuillets (MWCN) sont les plus utilisés. Plusieurs auteurs ont réalisé l’immobilisation
de lipases sur ces supports et ont observé de très bonnes performances parfois supérieures à
celles observées avec des enzymes commerciales pour les réactions de transestérification et
d’estérification (Shah et al., 2007 ; Szelwicka et al., 2019). Papadopoulou et al. (2013) ont
60
réalisé la réaction d’acylation de la pyridoxine, du tyrosol et de la tyramine avec l’acide -

lipoïque en présence de CALB immobilisée sur des nanotubes de carbone dans des liquides
ioniques et des solvants eutectiques. Ils ont montré de meilleures activités d’acylation
enzymatique par rapport à CALB immobilisée commerciale (Novozyme 435) (Papadopoulou
et al., 2013). Shah et al. ont aussi observé une meilleure activité et stabilité dans l’hexane et les
liquides ioniques de la lipase de Candida rugosa par rapport à l’enzyme lyophilisée. Cette
importante augmentation de l’activité était liée à un changement conformationnel de l’enzyme
suite à l’interaction avec la surface hydrophobe du support qui s’est traduite par l’ouverture du
volet moléculaire (lid), permettant une amélioration du transfert du substrat vers les résidus
catalytiques (Shah et al., 2007). Ce phénomène d’activation interfaciale est très souvent observé
lors de l’immobilisation des lipases sur des supports hydrophobes et engendre une augmentation
de l’activité et de la stabilité enzymatique et, dans certains cas, un changement de la
régiosélectivité des lipases (Fernandez-Lorente et al., 2008 ; Abreu Silveira et al., 2017 ; 2019).
Pavlidis et al. (2010) ont immobilisé par adsorption CALB sur des nanotubes de carbone
multifeuillets fonctionnalisés avec des groupements carboxylique, amine et aliphatique. Le taux
d’immobilisation le plus important a été obtenu en présence du groupement carboxylique avec
environ 50 % d’immobilisation alors que la meilleure activité d’estérification a été obtenue en
présence du groupement aliphatique due à une probable mauvaise orientation (Pavlidis et al.,
2010a).
Les oxydes de graphène sont d’autres types de supports carbonés similaires aux nanotubes de
carbone (surface spécifique, résistance mécanique et thermique) largement utilisés dans
différents domaines dont l’immobilisation d’enzymes (Shan et al., 2009). La présence de
groupements carboxyle, hydroxyle et époxy à la surface de ces supports facilite
l’immobilisation des enzymes par interactions électrostatiques ou par des liaisons covalentes,
ce qui peut améliorer l’activité enzymatique et la stabilité lorsque les enzymes ont une bonne
orientation (Jiali Zhang et al., 2010 ; Qingzhong Li et al., 2013). Dans certains cas, la formation
de ces interactions électrostatiques n’est pas favorable à l’activité enzymatique (Yan Zhang et
al., 2012). Certains auteurs ont décrits la possibilité de moduler le caractère hydrophobe de la
surface du support par réduction des groupements fonctionnels, permettant ainsi une
amélioration de l’adsorption et de l’activité enzymatique (figure 1.18) (Compton, Nguyen,
2010 ; Duan et al., 2015). Cela permet la synthèse de graphènes réduits qui sont des supports
également très utilisés pour l’immobilisation d’enzymes. Hermonanová et al. (2015) ont évalué
la stabilité thermique et au solvent de la lipase de Rhizopus oryzae immobilisée par adsorption,
61
liaison covalente sur des oxydes de graphène ainsi que par réticulation en surface de ces
supports. Les enzymes présentaient une très bonne stabilité thermique en particulier lorsqu’elles
étaient immobilisées par liaison covalente en comparaison avec l’enzyme libre avec 65%
d’activité résiduelle après incubation de l’enzyme immobilisée à 70°C contre le même taux
après incubation de l’enzyme libre à 40°C (Hermanová et al., 2015). Les mêmes observations
ont été décrites par Tan et al. (2019) lors de l’immobilisation de la glutaryl-7-
aminocephalosporanique acide acylase sur des oxydes de graphène (Tan et al., 2019c).
Figure 1.18 : représentation de l’organisation moléculaire des oxydes de graphène et des oxydes
de graphène réduits (Jiali Zhang et al., 2010 ; Duan et al., 2015)
1.4.1.5 Les supports magnétiques

Afin de faciliter la séparation et d’augmenter la résistance mécanique des matériaux, des
supports magnétiques peuvent être utilisés pour l’immobilisation d’enzyme. Ces derniers sont
obtenus par mélange d’une solution contenant du fer (chlorure de fer, …) avec un polymère
afin de former des nanoparticules poreuses ou en recouvrant des particules de fer (Fe3O4) d’un
polymère obtenant ainsi un cœur magnétique. De très nombreux supports magnétique poreux
et non-poreux ont été développés ces dernières années à base de polymères de nature très variée,
permettant de moduler les caractéristiques de la surface des supports tout en facilitant leur
récupération. Les enzymes immobilisées par adsorption ou par liaison covalente sur ces
supports ont présenté des activités et stabilités aux conditions réactionnelles (température, pH,
…) très attractives, permettant d’envisager une adaptation à la production industrielle par le
biais de ces enzymes (Sheng et al., 2018 ; Lin et al., 2019 ; Bezerra et al., 2020 ; Sahin, Ozmen,
2020 ; Zhong et al., 2020).
1.4.2 Caractéristiques du support

Le choix du diamètre des pores le plus adapté à l’immobilisation est crucial afin de minimiser
les limitations de transfert de matière vers l’enzyme et de stabiliser cette dernière au niveau des
62
pores (Estruch et al., 2008). Les supports utilisés pour l’immobilisation peuvent être classés
selon la présence ou l’absence de pores, selon la taille des pores et selon l’organisation de ces
derniers. La taille des pores peut varier de 1 nm à plusieurs dizaines de micromètres (Figure
1.19.A). On retrouve ainsi les matériaux microporeux de taille de pores inférieure à 2 nm tels
que les supports siliceux microporeux (zéolites) et les supports carbonés (nanotubes de carbone
et les graphènes). L’immobilisation sur ces matériaux se fait en surface externe qui est très
importante en raison de leur taille et structure nanométrique, mais avec une importante
exposition aux conditions extérieures. Les matériaux macroporeux présentent des diamètres de
pores supérieurs à 50 nm avec une surface spécifique plus faible (environ 100 m²/g, parfois
significativement plus). La macroporosité permet par ailleurs de meilleurs transferts des
substrats et produits et de leur solvant dans la porosité du matériau. Cao (2005) a recommandé
l’usage de pores ayant environ 10 fois le diamètre de la protéine immobilisée afin de faciliter
l’immobilisation et les transferts de matière (Cao, 2005b). Le cas le plus connu et le plus utilisé
dans la littérature est la CALB immobilisée sur des billes macroporeuses de poly-méthacrylate
divinylebenzène (Lewatit VP OC 1600) appelé « Novozyme 435 ». Ces billes ont été analysées
par Mei et al. (2002) en utilisant de la micro-spectroscopie infrarouge synchrotron et de la
microscopie électronique à transmission. Les résultats ont montré une conservation de la
structure 3D de l’enzyme immobilisée. Les auteurs ont démontré que la lipase était répartie au
niveau des 90 premiers µm sous la surface externe des billes et la taille des pores (100 nm) était
environ 10 fois plus importante que celle de l’enzyme permettant un bon échange de matière
avec le milieu externe (Mei et al., 2003). Un autre exemple est l’utilisation des supports siliceux
monolithiques macro-mésocellulaires appelé HIPE (High Internal Phase Emulsion) pour
l’immobilisation de Thermomyces lanuginosus pour la réaction de transestérification (Backov,
2012b). L’enzyme immobilisée a présenté une bonne activité et une excellente stabilité au cours
du temps avec une bonne rétention d’activité même après 60 jours d’utilisation.
Les supports mésoporeux présentent une taille de pores intermédiaire entre 2 et 50 nm avec une
surface spécifique également souvent intermédiaire par rapport aux supports microporeux et
aux supports macroporeux. Parmi ces matériaux, les supports mésoporeux ordonnés présentant
un diamètre et une forme de pores homogène sont les plus utilisés pour l’immobilisation des
enzymes (Zucca, Sanjust, 2014). En effet, étant donné que le diamètre des enzymes est
généralement proche de la taille des pores du support, cela permet une meilleure stabilisation
(rigidification) de la conformation 3D de l’enzyme (figure 1.19.B) (Takahashi et al., 2000 ; Lu
et al., 2011). Certains auteurs ont noté une plus faible stabilité structurale en augmentant la
taille des pores du supports liée à une flexibilité plus importante de la conformation 3D de
63
l’enzyme ainsi qu’une désorption facile de l’enzyme immobilisée (Yiu et al., 2001 ; Sang,
Coppens, 2011). En revanche, l’utilisation de mésopores pour l’immobilisation peut engendrer
des limitations diffusionnelles du substrat vers l’enzyme (Kang et al., 2007). L’utilisation de
matériaux présentant une structure tridimensionnelle interconnectée de pores tels que les MCFs
(Mesocelluar foams) et les SBA16 pourrait présenter un intérêt en réduisant les problèmes
d’accessibilité des enzymes et des substrats à l’intérieur de la structure (Washmon-Kriel et al.,
2000).
A. B.
Figure 1.19 : classification des matériaux selon le diamètre des pores (A) et comparaison du
diamètre des pores des supports mésoporeux ordonnés et du diamètre des enzymes (B ; (Zhou,
Hartmann, 2013)).
L’utilisation de supports avec une structure contenant à la fois une mésoporosité et une
macroporosité (on parle alors de porosité hiérarchisée) pourrait s’avérer aussi très utile afin
d’exploiter les avantages de la présence de mésopores (stabilisation de la structure de l’enzyme
et assez grande surface spécifique) et des macropores (meilleur transfert de matière) (Roucher
et al., 2018a ; Zhou et al., 2019) (figure 1.20). Cela a permis à certains auteurs de réaliser des
réactions de transestérification en continu suite à l’immobilisation de leur enzyme sur des
supports silicatés présentant des mésopores d’environ 20 nm et des macropores d’entre 30 et
50 µm de diamètre (Szymańska et al., 2016).
Figure 1.20 : organisation d’un support avec une structure de pores hiérarchiquement ordonnés
(Blin et al., 2006)
64
1.4.3 Techniques d’immobilisation
L’immobilisation des enzymes sur ces supports peut se faire soit par adsorption physique
(physisorption) en faisant appel à des liaisons faibles (Van der Waals, ionique,
hydrophobe/hydrophile, …) soit par des liaisons covalentes (chimisorption) (figure 1.21).
D’autres méthodes d’immobilisation telles que l’encapsulation et l’agrégation des protéines ont
aussi été décrites. Les différentes techniques les plus utilisées pour l’immobilisation des
enzymes seront décrites ci-dessous (figure 1.21).
Figure 1.21 : les principales techniques d’immobilisation d’enzymes (à partir de Chapman,

Stenzel, 2019)
1.4.3.1 Immobilisation par adsorption

L’immobilisation par adsorption sur un support est la méthode d’immobilisation la moins
coûteuse et la plus simple à réaliser. Elle consiste à mettre en contact une suspension d’enzymes
avec un support. L’adhésion du catalyseur soluble sur le support se fait par affinité par
l’implication de liaisons faibles telles que les interactions de Van der Waals, hydrogène,
hydrophobes et électrostatiques. L’immobilisation dépend de la nature chimique du matériau et
surtout de ces propriétés physicochimiques en surface (polarité, charge et présence de
groupements spécifiques) qu’il faut adapter aux propriétés de la surface des enzymes
(caractéristiques physicochimiques des résidus d’acides aminés présents à la surface de
l’enzyme, i.e. résidus hydrophobes ou hydrophiles, présentant des groupements amines ou
carboxyliques) lors de leur immobilisation. Le pH lors de l’immobilisation influence l’état
d’ionisation de l’enzyme et du support en intervenant sur la charge en surface de ces derniers
65
favorisant ou pas les interactions électrostatiques. Wang et al. (2005) ont réalisé
l’immobilisation de plusieurs enzymes sur un support siliceux présentant un pI de 3. Ils ont
observé une immobilisation plus importante des enzymes ayant un pI supérieur à 7 (pH utilisé
lors de l’immobilisation) par implication d’interaction électrostatique (Wang, Caruso, 2005).
La présence d’un grand nombre de groupements silanes (-Si-OH) à la surface des matériaux
poreux siliceux confère un caractère très hydrophile au support ce qui peut être limitant lors de
l’immobilisation des enzymes lié aux faibles interactions (hydrogène et Van der Waals) qui
peuvent être à l’origine d’une désorption importante de l’enzyme suite au recyclage (Jacoby et
al., 2013 ; Carteret et al., 2018). De plus, ces derniers présentent un point isoélectrique très bas
(pI d’environ 3) ce qui peut engendrer des effets de répulsion électrostatique avec l’enzyme
lorsque l’immobilisation est réalisé à des pH basiques (Maria Chong, Zhao, 2004 ; Grimaldi et
al., 2015). Par ailleurs, ces groupements silanes représentent un point d’ancrage important des
groupements organiques fonctionnels ou organosilanes (Gooding, Ciampi, 2011). Afin
d’améliorer l’affinité des enzymes pour le support, les matériaux en particulier les matériaux
poreux siliceux peuvent être fonctionnalisés soit par co-condensation en ajoutant un
modificateur organique ou un métal lors de la préparation du matériau ou par greffage d’un
groupement organique après synthèse du matériau (figure 1.22.A et B). Cela permet la
modification des propriétés du matériau adaptant ainsi, par exemple, le caractère hydrophobe
ou la charge en surface. Par ailleurs, il est important de prendre en considération le fait que
l’introduction de groupements fonctionnels dans la structure du support peut conduire à une
réduction de la taille des pores et du volume poreux (Brühwiler, 2010 ; Kang et al., 2007).
Différents types de groupements peuvent être greffés sur les supports siliceux permettant de
cibler des résidus spécifiques tels que la lysine et la cystéine ou des groupements spécifiques
tels que les groupements carboxyle, hydroxyle ou amines présents à la surface de l’enzyme
(figure 1.22.C) (Hoarau et al., 2017). Le choix du groupement fonctionnel dépend de la
structure de l’enzyme et des groupements exposés en surface. Afin de maintenir ou améliorer
l’activité et la spécificité de l’enzyme, la bonne orientation du site actif de l’enzyme est très
importante. Maria Chong et Zhao (2004) ont comparé les performances de la pénicilline G
acylase (PGA) immobilisée sur des SBA-15 modifiées par co-condensation avec des
organosilanes de différentes natures chimiques. La fonctionnalisation du support avec le (3-
Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) et le vinyltriethoxysilane (VTES) a permis une
augmentation de la quantité d’enzyme adsorbée et un quasi-doublement de l’activité
enzymatique par rapport aux enzymes immobilisées sur les SBA-15 non-fonctionnalisés. Ce
résultat semble lié à l’augmentation de l’hydrophobie de la surface du support en plus de
66
l’implication de liaisons électrostatiques et hydrogène (figure 1.23) (Maria Chong, Zhao, 2004).
L’acylase I d’Aspergillus melleus a été immobilisée sur des supports silicatés (Stöber silica)
fonctionnalisés avec de l’APTES et du glutaraldéhyde à pH 7. L’activité et la stabilité les plus
importantes de l’enzyme ont été observées après immobilisation sur les supports fonctionnalisés
avec de l’APTES due à une bonne rigidification et orientation de l’enzyme sans altération de
sa conformation. La réactivité du glutaraldéhyde utilisé a été mise en cause dans la perte
d’activité en dénaturant l’enzyme après immobilisation (Kołodziejczak‐Radzimska et al.,
2018). Plusieurs autres auteurs ont réalisé l’immobilisation d’enzymes (lipases et d’acylases)
sur les supports silicatés fonctionnalisées avec de l’APTES observant les mêmes résultats
décrits précédemment (Shah et al., 2008 ; Bernal et al., 2018a).
L’hydrophobie du matériau influence considérablement l’adsorption et l’activité des enzymes
selon les propriétés de surface de l’enzyme utilisée. Plusieurs auteurs ont décrit une perte
d’activité enzymatique après immobilisation sur des supports très hydrophobes et ont tenté de
comprendre le mécanisme moléculaire expliquant ces résultats en réalisant des études
structurales de différentes enzymes après immobilisation sur des supports de différentes
polarités (Raffaini, Ganazzoli, 2010 ; 2012). Les résultats obtenus montrent d’importants
changements de la conformation secondaire de l’enzyme suite à l’immobilisation sur les
supports hydrophobes causée par l’interaction des résidus d’acides aminés non seulement
hydrophobes mais aussi hydrophiles tels que l’arginine avec le matériau. Par ailleurs, une fois
que l’enzyme est stabilisée sur le support, très peu de changements sont visibles. Sur les
supports hydrophiles, peu de changements de la configuration 3D de l’enzyme ont été
enregistrés en raison de la faible force d’interaction avec le support en comparaison avec le
support hydrophobe. Plusieurs auteurs ont proposé l’utilisation de supports avec un équilibre
hydrophobe/hydrophile moyen afin de maintenir une conformation active des enzymes
immobilisées et ainsi d’obtenir un biocatalyseur avec l’activité et la stabilité recherchées
(Radhakrishna et al., 2013 ; Grimaldi et al., 2015).
67
A. C.
B.
Figure 1.22 : méthode de Co-condensation (A) et de greffage (B) des groupements organiques
sur les supports à base de silice (R = groupement organique fonctionnel) et groupement
fonctionnels généralement utilisé pour la modification de la surface des supports (C)
(Hartmann, Kostrov, 2013a ; Hoarau et al., 2017)
Figure 1.23 : interactions possibles entre l’enzyme et le support fonctionnalisé avec de l’APTES
(Bernal, Poveda-Jaramillo, et al., 2018)
1.4.3.2 Immobilisation par chimisorption

L’immobilisation des enzymes par chimisorption consiste en la formation d’une liaison
covalente entre l’enzyme par implication des acides aminés à la surface de cette dernière
contenant des groupements nucléophiles libres (amine, carboxylique, thiol, …) et le support
(figure 1.21).
Dans ce cas les enzymes sont immobilisées sur des supports préalablement fonctionnalisés soit
avec des molécules organiques telles que l’APTES puis l’immobilisation est réalisée en
rajoutant une molécule qui formera un pont entre l’enzyme et le support tel que le
glutaraldéhyde, soit par le greffage de groupement contenant une fonction epoxy telle que le
68
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (glymo) qui permet sous certaines conditions

(molarité, force ionique et pH du tampon) de former des liaisons covalentes entre l’enzyme et
les supports après ouverture du cycle epoxy. De nombreux autres agents organiques peuvent
servir de point d’ancrage après greffage sur les groupements silanes du support silicaté par
exemple (i.e. isocyanate) et plusieurs techniques d’activation de ces groupement sont décrites
dans la littérature (Zucca, Sanjust, 2014). La lysine est l’un des acides aminés de la surface de
l’enzyme généralement impliqués dans la formation de liaisons covalentes mais d’autres résidus
contenant des groupement nucléophiles (l'histidine, la cystéine, la tyrosine, …) peuvent aussi
être impliqués. Dans le cas où l’enzyme contient très peu de lysine en surface, une étape
d’amination des résidus d’acides aminés acides par l’utilisation d’une solution d’éthylène-
diamine pourra améliorer les interactions (Bernal et al., 2013). Les performances des enzymes
immobilisées dépendent de la structure de l’enzyme et de la nature et des propriétés de la
molécule utilisée pour son ancrage (spacer). En effet, si l’enzyme contient peu de résidus
d’acides aminés permettant l’ancrage ou si la fonctionnalisation a été réalisée avec une trop
faible concentration de fonctionnalisant organique, peu de liaisons covalentes seront obtenues.
Cela résulte en une meilleure flexibilité de l’enzyme mais avec un risque élevé de dénaturation
contrairement au cas où il y a présence de multiples points d’ancrage qui permettent une
rigidification plus importante de l’enzyme conduisant à une meilleure stabilité structurale
(figure 1.24). Les propriétés du modificateur organique tel que sa longueur peuvent aussi jouer
un rôle dans les performances catalytiques. L’utilisation d’un court spacer conduit à une
rigidification plus importante de l’enzyme mais cela peut engendrer des limitations de transfert
de matière contrairement à l’utilisation d’un long spacer qui permet une bonne flexibilité de
l’enzyme et une bonne accessibilité des substrats. Par ailleurs, une dégradation des
performances de l’enzyme peut être observée dans tous les cas de figure suite à une dénaturation
de l’enzyme par la formation de liaisons covalentes avec les résidus proche du site catalytique
de l’enzyme.
A. B.
Figure 1.24 : schéma des différents point d’ancrage possibles de l’enzyme sur un support, A :
un seul vs plusieurs points d’encrage, B : ancrage avec des spacers de différentes longueurs
(Hoarau et al., 2017)
69
Le choix du groupement fonctionnel lors de l’immobilisation doit être adapté à l’enzyme

utilisée et aux conditions de mise en œuvre. Plusieurs auteurs ont observé une meilleure
immobilisation covalente des enzymes après greffage sur des supports contenant des cycles
époxy en surface (Fei et al., 2016 ; Tong et al., 2019). L’augmentation du pH et de la force
ionique du tampon d’immobilisation améliorent la formation de liaisons covalentes entre
l’enzyme et le support à multiples points en neutralisant les charges des groupements amine de
la chaine latérale des lysines présentent à la surface de l’enzyme et en favorisant la réactivité et
l’ouverture des cycles epoxy permettant un meilleur attachement dans le cas de l’utilisation du
glymo (Mateo et al., 2000). Certains auteurs ont aussi décrits l’amélioration de l’activité et de
la stabilité thermique et aux solvants organiques des enzymes après modification de leur
structure en rajoutant des résidus lysine à la surface ou en réalisant l’amination des acides
aminés acides de la surface des enzymes permettant de former un ancrage à multiple points
avec le support (Bernal et al., 2013 ; 2014 ; Vikas, Srashti, 2014).
Plusieurs études ont réalisé l’immobilisation des enzyme en utilisant cette méthode observant
le maintien d’une bonne activité tout en améliorant la stabilité de l’enzyme (Canilho et al.,
2013 ; Xiang et al., 2018). De Lima et al. (2018) ont réalisé la réaction d’estérification de
plusieurs molécules avec différents acides carboxyliques en utilisant des lipases de différentes
espèces immobilisées sur des billes acryliques par liaison covalente par l’intermédiaire d’un
groupement époxy et sur de la silice contenant un groupement octyle pour l’immobilisation de
la lipase de Pseudomonas fluorescens par interaction hydrophobe. Toutes les enzymes
immobilisées présentaient une très bonne activité enzymatiques ainsi qu’une excellente stabilité
au recyclage sauf dans le cas de la lipase de Pseudomonas fluorescens où une perte d’activité
entre les cycles a été observée lors de l’immobilisation par liaison covalente et une bonne
stabilité lors de l’immobilisation par des interactions hydrophobes (De Lima et al., 2018).
D’autres auteurs ont décrit une perte très importante des performances des enzymes suite à la
formation de liaisons covalentes qui peut engendrer une dénaturation de la structure. C’est le
cas de l’étude décrite par Dettori et al. (2018) qui ont réalisé l’immobilisation de l’extrait brut
des aminoacylases de Streptomyces ambofaciens sur des SBA-15 par physisorption et par
chimisorption en utilisant du glutaraldéhyde et du glymo. Une perte quasi-totale de l’activité a
été observée suite à la chimisorption contrairement à la physisorption ou 30 % d’activité a été
retrouvée (Dettori et al., 2018).
70
1.4.3.3 Encapsulation
Il s’agit de piéger l’enzyme à l’intérieur des pores du support. Plusieurs stratégies peuvent être
utilisées pour y parvenir. En général, l’enzyme est initialement immobilisée sur le support
poreux par adsorption physique (physisorption) puis piégée à l’intérieur de la structure par ajout
d’un film externe poreux (Ishizuka et al., 2018). Cela permet une augmentation importante du
taux d’immobilisation avec de meilleures performances et une meilleure stabilité aux conditions
réactionnelles et au recyclage (Wang, Caruso, 2005). Cependant, des limitations de transfert de
matière peuvent être observées dans le cas d’une trop faible porosité de la couche externe et la
présence d’une quantité importante d’enzyme pouvant obstruer les pores. Blin et al. (2014) ont
développé ce genre de méthode d’immobilisation par l’utilisation de double émulsion afin
d’encapsuler l’enzyme et de former un matériau final avec une macroporosité contenant
l’enzyme et une mésoporosité permettant l’accès du substrat. Les performances de la lipase de
Mucor miehei immobilisée dans ces derniers ont été comparées à celles de la même lipase
immobilisée par adsorption sur les supports mésoporeux SBA-15 présentant un diamètre de
pores similaire. Le système à double émulsion présentait une stabilité au cours du recyclage
bien meilleure que celle des enzymes immobilisée sur les SBA-15 (Blin et al., 2014a). Han et
al. (2006) ont réalisé l’immobilisation de CALB en la piégeant dans un support à base de silice
(MCF ; mesocellular foam) sur lequel une chaine carbonée (C8) a été greffée afin de la rendre
plus hydrophobe. Le support était caractérisé par des pores interconnectés d’un diamètre interne
d’environ 25 nm et d’un diamètre de la fenêtre d’entrée inter-pores d’environ 14,5 nm ce qui a
permis d’améliorer le transfert du substrat vers l’enzyme. Les résultats de l’activité
enzymatique ont montré que l’enzyme immobilisée sur ces supports présentait une activité et
une stabilité thermique (y compris au cours du recyclage) supérieures à celle de la CALB
commerciale (Novozyme 435) (Han et al., 2006a). Afin d’augmenter le taux d’encapsulation
des molécules telles que des tensioactifs et du polyamide peuvent être ajoutées lors de
l’immobilisation (El-Batal et al., 2005 ; Escobar et al., 2013 ; 2018). Escobar et al. (2018) ont
rajouté du polyethylenimine lors de l’immobilisation de la lipase de Thermomyces lanuginosus
par encapsulation. Cela a conduit, d’une part, à une augmentation du taux d’immobilisation et,
d’autre part, à une meilleure activité et stabilité thermique de l’enzyme (Escobar et al., 2018).
Afin d’augmenter la stabilité des enzymes encapsulées, certains auteurs ont réalisé une
immobilisation par chimisorption sur les supports avant encapsulation permettant de maintenir
une bonne activité catalytique après rigidification des enzymes à l’intérieur du support (Xie,
Zang, 2017).
71
1.4.3.4 Immobilisation par réticulation

Le principe de cette méthode est la précipitation des protéines par la formation d’un pontage
par liaison covalente entre les enzymes en l’absence de matériau (Cross linking enzyme
aggregates ou CLEAs). Le glutaraldéhyde est le plus utilisé pour la formation de ces liaisons
covalentes. Certains auteurs ont utilisé cette méthode pour la stabilisation de l’activité des
enzymes telles que les acylases (Sheldon, 2007 ; Vaidya et al., 2012). Par ailleurs, afin d’éviter
le lessivage d’enzymes immobilisées sur des supports poreux, une agrégation contrôlée de ces
dernières par formation de CLEA peut présenter un intérêt. Dans ce cas, les enzymes sont
initialement immobilisées sur le support par physisorption ou chimisorption puis l’agrégation
des enzymes est réalisée par ajout d’agents bifonctionnel tels que le glutaraldéhyde ou le
polyéthylène glycol (Basak et al., 2015). Cela conduit à la formation d’amas d’enzymes de taille
importante à l’intérieur des pores améliorant ainsi le phénomène de transfert de substrats grâce
aux macropores et réduisant la désorption des enzymes retenues par réticulation (Jung et al.,
2009). Cette méthode peut aussi être utilisée suite à l’immobilisation à la surface de matériaux
non-poreux (cas des nanotubes de carbone) permettant une amélioration des performances
enzymatiques (Wee et al., 2019). Récemment, Ayakar et al., ont immobilisé la PGA sur des
supports silicatés mésocellulaires (MCF) par physi- et chimisorption et avec et sans réticulation
et/ou encapsulation. Les meilleurs résultats ont été obtenus lors de l’immobilisation des
enzymes par chimisorption suivie d’une réticulation avec et sans encapsulation avec 97,8 % de
taux d’immobilisation et une activité plus de deux fois supérieure à l’enzyme immobilisée par
adsorption et environ 1,5 fois supérieure à celle de l’enzyme immobilisée par chimisorption.
Après 4 recyclages des supports, une rétention de l’activité hydrolytique de la pénicilline G de
plus de 91% a été observée avec les enzymes immobilisées par chimisorption et réticulation
(environ 95% avec encapsulation) contre 38 et 66% pour les enzymes immobilisées par physi-
et chimisorption (Ayakar, Yadav, 2019).
Cependant, une perte d’activité peut être observée en présence d’une concentration trop
importante de glutaraldéhyde en raison d’une moindre flexibilité de l’enzyme ou bien de la
formation de liaisons covalentes entre les résidus d’acides aminés de la cavité catalytique
induisant un changement conformationnel (Langen et al., 2002 ; López-Gallego et al., 2013).
1.5 Approches utilisées pour l’intensification de procédés enzymatiques

L’intensification des procédés est une discipline qui a été définie pour la première fois par
Stankiewicz et Moulijn en 2000 et qui consiste au développement de méthodes et de dispositifs
innovants, qui, en comparaison avec l’existant, offrent une amélioration significative de la
72
qualité de production et une diminution de la consommation d’énergie, de la production de

déchets, et du rapport taille/capacité. Ce dernier point implique une maximisation de la
production par unité de taille de réacteur et par unité de temps (Stankiewicz, Moulijn, 2000).
1.5.1 Le type de réacteur

L’intensification des réactions enzymatiques est une étape cruciale afin d’envisager une montée
en échelle d’un procédé pour assurer sa compétitivité par rapport au procédé existant en
augmentant la productivité et en réduisant le plus possible le temps et le coût de mise en œuvre
(Sheldon, Woodley, 2018a). A cet effet, plusieurs stratégies peuvent être envisagées telles que
la modification de l’enzyme par ingénierie enzymatique et/ou l’optimisation des réacteurs et
des conditions opératoires. Afin d’accroître les performances catalytiques, une première
approche peut-être la sélection et/ou l’amélioration des enzymes utilisées. Le développement
de l’ingénierie moléculaire en particulier celle des protéines a vu une évolution importante ces
dernières années, permettant la production d’enzymes avec des performances et résistances
exceptionnelles ouvrant les portes au développement industriel de procédés enzymatiques (Iyer,
Ananthanarayan, 2008 ; Bommarius et al., 2011 ; Otte, Hauer, 2015 ; Goldsmith, Tawfik,
2017 ; Bernal, Rodríguez, et al., 2018). La deuxième étape est la sélection et le développement
du procédé de production le plus adapté permettant d’atteindre une productivité assez
importante pour permettre une montée en échelle. L’ingénierie des réacteurs est une filière qui
touche tous les domaines et a pour but de développer des réacteurs intensifiés, dont des réacteurs
microstructurés, en jouant sur le mode de mise en œuvre (batch/continu, mode de chauffage,
mode d’agitation et de mélange, couplage production extraction, …) et en se basant sur les
principes de la dynamique des fluides.
L’exemple le plus répandu de développement de procédés efficaces est l’utilisation des
enzymes en continu dans des réacteurs à lit fixe après leur immobilisation sur un support ou sur
une membrane, permettant l’obtention du produit pur en sortie du réacteur et de maintenir
l’enzyme dans le réacteur (Machado et al., 2017). L’utilisation des réacteurs à lit fixe (RLF)
permet de s’affranchir des limitations de transfert du substrat vers l’enzyme en forçant le
passage du mélange réactionnel dans les pores du support, ce qui permet une augmentation du
taux de conversion et l’accélération de la réaction (Kamble, Yadav, 2017 ; Salvi et al., 2018).
De plus, l’optimisation des conditions réactionnelles peut être réalisée en continu et l’enzyme
peut être recyclée très facilement sur ce type de système, ce qui rend cette technologie très
attractive pour des applications industrielles (Thompson et al., 2019). L’absence ou le faible
lessivage de l’enzyme est une condition d’utilisation de cette méthode. Cette technologie
73
permet aussi l’utilisation ou l’association de plusieurs enzymes, ouvrant la possibilité de réaliser

des réactions en cascades d’une efficacité remarquable (Satyawali et al., 2017).
Les réacteurs enzymatiques à lit « fixe » rotatif (i.e. SpinChem®, Suède) sont des réacteurs
similaires au RLF qui permettent d’étudier rapidement les performances d’une enzyme
immobilisée en mode batch mais avec une maximisation des transferts de matière. Dans ces
réacteurs thermostatés, plusieurs compartiments remplis d’enzyme immobilisée sont mis dans
une enceinte contenant le mélange de substrat. Lors de la réaction, les compartiments tournent
à une vitesse donnée plaquant le catalyseur sur la paroi (grille) par effet centrifuge, ce qui
permet d’éviter les chocs entre particules de support d’immobilisation (figure 1.25) (Mallin et
al., 2013 ; Szymańska et al., 2017). Cela permet également d’augmenter le coefficient de
transfert de matière et ainsi d’améliorer les performances des enzymes immobilisées (Sheldon,
Pereira, 2017).
Figure 1.25 : représentation schématique du système de type SpinChem®

L’association de l’utilisation des ultrasons et de l’immobilisation des enzymes est une méthode
qui a montré une très bonne efficacité. Les ultrasons provoquent des vibrations à la surface du
support ce qui permet de décrocher l’eau présente à la surface du biocatalyseur permettant de
contrôler la quantité d’eau disponible pour l’enzyme en retirant le surplus (eau libre) produit
lors de la réaction d’acylation. Cela permet une augmentation de l’activité et de la vitesse de la
réaction des lipases mises en solvant non-aqueux (Yu et al., 2010 ; Alves et al., 2014 ; Badgujar,
Bhanage, 2015 ; Paludo et al., 2015 ; Balen et al., 2015 ; Khan et al., 2015).
La qualité du mélange réactionnel est un paramètre très important lors des réactions
enzymatiques afin de contrôler le transfert du substrat vers l’enzyme. Dans les réacteurs agités,
l’augmentation de la vitesse d’agitation est souvent accompagnée d’une amélioration de la
vitesse initiale de la réaction due à un meilleur transfert externe et interne (Wojtusik et al.,
2016). En revanche, ceci peut s’accompagner d’un effet de cisaillement très important qui peut
engendrer une perte de stabilité enzymatique et une détérioration du matériau dans le cas d’une
catalyse hétérogène avec des enzymes supportées (Noraida et al., 2015). Afin d’améliorer le
74
transfert de matière et de chaleur en augmentant la surface d’échange entre la paroi du réacteur

et le milieu réactionnel et entre ce dernier et l’enzyme, plusieurs types de réacteurs intensifiés
microstructurés basés sur une configuration externe et/ou une structuration interne particulière
(mélangeur statique, …) ont vu le jour (Šalić, Zelić, 2018). Ces derniers sont structurés de façon
à optimiser le mélange selon les objectifs de mise en œuvre (formation de microémulsion,
système biphasique, …), le régime d’écoulement (laminaire ou turbulant ou chaotique) et la
qualité du transfert de chaleur voulu (figure 1.26). Le développement de ces réacteurs nécessite
une optimisation des conditions de mise en œuvre, en particulier des flux de substrat qui peuvent
influencer de façon considérable les taux de conversion si le temps de contact enzyme / substrat
n’est pas maîtrisé (Tišma et al., 2009 ; Marques et al., 2010). L’optimisation de la structure
interne du mélangeur statique en modifiant les dimensions de ce dernier (i.e. élargissement d’un
côté et rétrécissement de l’autre (figure 1.26.C)), en ajoutant des obstacles (figure 1.26.D) et en
contrôlant le flux et la trajectoire d’entrée et de sortie du liquide dans ces structures, permet
d’améliorer considérablement les transferts (de matière et de chaleur) en augmentant les
collisions au sein du liquide (Znidarsic-Plazl, 2014 ; Solsona et al., 2019). Plusieurs sociétés de
développement et production de réacteurs intensifiés sont présentes sur le marché telles que
Corning, Chart Industries, NiTech Solutions, AM Technology. Cela a permis le développement
et la commercialisation de plusieurs types de réacteurs/échangeurs intensifié plus ou moins
facilement extrapolables à l’échelle industrielle tels que le réacteur Corning Advanced Flow
qui a présenté de très bonnes performances lors de réactions enzymatiques (figure 1.26.D et
tableau 1.6) (Zhang et al., 2017). Ce réacteur se présente sous forme d’un échangeur de chaleur
dans lequel le liquide de régulation de la température passe entre des plaques présentant à
l’intérieur des structures en forme de cœur, avec un obstacle permettant la collision du mélange
de liquide et augmentant ainsi la qualité de ce mélange et le transfert de matière vers le site actif
de l’enzyme. D’autres systèmes plus simples ont été décrits (i.e. réacteur Shimtec® de Chart
Industries). D’autres réacteurs sont sous forme tubulaire présentant des chicanes qui rentrent en
collision avec le liquide, provoquant des oscillations du mélange en plus de l’impact avec le
flux de liquide apporté. Les systèmes basés sur ce principe (i.e. réacteur Continuous Oscillatory
BaffledTM ou COBRTM de NiTech Solutions) ont montré de très bonnes efficacités lors de
l’optimisation de réactions enzymatiques (Elgue et al., 2013). Dans ces réacteurs intensifiés,
l’enzyme peut être utilisée libre, immobilisée dans le microréacteur ou sur un support selon
l’objectif du procédé (Tudorache et al., 2011 ; Čech et al., 2012 ; Sudar et al., 2013 ; Wei et al.,
2018). Les deux dernières catégories permettent la récupération du produit et des substrats
75
résiduels uniquement, réduisant le coût lié à l’élimination de l’enzyme. Plusieurs exemples de

configurations développées pour les réactions enzymatiques sont présentés dans le tableau 1.6.
A B
Figure 1.26 : A. représentation schématique de quelques configuration internes de mélangeurs

stationnaires : (a) structures simples de mise en contact, (b) structure multi-laminaire, (c)
structure courbée ou sous forme d’hélicoïdale, (d) structures en split-recombiné et (e) structure
statique périodique (Zhang et al., 2017), B. configuration des microréacteurs simples, C.
réacteur microstructuré sous forme de goutte optimisé par Mielke et al., 2018, D. réacteur
microstructuré commercialisé sous le nom de Corning Advanced Flow Reactor (a) vue
d’ensemble du réacteur avec entré des substrats et enzymes en solution (point rouge), sortie du
réacteur (point vert) et entré et sortie de l’échangeur de chaleur (point bleu), (b) structure du
mélangeur statique sous forme de cœur, (c) schéma d’une coupe transversale du réacteur
(Nieves-Remacha et al., 2012)
76
Tableau 1-6 : exemples d’utilisation de réacteurs intensifiés

Enzyme Réaction et milieu Technologie Remarque Réf
Synthèse de Système Corning AFR™ Low Flow (LF) Augmentation de la surface d’échange
l’isoamyle-acétate enzyme / substrat due à la formation (Novak
par estérification en d’émulsion permettant une augmentation et al.,
milieu biphasique de la productivité de plus de 6,5 fois 2016)
eau / n-heptane
Comparaison de 3 réacteurs microstructurés :
Le système Corning advanced‐flowTM reactor (AFR ) (figure 1.26.B)
Le système Shimtec®
Lipase B de Candida antarctica (CALB)
reactor de Chart Industries Les 3 premiers réacteurs présentaient de

(Elgue et
bonnes performances.
al.,
Le transfert de matière était meilleur dans
Le système Continuous 2013)
Synthèse de le système Nitech COBR, qui fonctionne
l’éthyle-oléate par Oscillatory Baffled
Enzyme libre
par oscillation du liquide au niveau des

estérification en ReactorTM (COBRTM ) de compartiments, que dans les deux autres
milieu biphasique NiTech Solutions permettant de meilleurs taux de
cyclohexane / conversion.
tampon phosphate Comparaison des 3 réacteurs précédents avec le réacteur multiétage Le système AM Technology Coflore®
AM Technology Coflore® présentait les plus faibles performances
liées au système d’injection qui n’était
pas adapté au milieu biphasique. (Elgue et
al.,
2014)
Synthèse de Réacteur microstructuré sous forme de  Augmentation de la productivité de 3 fois

l’isoamyle-acétate par rapport au batch agité due à la
(Pohar et
par estérification en formation d’émulsion en continu sous
al.,
milieu biphasique forme de microchaine qui augmente la
2009)
liquide ionique / n- surface d’échange enzyme / substrat et
heptane améliore le transfert de matière
77
Tableau 1.6 (suite) : exemples d’utilisation de réacteurs intensifiés
Enzyme Réaction et milieu Technologie Remarque Réf

Synthèse de Réacteur microstructuré sous forme de Y Ecoulement laminaire des
(Žnidaršič-
Enzyme libre
l’isoamyle-acétate par deux fluides

Séparation facile des deux Plazl,
CALB estérification en milieu Plazl,
biphasique eau / n- phases en sortie
Accélération très importante 2009)
hexane
de la réaction
Alcool dé- Réacteur microstructuré contenant des enzymes et/ou des
Oxydation de
hydrogénase levures immobilisées par liaisons covalentes sur les parois du (Šalić et
l’hexanol en hexanal Production en continu sans
(ADH) et réacteur al., 2013)
puis acide hexanoique coproduit à éliminer
levures
dans de l’hexane Maintien de bonnes
productrices
performances du catalyseur
Biotransformation de libre (Stojkovič
Fumarase l’acide fumarique en et al.,
acide malique 2011)
Enzyme immobilisée
Microréacteur capillaire formé

de fibres microstructurées sur Production en continu sans
lesquelles CALB est coproduit à éliminer (Mugo,
Synthèse du butyle-
immobilisée par liaisons 99% de conversion à un temps Ayton,
CALB laurate dans du n-
covalentes de séjour de moins de 38 s 2010)
hexane et n-heptane
Système recyclable au moins
7 fois
Enzyme immobilisée dans la

structure du filtre
Lipase de Transestérification de (Machsun
Pseudomonas la trioléine avec du Activité 3 fois supérieure à et al.,
fluorescens méthanol celle de l’enzyme libre 2010)
78
1.5.2 Procédés assistés par micro-ondes
La régulation de la température lors des réactions est l’un des paramètres les plus influents sur
les performances catalytiques (taux et vitesse de conversion) et sur la structure de l’enzyme
(risque de dénaturation à des températures inappropriées). Plusieurs types de chauffage peuvent
être utilisés dont le chauffage conventionnel, réalisé par le transfert d’énergie par conduction
d’une source thermique (plaque chauffante, enveloppe de chauffage, résistance, …) vers la
paroi du contenant du milieu réactionnel puis par convection de chaleur de la paroi vers le
milieu. Dans ce cas, une température hétérogène peut être observée entre le mélange réactionnel
au contact de la paroi et celui au centre du tube causant une activité différente de l’enzyme et
induisant une réduction de l’activité et de la vitesse de la réaction. L’augmentation de l’agitation
peut permettre un meilleur transfert mais au-delà d’une certaine vitesse d’agitation, il y a une
perte d’activité soit par effet de cisaillement induisant une dénaturation rapide ou en réduisant
le transfert interne de substrats (de la surface de l’enzyme vers son site actif). Le chauffage non
conventionnel consiste à utiliser d’autres sources d’énergie et d’autres méthodes d’agitation
moléculaire, c’est le cas du chauffage par les micro-ondes. Les micro-ondes sont des
oscillations d’énergie électromagnétique avec des fréquences entre 300 MHz - 300 GHz. Ces
dernières engendrent une agitation rapide des molécules ayant un moment dipolaire qui
absorbent l’énergie apportée puis la réémettent sous forme de chaleur localisée (au niveau de
ces molécules) qui se disperse par la suite dans le milieu, c’est le principe du chauffage
diélectrique (Bansode, Rathod, 2018). Par exemple, une fréquence d’irradiation de 2,5 GHz
conduit à environ 2,5 milliards de cycles par seconde conduisant à de très importantes frictions
et collisions entre les molécules permettant ainsi une très rapide montée de la température
interne. Ceci conduit à la réduction de l’énergie d’activation et donc à une accélération des
réactions dans le cas des réactions enzymatiques (Réjasse et al., 2006 ; Bhavsar, Yadav, 2018).
L’utilisation de cette technologie lors des réactions enzymatiques dans des solvants organiques
ou dans des solvants verts tels que l’eau, les liquides ioniques et les solvants eutectiques a déjà
été bien décrite dans la littérature (tableau1.7). Au-delà de l’amélioration de l’activité et surtout
de l’accélération de la vitesse initiale de la réaction, un bon maintien de la stabilité des enzymes
au recyclage, surtout après immobilisation a été observé (Ziaullah, Rupasinghe, 2013 ; Li et al.,
2016 ; Lei Wang et al., 2018).
79
Tableau 1-7 : exemple d’utilisation des micro-ondes et influence de l’utilisation des réacteurs à micro-ondes sur les performances enzymatiques
Enzyme Milieu Réaction Conditions Remarque Réf
95% conversion (après 120 min)
Estérification : Puissance : 700 W (Bansode,
Sans Energie d’activation plus faible que celle avec un chauffage traditionnel
iCALB synthèse isoamyle Sans agitation Rathod,
solvant et par ultrasons
butyrate T°C : 60°C 2018)
Bonne stabilité au recyclage de l’enzyme
Fréquence :
Estérification : (Bhavsar,
Sans 2455 MHz
iCALB synthèse n-butyl 92% conversion (après 8 h) Yadav,
solvant Puissance : 50 W
propionate 2018)
T°C : 60°C
Tert-butyl Transestérification : Puissance : 400 (Zhi
Plusieurs Activité plus de 5 fois plus importante avec le micro-onde qu’avec
methyl synthèse 4′-O- W Wang et
lipases chauffage conventionnel
ether acetyl- resvératrol T°C : 35°C al., 2018)
Résolution Activité 3 fois plus importante avec le micro-onde qu’avec chauffage
Puissance :50 W (Gupta et
iCALB Toluène énantiomérique du conventionnel
al., 2017)
(R,S)-flurbiprofène Excellente stabilité des enzymes
Différentes
Plusieurs Tampon (Chen et
H trioléine températures et Même activité avec le chauffage micro-onde et conventionnel
lipases Tris–HCl al., 2016)
puissances
Estérification : (Bukhari
Puissance : 200
iCALB Toluène synthèse méthyl- Accélération de la vitesse de la réaction et al.,
W
oléate 2014)
Estérase Estérification Puissance : 480 Activité et énantiosélectivité 21,9 et 1,4 fois, respectivement, plus
(Yang et
d’Aeropyrum n-heptane enantiomérique de W importantes avec le micro-onde qu’avec chauffage conventionnel
al., 2013)
pernix K1 l’ibuprofène T°C : 50°C Stabilité de l’activité après 5 recyclages
Plusieurs Transestérification Puissance : 480 Effet synergique de l’utilisation des liquides ioniques et de l’irradiation
(Yu et al.,
iCALB liquides du méthanol avec W avec les micro-ondes
2011)
ioniques de l’huile de soja T°C : 60°C Développement d’un procédé vert
Profil d’inactivation très différent de celui avec le chauffage
Alcoolyse : Différentes (Réjasse
conventionnel (profil linéaire en fonction de la température)
CALB Butanol synthèse butyl- températures et et al.,
Chauffage par micro-ondes : inactivation suivant un profil linéaire en
butyrate puissances 2006)
deux étapes dont une inactivation lente à T°C ˂ 90°C et rapide au-delà
80
CHAPITRE II : MATÉRIEL ET MÉTHODES
81
82
Chapitre II : Matériel et méthodes
2 Chapitre II : Matériels et méthodes

Étude expérimentale
2.1 Biocatalyseurs utilisés
Afin d’atteindre les objectifs de ce travail, deux familles d’enzymes ont été utilisées :
• Les hydrolases : la lipase B de Candida antarctica (CALB) qui est une triacylglycérol
acyl hydrolases (EC 3.1.1.3)
• Les acylases : les aminoacylases extraites d’une culture de Streptomyces ambofaciens
Pour CALB, Lipozyme 435®, produite par Novozyme Corporation et commercialisée par
Sigma, a été obtenue suite à l’immobilisation de la lipase B de Candida antarctica sur une
résine de méthacrylate divinylbenzène macroporeuse. Elle est commercialisée sous forme de
sphères blanches de diamètre compris entre 0,3 et 0,9 mm, avec une activité de 7000 PLU.g-1
(Propyl Laurate Synthesis) où une unité PLU correspond à la quantité d’enzyme qui permet la
transformation d’1 µmol d’acide laurique en laurate de propyle par minute en conditions
standards et équimolaires. Sa teneur en eau est de 1 à 2 % (p/p) et sa teneur en protéine
enzymatique est comprise entre 1 et 10 %.
CALB a aussi été utilisée sous forme libre, produite par Novozyme et commercialisée par
Sigma, dont la composition du milieu est fournie sur la fiche technique (tableau 2.1). Cette
dernière a été immobilisée sur différents supports. L’activité de l’eau (a W), des lipases
immobilisées commerciales et celles immobilisées lors de cette thèse, a été contrôlée en utilisant
la méthode des microclimats en utilisant une solution saturée d’acétate de potassium permettant
de maintenir l’aW au tour de 0,2. L’activité de l’eau a été vérifiée avec un aW-mètre Novasina
Lab-Master (Basel, Suisse).
Tableau 2-1 : Composition de la solution de CALB utilisée
Pour les aminoacylases, deux souches de Streptomyces ambofaciens ont été utilisées pour la
production des aminoacylases :
83
- Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 : souche sauvage obtenue à partir de

l’american type culture collection (ATCC);
- Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 ΔSAM23877_1485::scarΔSAM23877_

0977::scar correspondant à la souche sauvage dans laquelle les gènes codants pour
l’epsilon lysine acylase (ELA) et la pénicilline V acylase (PVA) ont été éliminés en
respectant la phase de lecture. Ces mutants doubles ont a été construits et utilisés lors
des travaux de Ferrari, 2014, en partenariat avec l’UMR 1128 DynAMic (Dynamique
des Génomes et Adaptation Microbienne).
Toutes les souches sont conservées sous forme de spores à -80°C dans une solution de 15-20%
de glycérol. Les deux souches ont été cultivées dans les mêmes conditions et l’extrait brut de
chaque souche a été obtenu suivant la même procédure.
2.1.1 Production des aminoacylases

La culture des S. ambofaciens à partir desquelles les aminoacylases sont extraites passe par
plusieurs étapes. La première est la germination des spores dans du milieu ICS pendant 48h, à
une température de 28°C, sous une agitation de 250 min-1. Pour cela, dans une fiole
d’Erlenmeyer de 250mL stérile, 100μL de spores sont ensemencés dans 40mL de milieu ICS.
Cette étape est suivie par une préculture de la suspension bactérienne obtenue par
l’ensemencement du milieu de préculture « Koreishi pH 6,5 » avec 10% (v/v) de la culture
précédente (germination). Cette préculture est mise en œuvre pendant 48h dans les mêmes
conditions de température et d’agitation que l’étape précédente permettant une croissance
bactérienne importante. L’étape finale consiste à la mise en culture des bactéries durant 7 jours,
à 28°C et 200rpm suite à l’ensemencement du milieu de culture « Koreishi » avec 3% (v/v) de
la préculture. C’est durant cette étape qu’il y a production des aminoacylases par S.
ambofaciens. Les compositions des différents milieux de cultures utilisés sont présentées dans
le tableau 2.2.
84
Tableau 2-2 Composition des milieux utilisés lors des différentes étapes de culture de S.
ambofaciens
Milieu Composition Concentration (g / L)
Saccharose 15
(NH4)SO4 10
NaCl 3
ICS (germination) KH2PO4 1
MgSO4, H20 0,2
CaCO2 1,25
Cornsteep 5
Glucose 10
Dextrines blanches 10
Koreishi (préculture ; pH 6,5) Extrait de levure 5
Hydrolysat de caséine 5
CaCO2 1
Extrait de viande 40
Amidon soluble 40
Koreishi (culture ; pH 7) Hydrolysat de caséine 20
MgSO4, H20 20
K2HPO4 2
2.1.2 Traitement des surnageants de culture

2.1.2.1 Lyse des cellules
Afin d’augmenter le rendement de récupération des protéines intra- et extracellulaires, une lyse
des cellules a été réalisée par l’utilisation d’un destructeur de cellule (Constant cell disruption
system). La lyse des cellules est réalisée par une succession de cycles de pression /
décompression. La suspension de culture de S. ambofaciens obtenue subit deux passages au
travers de l’appareil à 1500 bars. La séparation des débris cellulaires, résultants du surnageant
contenant les protéines d’intérêt, est effectuée par centrifugation à 8200 g, 4 °C pendant 15 min
(Avanti 30, Beckman).
2.1.2.2 Précipitation des protéines

La précipitation des protéines, présentes dans le surnageant, est réalisée par l'addition de sulfate
d'ammonium ((NH4)2SO4) à forte concentration qui cause une diminution de la quantité d'eau
disponible pour solvater les protéines et leur précipitation. La précipitation est mise en œuvre
en présence de (NH4)2SO4 à 60% de la saturation sous agitation pendant 2 heures à température
ambiante. Les protéines précipitées sont ensuite récupérées par centrifugation à 8200 g, à 4 °C,
pendant 20 min (Avanti 30, Beckman) puis resolubilisées dans du tampon Tris-HCl (25mM)
NaCl (50mM) à pH 8.
85
2.1.2.3 Diafiltration et concentration des protéines

L’extrait protéique obtenu, suite à la précipitation des protéines, est très riche en sulfate
d’ammonium, et la concentration en protéine est faible (environ 2 g/L). Pour éliminer la
présence des sels, il a été nécessaire de réaliser une étape de diafiltration et concentration de la
solution protéique. Ces étapes ont été réalisées en utilisant un système d’ultrafiltration
tangentielle sur un pilote Cogent® μScale (Millipore, Molsheim, France) équipé d’une cassette
formée d’un empilement de membranes planes en cellulose régénérée avec un seuil de coupure
de 10 kDa. Le but de la diafiltration est d’éliminer le maximum de sels dans le perméat, suivi
par un conductimètre, et de récupérer le maximum de protéines dans le retentât. Elle consiste à
maintenir constant le volume du retentat en ajoutant du tampon Tris-HCl (25mM) NaCl
(50mM) à pH 8. 4 diavolumes ont été réalisés (un diavolume = le volume récupéré dans le
perméat et le même que le volume de la solution initiale à dia-filtrer). La concentration de la
solution diafiltrée est réalisée en arrêtant l’apport en tampon pour le maintien du volume.
L’arrêt de la concentration est effectué lorsqu’il y a une fluctuation importante de la pression
transmembranaire (différence de pression entre l’entrée et la sortie de la membrane) et / ou
diminution importante du débit du perméat, signe d’un colmatage de la membrane.
Lors de la production de petits volumes (inférieur à 500 mL) d’enzymes la même procédure est
suivi (dia-filtration et concentration) en utilisant un petit système d’ultrafiltration tangentielle
qui se présente sous forme d’un tube Falcon® équipé d’une membrane en cellulose regénérée
de 10 kDa (système Amicon Ultra-15 ; Millipore, Billerica, MA, EtatsUnis). Elle est réalisée
par centrifugation d’un volume, de 0 à 15 mL maximums, de la solution à concentrer, déposé
dans le compartiment « rétentat », pendant 30 min à 5000 g à température ambiante (20°C).
2.1.3 Expression hétérologue des aminoacylases de S. ambofaciens chez

E. coli Origami B (DE3)
L’expression hétérologue des aminoacylases de S. ambofaciens a été réalisée en utilisant
comme hôte la souche d’E. coli Origami B (DE3), qui dérive d’un mutant lacZY d’E. coli BL21
(DE3). Les mutations qui sont présentes dans cette souche au niveau de la thiorédoxine
réductase (trx B) et des gènes de la glutathion réductase (gor) sont sélectionnables
respectivement sur kanamycine et tétracycline et permettent d’améliorer considérablement la
formation des ponts dissulfures dans le cytoplasme. La transformation est réalisé par
introduction par électroporation du plasmide pET-15b (figure 2.1) sur lequel les gènes codant
pour les aminoacylases de S. ambofaciens (Sam ELA, Sam PVA ou Sam AA) sont insérés (les
plasmides pET-15b/Sam ELA, pET-15b/ Sam PVA ou pET-15b/ Sam AA, respectivement). La
86
culture est réalisé dans le milieu Luria-Bertani (LB, Sigma-Aldrich) soit liquide ou gélosée par
addition d’agar-agar à 15 g/L. La sélection des souches transformés se fait dans du milieu LB
contenant 50 µg/mL de kanamycine, 12,5 µg/mL tétracycline et 100 µg/mL d’ampicilline.
Figure 2.1 : carte plasmidique de pET-15b avec ses principales caractéristiques

Initialement, une préculture d’une nuit à 37°C et 200 rpm des différentes souches transformées
ou pas (100 µL de cellules en suspension) a été réalisé dans tubes Falcon 15 mL contenant 6
mL du milieu LB avec les 3 antibiotiques (le milieu de culture avec E. coli Origami B (DE3)
non transformée ne contenait pas d’ampicilline). Une fois la densité optique (DO 600 nm) a été
proche de 0,05, la culture est lancée en inoculant les souches dans 250 mL de milieu LB
contenant de l’ampicilline puis incubées à 37°C et 200 rpm jusqu’à une DO entre 0,6 et 0,9.
L’expression protéique a été ensuite initiée par ajout de 0,1 mM d’IPTG et les cultures sont
incubées directement à 16°C. Le suivie de la croissance cellulaire a été réalisé en mesurant la
DO 600 nm des prélèvements (1 mL) de milieu de culture après induction et jusqu’à l’arrêt de
culture (18h – 20h après induction). Les prélèvements ont été conservés (-20°C) pour l’analyse
ultérieure des protéines. Les cellules sont récupérées après la culture par centrifugation (8000
rpm, 4°C, 10 min ; Centrifuge 5804 R, Eppendorf) puis le culot été lavé avec du tampon Tris
HCl 25mM, NaCl 50 mM, pH 8 (50 mL), centrifugé dans les mêmes conditions et suspendu
dans 25 mL du même tampon.
Les cellules en suspensions ont été lysées en utilisant la presse de French (1 passage à 2 Kbar),
et les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation (11000 rpm, 20 min, 4°C ; Centrifuge
5804 R, Eppendorf). Les protéines solubles présentent dans le surnageant ont été concentrées
10X par ultrafiltration dans des systèmes de filtration Amicon Ultra-15 10KDa (Millipore) en
réalisant des séries de centrifugation (4000g, 4°C, 15 min,). La concentration des protéines de
87
l’extrait brut a été déterminée par la méthode Bradford et BCA (BiCinchoninic acid Assay) qui
seront présenté ultérieurement. L’activité spécifique et la régiosélectivité des protéines de
l’extrait brute des souches transformées ou pas a été déterminée sur la base de l’activité
hydrolytique du N-α/ε- acétyl-L-lysine en utilisant de 100 à 500 µL de fraction protéique. La
réaction d’hydrolyse mise en œuvre et la méthode de quantification du produit de la réaction
seront présentées ultérieurement.
La purification des protéines recombinantes a été réalisée à partir de l’extrait protéique
concentré issu de la culture d’E. coli Origami B (DE3) transformé avec le plasmide pET-15b /
SamAA en utilisant la chromatographie d’affinité aux ions métalliques immobilisés (IMAC).
La colonne (HisTrap Excel ; GE healthcare) contenant le Nickel (Ni2+) immobilisé sur la phase
stationnaire permettant la rétention de la queue poly-histidine (étiquette his-6) ajoutée à la
protéine recombinante SamAA. L’équilibration de la colonne, le lavage et l’élution ont été
réalisés avec du tampon Tris HCl 25 mM, NaCl 50 mM, pH 8 en présence d’imidazole à
différentes concentrations (20 mM, 80 mM, 160 mM et 250 mM). La concentration et
l’élimination de l’imidazole présent dans les fractions éluées ont été effectuées par
ultrafiltration avec le système Amicon Ultra-15 (4000g, 4°C, 15 min). Les protéines ont été
précipitées dans de l’acétone 80% (-20 °C, 60 min) puis centrifugées (10000 rpm, 0 °C, 20 min)
et le culot a été séché à l’azote gazeux avant de réaliser l’analyse des protéines par SDS-PAGE.
Les protéines issues des différentes transformations ont été analysées par électrophorèse sur gel
de polyacrylamide en présence de dodécyl-sulfate de sodium (SDS-PAGE), par migration
verticale. La composition des gels, tampons et solutions utilisées sont décrites dans le tableau
2.3.
Les échantillons sont standardisés en fonction de la DO600nm de la culture bactérienne, selon
DO600nm
la formule suivante Vtampon dénaturation (µL) = avant dénaturation à 100°C
0,6 ×20
pendant 10 min. 15 µL du marqueur de taille, et 25 µL de chaque échantillon ont été déposés

dans les puits. La migration a été effectuée à 120 V constant pendant 1h 30min (Mini-
PROTEAN II, Bio-Rad) puis les gels ont été placés dans la solution de révélation sous agitation,
pendant une nuit. La décoloration a été réalisée avec une solution d’acide acétique/ méthanol/
eau (10/40/50, v/v/v). Les gels ont été stockés dans une solution aqueuse à 5% (v/v) d’acide
acétique.
88
Tableau 2-3 : Composition des gels et solutions utilisés pour les SDS-PAGE
Constituants Quantité
Gel de séparation à 12,5% d’acrylamide Solution d’acrylamide 4,15 mL
Eau distillée 3,25 mL
Tampon Tris HCl pH 8,8 2,5 mL
Solution SDS à 10% 100 µL
Persulfate d’ammonium 10% 50 µL
TEMED 5 µL
Gel de concentration à 4% d’acrylamide Eau distillée 6,1 mL
Solution d’acrylamide 1,3 mL
Solution SDS à 10% 100 µL
Persulfate d’ammonium 10% 50 µL
TEMED 10 µL
Tampon de dénaturation (Laemmli) Eau distillée 3,55 mL
Glycérol 2,5 mL
Solution SDS à 10 % 2 mL
Bleu de bromophénol 1 mg
β-mercaptoéthanol 500 µL
Tampon de migration pH 8,3 Tris base 3 g.L-1
Glycine 14,4 g.L-1
SDS 1 g.L-1
Solution de révélation Méthanol 50 %
Acide acétique 10 %
Eau distillée 40 %
Coomassie R-250 1 g.L-1
2.2 Immobilisation des aminoacylases de S. ambofaciens et de CALB
L’évaluation des performances d’enzymes immobilisées sur différents supports poreux à base
de silice, développés en partenariat avec le Laboratoire Lorrain de Chimie Moléculaire (L2CM)
de Nancy du Centre de Recherche Paul Pascal (CRPP) et la collaboration de l’Institut Jean
Lamour (IJL), pour le développement de supports à base de carbone, entre dans les prorogatifs
de la tache 1 du projet ANR ISEAPIM3 (ANR-15-CE07-0023) : « Intensified & Sustainable
Enzymatic Acylation Processes on Innovative Macroporous / Mesoporous Materials ».
L’objectif principal est de développer un support le plus compétitif possible au support
commercial pour CALB et d’immobiliser les aminoacylases produites par S. ambofaciens. Pour
y parvenir, des supports non poreux carbonés (nanotubes de carbone) et poreux siliceux de
différentes porosités, mésoporeux (SBA15), méso-macroporeux et macroporeux (siHIPE) ont
été utilisés pour l’immobilisation par physisorption ou par chimisorption en utilisant différents
greffons. Des supports à base de carbone ont aussi été produits et fonctionnalisés par le
89
laboratoire de l’IJL et utilisés pour l’immobilisation des lipases par physisorption et

chimisorption. La méthodologie est décrite dans l’article « Non-covalent and covalent
immobilization of Candida antarctica Lipase B on chemically modified multiwalled carbon
nanotubes for a green acylation process in supercritical CO2 »
2.2.1 Synthèse des matériaux à base de silice

Les SBA15 (Santa Barbara Amorphous 15) et les supports méso-macroporeux ont été produits
en collaboration avec le laboratoire L2CM. Les SBA15 ont été synthétisés suivant un procédé
sol-gel (ou solution-gélification) en pH acide (acidifiés avec du HCl 1M) en présence du P123
(Poly(éthylène glycol)-block-poly(propylène glycol)-block-poly(éthylène glycol)) comme
tensioactif structurant et du tétraméthylorthosilicate (TMOS) comme précurseur de la silice. Le
mélange est mis sous agitation à 40 °C pendant 24 h puis à 100 °C pendant 48 h. Dans ces
conditions, il y a hydrolyse et polycondensation du précurseur TMOS en dehors de micelles
formées par le P123. Ensuite, des lavages successifs à l’éthanol sont réalisés afin d’éliminer le
tensioactif et libérer la porosité de la silice.
Les supports siliceux méso-macroporeux (MMS) ont été synthétisés suivant la démarche décrite
par Blin et al., (2006). Ils sont fabriqués à partir d’une nano-émulsion formée en mélangeant
des surfactants fluorés préparés dans de l’eau à pH proche de 0 et à 40°C avec du
perfluorodecaline comme phase huileuse sous agitation. Après une nuit de repos, une quantité
de TMOS (1 mole / 0,5 mole du surfactant) est ajoutée et le mélange est mis sous agitation à
40°C pendant 1 h. Un traitement hydrothermal est ensuite effectué dans un autoclave à 100°C
pendant 24 h. Le produit final est récupéré après extraction du surfactant avec de l’éthanol dans
un Soxhlet pendant 48h, suivi d’un séchage à température ambiante pendant 24 h.
Les supports macroporeux (SiHIPE) ont été produits par le CRPP suivant la méthode décrite
par Backov, (2012). Ils sont synthétisés à partir d’une émulsion huile (Dodécane) dans une
phase aqueuse formée de tétraethoxysilane (TEOS) préparée dans une solution de bromure de
tétra-décyl-triméthyl-ammonium (TTAB) en condition acide. La polycondensation du squelette
inorganique est réalisée en laissant vieillir pendant une semaine, puis quatre jours de rinçage
avec un mélange tétrahydrofurane / acétone (50/50 v/v) pour extraire la phase huileuse présente
dans le matériau.
2.2.2 Fonctionnalisation des matériaux

Lors de l’étude de l’influence du taux d’aminopropyltriéthoxysilane (APTES) sur l’activité et
la stabilité des aminoacylases de S. ambofaciens par physisorption, les supports SBA15 et MMS
90
synthétisés ont été fonctionnalisés en faisant varier la proportion molaire d’APTES à celle des
supports. Il est possible d’obtenir plusieurs taux de fonctionnalisation des groupements
organiques dans la silice. Celui-ci est calculé selon la formule : 𝜏 = nombre de moles APTES x
100 / (nombre de moles APTES + nombre de moles de silice) sachant que la masse molaire de
l’APTES est de 221 g / mole et celle de la silice (SiO2) est de 60 g / mole. La fonctionnalisation
est réalisée dans du toluène (50 mL / g de support) et mise sous agitation à 110°C pendant une
nuit. Le mélange est ensuite filtré et le support récupéré et lavé deux fois avec du toluène puis
de l’éthanol avec le même volume du mélange filtré à chaque lavage.
Les lipases ont été aussi immobilisées par physisorption et chimisorption sur des SBA15. La
fabrication du support et l’immobilisation ont été réalisées par nos partenaires au L2CM.
L’immobilisation par physisorption a été effectuée sur les SBA15 fonctionnalisés avec du
triéthoxy(phényl)silane à 5% molaire. L’immobilisation par chimisorption sur les SBA15 a été
réalisée en utilisant plusieurs groupements organiques permettant la formation de liaisons
covalentes entre le support et l’enzyme. Les supports ont été fonctionnalisés avec du
glutaraldéhyde, de l’isocyanate et du glymo (3-glycidyloxypropyl-triméthoxysilane). Afin de
pouvoir greffer ces groupements, une pré-fonctionnalisation avec de APTES est réalisée. En
générale, lors de l’immobilisation, il y a formation d’une liaison imine avec une amine libre
présente à la surface de l’enzyme en particulier celui de la lysine. Le taux de fonctionnalisation
du groupement organique dépend du taux de fonctionnalisation initiale avec l’APTES. Les
supports finaux qui serviront à l’immobilisation sont obtenus en mettant en contact le
groupement organique avec le support dans un tampon Tris (tris-hydroxy-méthyl-amino-
méthane).
Pour les supports macroporeux, la fonctionnalisation s’effectue par imprégnation, à température

ambiante, de la solution contenant le groupement organique dans du chloroforme, pendant 3
jours, suivi d’un rinçage avec du chloroforme, de l’acétone puis de l’eau durant 3 jours. Ceci
permet l’élimination des résidus du précurseurs TEOS (Backov, 2012b).
2.2.3 Immobilisation des enzymes

Avant l’immobilisation des lipases, la solution commerciale a été standardisée afin d’éliminer
les conservateurs qui peuvent perturber l’immobilisation. Cette dernière a été diluée trois fois
afin de réduire la viscosité puis filtrée dans des tubes d’ultrafiltration (Amicon), de 10 kDa, en
réalisant une centrifugation pendant 40 min à 4000 g. Le volume, récupéré dans le rétentat, est
91
dilué par 10 dans du tampon Tris puis centrifugé pendant 20 min suivant les conditions
précédentes. A la fin, le concentrât protéique est repris dans le tampon d’immobilisation.
L’immobilisation sur les SBA15 et les MMS a été réalisée en mettant en contact les enzymes
avec les différents supports dans un tampon TRIS-HCl 25 mM, NaCl 50 mM (pH8).
L’immobilisation des lipases par chimisorption, s’est faite par une mise en contact pendant 3h
à température ambiante et une agitation de 250 min-1. Pour les aminoacylases de S. ambofaciens
immobilisés par physisorption, une mise sous agitation pendant 18h à 4°C sous une agitation
rotatoire 150 min-1 a été nécessaire afin d’éviter la dénaturation de l’enzyme. Les mélanges sont
ensuite filtrés et rincés deux fois avec le même tampon d’immobilisation et laissés sécher une
nuit à l’air libre. L’immobilisation sur les supports monolithique (SiHIPE) a été réalisée suivant
les mêmes étapes en continu dans un réacteur à lit fixe. Pour l’immobilisation des lipases par
chimisorption sur les supports fonctionnalisés avec du Glymo, la solution enzymatique a été
préparée dans un tampon Tris à forte molarité (1M) afin de permettre une bonne ouverture des
cycles epoxy, permettant de meilleures interactions et une immobilisation plus importante
(figure 2.2).
80
Pourcentage d'enzyme
70
immobilisée (%)
60
50
40
30
20
10
0
Tris 0,25 M Tris 0,5 M Tris 1 M
Concentration molaire du tampon Tris
Figure 2.2 : influence de la concentration du tampon par rapport à la concentration d’enzyme

initiale sur le pourcentage d’immobilisation
La formation des CLEAs (cross linking enzyme agregate) à la surface des SBA15 a aussi été
réalisée. Pour cela, différents taux de glutaraldéhyde (1, 5 et 10 % molaire par rapport au
nombre de moles de silice utilisée) ont été utilisés. Les différentes quantités nécessaires de
glutaraldéhyde ont été mélangées avec des SBA15 fonctionnalisés à 50% d’APTES sur
lesquelles les aminoacylases ont été immobilisées. Le mélange a été mis sous agitation pendant
18h puis filtré et lavé avant de le mettre à sécher pendant une nuit à l’air libre.
92
2.2.4 Caractérisation des matériaux

Les propriétés physiques et chimiques des SBA15 et les MMS avant et après fonctionnalisation
et immobilisation ont été caractérisées par plusieurs méthodes. La détermination de la surface
spécifique des matériaux, avec la méthode BET (Brunauer, Emmett et Teller), la distribution
du diamètre des pores, par la méthode BJH (Barrett, Joyner et Halenda), et le volume poreux
par la méthode d’adsorption-désorption d’azote. La diffraction des rayons X aux petits angles
(ou SAXS, Small Angle X-ray Scattering) a été utilisée pour déterminer la structure et
l’organisation des différents supports silicatés et pour la détermination de la distance de Bragg
(d100) qui correspond à 2π/l’angle de réflexion du premier pique et de paramètre de maille a0
= 2 x d100 / √3 permettant de revenir à l’épaisseur de la paroi des méso-pores après soustraction
du diamètre des pores déterminé par la méthode BJH. La détermination de la porosité au
mercure a été utilisée afin de visualiser la distribution de taille des pores des supports méso-
macroporeux et macroporeux. Enfin, lors de l’immobilisation des aminoacylases par
physisorption sur les supports SBA-15 et MMS, l’analyse par résonance magnétique nucléaire
(RMN) du silicium et du carbone a permis de vérifier la bonne fonctionnalisation et
l’immobilisation des enzymes par l’apparition des pics correspondant à ces derniers.
2.2.5 Autres types d’immobilisation

Les aminoacylases ont aussi été immobilisées par encapsulation dans une émulsion double. Elle
consiste à piéger les enzymes, préalablement solubilisées dans du tampon Tris pH 7,6, en les
introduisant dès le départ dans une émulsion formée de dodecane, de polyricinoléate de
polyglycérol (PGPR). L’émulsion est formée par l’utilisation d’un ultraturrax à 24000 min-1, et
la deuxième, en versant, goutte à goutte, le premier mélange dans une solution aqueuse de P123
(5% massique). L'émulsion double ainsi formée est dispersée dans du tampon Tris pour la diluer
puis 1 mL de silicate est ajouté sous condition acide. La minéralisation est réalisée pendant une
nuit suivie d’un séchage afin de récupérer une poudre.
2.3 Mise en œuvre des réactions enzymatiques

Les réactions enzymatiques ont été réalisées dans différent types de réacteurs. L’évaluation des
performances des aminoacylases de S. ambofaciens libres et immobilisées a été réalisée dans
des réacteurs batch de différents volumes. L’évaluation des lipases (CALB immobilisée
commerciale, Lipozyme 435, et CALB immobilisée sur les différents supports) pour les
réactions d’acylation a été mise en œuvre dans des réacteurs batch et continus. Dans ce cas la
réaction de N-acylation des acides aminés avec CALB, les réacteurs en batch ont servi pour
93
l’évaluation des performances enzymatiques dans le solvant organique 2-méthyl-2-butanol, les

solvants eutectiques et les milieux biphasiques alors que les réactions continues ont été réalisés
pour l’évaluation de l’activité sous CO2 supercritique. La réaction de O-acylation du géraniol
avec l’acide acétique a été utilisée pour l’évaluation des performances de CALB immobilisée
sur les différents supports et commercial (Lipozyme 435) en continu sous scCO2.
2.3.1 Réactifs utilisés

Tableau 2-4: réactifs utilisés lors des réactions enzymatique
Produit Pureté (%) Fournisseur
L-Acides aminés Entre 97 et 99 Sigma-Aldrich
Acide caprylique 98 Sigma-Aldrich
Acide undécénoïque 99 Sigma-Aldrich
Acide laurique 99 Sigma-Aldrich
Acide oléique 99 Sigma-Aldrich
N-α-acétyl-L-lysine 99 Sigma-Aldrich
N-ε-acétyl-L-lysine 99 Sigma-Aldrich
2-méthyl-2-butanol 99 Sigma-Aldrich
Triéthylamine 99 Sigma-Aldrich
Trizma Base 99 Sigma-Aldrich
NaCl 99 Bachem
Choline chloridium 98 Sigma-Aldrich
Urée 97 Sigma-Aldrich
Glycérol 99 Sigma-Aldrich
Décane 99 Sigma-Aldrich
Hexane 95 Sigma-Aldrich
Acide acétique 99,8 Sigma-Aldrich
Géraniol 97 Sigma-Aldrich
Méthyl décanoate 99,5 Sigma-Aldrich
Acétone 99,8 Carlo Erba
2.3.2 Réactions en continu sous CO2 supercritique (scCO2)

Les réactions sous scCO2 ont été réalisées avec des enzymes immobilisées dans un réacteur à
lit fixe selon la figure 2.3. L’installation comporte une bouteille d’alimentation en CO2 gaz (60
bars) équipée d’un tube plongeur d’alimentation. Le CO2 est ensuite pompé et amené sous
forme liquide, suite à un passage par un cryostat, en utilisant une pompe à CO 2 liquide (Jasco,
Japon) puis par un bain chauffant vers une étuve tous deux régulées à la température du scCO2
voulue (supérieure à 32°C). Au niveau de l’étuve, le scCO2 rentre en contact avec les substrats,
apportés par les pompes, permettant d’avoir des débits minimaux très faibles (minimum 2 µL /
min), au niveau d’un T (Valco) résistant à des pressions allant jusqu’à 350 bars. Le mélange
scCO2 / substrat est homogénéisé par passage à travers un mélangeur statique, avant d’atteindre
94
le réacteur à lit fixe d’un volume de 1,3 mL ou 5 mL contenant les enzymes immobilisées seules
ou mélangées avec des billes en verre de 0,6 mm de diamètre moyen afin de compléter le
volume. Le contrôle de la pression s’effectue à l’aide d’un régulateur de pression ou Back
pressure regulator (BPR; Jasco, Japon) équipé d’un brise jet permettant de récupérer
efficacement les produits formés et les substrats résiduels. Les débits d’alimentation en scCO2
et en substrats des différentes pompes ainsi que la pression du BPR et donc du scCO 2 ciblée
sont contrôlées par le logiciel ChromNav (Jasco, Japon).
Lors des réactions de synthèse de l’acétate de géraniol à partir de l’acide acétique et du géraniol
en concentration équimolaire (57 mM), le mélange de substrat est préalablement réalisé et
pompé à un débit de 40 µL / mn afin d’éviter un déséquilibre d’alimentation en substrats et
fausser les résultats.
Lors de l’évaluation des performances des lipases immobilisées sur les différents supports, un
réacteur court de 1,3 mL de volume a été utilisé. Ce dernier était connecté au niveau de
l’installation en vérifiant l’étanchéité assurée par des férules adaptées. La montée en pression
est progressive avec contrôle de l’étanchéité tous les 50 bars. Le CO2 est pompé sur une base
liquide à -8°C à un débit de 3 mL/min et expansé en passant d’une température de -8°C à la
température de consigne de 55°C pour devenir supercritique en maintenant une pression finale
de 200 bars. Le temps de séjours des mélanges réactionnels obtenus est de l’ordre de 8 secondes
dans le réacteur court. Les réactions sont réalisées pendant 30 min. Le mélange de substrats et
produits est récupéré au cours de la réaction et le scCO2 s’évapore directement en contact avec
l’air. Une fois la réaction finie, une dépressurisation rapide de l’installation est réalisée en
passant directement de la pression de la réaction à la pression atmosphérique.
L’évaluer de l’activité de CALB commerciale immobilisée sur des supports de méthacrylate

divinylbenzène macroporeux (Lipozyme® 435) a aussi été réalisé dans le même système et dans
des conditions similaires. L’influence des conditions de pression et de température du scCO2
sur l’activité enzymatique a été mesurée en utilisant un plan d’expérience factoriel simple à
deux facteurs, deux niveaux avec point central additionnel. Dans ce cas les conditions
réactionnelles étaient les mêmes mais avec une variation de la température entre 45 et 65°C et
de la pression entre 150 et 300 bars. L’évaluation de l’influence de la configuration et de la
mise en œuvre du réacteur a été réalisée en utilisant des réacteurs de différentes longueurs de
même diamètre utile de 0,46 cm (volume de 1 mL avec 300 mg de billes et 5mL avec 1500 mg
de bille) ou bien en mettant des réacteurs courts de 1 mL en parallèle pour simuler un réacteur
de même longueur mais de diamètre double (2*300 mg=600 mg de billes) dont nous ne
95
disposions pas. L’influence du temps de séjour des substrats dans le réacteur a été évaluée en
utilisant le réacteur de 1 mL à 55°C et 200 bars. Les réactions ont été mises en œuvre à des
débits de CO2 entre 0,5 et 6 mL / min. La stabilité des enzymes immobilisées au cours du temps
a été réalisée dans les conditions standards, décrites dans le paragraphe précédent, durant 24 h
avec des prélèvements dans le temps. 6 cycles de dépressurisation ont été réalisés afin de
contrôler leur stabilité.
Tous les échantillons prélevés sont dilués cinq fois dans de l’acétone puis 50 µL de méthyle
décanoate est ajouté comme étalon interne avant les analyses en chromatographie en phase
gazeuse (GC).
Figure 2.3: Equipements utilisés pour la mise en œuvre des réactions enzymatiques sous
scCO2 dans les conditions standards
2.3.3 Réaction en batch dans des réacteurs agités mécaniquement

2.3.3.1 Synthèse enzymatique
2.3.3.1.1 Solvant organique en réacteur agité
L’acylation enzymatique des acides aminés a été réalisée dans différents milieux réactionnels.
L’acylation des acides aminés (0,12 M) par l’acide undécénoïque (0,24 M) a été réalisée dans
2 mL de 2-methyl-2-butanol (M2B2) comme solvant organique, préalablement déshydraté sur
tamis moléculaires 4Å. 2,4 mol L-1 de la triéthylamine ont été ajoutée au milieu réactionnel afin
de favoriser la forme neutre du groupement amine (Husson et al., 2010b). Le mélange est mis
sous sonication 2,5 min à 200 W de puissance de l’appareil ULTRASONIC PROCESSOR
(Bioblock Scientific, Thermofisher) puis laissé agiter une nuit à 55°C et 250 min-1, pour mieux
solubiliser l’acide aminé, dans un Carrousel 12 Plus Reaction Station™ équipé d’un barreau
aimanté et thermo régulé. 10 g/L de Novozym 435® (CALB) sont ensuite ajouter pour démarrer
la réaction. Les réactions sont mises en œuvre à 55°C et 500 min-1. Des échantillons sont
prélevés toutes les 24 h puis dilués 10 fois avec de l’eau/méthanol (80/20, v/v), filtrés afin
96
d’éliminer CALB puis analysés en LC-MS-MS. les réactions ont été répétées au minimum deux
fois.
Des réactions en mélange eutectique profonds (MEP) ont aussi été réalisées. Le MEP formé de
sel d’ammonium avec son contre ion, chlorure de choline, et les donneurs de liaison
hydrogènes, urée et glycérol, ont été préparés à un ratio molaire de 1 / 2. Le mélange, solide,
est mis sous agitation en reflux pendant 2 h à 60°C. Le mélange liquide obtenu est équilibré
jusqu’à une activité de l’eau, aw, de 0,2 avant de lancer la réaction dans les mêmes conditions
qu’avec le M2B2. La régulation de l’aW permet une réduction importante de la viscosité.
Des milieux biphasiques ont aussi été réalisés. Ils sont formés par un mélange contenant 50%
d’un solvant organique décane et hexane, dans lequel l’acide gras (AG) a été dissout, et 50%
de tampon Tris Base 0,1 M dans lequel l’acide aminé (AA) a été solubilisé. Différentes
concentrations de substrat ont été évaluées ratio constant AG/AA de 2/1. Les réactions ont été
réalisées dans un volume final de 4 mL (2 mL de chaque partie) en présence de différentes
concentrations de CALB liquide à 55°C et 1000 min-1 d’agitation.
2.3.3.1.2 En milieu aqueux

La réaction de N-acylation des acides aminés, avec différents donneurs d’acyles, a été réalisée
dans des tubes à vis équipés de barreaux aimantés et chauffés dans un bain d’huile par une
plaque chauffante thermo régulée (IKA). L’émulsion de substrats en condition équimolaire (0,1
/ 0,1 d’AG / AA) est préparée dans un tampon Tris HCl 25 mM, NaCl 50 mM pH8 par
sonication pendant 2,5 min à 40 % de la puissance maximum. Les réactions sont lancées par
l’ajout des aminoacylases de S. ambofaciens, libres ou immobilisées (1 g/L), pour un volume
réactionnel final de 2 mL. Les réactions sont réalisées à 45°C avec une agitation magnétique de
500 min-1. Les échantillons prélevés sont dilués par 5 ou par 10 dans un mélange méthanol/eau
(80/20) puis filtrés avant d’être analysés par CLHP ou LC-MS-MS.
Des réactions d’acylation de la phénylalanine avec l’acide 10-undecénoïque ont aussi été mises
en œuvre en utilisant deux autres types de réacteurs dont un réacteur Wheaton® d’une capacité
de 50 mL et un réacteur Optimax® de d’une capacité de 1 L. Le réacteur Wheaton® est équipé
d’un barreau aimanté suspendu évitant des cisaillements importants avec l’enzyme au cours des
synthèses (figure 2.4.A). Une plaque chauffante (IKA) est utilisée pour le maintien de la
température à 45 °C, par l’intermédiaire d’un bain d’huile thermostaté. Le réacteur a été rempli
à un volume de 10 mL ou de 20 mL lors des réactions de N-acylation.
97
Le réacteur Optimax® (MettlerToledo) est équipé d’une agitation mécanique assurée par une
pale Rushton, une sonde de température et de pH et un système de reflux permettant d’éviter
l’évaporation (figure 2.4.B). Le système est entièrement automatisé et contrôlé par le logiciel.
Une fois le mélange de substrats introduit dans la cuve (volume final 300 mL), l’appareil
préalablement programmé démarre automatiquement l’agitation à 700 min-1 puis régule la
température, par chauffage d’une chemise de régulation de température qui entoure la cuve, et
le pH du milieu réactionnel par injection progressive (toutes les 10 secondes), à l’aide d’une
pompe-seringue, d’une certaine quantité soit de NaOH 1 M ou de HCl 1 M jusqu’à atteindre le
pH 8. Une fois la régulation finie, le volume nécessaire d’enzyme pour atteindre la
concentration cible est ajoutée afin de commencer la réaction. L’évolution du pH, de la
température et de la vitesse d’agitation est suivie par le logiciel lors de la réaction.
A B
Figure 2.4 : A. Réacteur Wheaton® B. Réacteur Optimax®
2.3.3.2 Hydrolyse enzymatique

Les réactions d’hydrolyses de N-α-acétyl-L-lysine et de N-ε-acétyl-L-lysine ont été effectuées
dans le but d’évaluer l’activité des aminoacylases de S. ambofaciens et des extraits protéiques,
lors de l’expression hétérologue des différentes acylases ainsi que celle des aminoacylases après
immobilisation. L’hydrolyse est réalisée à 37°C dans des tubes à vis contenant le tampon Tris-
HCl (25mM) NaCl (50mM) à pH 8 et 4 mM de substrat. La lysine produite lors de cette réaction
est vérifiée par chromatographie sur couche mince (CCM) et chromatographie liquide à haute
performance (CLHP).
2.4 Méthodes analytiques

2.4.1 Réactifs et solvants
Les produits chimiques utilisés dans cette étude sont indiqués dans le tableau ci-dessous :
98
Tableau 2-5: Liste des produits utilisés pour les analyses des produits des réactions
enzymatiques
Produit Fournisseur
Dosage acides Sodium Borate Sigma
aminés β-mercaptopropionic acid Fluka
Ortho-phthalaldehyde Sigma
4-Chloro-7-nitrobenzofurazan Fluka
Sodium phosphate mono basic déshydrate Fluka
Di-sodium hydrogenphosphate Fluka
Acetonitrile Carlo-Erba
Dosage acides Methanol Carlo-Erba
gras et produits Acide trifluoroacétique Sigma-aldrich
acylés N-10-undecylenoyl-L-Phénylalanine SEPPIC
N-capryloyl-L-glycine SEPPIC
Standard lysine acylés Gencust
Chromatographie Butanol Sigma-aldrich
sur couche mince Acide acétique Carlo-Erba
Cyclohexane Carlo-Erba
Acétate d’éthyle Carlo-Erba
Ninhydrine Sigma-aldrich
Permanganate de potassium -
Iode -
Dosage de Géraniol Sigma-aldrich
l’acétate de Acide acétique Sigma-aldrich
géraniol Acétate de géraniol Sigma-aldrich
Méthyle décanoate Sigma-aldrich
2.4.2 Chromatographie sur couche mince (CCM ; analyse qualitative)

Les prélèvements des réactions d’hydrolyse et de synthèse en présence de lysine et/ou d’un
acide gras, contenant des doubles liaisons, ont été analysés par CCM. La migration est réalisée
sur des plaques de silice de 20 x 20 cm (Silica gel 60, Merck). Un volume de 5 à 10 µL de
prélèvement est déposé à 2 cm de la marge de la plaque avant de la placer dans une enceinte
fermée hermétiquement contenant l’éluant. Les plaques sont ensuite séchées à l’air libre.
Plusieurs types d’éluant ont été utilisés. Pour les réactions en présence de lysine, un mélange
contenant du butanol (60 %), de l’acide acétique (20 %) et de l’eau (20 %) a été utilisé
permettant de séparer la lysine de ces dérivés monoacylés (Soo et al., 2003a). Dans ce cas, la
révélation est réalisée par pulvérisation d’une solution éthanolique de ninhydrine à 0,1 % qui
va réagir avec les fonctions amines libres de l’acide aminé. La plaque est chauffée à 110 °C
permettant l’apparition d’un chromophore violet (révélation destructive). Lors de la purification
de l’undécénoyl-phénylalanine (C11’F) du mélange réactionnel contenant de l’acide 10-
99
undécénoïque, un mélange cyclohexane / acétate d’éthyle à 50 / 50 a été utilisé pour faire migrer
l’acide gras. Une deuxième migration a été réalisée sur la même plaque après séchage à l’air
libre en ajoutant 1% d’acide acétique au mélange permettant de faire migrer le C11’F. La plaque
est ensuite séchée et exposée à des vapeurs saturées en iode qui va réagir et colorer les molécules
présentant des doubles liaisons (révélation non-destructive).
2.4.3 Dosage de la lysine issue des réactions d’hydrolyse

La quantification de la lysine produite lors des réactions d’hydrolyse a été déterminée par deux
méthodes dont l’une par l’utilisation d’une chromatographie liquide haute performance (HPLC)
équipé d’un détecteur spectro-fluorimètrique (HPLC-Fluo), la deuxième méthode par
l’utilisation d’une HPLC couplée à un spectromètre de masse (LC-SM).
La première méthode, utilisée permettant la séparation et la quantification de la lysine a été

créée et brevetée par Shimadzu®. L’appareil HPLC (LC-20) Shimadzu® utilisé est représenté
sur la figure 2.5 est équipé d’un détecteur fluorimétrique. Cette méthode est basée sur la
détection des acides aminés fluorimétrie après une étape de dérivatisation des acides aminés
par de l’ortho-phtaldéhyde (OPA). Celle-ci permet de détecter une fluorescence à 460 nm suite
à une excitation à 350 nm. La dérivatisation consiste à la formation du dérivé thioisoindoles
fluorescents en présence de l’OPA et du β-mercaptoéthanol (figure 2.6). Pour cela, un volume
de 10µL d’échantillon ou de standard est déposé dans un flacon HPLC de 1,5 mL puis le passeur
automatique se charge de la réalisation du mélange de réactifs (tableau 2.6) avec l’échantillon
et des temps d’attente avant injection suivant un programme prédéfini avec le logiciel (LC-
solution®) de la chaine HPLC.
Tableau 2-6 : Composition des réactifs utilisés pour la dérivatisation
Réactif Composition Quantité
Tampon Sodium Borate (pH à Acide borique 1,55 g
9 ajusté avec NaOH 30%) Eau miliQ 250 mL
β-mercaptopropionic 100 µL
A
Tampon borate 100 ml
OPA 200 mg
B Acétonitrile 30 mL
Tampon borate 100 mL
4-Chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) 1g
C
Acétonitrile 100 mL
1 ou 2 μL de l’échantillon sont ensuite injectés dans le système. La séparation est réalisée par
une colonne C18 (150 x 4,6 ; 5 µm Alltech-Grace®, États-Unis), thermostatée à 45°C, à un
débit de 1 mL/mn. L’élution se fait par un gradient de phases suivie d’un nettoyage du système
100
avec de l’acétonitrile puis un retour dans les conditions initiales. La composition des solvants
d’élution et le gradient utilisé sont représentés dans le tableau 2.7. L’activité spécifique (A.S)
des enzymes a été déterminé suivant la formule : A.S (nmole de lysine produite / min / mg de
protéines) = d [lysines produites] / (dt * [protéines de l’extrait soluble]).
Tableau 2-7 : Gradient de phases et composition des solvants d’élution
Phase A (0,78 g/L
Temps Phase B (600 mL phase A + Phase C (Acétonitrile /
NaH2PO4 + 1,79 g/L
(mn) 300 mL Acétonitrile) eau 80/ 20)
Na2HPO4)
0-1 95% 5% 0%
1 - 10 5% 95% 0%
10 - 15 0% 100% 0%
15 - 16 100% 0% 0%
16 - 21 0% 0% 100%
21 - 34 95% 5% 0%
Figure 2.5 : Schéma de la chaine CLHP et des équipements utilisés pour le dosage des acides
aminés
101
Figure 2.6 : Réaction de dérivatisation des acides aminés

La deuxième méthode, utilisée pour la détermination de la concentration de lysine produite au
cours des réactions d’hydrolyse, ne nécessite pas d’étape de dérivatisation. Elle consiste à
l’utilisation d’une colonne Hypercarb (100 x 2,1 mm ; 5µm), thermostatée à 10°C (Igloo-Cil®).
Cette colonne contient une phase stationnaire en carbone graphitique poreux (phase très
hydrophobe). La phase A utilisée contient 20 mM d’acide Nonafluoropentanoique (NFPA ;
acides carboxyliques perfluorés) préparé dans de l’eau déionisée permettant de mieux visualiser
les acides aminés et une phase B composée d’acétonitrile. Le gradient utilisé est représenté sur
le tableau 2.8. La détection et la quantification de la lysine se fait sur la base du suivi de la
transition de la lysine (M+H/z=147.10uma) vers un ion fils majoritaire (M+H/z=84.10uma),
issu de la dissociation induite après collision avec de l’argon, en mode MRM positif (Multiple
Reaction Monitoring, aussi appelé Selective Reaction Monitoring – SRM), par LC-TQMS
Shimadzu® selon les conditions présentées sur le tableau 2.9. L’appareil est équipé d’un
système d’interface double ionisation ou DUIS (Dual Interface Ionization System) dont une
ionisation par électro-nébuliseur ou ESI (ElectroSpray Ionization) et une ionisation chimique à
pression atmosphérique ou APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization).
Tableau 2-8 : Gradient des solvants utilisés

Temps (mn) Phase A Phase B
0-1 100% 0%
1 - 11 85% 15%
11 - 21 74% 26%
21 - 31 50% 50%
31 - 41 50% 50%
41 - 42 100% 0%
42 – 52 100% 0%
102
Tableau 2-9 : conditions d’analyse des acides aminés avec la LC-MS

Paramètre Réglage
Débit de gaz de nébulisation 2 L/mn
Débit de gaz de chauffage 10 L/mn
Débit de gaz de séchage 10 L/mn
Température Interface 300°C
Température de la ligne de désolvatation 250°C
Température de la chambre de nébulisation 400°C
Temps de mesure par spectre (Temps de pause) 3 ms (1 ms)
Tension Interface 5kV
Tension aiguille Corona 4.5kV
Tension Q1 -15V
Tension Q3 Pre Bias -17V
Energie de collision 18 unités
CID gaz 250kPa
2.4.4 Dosage des acides aminés acylés produits et des acides gras
consommés lors des réactions de N-acylation
La quantification des produits issus de la réaction d’acylation des acides aminés et de la
consommation des acides gras a été réalisée par CLHP équipé d’un détecteur UV-visible et
d’un détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL). La chaine CLHP utilisée est une
Shimadzu LC 10 AD-VP (Shimadzu®, France) équipée d’une colonne Alltima HP C18 « amide
» (125 x 2,1 mm, 5µm, Alltech Grace®) avec sa pré-colonne (15 x 2,1 mm, 5µm, Alltech
Grace®), maintenue à 25°C dans un four colonne (CTO-10 AS VP ; Shimadzu®), et d’un
injecteur automatique d’échantillons (SIL-10 AD VP ; Shimadzu®), d’un détecteur UV à
barrette de diode (SPD-M10A VP 190 – 290 nm ; Shimadzu®) et d’un détecteur évaporatif à
diffusion de lumière à faible température (ELSD – LT ; Shimadzu®). Lors de l’analyse des
produits de la réaction de N-acylation de la phénylalanine, leucine et isoleucine une colonne
Force Biphenyl (150×2.1mm ; 3μm) nouvellement mise sur le marché par Restek® (USA),
maintenue à 35°C, a été utilisée à cause de soucis de séparation du produit et de l’acide gras.
La présence de cycles phényle à la surface de la phase stationnaire permet une meilleure
résolution en présence d’acides aminés hydrophobes. Le débit (0,2 mL/mn) et le gradient des
solvants d’élution (tableau 2.10) sont les mêmes pour les deux colonnes.
103
Tableau 2-10 : Composition et gradient des solvants d’élution pour les colonnes C18 amide et
Biphényl
Phase A (méthanol/eau/acide Phase B (méthanol/TFA,
Temps (mn)
trifluoroacétique (TFA), 60/40/0,1) 100/0,07)
0-1 95% 5%
1-7 5% 95%
7 – 20 5% 95%
20 - 21 95% 5%
21 - 35 95% 5%
La détection et la quantification ont été réalisées par spectrométrie UV à 214 nm pour les
réactions en présence de molécules à courte chaine et pour les acides gras non visibles en DEDL
(taille inférieure à 12 carbones). Le détecteur DEDL réglé à une pression d’air comprimé de
350 kPa et une température de 40°C a été utilisé pour la quantification des produits acylés tels
que l’undécénoyl-phenylalanine. Les concentrations des produits ou des acides gras ont été
déterminées en se référant à la courbe d’étalonnage des standards. Le pourcentage de
conversion correspond au rapport entre le nombre de moles du produit formé ou de l’acide gras
consommé lors de la réaction et le nombre de moles d’acide gras initial.
2.4.5 Identification de la régiosélectivité et de la chimio-sélectivité des

enzymes par CL-SM-SM
L’analyse qualitative et semi-quantitative des acides aminés N-acylés a été réalisée par CLHP-
SM-SM (ThermoFisher Scientific®, San Jose, CA, USA) équipée d’un détecteur UV (PDA) et
d’un spectromètre de masse à trappe ionique linéaire (LTQ). La séparation est réalisée par une
colonne C18 Altima (Alltech Grace®, Darmstadt, Germany, 150mm × 2.1mm, 5 μm) régulée
à 25°C sauf dans le cas des dérivés de la phénylalanine, la leucine ou l’isoleucine où la colonne
Allure Biphenyl (150 x 2.1mm ; 3μm, Restek®, USA) régulée à 35°C, est utilisée. Un volume
de 10 µL de l’échantillon est injecté sur la colonne et l’élution est réalisée par gradient, présenté
sur le tableau 2.11, de méthanol à un débit de 0,2 mL/min. L’ionisation de l’échantillon est
réalisée par électro-spray en mode positif (ESI+). Les conditions d’analyse en spectrométrie de
masse sont : la tension d’électro-spray = +4.5kV ; le gaz de nébulisation, le gaz auxiliaire et le
gaz rideau = 30, 10 et 10 UA/min, respectivement ; température capillaire = 250°C ; tension
capillaire = 48V ; tensions optiques de transfert, tube lens, split lens et front lens = 120V, −34V
et -4.25V, respectivement. La calibration des paramètres de l’optique ionique pour le mode
ESI+ a été réalisée en utilisant une solution de 0,1 g/L d’oleoyl-lysine-serine injectée à un débit
de 5 µL/mn. Le balayage entier des spectres de masse a été effectué entre 100 et 1000 m/z pour
les spectres MS et MS2. La chimio- et la régiosélectivité des enzymes et déduite en se basant
104
sur la masse et la structure du produit attendu. Les données ont été analysées en utilisant le
logiciel Xcalibur®.
Tableau 2-11 : Composition et gradient des solvants d’élution des analyses en CL-SM-SM
Phase A (méthanol/eau/TFA, 80/20/0,1 acide
Temps Phase B (méthanol/TFA,
laurique et oléique méthanol/eau, 50/50 acides
(mn) 100/0,1)
gras plus courts (inférieur à C12)
0–1 100% 0%
1–6 0% 100%
6 – 16 0% 100%
2.4.6 Dosage de l’acétate de géraniol issu des réactions de O-acylation
sous scCO2
La quantification de l’acétate de géraniol issu de la réaction d’acylation du géraniol par l’acide
acétique a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse (CG) (Agilent®, Santa Clara,
USA) et détecteur à ionisation par flamme (FID), chauffé à 250°C, et couplée à un spectromètre
de masse à triple-quadripôle (Agilent®). Lors des analyses, un volume de 1 μL de mélange
réactionnel, contenant du méthyle décanoate comme étalon interne, est injecté avec un injecteur
automatique (Agilent®) avec un rapport de division de 100:1 et une température d’injection de
240°C. Le chromatographe est équipé d’une colonne HP-INNOWax (30 m×0,32 mm DI × 0.25
μm, Agilent®) installée dans un four à colonne chauffé à 60°C pendant 2 mn. Durant l’analyse,
la température est augmentée à 200°C avec un gradient de 10°C / mn puis de 200°C à 220°C
avec un gradient de 5°C / mn. Le gaz vecteur est composé d’hélium à un débit de 1,5 mL/mn.
La quantification est obtenue à partir des gammes étalons de l’acide acétique, du géraniol et de
l’acétate de géraniol.
2.4.7 Dosages des protéines

Plusieurs méthodes ont été utilisées pour l’évaluation de la concentration des protéines issues
de la production d’enzymes ou lors de la détermination de la quantité de protéines immobilisées
sur les supports. L’activité spécifique des enzymes pour les réactions d’hydrolyse de l’α-, ε-
acétyle-lysine ou pour les réactions d’acylation a été calculée selon la formule
Quantité de produit (mmol / h)

Activité spécifique =
Quantité de protéine (mg)
2.4.7.1 Bradford
La détermination de la concentration des protéines des échantillons a été réalisée par la méthode
de Bradford (Bradford, 1976). Elle est basée sur le dosage colorimétrique de l’interaction entre
105
le bleu de Coomassie G-250 et les résidus arginine et hydrophobes des protéines. Le réactif de
Bradford est une solution contenant 20 mg de bleu de Coomassie G-250 dissout dans 10 mL
d’éthanol à laquelle est ajouté 20 mL d’acide orthophosphorique et 20 mL d’eau. 20 μL de
l’échantillon ou du standard est mélangé à 980 µL du réactif de Bradford puis laissé réagir
pendant 15 min à l’obscurité. L’absorbance à 595 nm est ensuite mesurée et la concentration en
protéines est déterminée à partir d’une courbe de calibration d’une solution étalon (de 0,25 à
1,5 g/L) d’albumine de sérum bovin (BSA).
2.4.7.2 BCA
La méthode BCA (BiCinchoninic acid Assay) a aussi été utilisée pour la quantification des
protéines. C’est un dosage colorimétrique basé sur la formation d’un complexe entre le Cu2+ et
les protéines sous des conditions alcalines, suivi par la réduction du Cu 2+ en Cu+. Le taux de
réduction est proportionnel à la quantité de protéines présentes. Il a été démontré que la cystéine,
tryptophane et la tyrosine et les liaisons peptidiques peuvent réduire le Cu2+ en Cu+. La présence
de l’acide bicinchoninique permet l’apparition d’une couleur pourpre, absorbant à 562 nm, lors
de la formation du complexe avec le Cu+. Le réactif BCA est un mélange de deux réactifs A et
B. Il est préparé en mélangeant 50 unités du réactif A, un mélange d’acide bicinchoninique, de
carbonate de sodium, de tartrate de sodium et de bicarbonate de sodium dans NaOH 0,1 N, avec
1 unité du réactif B, une solution de sulfate penta-hydrate de cuivre (II) 4 % (W/V). Un volume
de 100 µL de l’échantillon est mélangé avec 2 ml du mélange de réactif BCA suivi d’une
incubation de 30 mn à 37°C. L’absorbance à 562 nm est mesurée et la concentration de
protéines déterminée à l’aide d’une gamme d’étalonnage réalisée avec du BSA.
Étude théorique : modélisation moléculaire

Suite aux réactions de N-acylation des acides aminés par CALB dans différents milieux
réactionnels, une étude des interactions entre CALB et les accepteurs d’acyle (acides aminés)
en présence de différents acides gras (donneurs d’acyle) a été effectuée à l’échelle moléculaire.
Cette modélisation moléculaire a été réalisée en utilisant le logiciel Discovery Studio® 4.1
(Accelrys®, Inc) installé sur un ordinateur bi-processeur Intel Xeon® 4CPU L5420 (2,5 Ghz,
30 cœurs de calculs, 16 Go de mémoire). Deux études des interactions enzyme/substrat ont été
réalisées par modélisation moléculaire. La première est l’étude de la N-acylation de la
phénylalanine (Ligand) catalysée par CALB dans laquelle un acide oléique a été introduit par
liaison covalente entre le groupement hydroxyle de l’acide gras et la sérine catalytique (Ser-
105). La structure de l’acyl-enzyme utilisée a été construite et optimisée lors de l’étude de
Ferrari et al., (2014). La deuxième étude a pour but d’évaluer les interactions moléculaires entre
106
15 acides aminés protéinogéniques et CALB sur laquelle un acide undécénoïque a été greffé.
La construction et l’optimisation de la structure de ce dernier ainsi que la structure de tous les
ligands ont été réalisées lors de cette étude. Le protocole de docking et d’analyse des possibles
interactions ont été réalisés de la même manière pour les deux études.
2.5 Construction des structures

2.5.1 Structure des ligands
La structure tridimensionnelle de différents acides aminés (ligands) a été construite en utilisant
le module Builder de Discovery Studio® 4.1. Afin de réaliser le typage des atomes, des
molécules construites, qui permet la bonne reconnaissance du système moléculaire par le
logiciel, un champ de force CHARMM a été appliqué sur les structures. Une correction de la
géométrie des structures, qui assure un bon ajustement des longueurs et des angles des liaisons,
a été effectuée en utilisant l’outil « clean geometry » avant de réaliser une étape de minimisation
des énergies des systèmes de 2000 itérations avec l’algorithme : Steepest Descent.
2.5.2 Structure de CALB et de l’acyl-CALB

La structure de l’oléoyl-CALB, utilisé lors de la première étude, a été construite et optimisée à
partir de la structure cristallisée 1LBS issue de la « protein data bank » (PDB) lors de la thèse
de Ferrari, (2014). Cette structure cristallographique de CALB est formée de six chaînes
protéiques, chacune d’entre elle est composée de 317 acides aminés. Lors de la cristallisation,
un inhibiteur éthyl-hexylphosphonate, lié par liaison covalente à la sérine catalytique, a été
cristallisé. Sachant que la triade catalytique de CALB est formée des résidus Ser105, His224 et
Asp187, la présence de l’inhibiteur a permis d’avoir des informations sur le positionnement du
ligand par rapport aux autres résidus et au trou oxyanionique (Thr40 et Gln106). Cela a permis
d’orienter la construction de l’oleoyl-CALB, après suppression de l’inhibiteur, suite à
l’ajustement de la structure de l’acide oléique et de l’état de protonation des résidus de CALB
à un pH neutre. Une boite d’eau, de type TIP3P, comportant 16585 molécules d’eau et une
dimension géométrique de a = 92 Å, b = 86 Å, c = 70 Å; α = β = γ = 90° ainsi qu’un un
contre-ion, a été ajoutée, afin de solvater et de neutraliser le système, avant de procéder aux
étapes de dynamique moléculaire permettant d’évaluer la stabilité du système. La configuration
d’acyl-CALB sélectionnée a été utilisée dans cette étude. Cette dernière a été modifiée afin de
passer de 18 carbones, avec une double liaison au niveau du 9ème carbone, à 11 carbones avec
une double liaison au niveau du 10ème carbone. Différentes étapes de minimisation de l’énergie
du système et de dynamique moléculaire ont été réalisées afin d’évaluer la stabilité du système
et d’étudier le positionnement de la chaine de l’acide gras dans la cavité catalytique de CALB
107
et permettant de sélectionner la conformation la plus appropriée pour l’étape de docking

moléculaire.
2.5.2.1 Minimisation de l’énergie du système

Les étapes de minimisation ont été réalisées en utilisant les algorithmes « Steepest
descent » (lors de la première étape) ou « Conjugate gradient » en fixant un nombre d’étapes
maximales à 10000 et en augmentant l’exigence par rapport au gradient de l’écart quadratique
moyen (rmsd : root mean square deviation gradient). En effet, ce dernier a été réduit d’un
facteur 10 à chaque étape de la minimisation tout en procédant à une relaxation progressive de
la structure de l’acyl-enzyme. Le rmsd est le critère qui doit être respecté si on ne veut pas
relancer le calcul avec un nombre d’étape plus important (tableau 2.12).
Tableau 2-12 : Conditions implémentées lors des étapes de minimisation de l’énergie du
système
Conditionnement de la structure Algorithme Critères d’arrêt du calcul
Fixation de toute la structure par des contraintes :
Steepest Max steps 10000 et/ou
tous les atomes sont fixes sauf les atomes d’H et
descent rmsd gradient 0,1
l’eau de la cristallographie
Fixation de la chaine principale et contraintes
Conjugate Max steps 10000 et/ou
harmonieuses appliquées aux chaînes latérales des
gradient rmsd gradient 0,01
résidus
Fixation de la chaine principale par des contraintes Conjugate Max steps 100000 et/ou
harmonieuses gradient rmsd gradient 0,001
Conjugate Max steps 100000 et/ou
Relaxation de tout le système
gradient rmsd gradient 0,0001
2.5.2.2 Simulations de dynamique moléculaire
Les simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées par le module dynamique NAMD
du logiciel Discovery Studio® 3.5 en partant de la structure issue des étapes de minimisation.
Les conditions, appliquées lors de la simulation, sont présentées sur le tableau 2.13. Cette étape
a été réalisée selon celle décrite par Ferrari (2014).
La dynamique moléculaire commence par l’équilibration du système intégrant des équations de

mouvement. Cette phase permet au système initial d’atteindre la configuration d’équilibre
(stabilité de l’énergie, de température et de pression du système) à une température donnée (300
K). La deuxième étape, la plus longue (environ 6 heures), est la phase de production de
trajectoires. Elle permet de générer les différentes trajectoires possibles du système et ainsi
donner plusieurs configurations d’acyl-enzymes.
108
Tableau 2-13: Conditions implémentées lors des étapes de dynamique moléculaire

Paramètre Valeur
Température 300 K
Pas d’intégration 2 fs
Algorithme SHAKE (maintient rigide du lien entre les Oui
atomes lourds et les atomes d’hydrogène)
Ensembles thermodynamiques NPT : ensemble isothermale-isobare
Distance de troncation (Particule Mesh Ewald) Cutoff : 12 Å
Switching : oui, distance (interactions
de Van der Waals) : 10 Å
Conditions périodiques frontières (Periodic Boundary Oui
Conditions)
Sauvegarde des coordonnées 2 ps
Actualisation de la liste des atomes pour les Toutes les 20 étapes d’intégration
interactions
Temps de simulation 1000 ps
Nombre de processeur 32
2.5.2.2.1 Analyses des résultats
Les trajectoires de dynamique moléculaire, issues de la dernière étape, permettent de visualiser
l’évolution de la conformation de l’enzyme au cours du temps. Cela permet de tracer et de
visualiser l’évolution des paramètres thermodynamiques du système (énergie, température, …).
L’analyse des conformations générées permet d’évaluer la stabilité de la protéine en calculant
l’écart quadratique moyen (RMSD ; Root Mean Square Deviation) et donne une idée de
l’éloignement de la structure finale de la structure cristallographique. Il est calculé selon
l’équation :
1
RMSD = √N ∑𝑁
𝑖=0 𝛿𝑖
2 où N est le nombre d’atomes et δ, la distance entre N paire d’atomes
Le positionnement de la chaine undécénoyle, et l’orientation de son groupement carbonyle dans

la cavité du site actif par rapport à la triade catalytique et aux résidus du trou oxyanionique ont
été évalués dans le but vérifier la stabilité de la structure et de sélectionner la configuration la
plus appropriée pour l’étape de docking moléculaire. Le choix de la conformation a été établie
sur la base de critères de distance. Les critères sont une distance inférieure à 3 Å entre l’oxygène
du groupement carbonyle de l’acide gras, fixé sur la sérine catalytique, et les fonctions amides
et hydroxyles de la Thr40 et de la Gln106. La deuxième condition est le bon positionnement de
la chaine grasse permettant une bonne accessibilité de l’acide aminé au fond de la cavité
catalytique.
109
2.5.2.2.2 Définition du site actif
Afin d’identifier la zone d’interaction du ligand, il a été nécessaire de définir le site actif de
l’enzyme. Réalisé en utilisant la méthode des cavités, elle identifie celles (zone vide au niveau
de la structure) à la surface de l’enzyme comme de possibles sites de liaison par la création
d’une grille tridimensionnelle (x, y, z) avec un espacement de 0,5 Å qui évalue les zones libres
à la surface. Cela permet la récupération de plusieurs sites d’interaction possibles. La cavité
choisie sera celle qui recouvre les résidus de la cavité catalytique déjà identifiés et largement
décrits dans la littérature (Uppenberg et al., 1994b). Elle est formée principalement de résidus
aliphatiques hydrophobes (Leu140, Ala141, Leu144, Val149, Ser150, Ala151, Val154, Ile189,
Lys290, Leu278, Ala281, Ala282, Ile285 et Ala286), de certains résidus hydrophiles (Asp134
et Gln157) et des résidus du trou oxyanionique (Thr40 et Gln106). C’est une cavité étroite et
profonde au fond de laquelle se trouve la triade catalytique (Ser105, His224 et Asp187).
2.5.2.3 Simulation de docking

Le docking moléculaire est une méthode qui permet d’évaluer les possibilités de positionnement
du ligand, selon différentes orientations, au niveau du site actif de CALB en explorant l’espace
conformationnel. L’algorithme utilisé dans cette étude, implémentée dans le module LibDock
de Discovery Studio, est un algorithme de docking rigide où le ligand est considéré comme un
élément flexible et l’enzyme comme un élément rigide. La flexibilité de la protéine lors des
réactions n’est donc pas prise en compte.
Le protocole de docking de LibDock est basé sur l’algorithme développé par Diller, Merz,
(2001). Il se déroule en plusieurs étapes comprenant la génération des conformations du ligand,
l’identification des points d’ancrage (hotspots), l’évaluation des interactions possibles entre ces
derniers et le ligand (docking), l’optimisation des complexes (poses) générés et enfin leurs
classements selon la probabilité d’apparition (scoring) (Rao et al., 2007). La première étape
consiste à l’identification du site actif par l’échantillonnage de l’espace conformationnel du
ligand selon la méthode Monte Carlo (méthode stochastique). La génération des conformères
du ligand est réalisée en modifiant l’angle de torsion de la molécule initiale de façon aléatoire.
Les différents conformères ainsi produits sont introduits au niveau du site actif selon quatre
orientations permettant quatre positionnements différents du ligand (Figure 2.7). Le docking
est réalisé suite à l’identification et le classement des points polaires et apolaires présents au
niveau du site actif de l’enzyme. Cela permet de cartographier les hotspots (point chauds) qui
seront utilisés pour évaluer, respectivement, les interactions hydrophiles et hydrophobes avec
les atomes polaires, atomes d’hydrogène de l’accepteur d’acyle (interactions hydrogènes), ou
110
les atomes apolaires, atomes de carbone (i.e. cycles aromatiques et chaines aliphatiques).
L’étape d’optimisation consiste à retirer les poses qui ne sont pas favorables stériquement
(problème d’accessibilité) en utilisant l’algorithme d’optimisation BFGS qui permet
l’évaluation du potentiel stérique et des interactions hydrogènes. Les poses ainsi générées sont
classées (scoring) en utilisant des fonctions de score calculées sur la base d’un consensus
associant plusieurs fonctions de score afin d’améliorer la fiabilité du classement. Six différentes
fonctions de scores ont été utilisées : PLP1 et PLP2 (Gehlhaar et al., 1995), LigScore1 et 2
(Krammer et al., 2005), Jain (Jain, 1996) et PMF (Muegge, Martin, 1999). Enfin, les poses sont
classées selon le nombre d’apparition de cette pose lors des différents classements par les six
fonctions de score appliquées. Par exemple, si une pose est identifiée plusieurs fois par les
différentes fonctions de score parmi le top 10, cela signifie que la probabilité d’apparition de
cette conformation est élevée.
Suite au docking moléculaire, le choix des poses produites est réalisé sur la base du respect de
certains critères de distance en plus du classement de ces poses. Une pose productive est définie
comme une pose permettant la formation du 2ème intermédiaire tétraédrique conduisant à
l’acylation de l’accepteur d’acyle. Les critères de distance permettant l’attaque nucléophile et
l’acylation du groupement amine, de l’acide aminé, par le groupement hydroxyle de l’acide
gras sont :
- Une distance inférieure à 4 Å entre groupement nucléophile de l’accepteur d’acyle
(amine) et la fonction carbonyle de l’acyl-enzyme
- une distance inférieure à 4 Å entre l’His224, qui intervient dans l’attaque nucléophile
par transfert d’un proton, et le groupement amine de l’accepteur d’acyle
- une distance inférieure à 4 Å entre l’amine secondaire de l’His224 et la chaîne latérale
de la Ser105 permettant de vérifier le maintien de la conformation du site actif.
Figure 2.7 : Représentation des orientations du ligand au niveau du site actif (Venkatachalam
et al., 2003)
111
112
CHAPITRE III : PERFORMANCES DES LIPASES POUR LA
RÉACTION D’ACYLATION ENZYMATIQUE DES ACIDES AMINÉS
113
114
Chapitre III : Performances des lipases pour la réaction d’acylation des acides aminés
3 Chapitre III : Performances des lipases pour la réaction d’acylation

enzymatique des acides aminés
3.1 Introduction :
Le développement de procédés enzymatiques d’acylation d’acides aminés présente plusieurs
enjeux majeurs environnementaux et économiques. En effet, la réaction chimique actuellement
utilisée à l’échelle industrielle présente un impact environnemental important, remettant en
question l’adéquation de cette méthode de production. Cela a conduit à l’émergence de projets
de développement de procédés éco-compatibles durables afin d’atténuer les effets négatifs de
cette voie de synthèse. L’objectif global de cette thèse est de contribuer à la mise en place d’un
procédé d’acylation enzymatique d’acides aminés par des acides gras, dans des conditions
réactionnelles plus respectueuses de l’environnement. Afin de respecter les règles de la chimie
verte, il est crucial de choisir au mieux la combinaison « enzyme/solvant réactionnel/conditions
réactionnelles » la plus adaptée pour réaliser la réaction de synthèse du produit souhaité, sans
production de molécules secondaires, tout en réduisant les étapes de préparation du produit fini
(Sheldon, 2012 ; Sheldon, Woodley, 2018b). Lors de cette étude, l’aptitude d’enzymes
spécifiques à catalyser la réaction d’acylation des acides aminés en général, puis en se focalisant
sur la réaction de production de certains surfactants à intérêt industriel (10-undécénoyl-
phénylalanine, octanoyl-glycine, …) a été évaluée. Ces molécules ont été décrites dans la
littérature comme possédant des propriétés biologiques très attractives pour des applications en
cosmétique (agent dépigmentant de peau, agent anti-âge, agent antibactérien,…) (Bissett et al.,
2009a ; Sreenu et al., 2015 ; Pinazo et al., 2016 ; Mangodt et al., 2019). Certaines études ont
décrit la capacité d’enzymes telles que les lipases (Montet et al., 1990 ; Valivety et al., 1997),
les protéases (Bernal, Guzman, et al., 2018b) et les acylases (Koreishi et al., 2005a ; Dettori et
al., 2017 ; Takakura, Asano, 2019) à catalyser la réaction de N-acylation des acides aminés. Par
ailleurs, chaque catégorie d’enzymes présente des spécificités de substrat avec des chimio-,
régio- et énantio-sélectivités très différentes. Dans notre cas, la N-acylation des acides aminés
sur l’amine en position alpha est la réaction la plus recherchée. Peu d’études ont décrit l’aptitude
d’enzymes à réaliser ce type de réaction (Koreishi et al., 2006a ; 2005a ; Takakura, Asano,
2019).
La première stratégie suivie dans notre étude a concerné l’utilisation des hydrolases telles que
les lipases, en particulier la lipase B de Candida antarctica (CALB) en milieu non
conventionnel. Cette dernière a été largement étudiée autant pour ses performances
hydrolytiques d’esters d’acides gras ainsi que pour sa chimio-, régio- et énantio-sélectivité lors
115
des réactions de synthèse : estérification, amidation, aminolyse, résolution de mélange

racémique… (Krishna, Karanth, 2002 ; Husson et al., 2008b ; Durand et al., 2013a ; Neta et al.,
2015 ; Gérard et al., 2017a). En effet, ces enzymes ont été décrites dans la littérature comme
capables de réaliser des réactions d’acylation de molécules fonctionnelles telles que les sucres,
les flavonoïdes, les amino-alcools et les acides aminés, à intérêt cosmétique, dans des milieux
réactionnels anhydres tels que les solvants organiques, les liquides ioniques et le CO2
supercritique (Khan, Rathod, 2015 ; Miguez et al., 2018 ; Tripathy et al., 2018). Ces enzymes
ont été largement utilisées pour catalyser les réactions de O-acylation tandis que leur mise en
œuvre dans les réactions de N-acylation des molécules, en particulier celles des acides aminés,
ont été très peu décrites. Très peu d’informations sur la N-acylation des acides aminés, autres
que la lysine et les esters de certains acides aminés tels que la glycine, sont disponibles dans la
littérature (Montet et al., 1990 ; Izumi et al., 1997 ; Valivety et al., 1997 ; 1998 ; Soo et al.,
2004b ; Bidin et al., 2009 ; Bernal, Guzman, et al., 2018b).
Le but de cette étude est d’évaluer la spécificité de substrat et la sélectivité de CALB pour la
réaction d’acylation des acides aminés dans différents milieux réactionnels. Plusieurs études
précédentes réalisées in-silico et in-vitro ont montré que CALB présente une régio-sélectivité
orientée en majorité vers l’amine en position epsilon de la lysine mais aucune étude de
sélectivité envers les autres acides aminés n’a été menée (Ferrari et al., 2014a ; L. Dettori,
Jelsch, et al., 2018b). Afin de développer un procédé respectueux de l’environnement, les
solvants réactionnels non aqueux les plus éco-compatibles (CO2 supercritique, solvants
eutectiques, …) ont été testés en plus des solvants organiques. D’autre part, afin de consolider
les résultats expérimentaux obtenus, une étude par modélisation moléculaire des interactions
acyl-enzyme/acides aminés a été réalisée à la fin de cette partie.
3.2 Acylation enzymatique catalysée par les lipases en solvant organique

L’objectif de cette étude préliminaire est de vérifier la faisabilité de l’acylation enzymatique
des acides aminés par CALB et déterminer la chimio- et régiosélectivité de l’enzyme en solvant
organique. Pour cela, plusieurs réactions ont été mises en œuvre en utilisant l’acide
undécénoïque (0,24 M) comme agent acylant en présence des 22 acides aminés protéinogènes
(0,12 M). Le choix de l’acide undécénoïque comme donneur d’acyle a été motivé par son intérêt
cosmétique en particulier pour l’obtention de l’undécénoyl-phénylalanine (Bissett et al.,
2009a). La réaction a été réalisée dans du 2-méthyl-2-butanol à 55°C pendant 48h (Husson et
al., 2010a). Afin que les substrats soient sous forme neutre, de la triéthylamine (TEA) a été
ajoutée à hauteur de 2.4 M en concentration finale (Reyes-Duarte et al., 2002). Le mélange
116
réactionnel a été analysé par HPLC et par LC-MS-MS afin de détecter l’apparition de produits
acylés et d’évaluer la sélectivité de la réaction. Sur les 22 acides aminés, la lysine a été acylée
uniquement sur l’amine de sa chaine latérale (figure 3.1). En effet, l’analyse par LC-MS-MS a
montré l’apparition d’un seul produit monoacylé correspondant au rapport m/z de 313 (Figure
3.1 A). La fragmentation de ce dernier a généré un seul ion fils majoritaire correspondant à la
libération du groupement carboxylique présent à l’extrémité de la molécule (Figure 3.1 B). Cela
n’est pas le cas de l’-10-undécénoyl-lysine (standards commercial) dont la libération du
groupement carboxylique est moins prononcée, avec le [C11’K - 2 H2O + H]+ comme ion fils
majoritaire (figure 3.1 C). Cela confirme l’acylation sur l’amine en position epsilon de la lysine.
Ces résultats sont en accord avec des études antérieures qui avaient mis en évidence la
régiosélectivité de CALB orientée vers l’amine en position epsilon de la lysine. Montet et al.
1990 avaient réalisé des réactions avec des acides gras issus de l’hydrolyse de triglycérides et
la lysine en présence de CALB. A l’issue de cette réaction, il a été montré que la lysine est
acylée avec plusieurs acides gras (acides laurique et oléique) exclusivement sur la fonction
amine de la chaine latérale (position epsilon). Les produits issus de cette réaction présentent
une solubilité très faible dans l’eau, ce qui leur confère un intérêt en cosmétique en tant
qu’agents de surface résistant à l’eau (Montet et al., 1990). D’autres auteurs se sont intéressés
à l’étude in-silico des interactions acyle-enzyme/substrat avec des peptides ou acides aminés
(Ferrari et al., 2014a ; L. Dettori, Jelsch, et al., 2018b). Dettori et al., 2018 ont réalisé une étude
approfondie in-silico par docking flexible sur les interactions entre l’oleoyl-CALB et la lysine.
Les résultats de simulation par docking ont d’abord montré deux orientations possibles de la
lysine dans la cavité catalytique, selon que la fonction amine NH2 α (N terminal) ou la fonction
amine NH2  (chaîne latérale) pointe vers les résidus catalytiques. Les deux familles de
complexes obtenues ont été analysées selon des critères de distance entre la fonction amine
dirigée vers la triade catalytique et, d’une part (i) le groupement carbonyle de l’acyle enzyme
formé par fixation de l’acide gras sur la sérine catalytique 105, d’autre part (ii) l’azote de
l’histidine catalytique 224. Ces mesures ont été complétées par des calculs d’énergie
d’interaction électrostatique entre la lysine et les résidus de la triade catalytique, ainsi que 24
autres résidus de la cavité catalytique. Les résultats obtenus sur la base des critères de distance
et d’énergie ont suggéré l’acylation quasi exclusive de la fonction amine  de la lysine. Par
ailleurs, en observant de manière plus détaillée la cavité catalytique de l’enzyme CALB, Dettori
et al. ont observé que les résidus Gln157 et Ser153 localisés à l’opposé de la triade catalytique
interagissent avec la fonction amine dans le cas de l’orientation α, ce qui pourrait expliquer le
117
manque d’interaction observé avec l’His224 de la triade catalytique, et par suite, l’absence
quasi-totale de lysine N-acylée en position α.
Figure 3.1 : analyse LC-MS-MS des produits de la réaction d’acylation de la lysine A. suivi
MS de l’élution du produit monoacylé (313 m/z) au cours du temps B. fragmentation MS2 du
produit issu de la réaction (temps de rétention 9,26 min) correspondant à l’-10-undécénoyl-
lysine C. fragmentation MS2 de l’-undécénoyl-lysine à titre de comparaison.
Concernant l’acylation des autres acides aminés, les analyses en LC-MS-MS ont montré
l’apparition de glycine acylée en très faible quantité ainsi que des traces de phénylalanine
acylée. La N-acylation de la glycine a été confirmée en comparant le profil de fragmentation
avec celui du produit de référence. La fragmentation du produit acylé montre l’apparition d’ions
fils correspondant aux ions [MMproduit - O2 + H]+ et [produit - COOH], ce qui confirme
l’acylation sur le groupement amine de la glycine (Figure 3.2). Certains auteurs se sont
intéressés à l’acylation de la glycine avec de l’acide arachidonique en utilisant CALB comme
catalyseur (Goujard et al., 2004). Ils ont montré que CALB est capable de catalyser la réaction
d’acylation de la glycine avec de très faibles taux de conversion. Par ailleurs, la modification
de la structure de l’accepteur d’acyle (glycine) par l’utilisation d’une forme ester a permis une
118
amélioration significative du taux de conversion passant de moins de 10 % avec la glycine à

plus de 75% en utilisant l’ester de glycine et d’acide tert-butylique. Cette augmentation de
rendement a été reliée à l’amélioration de la solubilité de l’acide aminé sous forme ester
aliphatique (Goujard et al., 2004). D’autres auteurs expliquent cette amélioration par
l’utilisation de molécules dites « activées » (ester de peptide, par exemple), permettant un
meilleur contrôle de la cinétique de la réaction et l’orientation de la réaction de synthèse en
faveur de l’acylation du groupement amine (Hanefeld, Lefferts, 2018).
Pour expliquer certains de ces résultats à l’échelle moléculaire, Dettori et al. (2017) ont mené
des simulations de docking moléculaire en utilisant la glycine en présence de l’oléoyl-CALB
comme structure modèle d’acyl-enzyme. Les résultats ont montré que la glycine, en raison de
sa petite taille, avait du mal à se positionner et se stabiliser au sein de la cavité du site actif
engendrant de très faibles interactions avec les résidus catalytiques. Des simulations menées
avec des esters de glycine (glycine méthyl ester, glycine éthyle ester et glycine tert butyl ester)
ont suggéré une meilleure stabilisation de la glycine dans la cavité ainsi qu’une amélioration de
ses interactions avec les acides aminés constituant les parois de la cavité et les résidus du site
actif. Des réactions d’acylation de la glycine et de ses différents dérivés par l’acide oléique
comme donneur d’acyle ont permis de confirmer ces résultats. En effet, une augmentation du
taux de conversion a été observée en présence d’ester de glycine, comparativement à la glycine.
Plus précisément, les taux de conversion les plus élevés ont été observés avec les esters de
glycine les plus encombrés, un taux de conversion de 100% étant obtenu en présence de l’ester
tert-butylique de glycine (Dettori, 2017).
119
Figure 3.2 : fragmentation MS2 du 10-undécénoyl-glycine A. fragmentation MS2 du produit

de la réaction de synthèse en présence de CALB B. fragmentation MS2 du produit de
référence
L’acylation des acides aminés autres que la lysine et la glycine n’a pas pu être réalisée en
présence de CALB dans les conditions réactionnelles appliquées. Plusieurs facteurs sont
susceptibles d’expliquer cette absence de réaction. Tout d’abord, la faible solubilité des acides
aminés dans les solvants organiques tels que le 2-méthyl-2-butanol, mais aussi peut-être, une
faible spécificité de CALB vis-à-vis des acides aminés. Le manque de données dans la
littérature sur l’acylation des acides aminés catalysée par les lipases ne nous permet cependant
pas de confirmer cette seconde hypothèse. La faible solubilité des molécules polaires dans les
solvants organiques a souvent été pragmatiquement considérée comme la cause de la faible
activité des lipases pour l’acylation de ces molécules (Soo et al., 2003b ; Zhang et al., 2005 ;
Husson et al., 2009b ; 2011 ; Durand et al., 2015b). Afin de remédier à ce problème, plusieurs
stratégies peuvent être envisagées, soit par la modification de la structure du substrat afin
d’améliorer sa solubilité, ou par l’utilisation de solvant réactionnel plus adapté. La première
stratégie a montré une certaine efficacité mais nécessite le passage par plusieurs étapes de
protection et déprotection du groupement carboxylique par l’utilisation de solvants organiques
(Goujard et al., 2004). Cependant, l’objectif de ce travail est de trouver le moyen de réaliser la
120
N-acylation des acides aminés tels que la phénylalanine en réduisant au maximum les étapes de
production et en utilisant des milieux réactionnels éco-compatibles, dans des conditions
respectueuses de l’environnement. A cet effet, la deuxième stratégie semble la plus adaptée.
Plusieurs milieux réactionnels permettant une meilleure solubilisation des molécules polaires
et apolaires avec des propriétés physiques et physicochimiques très attractives ont été décrits
dans la littérature. L’émergence de solvants réactionnels tels que les liquides ioniques, les
solvants eutectiques profonds, le CO2 supercritique ou la combinaison de plusieurs solvants
(milieux biphasique) ont ouvert une multitude de possibilités faisant apparaître des potentialités
alors peu connues chez les lipases (Lozano, 2010b ; Durand et al., 2013a ; Gérard et al., 2017b).
Les liquides ioniques, en dépit de quelques inconvénients, ont été considérés comme une
alternative prometteuse. Certains d’entre eux permettent en effet une amélioration de la
solubilisation des deux composés polaire et apolaire (selon le solvant préparé) ce qui permet,
dans certaines études, d’améliorer l’activité lipasique (Husson et al., 2008b). En revanche,
certaines études ont montré une certaine toxicité de ces derniers vis-à-vis de l’environnement ;
en plus de la complexité amont de leur synthèse, conduisant à des coûts très dissuasifs pour un
développement industriel (Costa et al., 2017). C’est pourquoi, ce type de solvant n’a pas été
évalué dans cette étude. Les solvants eutectiques profonds appartiennent à la même catégorie
que les solvants ioniques mais avec une voie de préparation plus simple qui fait appel à des
molécules naturelles biodégradables (on parle alors de NADES, Natural Deep Eutectic
Solvant). Leur coût est aussi, de ce fait, bien moindre. Le CO2 supercritique est lui l’un des
solvants réactionnels les plus écologiques, permettant la solubilisation des molécules, en
particulier apolaires (ou polaires mais avec des volatilités assez élevées). Un objectif de ce
travail étant de pouvoir produire une des molécules à intérêt cosmétique industriel qui est le 10-
N-undécénoyl-phénylalanine, nous avons donc souhaité focaliser nos travaux sur cette réaction
d’acylation de la phénylalanine par l’acide 10-undécénoïque, afin d’évaluer les performances
catalytiques obtenues dans les différents solvants réactionnels mentionnés ci-dessus.
3.3 Acylation enzymatique sous CO2 supercritique

Le CO2 supercritique est un solvant très prometteur en raison de son éco-compatibilité et de sa
disponibilité. De plus, les conditions pour atteindre le point critique sont assez douces (pression
de 73 Bars et température de 31°C), ce qui permet de préserver l’intégrité structurale des
enzymes et des molécules thermolabiles. L’avantage principal de ce solvant réside dans ses
propriétés physiques dont sa densité qui est comparable à celle des liquides et sa diffusivité qui
est comparable à celle d’un gaz, avec une viscosité également proche de celle d’un gaz. On peut
121
ajuster le pouvoir solvant du CO2 supercritique en augmentant sa densité par action sur le couple
pression-température. Avec des substrats apolaires et grâce à sa très faible viscosité, le CO 2
supercritique permet de faciliter l’accès des substrats au site actif de l’enzyme (en général
immobilisée dans des support poreux polymériques), ce qui peut améliorer considérablement
l’activité (Dumont et al., 1992). Cependant, son caractère hydrophobe demeure incompatible
avec l’utilisation de molécules polaires et non volatiles tels que les acides aminés, conduisant à
une très faible solubilité de l’ordre de 10-7 à 10-8 en fraction molaire (Vedaraman et al., 2004b ;
Payne, Kerton, 2010). Plusieurs réactions d’acylation enzymatique de la phénylalanine et de la
glycine avec l’acide 10-undécénoique et l’acide octanoïque pour la production du 10-
undécénoyl-phénylalanine (C11’F) et l’octanoyl-glycine (C8G), respectivement, ont été
réalisées en utilisant CALB immobilisée (Lipozyme 435, Novozymes, Danemark). La lipase
utilisée a été préalablement conservée dans une jarre hermétiquement fermée contenant une
solution saturée de chlorure de lithium afin de réguler l’activité de l’eau des billes d’enzyme à
0,11. Les réactions ont été réalisées suivant les conditions présentées dans le tableau 3.1. Afin
de réduire la quantité d’eau apportée dans le système, un faible débit d’alimentation des
substrats a été imposé. Par ailleurs, la solubilité de la glycine dans le tampon étant bien plus
importante que celle de la phénylalanine dans le tampon et étant limité par le débit
d’alimentation du réacteur, les concentrations finales étaient elles-mêmes très limitées par
l’installation.
A la fin de la réaction, un important dépôt blanc a été observé au niveau du mélangeur statique
(Figure 3.3 A). L’analyse des produits après 1 h de réaction n’a pas montré d’apparition de
produit à base de phénylalanine ou de glycine. Ceci peut s’expliquer par le fait que le CO 2
supercritique est tout de même capable de solubiliser de très faibles quantités d’eau et ainsi de
limiter le rôle de cosolvant de cette dernière, en favorisant la précipitation de l’acide aminé. On
parle alors d’effet anti-solvant du CO2 supercritique. La précipitation a été observée
principalement au niveau du mélangeur statique mais aussi dans le tubing. Comme il a été
démontré qu’il n’y avait pas d’impact significatif de la variation de pression et de température
sur la solubilité ultra faible des acides aminés tels que la phénylalanine dans le CO 2
supercritique, la modification du système par l’amélioration du contact entre les deux substrats
et l’enzyme est apparue comme une source d’amélioration potentielle de cette faible solubilité
(Gao et al., 2002).
122
Tableau 3-1 : conditions réactionnelles lors de la synthèse du C11’F et du C8G sous scCO2
Conditions C11’F C8G

Réacteur Lit fixe
iCALB (Lipozyme 435) 300 mg
Pression/température 200 Bars / 55°C
3 mL / min en liquide et 3.94 mL/min en
Débit de scCO2
scCO2
Solution d’acide aminé (préparé soit dans du
Phénylalanine (20 g/L) Glycine (118 g/L)
tampon tris HCl 25 mM ou de l’éthanol)
Acide gras Acide 10-undécénoique Acide octanoïque
Débit des substrats 0.025 mL/min 0.025 mL/min
Ratio molaire AG/AA 243 / 6 157 / 39
Figure 3.3 : configuration du système sous scCO2 utilisé A. configuration initiale B.

configuration modifiée
Afin de remédier à ce problème, quelques modifications sur l’équipement utilisé ont été
réalisées dans le but de réduire au maximum le volume mort. Elles consistent à remplacer
l’utilisation du mélangeur statique, qui correspond au lieu de précipitation des acides aminés,
par un mélangeur en T, mis en place avant introduction des substrats (figure 3.3.B). Cela permet
de préparer un mélange émulsionné (huile/eau/acide aminé) avant le contact avec le scCO2, qui
123
va être fortement amélioré au contact avec le scCO2 par effet de cisaillement, sachant que le
débit global d’introduction des substrats est de 0,05 mL/min contre 3,94 mL/min pour le scCO2.
Afin de tester l’efficacité du système, la réaction de synthèse du 10-undécénoyl-phénylalanine
dans les mêmes conditions précédentes a été mise en œuvre. Les premières observations ont
montré que ces petites modifications ont permis d’avoir un meilleur rendement de récupération
qui peut aller jusqu’à 70 % au lieu d’environ 20 % avec le système initial. Ceci peut être
expliqué par l’amélioration de l’entrainement des deux substrats en même temps par le CO2
sans précipitation importante de l’acide aminé. Cependant, une très faible quantité de produit a
été obtenue, observée par LC-MS-MS. L’utilisation de co-solvant tel que l’éthanol n’a pas
permis d’améliorer ces rendements. Plusieurs phénomènes peuvent expliquer les résultats
obtenus. L’utilisation du tampon pour la solubilisation des acides aminés peut engendrer une
augmentation de l’activité de l’eau à la surface des billes de CALB, qui devrait être inférieure
à 0,2, ce qui perturbe l’activité synthétique de l’enzyme (Humeau et al., 1998). Il est possible
d’évaluer la quantité d’eau qui peut-être solubilisée par le CO2 supercritique dans ces conditions
(55°C, 200 bars) connaissant la masse volumique de ce dernier ( =  kg/m3) et en utilisant
𝐴
la corrélation de Chrastil : 𝐶 = 𝜌𝑘 𝑒 (𝑇+𝐵) sachant que k, A et B sont des constantes (A = -
−2826,4
2826,4, B = -0,81, k = 1,549). C = 754.11.549 × 𝑒 ( 328.15 −0.81) = 0,00231 kg/m3 = 2,31 mg
d’eau/L de CO2.
En d’autres termes, 1 L de CO2 supercritique à 55°C et 200 bars peut solubiliser 2,31 mg d’eau.
Sachant que le débit de CO2 est de 3 mL/min pendant 60 minutes. Le volume de CO2 final est
de 180 mL donc la quantité d’eau qui peut être solubilisée est de 0,416 mg, alors que la quantité
d’eau apportée était de 1,5 g (Q = 0,025 mL/min). Cela signifie qu’une importante quantité
d’eau reste dans l’installation. En plus du risque de changer l’équilibre thermodynamique de la
réaction vers la réaction d’hydrolyse, la dissolution du CO2 dans l’eau conduit à l’apparition
d’acide carbonique, provoquant une acidification du microenvironnement aqueux de l’enzyme.
Ce dernier peut se dissocier par la suite pour former des ions bicarbonate provoquant des
perturbations de l’activité enzymatique. Ce phénomène a été mis en cause lors de la perte
d’activité enzymatique en milieu biphasique eau/scCO2 par certains auteurs. Afin de remédier
à cela, ils ont pu éviter la dissociation de l’acide carbonique par l’ajout de bicarbonate de sodium
permettant d’améliorer l’énantio-sélectivité de l’alcool déshydrogénase utilisée (Harada et al.,
2009b). Les anions bicarbonates formés après dissociation de l’acide carbonique peuvent réagir
avec l’amine secondaire des lysines présentes à la surface de l’enzyme formant ainsi des
124
carbamates. La carbamatation de la lysine peut influencer significativement l’activité

enzymatique. En effet, certains auteurs décrivent une inactivation de l’activité de la lipase de
Candida rugosa lors de la réaction d’estérification du citronellol avec l’acide n-butyrique. La
perte d’activité était reliée à la carbamatation des lysines présentes au niveau du site actif
réduisant l’accessibilité à ce dernier (Habulin, Željko Knez, 2001). CALB présente aussi des
résidus lysine situés à sa surface dont 5 sont présents du côté opposé au site actif et une autre
proche de l’entrée de la cavité catalytique. Dos Santos et al (2016) ont observé la perte d’activité
de CALB immobilisée (Lipozyme 435) lors de la réaction d’estérification de l’acide oléique
avec le méthanol sous scCO2, en mode batch. L’analyse structurale de l’enzyme par
spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) a montré une différence d’absorption
entre l’enzyme utilisée et non utilisée à un nombre d’onde de 1735 cm-1 environ très proche de
la plage de nombre d’onde de 1600-1700 cm-1 couramment considérée comme correspondant
aux amides primaires (figure 3.4). Ce changement conformationnel de la structure secondaire
de l’enzyme immobilisée correspondrait, selon les auteurs, à la formation de liaisons covalentes
avec les groupements amine. Il s’agirait de liaisons carbamates sur l’enzyme induisant une
réduction de son activité enzymatique (Dos Santos, Rezende, et al., 2016b). Dans le cadre des
essais de synthèse de C11’F et C8G, en raison de l’humidité perturbant l’analyse, ces données
n’ont pas été considérées comme fiables. Un procédé de séchage thermique pourrait permettre
de résoudre le problème mais conduit hélas à la rupture des liaisons carbamates, ce qui
fausserait aussi les résultats (Matsuda, 2013b). Les résultats des analyses FTIR des réactions de
production d’acétate de géraniol que nous avons menées en réacteur continu présentaient
néanmoins les mêmes tendances que celles observées par Dos Santos et al (2016). En effet, une
variation de la transmittance a été observée en particulier au niveau du nombre d’onde 1735
cm-1 correspondant aux liaisons amides primaires (Figure 3.5.A). Par ailleurs, ce nombre d’onde
correspondant aussi aux vibrations des liaisons esters présentes au niveau du produit de la
réaction (acétate de géraniol), l’interprétation des résultats a été plus compliquée (Figure 3.5.B).
C’est pourquoi, ces résultats n’ont pas été présentés dans cette étude mais l’hypothèse d’une
perturbation de l’activité enzymatique après formation des carbamates à la surface de l’enzyme
reste la plus probable pour justifier l’absence d’activité en se basant sur la littérature (Dos
Santos, Rezende, et al., 2016b). Certains auteurs ont proposé des solutions au problème de
carbamatation de la lysine de surface de CALB par la protection des groupements amine de la
chaine latérale de la lysine. Monhemi et Housaindokht (2016) ont réalisé une étude in silico sur
les modifications chimiques de CALB permettant d’augmenter la stabilité de l’enzyme sous
scCO2. Ils ont démontré que l’acétylation des résidus lysine permettait de protéger l’enzyme
125
contre la dénaturation thermique dans l’eau mais ils n’ont pas observé de stabilisation sous
scCO2. Par contre, une carboxylation et une méthylation de ces résidus permettaient une bien
meilleure protection contre la carbamatation de ces résidus sous scCO2. Sachant que ces
carbamates sont formés par l’interaction entre les ions bicarbonate et les groupements amine,
les amines libres des acides aminés utilisés comme substrats peuvent aussi former des
carbamates. Dans ce cas, les amines libres réactives ne sont plus disponibles pour la réaction,
ce qui rend la réaction de N-acylation impossible dans ces conditions. Afin d’éviter ou de
réduire l’apport d’eau dans le système, des réactions ont été effectuées soit en déposant
directement une certaine quantité de l’acide aminé sur le lit de billes de CALB à l’extrémité du
réacteur à lit fixe par laquelle le deuxième substrat (acide gras) et le CO2 rentrent, ou par
l’introduction d’un débit moins important de substrat (7 µL / min) et donc moins d’eau (420
mg total solubilisable par le CO2). Les analyses n’ont pas montré d’apparition de produit sans
doute à cause des trop faibles concentrations en substrat (acide aminé) solubilisé et produit
(amide) entraîné par le scCO2
Figure 3.4 : spectre FTIR de CALB immobilisé non traité et traité avec du scCO2 pendant 1 h
à 10 MPa et 6 h à 20 MPa et à 40°C a. spectre FTIR complet b. spectre FTIR normalisé à un
intervalle de nombre d’ondes de 1800-1500 cm-1 (Dos Santos, Rezende, et al., 2016b)
126
A. B.
Amide =1735 Lipozyme 435 0,2
v(C-O) et v(C-OH)
cm-1 55°C 200Bar
Absorbance (AU)
0,15
1735 cm-1 =
0,1 v(C=O) (ester)
0,05 3100-2850 cm-1

= -CH3, -CH2-
0
1800 1700 1600 1500
Nombres d'onde (cm-1)
Figure 3.5 : A. spectre FTIR normalisé à un intervalle de nombre d’ondes de 1800-1500 cm-
1de CALB immobilisée (Lipozyme 435) avant et après traitement (55°C 200 Bar) avec du
scCO2 pendant 30 min à 200 Bar et à 55°C B. spectre FTIR caractéristique de l’acétate de
géraniol
Etant donné les problèmes de solubilité des acides aminés sous scCO2 et les problèmes liés à
l’interaction du CO2 avec les amines libres (ceux des résidus lysine de surface de l’enzyme et
ceux des acides aminés utilisés comme substrats), il a été nécessaire d’envisager d’autres
systèmes réactionnels que le scCO2, qui n’est pas adapté aux réactions de N-acylation d’acides
aminés. Pour cette réaction, il a été recherché des milieux liquides permettant la solubilisation
des substrats tels que les acides aminés, avec une activité d’eau assez faible pour maintenir une
bonne activité des lipases. Les solvants eutectiques profonds (DES en Anglais) entrent dans ce
cadre.
3.4 Acylation enzymatique en solvants eutectiques

Les solvants eutectiques représentent une alternative intéressante au CO2 supercritique pour le
type de réaction envisagé. En effet, leur non-volatilité, leur faible toxicité, leur biocompatibilité,
leur biodégradabilité en plus de leur disponibilité à faible coût les a rendu très attractifs pour
diverses applications (Qinghua Zhang et al., 2012 ; Hayyan, Hashim, Hayyan, et al., 2013 ;
Durand et al., 2013b). Leur faible activité de l’eau permet de maintenir des conditions
réactionnelles favorables aux lipases. Plusieurs études ont démontré de meilleures
performances des biocatalyseurs enzymatiques dans ce genre de solvant réactionnel par rapport
aux liquides ioniques et solvants organiques (Gorke et al., 2008b ; Zhao et al., 2011). La
biocatalyse par l’utilisation des lipases dans ces milieux a aussi largement été décrite. Parmi les
lipases évaluées, plusieurs auteurs ont mis en évidence la supériorité catalytique de CALB par
rapport aux autres enzymes dans ces milieux réactionnels pour plusieurs réactions telles que la
transestérification et l’alcoolyse (Gorke et al., 2008b ; Zhao et al., 2013b ; Durand et al., 2013a).
127
Une multitude de solvants eutectiques ont été utilisés pour des réactions de synthèse et
d’hydrolyse (Pätzold et al., 2019). Parmi ces derniers, les mélanges eutectiques profonds
choline chloride / urée (ccu) et choline chloride / glycérol (ccg) sont les plus utilisés pour les
réactions avec CALB (Gorke et al., 2008b ; Durand et al., 2012b). Ces solvants eutectiques se
caractérisent par une température de fusion basse (12 et -40°C, respectivement), une viscosité
qui varie beaucoup selon la température (ccu : 750 cP à 25°C ➔ 169 cP à 40°C, ccg : 376 cP à
20°C ➔ 79 cP à 50°C) et une polarité similaire (0,84 selon le concept de Reichardt’s Dye 30)
(Durand, 2013b). Durand et al (2013) ont aussi montré une bonne activité de CALB dans ces
deux solvants pour la réaction d’alcoolyse entre des composés phénoliques et le butanol avec
une meilleure activité dans le milieu choline chloride / urée. La détermination du pH des deux
solvants, au ratio molaire sel d’ammonium / donneur de liaison hydrogène (DLH) de 1/2, a
montré un pH aux alentours de 8 en présence d’urée comme DLH et de 4 en présence de
glycérol comme DLH. Un pH bas (très) inférieur au pKa des amines (de l’ordre de 9) implique
une faible proportion voire une absence totale d’acides aminés ayant leur(s) amine(s)sous forme
NH2, au profit de la forme chargée NH3+. Ceci est susceptible de réduire les interactions enzyme
/ substrat, ce qui pourrait expliquer la faible activité observée en présence de glycérol. De
manière intéressante, l’ajout d’environ 10 % d’eau minimum est apparu nécessaire pour
observer une activité enzymatique maximale avec une meilleure stabilité de l’enzyme, la baisse
de viscosité liée à l’eau ajoutée améliorant sans doute les transferts de matière enzyme-substrat
(Durand et al., 2013b). En revanche, la présence d’une quantité trop élevée d’eau a conduit à
un changement de l’équilibre thermodynamique de la réaction en faveur d’une réaction
d’hydrolyse (Durand et al., 2014). Au-delà de l’amélioration de l’activité par ajout d’eau, un
changement de sélectivité de l’enzyme a aussi été observé lors de la transestérification du vinyl
laurate avec des alcools de différentes longueurs de chaine, ce qui pourrait être le cas lors de
l’acylation des acides aminés (Durand et al., 2012b). Sur la base de ces données et afin d’évaluer
la possible utilisation de ces solvants pour la N-acylation d’acides aminés, le mélange
eutectique profond (MEP) choline chloride / urée avec un ratio molaire de 1/2 a été utilisé.
Avant de débuter les réactions, un suivi de l’évolution de l’activité de l’eau (aW) en fonction de
la quantité d’eau ajouté a été réalisé dans le but d’atteindre une aW de l’ordre de 0,2 nécessaire
au bon fonctionnement de CALB. Les résultats représentés dans la figure 3.6 montrent que
l’ajout de 10 % d’eau permet d’atteindre rapidement une aW d’environ 0,2 en partant d’une aW
initiale de 0,03 ; ce qui est en concordance avec les résultats de Durand et al., (2013) où la
même quantité d’eau a été nécessaire pour avoir une bonne activité enzymatique (Durand et al.,
2013a). L’équilibration de l’aW a aussi été réalisée par la méthode des microclimats, par
128
l’utilisation d’une solution saturée de fluorure de potassium (aW = 0,27) mais un temps d’attente
de plus de trois semaines a été nécessaire pour atteindre une aW de 0,19.
0,2
0,15
aW
0,1
0,05
0
0% 5% 10%
% d’eau v/v
Figure 3.6 : suivi de l’évolution de l’activité de l’eau du mélange eutectique profond choline
chloride / urée (ratio molaire 1 / 2) en fonction de la quantité d’eau ajoutée.
Plusieurs réactions ont alors été mises en œuvre sous différentes conditions expérimentales dans
ce solvant eutectique (tableau 3.2). Initialement, CALB immobilisée commerciale (Lipozyme
450) a été utilisée pour les réactions d’acylation de la phénylalanine sous différentes conditions
de température, de ratio molaire entre substrats et de concentration d’enzyme. Les résultats ont
montré l’apparition d’une quantité très faible de phénylalanine N-acylée, non quantifiable,
quelles que soient les conditions testées. Ce résultat pourrait être attribué à l’importante
viscosité de ces solvants et qui peut engendrer des limitations de transfert de matière (Abbott et
al., 2004). Afin de vérifier cela, des réactions ont été effectuées à 45°C, en présence d’enzymes
non immobilisées : CALB libre ainsi que la lipase de Thermomyces lanuginosus (TL100) et
celle de Mucor miehei (Palatase). Les résultats de l’acylation enzymatique de la phénylalanine
avec l’acide undécenoïque ont montré l’apparition d’une quantité faible mais quantifiable de
produit en présence de ces trois lipases avec une meilleure activité en présence de CALB
(TL100 : 0,12 g/L, Palatase : 0,39 g/L et CALB : 0,56 g/L) après 48 h de réaction. Cela confirme
le problème de transfert de matière en présence de la CALB immobilisée. Par ailleurs, lors de
l’analyse par HPLC et détection fluorimétrique aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission
de la phénylalanine (257 et 282 nm respectivement), plusieurs pics de produits secondaires ont
été observés dans tous les cas (en présence et en absence d’enzyme libre ou immobilisée). Cette
apparition est accompagnée d’une réduction de la hauteur du pic de la phénylalanine qui va
réagir avec l’un des constituants du solvant eutectique et qui dépend de la température de la
réaction (apparition favorisée par l’augmentation de la température) (figure 3.7.a et b).
129
Tableau 3-2 : Résultats en solvants eutectiques après 24h, à une activité d’eau de 0,2
Quantification de la concentration
Conditions réactionnelles
de C11’F par HPLC-fluorimètrie
Enzyme : CALB immobilisée (Lipozyme Produit non quantifiable par

435) à 2, 4, 10 et 20 g/L fluorescence (très faible quantité
Ratio AG/AA: 0,24 / 0,12 ; 0,2 / 0,05 ; 0,1 visible en LC-MS)
/ 0,1 Apparition de plusieurs composés
T°C = 55 + 5°C et 45 + 5°C secondaires
Choline
chloride / Enzyme : Lipase de Thermomyces TL100 = 0,12 g/L (0,3%)
Urée (1/2) lanuginosus (TL100), Lipase de Mucor Palatase = 0,39 g/L (1%)
miehei (Palatase) et Lipase B de Candida CALB = 0,56 g/L (1,4%)
antarctica (CALB) libre à 0,5 g/L Apparition de plusieurs composés
Ratio AG/AA: 0,24 / 0,12 secondaires
T°C = 40 + 5°C
Choline CALB libre et immobilisée Absence de produit visible par

chloride / Ratio AG/AA: 0,24 / 0,12 et 0,1 / 0,1 fluorescence
Glycérol (1/2) T°C = 50 + 5°C Absence de composés secondaires,
Afin de confirmer le fait que la faible activité était due aux réactions secondaires avec le solvant,
des réactions en présence du mélange choline chloride / glycérol comme solvant dans les mêmes
conditions, ont été effectuées. Les analyses en HPLC-fluorimètrie ne montrent pas de variation
sur le pic de la phénylalanine et, logiquement, aucun produit secondaire n’est observé (figure
3.7.c). Cela signifie que les produits secondaires apparus avec le couple choline chloride / urée
(1/2) résultent de l’interaction de l’urée avec l’acide aminé, ce qui réduit considérablement la
quantité de substrat disponible pour les réactions de synthèse. Le fait que les réactions en
présence du mélange choline chloride/ glycérol n’ont pas permis de production de l’acide aminé
acylé pourrait être lié d’une part à la viscosité du milieu et d’autre part à la forte acidité du
solvant qui modifie l’état d’ionisation de l’enzyme (et de l’acide aminé), modifiant ainsi les
performances (Durand et al., 2013b).
130
a.
Phénylalanine C11’phe
b.
c.
Figure 3.7: chromatogrammes HPLC-fluorimètre des mélanges réactionnels a. Réaction

chloride / urée réalisé à 45  5°C, b. Réaction d’acylation de la phénylalanine en présence de
10 g/L de CALB immobilisé dans de la choline chloride / urée réalisé à 55  5°C, c. a. Réaction
chloride / glycérol réalisé à 55  5°C
Au regard des résultats obtenus en solvants eutectiques et de la présence de molécules

secondaires indésirables, les réactions en solvants eutectiques profonds n’ont pas abouti aux
résultats escomptés. D’autres milieux tels que les milieux biphasiques ont été envisagés, en
s’appuyant sur le caractère catalytique interfacial de la lipase.
3.5 Acylation enzymatique en milieu biphasique

Etant donné les faibles taux de conversion obtenus dans les milieux monophasiques
précédemment présentés, liés principalement à des problèmes de solubilité, de transfert de
matière ainsi qu’à la formation de co-produits, l’utilisation d’autres systèmes réactionnels
associant deux solvants de polarité différente a été envisagée. Ces milieux biphasiques ont été
largement décrits et utilisés dans la littérature pour des réactions faisant réagir deux substrats
131
de polarité opposée ou simplement pour l’amélioration de performances réactionnelles des

enzymes (Oliveira, Rosa, 2006 ; Lozano, 2010b ; Vobecká et al., 2018). Plusieurs milieux
biphasiques associant des milieux apolaires tels que le CO2 supercritique, les solvants
organiques ou par l’utilisation d’huile, qui jouera le rôle de solvant et de substrat, et des milieux
polaires tels que l’eau, les solvants eutectiques et les liquides ioniques ont été utilisés pour de
la biocatalyse en présence de lipases (Keskin et al., 2007b ; Kraai et al., 2008 ; Gérard et al.,
2017b ; 2017a ; Hommes et al., 2019). Dans notre étude, nous avons utilisé le système tampon
(tris base pH 8) / décane (50/50) pour l’évaluation de l’activité de CALB libre (0,5 g/L) lors de
la réaction de N-acylation de la phénylalanine (F : 0,12 M) avec l’acide undécénoïque (C11’ :
0,24 M) à 55°C sous forte agitation (1200 rpm) pour maximiser les interactions enzyme-
substrats. Sachant que le décane présente un log P supérieur à celui du C11’ et du produit acylé
(C11’F) cela pourrait favoriser la solubilisation de l’acide gras améliorant son accès au site actif
(tableau 3.3). L’analyse du milieu en HPLC-fluorimètrie et LC-MS-MS n’a malheureusement
pas montré l’apparition de produit acylé, après 48 h de réaction. D’autres réactions ont été
menées dans des systèmes contenant de l’hexane au lieu du décane ou en milieu fondu (l’acide
undécénoïque), mais aucun produit acylé n’a été observé. Les résultats décrits dans la littérature
ont été menés avec des enzymes présentant un volet moléculaire (lid) et une activation
interfaciale efficace. Par ailleurs, CALB présente un volet moléculaire moins développé que
plusieurs autres lipases ainsi qu’une faible activation interfaciale réduisant ainsi l’intérêt de
travailler dans des systèmes biphasiques eau / solvant organique (Martinelle et al., 1995 ; Zisis
et al., 2015).
Tableau 3-3 : logP des différentes molécules utilisées lors des réactions
Molécule C11’ F C11’F Décane Hexane Eau
LogP 3,99 1,11 5,05 6,07 3,94 -1,38
Les résultats de l’acylation enzymatique dans les différents solvants réactionnels ont montré
une très faible réactivité de CALB lors des réactions de N--acylation des acides aminés où
dans les meilleurs des cas, 1,5 % de conversion a été obtenu en solvant eutectique, avec
apparition de produits secondaires. Afin de vérifier si les faibles activités observées étaient
effectivement liées à un problème de mise en œuvre du procédé ou à une mauvaise interaction
entre l’enzyme et le substrat, et sachant que la structure de CALB est disponible, une étude par
modélisation moléculaire a été réalisée.
132
3.6 Étude par modélisation moléculaire de l’acylation enzymatique des

acides aminés, catalysée par CALB
Suite aux résultats obtenus lors de l’évaluation des performances de CALB dans différents
milieux pour la réaction d’acylation des acides aminés, une étude in-silico des interactions entre
CALB, le donneur d’acyle et les acides aminés a été menée. La structure cristallographique de
CALB a été élucidée en 1994 par Uppenberg et al. ; depuis plusieurs études ont été réalisées
afin de comprendre et d’anticiper le comportement de CALB dans les milieux réactionnels et
de prédire la régio- et chimio-sélectivité de la lipase lors de l’acylation de différentes molécules
polyfonctionnelles (Uppenberg et al., 1994a ; 1995 ; De Oliveira et al., 2009 ; Kumaresan et
al., 2011 ; Ferrari et al., 2014a ; Stauch et al., 2015 ; L. Dettori, Jelsch, et al., 2018b). Selon
Uppenberg et al. (1994), CALB présente une cavité catalytique d’une largeur de 10 Å × 4 Å et
de 12 Å de profondeur et ne présente pas de volet moléculaire responsable du phénomène
d’activation interfaciale. Elle comporte une triade catalytique (Ser105, His224 et Asp187) et un
trou oxyanion constitué des résidus Thr40 and Gln106. Au cours du mécanisme catalytique,
l’intermédiaire tétraédrique formé (dans les réactions d’acylation, cet intermédiaire résulte de
la fixation du donneur d’acyle sur la sérine catalytique par une liaison covalente) est stabilisé
par des interactions de type liaison hydrogène entre l’oxyanion et le groupement amine des
deux résidus constituant le trou oxyanion, ainsi qu’avec l’hydroxyle de la chaine latérale de la
Thr40. Les autres résidus formant la cavité du site actif sont majoritairement des résidus
hydrophobes aliphatiques (Leu140, Ala141, Leu144, Val149, Val154, Ile189, Leu278, Ala281,
Ala282, Ile285 et Ala286) ; on observe également quelques résidus polaires (Asp134 et Gln157)
(Uppenberg et al., 1994a).
En 2009, De Oliveira et al., ont mené des travaux de modélisation sur l’acétylation de
flavonoïdes (rutine et isoquercitrine), catalysée par CALB. Une méthodologie a été mise en
place pour étudier les modes d’interaction des substrats au niveau de la cavité catalytique et
identifier les complexes enzyme/substrats productifs, conduisant à l’acylation de ces molécules.
Les auteurs se sont basés sur l’évaluation des distances entre les groupements potentiellement
acylables du substrat et les résidus catalytiques de CALB (Ser105 et His224) et entre l’acyle à
greffer et les résidus du trou oxyanionique (Thr40 et Gln106) ; les interactions de type liaison
hydrogène entre les deux substrats et les résidus précités ont été analysées. Le travail de
simulation débute par plusieurs étapes de stabilisation de la structure de l’enzyme après fixation
du donneur d’acyle sur la serine catalytique (Ser105) afin de maintenir une structure protéique
la plus proche possible de la structure cristallographique et donc de la structure réelle de
l’enzyme (De Oliveira et al., 2009). Par une approche méthodologique similaire, Ferrari et al.
133
(2014) ont prédit la régio- et la chimio-sélectivité de CALB lors de la N-acylation de plusieurs

peptides avec l’acide oléique. Les résultats issus des modèles ont été confirmés
expérimentalement. Ainsi, ces auteurs ont montré que CALB conduit spécifiquement à
l’acylation du résidu lysine présent dans la structure des peptides étudiés, avec une sélectivité
vis-à-vis de la fonction amine de la chaine latérale (Ferrari et al., 2014a). Dettori et al., 2018
ont établi des conclusions similaires en réalisant une étude par modélisation moléculaire, suivie
d’une étude des énergies d’interactions électrostatiques entre l’acyle-enzyme (lauroyl)-CALB
et la lysine (Dettori et al., 2018b). D’autres auteurs ont utilisé les outils de modélisation
moléculaire afin d’expliquer l’absence de réaction observée lors de l’acylation de la quercétine,
catalysée par CALB à l’échelle expérimentale (Chebil et al., 2007b ; Bidouil et al., 2011). Ils
ont pu justifier l’absence de réaction par de fortes interactions hydrophobes entre le flavonoïde
et les résidus Ile189 et Ile285 qui stabilisent la molécule à l’entrée de la cavité du site actif,
limitant ainsi son accès aux résidus catalytiques (Bidouil, Basilio De Oliveira, et al., 2011).
Cette partie est consacrée à l’étude, à l’échelle moléculaire, de l’acylation des acides aminés,
catalysée par CALB, en présence d’acides gras comme donneurs d’acyles. L’objectif est de
trouver des éléments structuraux permettant de comprendre et d’expliquer les causes des faibles
rendements observés dans les différents milieux réactionnels. Sur la base des données
bibliographiques et des travaux réalisés antérieurement, qui stipulent que la sélectivité de
l’enzyme est liée aux modes d’interaction entre les substrats et les résidus formant la cavité
catalytique, plusieurs simulations ont été menées à l’aide d’outils de modélisation moléculaire.
Parmi ces outils, le docking moléculaire est l’un des plus utilisés pour étudier les interactions
entre une enzyme et son (ses) substrat(s). Cette méthode permet de prédire et de visualiser les
interactions les plus probables entre un ligand et le site actif d’une enzyme. Dans le cas de cette
étude, les substrats acides aminés sont définis comme des ligands dans le logiciel « Discovery
studio » ; la cible de docking, quant à elle, est le modèle d’acyl-enzyme préalablement généré
par l’établissement d’une liaison covalente entre le donneur d’acyle et la sérine catalytique
(Ser105), puis optimisée.
Dans ce travail, l’acylation de la phénylalanine par l’acide oléique a été modélisée dans un
premier temps. Des travaux antérieurs expérimentaux et de modélisation ayant déjà été menés
par notre équipe avec cet acide gras, le modèle d’acyl-enzyme développé dans ce cadre a pu
être utilisé comme cible de docking, sans modification.
Dans un second temps, la construction d’un modèle d’acyl-enzyme correspondant à l’acylation

de phénylalanine par l’acide 10-undécénoïque a été réalisée suivant la méthodologie décrite par
134
De Oliveira et al. (2011) et par Ferrari et al. (2014) afin de positionner correctement la chaîne
grasse dans la cavité enzymatique. Puis la géométrie du système a été optimisée par différentes
étapes de minimisation de l’énergie potentielle du système et des simulations de dynamique
moléculaire. La meilleure configuration générée a été utilisée comme cible pour les simulations
de docking de différents acides aminés, afin d’évaluer leurs interactions avec la cavité
catalytique.
Lors de cette étude, le module LibDock a été utilisé pour toutes les simulations de docking
moléculaire. Dans ce protocole de docking, l’acyl-enzyme est considéré comme un élément
rigide et le ligand (acide aminé dans notre cas) est considéré comme un élément flexible d’où
l’appellation « Docking rigide ». Le protocole de docking de LibDock est basé sur l’algorithme
développé par Diller, Merz, (2001). Il se déroule en plusieurs étapes comprenant la génération
des conformations du ligand, l’identification des points d’ancrage (hotspots), l’évaluation des
interactions possibles entre ces derniers et le ligand (docking) et enfin l’optimisation des
complexes (poses) générés et leurs classements selon la probabilité d’apparition (scoring) (Rao
et al., 2007). Le docking est réalisé suite à l’identification et le classement des points polaires
et apolaires présents au niveau du site actif de l’enzyme. Cela permet de cartographier les
hotspots qui seront utilisés pour évaluer les interactions hydrophiles et hydrophobes avec les
atomes polaires tels les atomes d’hydrogène de l’accepteur d’acyle (interactions hydrogènes)
ou les atomes apolaires tels les carbones (i.e. cycles aromatiques et chaines aliphatiques),
respectivement. L’étape d’optimisation consiste à retirer les poses qui ne sont pas favorables
du point de vue stérique (problème d’accessibilité) en utilisant l’algorithme d’optimisation
BFGS qui permet l’évaluation du potentiel stérique et des interactions hydrogène (Diller, Merz,
2001 ; Rao et al., 2007). Enfin, un consensus de score a été utilisé pour le classement des poses
générées selon la probabilité de leur apparition.
3.6.1 Modélisation de l’acylation de la phénylalanine par l’acide oléique,

catalysée par CALB
A l’échelle expérimentale, les réactions ont été menées dans du 2-méthyl-2-butanol (M2B2) en
présence de triéthylamine en excès (2,4 M), de phénylalanine (0,12 M) et d’acide oléique (0,24
M). D’après l’analyse des milieux par HPLC, aucun produit ne se forme après 48 h de réaction.
Afin d’essayer de comprendre ce résultat, des simulations de docking moléculaire ont été
réalisées en utilisant le module Libdock du logiciel Discovery studio.
L’application du protocole de docking a permis de générer 97 poses, montrant divers
positionnements et diverses orientations de la phénylalanine à l’intérieur du site actif (figure
3.8.a.1). Parmi elles, 76 poses présentent la phénylalanine à l’entrée du site actif (figure 3.8.a.2).
135
L’analyse des interactions au sein de ces complexes a montré la présence de plusieurs liaisons
hydrophobes et hydrogène qui peuvent affecter fortement la mobilité de la phénylalanine et
limiter son accès aux résidus catalytiques localisés au fond de la cavité. Selon les figures 3.8.b.1
et 2, le cycle aromatique de la phénylalanine peut interagir avec différents résidus hydrophobes
aliphatiques localisés à l’entrée de la cavité, en particulier Leu140 et Ala141 ainsi que Thr156
et Leu144. On observe par ailleurs la présence de plusieurs liaisons hydrogène entre les
groupements carboxyle et amine de la phénylalanine et plusieurs résidus de la cavité tels que
Ser150, Val154 et Trp155.
D’autre part, 21 poses générées au cours du docking, montrent la phénylalanine à l’intérieur de
la cavité, à proximité du site actif (entre 6 et 3 Å de distance entre le groupement carbonyle de
l’acyl-enzyme et l’atome le plus proche de la phénylalanine) (figure 3.8.a.3). L’analyse de
l’orientation de la phénylalanine au sein de ces complexes a montré que dans 7 poses, le cycle
aromatique de la phénylalanine, qui ne porte pas de groupement fonctionnel, est orienté vers
les résidus catalytiques de l’enzyme (figure 3.8.a.4). Dans ces 7 cas, des interactions
hydrophobes entre le cycle aromatique de la phénylalanine et le résidu Ile189 ainsi que des
liaisons hydrogène avec les résidus Val154 et Asp134 sont observées, pouvant expliquer
l’obtention de ce genre d’orientation. De même, Bidouil et al., 2011 ont pu justifier l’absence
d’acylation de la quercétine par la formation d’interactions hydrophobes avec les résidus Ile189
et Ile285, stabilisant la molécule à l’entrée du site actif de CALB, et causant l’absence de
réaction (Bidouil, Basilio De Oliveira, et al., 2011). Dans les 14 autres poses présentant la
phénylalanine à proximité du site actif, les groupements fonctionnels de l’acide aminé
(carboxyle et amine ) sont orientés vers les résidus de la triade (Ser105, His224 et Asp187).
Une analyse des distances impliquées dans le mécanisme catalytique a été menée afin de
discriminer les poses pouvant conduire à l’acylation de la phénylalanine (poses qualifiées de
productives), des poses non productives.
Plusieurs études antérieures ont montré l’importance de respecter des critères de distance
interatomique au sein des modèles afin d’assurer la formation du 2ème intermédiaire tétraédrique
menant à la formation de l’ester. La première de ces distances concerne le groupement
nucléophile de l’accepteur d’acyle (amine dans notre cas) et la fonction carbonyle de l’acyl-
enzyme afin qu’une attaque nucléophile puisse avoir lieu ; cette distance doit être inférieure à
4 Å. La deuxième distance d’intérêt concerne l’His224, qui intervient dans l’attaque nucléophile
par transfert du proton du groupement nucléophile de l’accepteur d’acyle ; la valeur maximale
de cette distance a également été fixée à 4 Å (De Oliveira et al., 2009 ; Bidouil, Basilio De
Oliveira, et al., 2011 ; Ferrari et al., 2014a ; L. Dettori, Jelsch, et al., 2018b). Enfin, un troisième
136
critère a été défini, permettant de contrôler le maintien de la conformation du site actif. Il s’agit
de la distance entre l’amine secondaire de l’His224 et la chaîne latérale de la Ser105. Les
résultats obtenus ont montré que, parmi les 14 poses analysées, seulement 2 poses respectent
les critères de distances précités (figure 3.8.c).
Ces analyses ont été complétées par l’étude des résultats du scoring, algorithme implémenté
dans le module de docking. Celui-ci permet le classement des poses issues du docking, de la
plus probable à la moins probable, en se basant sur la somme des énergies de Van der Waals et
électrostatique, calculées au sein des complexes. Selon le classement des ligands générés, les
poses présentant la phénylalanine à l’entrée du site actif sont les mieux classées selon les critères
énergétiques précités, suivies par les poses présentant le cycle aromatique de la phénylalanine
à proximité des résidus catalytiques. Les deux poses identifiées comme productives selon les
critères de distance font parties des poses les moins bien classées. Sur la base de ces résultats,
les modèles suggèrent qu’il est peu probable que l’acylation de la phénylalanine puisse avoir
lieu, ce qui corrobore l’absence de réaction observée expérimentalement. En résumé, ceci
pourrait s’expliquer par le positionnement préférentiel et la stabilisation de la phénylalanine à
l’entrée de la cavité, limitant la diffusion du substrat vers les résidus catalytiques.
Afin d’élargir notre compréhension sur les mécanismes qui rentrent en jeux lors de la N-
acylation, une étude par modélisation moléculaire a été menée pour étudier les modes
d’interaction entre CALB, le donneur d’acyle et d’autres acides aminés, de structure et de
polarités diverses. Dans ce travail, c’est l’acylation par l’acide 10-undécénoique qui a été
envisagée. Un modèle d’acyl-enzyme a été construit pour ce donneur d’acyle, en substituant
l’acide oléique par l’acide 10-undécénoique. Afin de générer un modèle robuste, plusieurs
étapes de minimisation de l’énergie du système et une étape de dynamique moléculaire ont été
appliquées afin de stabiliser la structure de l’acyl-enzyme tout en restant fidèle à la structure
cristallographique initiale.
137
a. 1. 2. 3. 4.
Entrée de
la cavité du
site actif
Triade catalytique
Espace au fond de la cavité
du site actif
représentant la
cavité du site
actif Donneur d’acyle
fixé sur la Ser105
b.1. 2. 3. 4.
c. 1. 2.
Distances permettant
le choix des poses
productives
Figure 3.8 : analyse des poses issues du docking moléculaire de la phénylalanine avec l’oléoyl-
CALB comme cible a. localisation et répartition des ligands générés au niveau de la cavité du
site actif b. interactions moléculaires observées entre la phénylalanine et l’entrée du site actif
(1 et 2) ; interactions moléculaires entre le site actif et la phénylalanine présentant son cycle
aromatique vers les résidus catalytiques (3 et 4) (--- : interactions hydrophobes, --- : interactions
hydrogènes) c. poses présentant la fonction amine de la phénylalanine à proximité des résidus
catalytiques ; analyse des distances impliquées dans le mécanisme catalytique
138
3.6.2 Modélisation de l’acylation des acides aminés par l’acide

undécénoïque, catalysée par CALB
3.6.2.1 Construction du modèle d’acyl-enzyme C11’- CALB et
sélection de la meilleure cible
Dans le cadre de cette étude, une nouvelle cible de docking, correspondant au système
undécénoyl-CALB a dû être développée. La construction de ce modèle a été réalisée à partir de
la structure de la cible oléoyl-CALB (C18:1-CALB) préalablement générée et optimisée lors
de l’étude de Ferrari et al., 2014. Les 7 atomes de carbone formant l’extrémité  de la chaîne
oléyle ont été supprimés et remplacés par un atome d’hydrogène. L’insaturation de la chaîne
oléyle a été saturée. Afin d’optimiser la position de la nouvelle chaîne acyle dans la cavité de
l’enzyme, le système a été solvaté dans une boîte comportant 16585 molécules d’eau et de
dimensions a = 92 Å, b = 86 Å, c = 70 Å; α = β = γ = 90°. Plusieurs étapes de minimisation
de l’énergie potentielle du système ont été menées, en appliquant une relaxation progressive du
système selon le protocole décrit par De Oliveira et al. (2009) (Tableau 3.4). Le maintien de la
structure native de l’enzyme a été contrôlé à chaque étape de minimisation via des mesures de
RMSD.
Tableau 3-4 : Protocole de minimisation du système acyl-enzyme et résultats associés
Etape Algorithme Critères d’arrêt Critère Energie RMSD
du calcule retenu potentielle protéine
(kcal/mol)
Fixation de toute la structure Steepest Max steps 10000 RMS - 343006,6 ➔ - 0
par des contraintes : tous les descent et/ou rmsd gradient 958292,5
atomes sont fixes sauf les gradient 0,1 0,1
atomes d’H et l’eau de la
cristallographie
Fixation de la chaine Conjugate Max steps 10000 RMS - 855709,8 ➔ - 0
principale et contraintes gradient et/ou rmsd gradient 870962,7
harmonieuses appliquées aux gradient 0,01 0,01
chaînes latérales des résidus
Fixation de la chaine Conjugate Max steps RMS - 841718,6 ➔ - 0,317
principale par des contraintes gradient 100000 et/ou gradient 862885,6
harmonieuses rmsd gradient 0,001
0,001
Relaxation de tout le système Conjugate Max steps RMS - 863192,7 ➔ - 0,466
gradient 100000 et/ou gradient 867892,8
rmsd gradient 0,0001
0,0001
RMSD : changement conformationnel de la structure protéique après minimisation par rapport à la
structure cristallographique initiale (doit être < 1)
RMSD protéine entre le début et la fin du protocole de minimisation = 0,588
139
Les étapes de minimisation ont permis une diminution importante de l’énergie potentielle du
système passant de - 343006,6 kcal/mol en début de la simulation à -867892,8 kcal/mol à la fin.
Une analyse des changements conformationnels au sein de la protéine par rapport à la structure
cristallographique a été réalisée afin de vérifier l’absence de distorsions importantes du
système. L’analyse de la variation de la structure entre le début et la fin de la procédure de
minimisation montre un RMSD inférieur à 1 (0,588), ce qui traduit un très faible changement
de la structure de l’enzyme par rapport à la structure initiale, et donc un maintien de sa
fonctionnalité.
Afin d’équilibrer le système optimisé et de générer un modèle robuste d’acyl-enzyme destiné à
être utilisé comme cible de docking, une dynamique moléculaire a été réalisée à 300 K, pendant
1 ns. L’évolution de l’énergie totale du système au cours du temps a été suivie. La figure 3.9
montre une stabilisation de l’énergie totale et de la température du système après un temps de
simulation de 50 ps.
a. b.
Figure 3.9 : suivi de l’évolution de l’énergie totale du système (a) et de la température (b) au
cours de la dynamique moléculaire
Cette simulation de dynamique moléculaire a permis de générer une centaine de conformations,

parmi lesquelles un modèle devait être choisi pour être utilisé dans les simulations de docking
ultérieures. La sélection de ce modèle s’est basée sur le respect de critères de distance
permettant un positionnement et une stabilisation corrects de l’acyl-enzyme au niveau du trou
oxyanion (Ferrari et al., 2014a). A cet effet, des distances entre l’oxygène oxyanion de l’acyl-
enzyme et les fonctions amide et hydroxyle de la Thr40 ainsi qu’avec la fonction amide de la
Gln106, inférieures à 3 Å sont nécessaires, afin de permettre l’établissement de liaisons
hydrogène. Sur les 100 conformations de la trajectoire, la grande majorité d’entre elles (71
configurations) respectent uniquement 2 des critères de distances précités, tandis que 8
conformations respectent tous les critères (figure 3.10).
140
a. b.
80
71
70
Nombre de conformation
60
50
40
30
20
10 11
8
10
0
0 1 2 3
Nombre de distance favorable
Figure 3.10 : distribution des cibles générées au cours de la trajectoire de dynamique

moléculaire selon le nombre de critères de distance respectés au sein du trou oxyanion (a) ; un
exemple de conformation respectant l’ensemble des critères de distance assurant un
positionnement et une stabilisation corrects de l’acyl-enzyme (b)
En plus de ces critères de distance, l’accessibilité au site actif durant les simulations de docking
doit également être prise en compte. Ainsi, les conformations dans lesquelles un repliement de
la chaîne grasse limiterait l’insertion des ligands dans le site catalytique ne peuvent être choisies
comme cibles de docking. Une évaluation du positionnement de l’extrémité de la chaine grasse
a donc été réalisée. Pour cela, l’accessibilité des molécules d’eau au site actif a été évaluée
visuellement, celle-ci laissant présager une bonne accessibilité des ligands au cours des
simulations de docking (formation d’un tunnel d’eau) (figure 3.11). Parmi les 8 configurations
précédemment sélectionnées seulement 4 présentent une bonne accessibilité des molécules
d’eau au site actif, la chaine grasse de l’acyl-enzyme interagissant étroitement avec la paroi de
la cavité catalytique ; l’une d’elles a été choisie comme cible de docking pour les simulations
ultérieures. Pour les autres conformations, l’accès au site actif est limité ; celles-ci ont donc été
rejetées.
Figure 3.11 : exemple d’une conformation de l’acyl-enzyme présentant une bonne accessibilité
des molécules d’eau aux résidus catalytiques
141
3.6.2.2 Etude des modes d’interaction entre les acides aminés et l’acyl-enzyme
C11’-CALB
Des simulations de docking moléculaire ont permis d’étudier les interactions entre divers acides
aminés accepteurs d’acyle et l’acyl-enzyme C11’-CALB. Le modèle d’acyl-enzyme
précédemment sélectionné a été utilisé comme cible de docking après avoir supprimé les
molécules d’eau présentes dans la cavité catalytique. Huit acides aminés portant des
groupements fonctionnels (lysine, arginine, histidine, cystéine, acide aspartique, sérine,
asparagine, tyrosine) ont été sélectionnés afin d’évaluer la régio- et chimio-sélectivité de CALB
au cours de la réaction d’acylation par l’acide undécénoïque. Par ailleurs, sept autres acides
aminés ont été choisis afin d’évaluer l’influence de la longueur et la structure de la chaine
latérale (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine). Les résultats dans
la figure 3.12, montrent que dans le cas des acides aminés non polaires aliphatiques, il y a une
claire influence de la longueur de la chaine latérale sur le nombre de poses générées au cours
des simulations de docking. En effet, l’augmentation de la longueur de la chaine latérale
s’accompagne d’une augmentation du nombre de poses générées jusqu’à un certain niveau
(leucine > valine > alanine > glycine). Ceci peut être expliqué par l’instabilité des ligands de
petites tailles tels que la glycine à l’intérieur de la cavité catalytique de CALB lors de
l’échantillonnage de l’espace conformationnel. Ceci a aussi été observé par Dettori (2017) qui
a démontré qu’une augmentation de la taille de la glycine par greffage de groupements tels que
le radical tert-butyle permettait d’améliorer les interactions avec l’enzyme. Pour les autres
acides aminés, les nombres de poses générées sont similaires.
120
Nombre de poses générés
100 98 100 101 100 100 97 99

100 88 92 91
75
80 63
60
40 29
20 7
0
Acide aminé
Figure 3.12 : Nombre de poses générées au cours des simulations de docking moléculaire de
différents acides aminés sur la cible C11’-CALB
Les poses générées au cours des simulations de docking ont été analysées en termes de
localisation des acides aminés au niveau de la cavité et de proximité aux résidus catalytiques
142
évaluée selon les critères de distances présentés en section 5.1 de ce chapitre. On rappelle que
les poses susceptibles de conduire à la formation d’un produit doivent présenter une distance
entre le groupement nucléophile de l’accepteur d’acyle (fonction amine dans notre cas) et la
fonction carbonyle de l’acyl-enzyme inférieure à 4 Å, afin de favoriser une attaque nucléophile.
La même contrainte a été appliquée à la distance entre l’His224 qui participe au transfert de
proton pendant l’attaque nucléophile et le groupement nucléophile du donneur d’acyle, ainsi
qu’à la distance entre l’amine secondaire de l’His224 et la chaîne latérale de la Ser105 (Bidouil,
et al., 2011 ; Ferrari et al., 2014a).
La distribution des poses générées au cours du docking montre une répartition en deux clusters,
selon que l’acide aminé est localisé à l’entrée de la cavité catalytique ou au fond de la cavité à
proximité des résidus catalytiques (figure 3.13). L’analyse des interactions au niveau des
ligands positionnés à l’entrée de la cavité montre une grande similitude entre les différents
acides aminés dockés. En effet, les ligands positionnés à l’entrée de la cavité établissent des
interactions hydrophobes avec les résidus Ala141, Val154, Trp155 et Leu144. Des liaisons
hydrogène avec les résidus Ser150, Asp145, Thr158 et Leu140 peuvent aussi intervenir dans la
stabilisation des ligands à l’entrée de la cavité.
Glycine Alanine Valine Entrée de la cavité
du site actif
Donneur d’acyle
fixé sur la Ser105
Sérine catalytique
fond de la cavité
du site actif
Leucine Isoleucine Proline
Cystéine Phénylalanine Sérine

Figure 3.13 : localisation des ligands au sein des poses générées au cours des simulations de
docking de différents acides aminés dans la cible C11’-CALB.
143
Asparagine Acide aspartique Histidine
Lysine Arginine
Figure 3.13 (suite) : localisation des ligands au sein des poses générées au cours des simulations
de docking de différents acides aminés dans la cible C11’-CALB.
Le scoring des poses selon la somme des énergies d’interaction, classe les poses présentant les
ligands à l’entrée de la cavité du site actif principalement à la fin du classement, traduisant une
faible probabilité d’apparition, sauf dans le cas de l’arginine et de la phénylalanine. Dans le cas
de l’arginine, la présence du groupement guanidine permet l’établissement de liaisons
hydrogène avec les résidus de l’entrée de la cavité du site actif ; par ailleurs, dans certaines
poses, des interactions électrostatiques avec des résidus acides (Asp145 et Glu294) (figure
3.14.a) sont observées. La présence du groupement aromatique de la phénylalanine permet
l’établissement d’interactions hydrophobes avec les résidus hydrophobes présents à l’entrée de
144
la cavité en particulier les résidus Leu140, Ala141, Leu144, et Val154. Tout ceci conduit à une
stabilisation des ligands à l’entrée de la cavité ce qui peut engendrer des problèmes de transfert
du substrat acide aminé vers la triade catalytique (figure 3.14.b). Ces résultats sont similaires à
ceux observés en présence de l’acide oléique comme donneur d’acyle (chapitre 3.a section 5.1).
a. b.
Figure 3.14 : interactions observées entre l’arginine (a), ou la phénylalanine (b) et les résidus
de l’entrée de la cavité catalytique (--- et --- interactions hydrogènes, --- interactions
hydrophobes, --- interactions électrostatiques)
Les poses présentant des ligands au fond de la cavité de l’enzyme ont été analysées suivant les
critères de distances décrits précédemment. L’occurrence des poses qualifiées de favorables à
la réaction est exprimée en pourcentage ; elle est donnée dans la figure 3.15.
Dans le cas des acides aminés possédant une chaîne latérale potentiellement acylable (lysine,
tyrosine, cysteine, asparagine, arginine et histidine), un faible nombre de poses respectant les
critères de distance a été observé (15% maximum de poses favorables à une acylation sur
l’ensemble des poses générées pour chaque acide aminé). Ce faible taux pourrait être lié à
l’établissement de liaisons hydrogène entre le groupement amine du ligand et certains résidus
tels que Gln157 et Asp134 ainsi qu’entre le groupement carboxyle de l’acide aminé et la Val154,
ce qui peut éloigner le ligand de la sérine catalytique. Par ailleurs, les poses présentant les
fonctions amines de la chaine principale de l’alanine et de l’acide aspartique ainsi que la
fonction amine de la chaine latérale de la lysine à proximité du fond de la cavité figurent en tête
de classement des poses (cinq premières positions). Cela suggère une probabilité importante
d’acylation de ces groupements par CALB. Toutefois, ces résultats sont en contradiction avec
les données expérimentales. En effet, l’évaluation de l’acylation des acides aminés par CALB
en solvant organique et autres milieux non-conventionnels n’a pas permis de détecter
l’apparition de produits acylés, sauf dans le cas de la lysine qui est acylée au niveau du
groupement amine de sa chaine latérale. Les divergences observées entre les données issues des
modèles et les données expérimentales peuvent s’expliquer par les nécessaires simplifications
145
admises lors de la construction des modèles ainsi que par le caractère qualitatif et peu quantitatif
de l’analyse des modèles. Plus spécifiquement, certains aspects entrant en jeu lors de la réaction
d’acylation comme la réactivité chimique des complexes enzyme/substrats, la solubilité des
substrats ou encore le transfert des substrats ne sont pas pris en compte dans les modèles, ce qui
peut fragiliser la capacité des modèles à prédire la faisabilité des réactions.
16% 15%
14% Position alpha Radical
Pourcentage de poses favorables
14%
12%
10% 10%
10%
8% 7% 7%
6% 6% 6%
6% 5%
4%
4% 3% 3% 3% 3%
2% 2% 2% 2% 2%
2%
0%
Acide aminé
Figure 3.15 : pourcentage des poses respectant les critères de distance soit avec la fonction
amine de la chaine principale, soit avec le groupement nucléophile de la chaine latérale de
l’acide aminé (histogrammes en jaune : ligands classés en premier suite au scoring)
3.7 Conclusions
L’objectif principal de ce chapitre était l’évaluation des performances des lipases pour la
réaction d’acylation des acides aminés en solvants non conventionnels en particulier verts
(scCO2 et solvants eutectiques profonds). La lipase B de Candida antarctica a été utilisée lors
de cette étude sur la base des données de la littérature qui ont montré que cette dernière
présentait des performances qui semblaient être adaptées à la réaction cible. Plusieurs solvants
réactionnels ont été utilisés pour la réaction d’acylation des acides aminés en particulier la
phénylalanine avec l’acide undécénoïque qui présente un intérêt industriel. Cependant, tous les
résultats ont montré de faibles performances de cette enzyme pour la réaction de N-acylation
des acides aminés (récapitulatif dans le tableau 3.5). Plusieurs facteurs ont été mis en cause
pour expliquer ces résultats selon le solvant réactionnel utilisé. En effet, le caractère hydrophile
des acides aminés constitue une limitation majeure lorsque la réaction est réalisée dans des
milieux apolaires tels que les solvants organiques et le scCO2, engendrant la précipitation de
ces derniers et ainsi un faible transfert de matière. Le problème de transfert du substrat peut
aussi être lié aux caractéristiques du solvant qui peut présenter une viscosité importante, comme
146
c’est le cas pour les solvants eutectiques profonds. L’utilisation de l’enzyme libre a permis
d’atténuer ce problème mais l’apparition de produits secondaires par interaction de l’acide
aminé avec le solvant réactionnel réduit considérablement la quantité de substrat disponible
pour la réaction, ce qui modifie l’équilibre réactionnel. L’utilisation de milieux biphasiques
peut aussi être envisagée afin de solubiliser les deux substrats par l’utilisation soit de deux
solvants organiques non-miscibles, soit du substrat donneur d’acyle en excès. Toutefois, ces
conditions n’ont pas permis d’améliorer les résultats. Suite à ces résultats, une étude in silico
s’est imposée afin de vérifier l’adéquation de CALB pour catalyser l’acylation des acides
aminés. Les résultats issus des modèles suggèrent une faible probabilité de N--acylation des
acides aminés avec l’acide undécénoïque, sauf dans le cas de l’alanine et de l’acide aspartique.
Ces observations ne sont pas en accord avec les résultats expérimentaux qui ont montré
l’absence d’acylation de ces acides aminés. Par ailleurs, les simulations de docking ont suggéré
la possibilité d’acyler la chaîne latérale de la lysine ce qui est cohérent avec les résultats
expérimentaux obtenus. Le docking des autres acides aminés a montré l’existence de poses
favorables d’un point de vue du positionnement de l’acide aminé dans la cavité catalytique,
mais peu favorables sur le plan énergétique. Les modes d’interactions des acides aminés avec
l’acyl-enzyme se justifient principalement par des interactions de type liaison hydrogène et/ou
des interactions hydrophobes avec des résidus localisés à l’entrée du site actif (Ala141 Leu140,
Ala141, Leu144, et Val154) ou avec des résidus proches de la triade catalytique (Gln157 et
Asp134). Ces résultats préliminaires sont intéressants car ils fournissent des premiers éléments
de compréhension de la sélectivité enzymatique mais ne nous permettent pas de confirmer avec
certitude l’inadéquation de CALB à catalyser ce genre de réaction. Il sera donc important de
compléter ces premiers résultats avec une étude in silico plus approfondie.
Au vu de ces résultats, la nécessité de trouver de nouveaux systèmes réactionnels apparaît

comme un véritable enjeu scientifique. L’une des alternatives aux lipases est l’utilisation
d’enzymes capables de catalyser les réactions d’acylation en milieux aqueux permettant une
bonne solubilisation des acides aminés : c’est le cas des acylases. Plusieurs auteurs ont décrit
la mise en œuvre d’aminoacylases en milieu aqueux tamponné ou par addition de glycérol pour
contrôler l’équilibre de la réaction d’acylation de différents acides aminés. Récemment, notre
équipe a mis en évidence la capacité d’aminoacylases de Streptomyces ambofaciens à catalyser
la réaction d’acylation de certains peptides et de la lysine au niveau des fonctions amines des
chaines principales (Dettori et al., 2017). Cependant, la capacité de ces enzymes à catalyser la
réaction d’acylation des acides aminés autres que la lysine n’a pas encore été décrite. A cet
147
effet, le chapitre suivant traitera de l’évaluation des performances de ces biocatalyseurs

originaux pour la réaction d’acylation des acides aminés.
Tableau 3-5 : Résumé des résultats expérimentaux obtenus avec les lipases en milieux non-
conventionnels et hypothèses sur les phénomènes mis en jeu.
Milieu Résultats Hypothèses des phénomènes impliqués
Solvant organique Pas d’acylation des acides - Faible solubilité des acides aminés dans les
(M2B2/TEA) aminés sauf pour la lysine solvants organiques
(acylation des 20 sur l’amine de la chaine - Absence spécificité de CALB vis-à-vis des
acides aminés) latérale fonctions amine en position alpha
- Précipitation des acides aminés par effet

antisolvant
- Acidification du microenvironnement aqueux
CO2 supercritique de l’enzyme par l’acide carbonique formé après
(acylation de la Traces de produit visibles dissolution du CO2
phénylalanine et de la en spectrométrie de masse - Formation de carbamates avec les amines libres
glycine) de la chaine latérale des lysines présentes à la
surface de l’enzyme
- Formation de carbamate avec les amines libres
des acides aminés utilisés comme substrat
Solvants eutectiques profonds (acylation de la
Très faible quantité de

produit d’acylation et - Importante viscosité ➔ problème de transfert
apparition de plusieurs du substrat vers l’enzyme
composés secondaires avec - Interaction entre la phénylalanine et l’urée
Choline CALB immobilisée
chloride / urée
(1/2) Production de 0,56 g/L de
C11’F et apparition de
plusieurs composés - Interaction entre la phénylalanine et l’urée
secondaires avec CALB
libre
Absence d’acylation de la
phénylalanine et absence
phénylalanine)
Choline
d’apparition de composés - pH acide du solvant (pH 4) ➔ état d’ionisation
chloride /
secondaires en présence de des substrats non favorable à une acylation
glycérol (1/2)
CALB libre et
immobilisée,
Aucune trace de produit en - Absence d’activation interfaciale de l’enzyme
Tampon (tris pH8) /
présence de CALB libre - Absence de spécificité de CALB vis-à-vis des
Décane ou acide gras
fonctions amine alpha
148
CHAPITRE IV : PERFORMANCES DES ACYLASES DE
STREPTOMYCES AMBOFACIENS COMME CATALYSEURS DE LA
RÉACTION D’ACYLATION ENZYMATIQUE DES ACIDES AMINÉS
149
150
Chapitre IV : Performances des acylases pour la réaction d’acylation des acides aminés
4 Chapitre IV : Performances des acylases de Streptomyces

ambofaciens comme catalyseurs de la réaction d’acylation
enzymatique des acides aminés
4.1 Introduction
Suite aux faibles conversions observées lors de l’étude de l’acylation enzymatique des acides
aminés par des lipases dans différents milieux réactionnels, la recherche d’autres catalyseurs
capables de réaliser cette catalyse en milieu aqueux a été envisagée. Les premiers résultats de
Dettori et al. 2017 ont démontré l’aptitude des aminoacylases de Streptomyces ambofaciens à
réaliser l’acylation de la lysine et de différents peptides, sur l’amine en position alpha, en milieu
aqueux contrairement à CALB qui présente une régiosélectivité en faveur de celle en position
epsilon de la lysine. Dans un premier temps, la spécificité de substrat et la chimio-sélectivité
des aminoacylases de S. ambofaciens ont donc été étudiées. L’influence de la concentration en
substrat et du produit ainsi que l’effet d’activation par des ions métalliques sur l’activité
enzymatique lors de la production de l’-lauroyl-L-lysine ont également été étudiés. L’objectif
global était donc d’estimer et de préciser les performances catalytiques des aminoacylases de
S. ambofaciens lors de réactions d’acylation d’acides aminés. Dettori et al., 2017 ont démontré,
chez cette bactérie, la présence de quatre aminoacylases. Les principales activités
aminoacylases ont été attribués à Sam-ELA, spécifique à l’acylation en position epsilon de la
lysine, et à Sam-AA, spécifique de l’acylation de la lysine en position alpha. Les activités de
synthèse des 2 autres aminoacylases, Sam-PVA et Sam-AA like, étaient minoritaires. Dans le
but de réaliser l’acylation des acides aminés en position alpha, deux stratégies ont été suivies
afin de produire et de caractériser Sam-AA séparément.
La première stratégie pour étudier Sam-AA a consisté à envisager la production hétérologue de
cette dernière, ainsi que de Sam-ELA et de Sam-PVA, chez E. coli. La deuxième stratégie a été
d’étudier la spécificité de substrat et la chimio-sélectivité des aminoacylases présentes dans un
extrait brut d’une culture d’une souche de S. ambofaciens chez laquelle les gènes codant pour
Sam-PVA et Sam-ELA ont été délétés, exprimant ainsi principalement Sam-AA. Les
caractéristiques mises en évidence chez cette souche mutante ont ensuite été comparées aux
performances des aminoacylases présentes dans un extrait brut de S. ambofaciens sauvage.
4.2 Evaluation des performances catalytiques des aminoacylases de S.

ambofaciens pour l’acylation d’acides aminés
La réaction de N-acylation enzymatique des acides aminés a été peu décrite dans la
littérature. Plusieurs enzymes ont été décrites comme capables de catalyser l’acylation d’acides
151
aminés avec des acides gras en milieu aqueux. Différentes enzymes produites par des micro-
organismes tels que les bactéries filamenteuses du genre Streptomyces ont été décrites dans
plusieurs études. Ainsi, Koreishi et al, ont pu identifier la présence de plusieurs aminoacylases
capables de réaliser l’acylation de différents acides aminés dans des surnageants de culture de
Streptomyces mobaraensis (Zhang et al., 2007 ; Koreishi et al., 2005a ; 2007a ; 2006a ;
2005ba ; 2009a). En 2018, Dettori et al. ont identifié la présence d’aminoacylases produites par
S. ambofaciens dont les gènes codant ces enzymes étaient très similaires à ceux des enzymes
codant pour les aminoacylases décrites par Koreishi et al avec 86, 80 et 69% d’identité de
séquence entre Sm-AA, Sm-ELA et Sm-PVA et Sam-AA, Sam-ELA et Sam-PVA
respectivement.
Le présent travail a donc pour but d’évaluer les performances des aminoacylases de S.
ambofaciens ATCC23877 en termes de chimio- et régiosélectivité ainsi que d’étudier
l’influence de certains paramètres réactionnels sur les performances catalytiques de ces
enzymes.
Les résultats de cette étude sont présentés sous la forme d’une publication publiée dans le
journal « Enzyme and microbial technology » (Bourkaib et al., 2020).
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
4.3 Contribution de l’article

Cette étude a permis d’évaluer le potentiel catalytique des aminoacylases de S. ambofaciens en
termes de sélectivité et de spécificité de substrats en milieu aqueux. Les résultats ont permis de
mettre en évidence un large champ d’application de ces enzymes pour la production d’acides
aminés acylés. Les conditions opératoires ont aussi été évaluées permettant de démontrer l’effet
des substrats, du produit et de l’ajout d’activateurs sur les cinétiques enzymatiques.
Dans un premier temps, la spécificité de substrat envers les accepteurs d’acyle a été étudiée.
Les réactions ont été menées en utilisant l’acide 10-undécénoique comme donneur d’acyle. Les
résultats ont montré que la majorité des acides aminés ont été acylés sauf ceux présentant un
groupement carboxylique au niveau de la chaine latérale (acide glutamique et acide aspartique)
ainsi que la proline. Pour la tyrosine, le tryptophane et l’histidine, une très faible production de
dérivés acylés a été observée mais probablement liée à des problèmes de solubilité de ces acides
aminés dans les milieux réactionnels. Les aminoacylases ont montré une régiosélectivité en
faveur de la position alpha dans tous les cas et une énantiosélectivité envers les acides aminés
naturels. Elles se sont avérées incapables de réaliser la réaction d’acylation en présence de
dérivés d’acides aminés (ester de glycine). Ces résultats sont très prometteurs dans une
perspective de développement et d’optimisation de l’acylation sélective d’acides aminés en
milieux aqueux.
Dans un second temps, la spécificité de substrat de ces enzymes envers les donneurs d’acyle a
été étudiée à partir d’acides gras de longueurs de chaine variables. Plusieurs acides aminés ont
été utilisés comme accepteurs d’acyle dont la lysine pour également étudier la régiosélectivité.
Les aminoacylases ont été capables de catalyser la réaction d’acylation en utilisant tous les
donneurs d’acyles testés (de C2 à C18 avec différentes configurations). Par ailleurs, en termes
de régiosélectivité, la diminution de la longueur de la chaine carbonée à un nombre de carbones
inférieur à 8 a conduit à l’apparition de produit acylé en position epsilon. Cela peut être lié à la
présence, parmi les enzymes de l’extrait brut, de Sam-ELA qui catalyse préférentiellement
l’acylation de l’amine primaire en position epsilon de la lysine. Cela met la lumière sur
l’importance de l’étude plus approfondie de l’influence de la longueur de la chaine sur les
performances catalytiques de ces enzymes. En effet, dans une étude précédente, il a été
démontré que les aminoacylases de S. ambofaciens étaient spécifiques de l’acylation de l’amine
en position alpha en présence de l’acide oléique (Dettori et al., 2017). Cette spécificité a été
reliée à l’activité de Sam-AA. Mais les résultats obtenus dans notre étude indiquent soit une
amélioration de l’activité de Sam-ELA soit une possible modification de régiosélectivité de
165
Sam-AA en présence d’acides gras à courte chaine. Dans le cas de cette seconde hypothèse, le
changement de régiosélectivité pourrait s’expliquer par un mouvement plus libre de la lysine
au sein du site catalytique de Sam-AA en raison d’un encombrement stérique moins important
permettant une acylation au niveau des deux amines primaires disponibles. Seule l’étude des
performances catalytiques de Sam-AA purifiée permettra de confirmer cette hypothèse. A cet
effet, les objectifs des parties présentées dans la partie suivante ont été de produire et d’étudier
les spécificités de substrat de cette enzyme.
Les résultats de notre étude ont également permis de mettre en évidence l’influence positive
de l’acide aminé (lysine) et l’effet inhibiteur de l’acide gras (acide laurique). L’utilisation d’ions
métalliques tels que le zinc, le cuivre et plus particulièrement le cobalt ont permis une
accélération jusqu’à 7 fois de la vitesse initiale de la réaction de synthèse de lauroyl-lysine.
L’ensemble de ces résultats nous ont fourni des voies d’optimisation des performances
catalytiques des aminoacylases de S. ambofaciens qui seront appliquées à la synthèse d’un acide
aminé acylé d’intérêt cosmétique, la N-10-undecenoyl-phenylalanine. Ce travail fera l’objet du
chapitre 6.
4.4 Résultats complémentaires

4.4.1 Production hétérologue des aminoacylases
La première stratégie suivie afin de pouvoir produire et caractériser les différentes
aminoacylases de S. ambofaciens séparément a été de réaliser une expression hétérologue de
ces dernières chez Escherichia coli.
L’expression bactérienne, en particulier E. coli, représente l’un des systèmes de production
hétérologue les plus utilisés, car elle est généralement économique et nécessite une expertise
technique moins importante. De plus, E. coli présente des avantages en termes de croissance
(temps de génération de l’ordre de 20 minutes) et de diversité génétique et métabolique
importante. Afin de transférer le gène codant pour la protéine dans l’hôte, l’utilisation d’un
vecteur (plasmide) est nécessaire. Ce dernier doit comporter l’insert ainsi que plusieurs
éléments nécessaires à la production hétérologue (le promoteur, le réplicon, le site de fixation
aux ribosomes et un système de sélection de la souche contenant le plasmide).
Les plasmides de la famille pET sont très utilisés pour la production hétérologue des protéines,
grâce au système du promoteur T7. En effet, les protéines dont l’expression est régulée par ce
promoteur peuvent représenter 50% de la quantité totale des protéines cellulaires traduites. Le
système permet d’atteindre ce niveau d’expression grâce à sa reconnaissance par la T7 ARN
polymérase. Cette dernière est capable de synthétiser des ARN 5 fois plus rapidement comparée
166
à la polymérase native d’E. coli. Dans ce type de vecteur, l’expression est contrôlée par
l’analogue du lactose : l’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Baolei, Jeon, 2019).
L’expression hétérologue de l’aminoacylase Sam-ELA de S. ambofaciens a été tentée
préalablement chez la levure Pichia pastoris X33 en utilisant le plasmide pPICZαA (3329 pb)
comme vecteur plasmidique. Une optimisation du gène à cloner avait été réalisée en raison de
la différence d’usage de codons entre S. ambofaciens et P. pastoris mais une altération de la
régio-spécificité de l’enzyme pour la Nε-acétyl-L-Lysine avait été observée (Ferrari, 2014a).
Lors d’un autre travail préalable au niveau du laboratoire visant l’expression hétérologue de la
même enzyme, la souche E. coli BL21 avec le plasmide pET-15b via une induction à l’IPTG a
été utilisée. Ces conditions d’expression ont mené à la formation majoritaire de corps
d’inclusion et très peu d’enzyme sous forme soluble. L’expression des protéines recombinantes
chez E. coli a été décrite comme conduisant souvent à l’apparition de corps d’inclusion due à
l’agrégation de ces derniers sous forme inactive à l’intérieur de la cellule. En effet, environ 70%
des protéines recombinantes sont surexprimées sous forme insoluble chez E. coli (Yang et al.,
2011). En général, ceci est dû à l’incapacité de cette souche à réaliser une bonne maturation des
protéines conduisant à de mauvais repliements, à l’agrégation ou à la perte d’activité des
enzymes produites (Safary et al., 2019). Une autre souche d’E. coli Origami B(DE3) a donc été
utilisée comme hôte dans le cadre de notre étude. En effet, cette souche favorise l’expression
des protéines recombinantes sous forme soluble, grâce aux mutations au niveau au niveau des
gènes de la thiorédoxine réductase (trx B) et des gènes de la glutathion réductase (gor),
permettant d’améliorer la formation de ponts disulfures pour une meilleure conformation
protéique, augmentant ainsi les performances de l’expression (Prinz et al., 1997 ; Safary et al.,
2019). Le plasmide pET-15b a aussi été utilisé dans ce cas. Ce dernier contient un gène de
résistance à l’ampicilline, permettant la sélection des souches transformées ainsi qu’une
séquence qui permet d’ajouter une étiquette poly-histidine ce qui facilite la purification de la
protéine produite. Par ailleurs, la température d’incubation des souches transformées après
induction a été abaissée de 37 °C à 16 °C, ceci dans le but de favoriser l’expression protéique
en favorisant un bon repliement des enzymes recombinantes permettant par conséquent, la
diminution de la formation de corps d’inclusion (Rosano, Ceccarelli, 2014). En effet, une
température supérieure à 16°C favorise les interactions hydrophobes entre les protéines ce qui
augmente l’agrégation de ces dernières à l’intérieur de la cellule (Sørensen, Mortensen, 2005).
D’autre part, la réduction de la concentration en inducteur (IPTG) de 1 à 0,1 mM peut assurer
un bon compromis entre l’induction de l’expression protéique sans affecter la croissance d’E.
coli (Gopal, Kumar, 2013). Selon certaines études, une forte concentration en IPTG réduit la
167
vitesse de croissance de la souche en raison de la production de protéines toxiques ou de

l’expression de protéases, réduisant l’efficacité de la production de protéines recombinantes
(Dvorak et al., 2015). D’autre part, une très faible concentration en IPTG peut ne pas assurer
une induction suffisante de l’expression protéique (De León et al., 2004). Une concentration de
0,1 mM en IPTG était suffisante pour induire l’expression des aminoacylases recombinantes,
sans effets négatifs (Marini et al., 2014). Ces modifications ont été réalisées afin d’augmenter
la probabilité d’obtenir une expression des aminoacylases de S. ambofaciens sous forme
soluble.
4.4.1.1 Evaluation de l’expression hétérologue des différentes

aminoacylases de S. ambofaciens chez E. coli Origami
B(DE3)
L’expression des trois aminoacylases (Sam ELA, Sam PVA et Sam AA) a été réalisée chez E.
coli Origami B(DE3) transformée par les plasmides pET-15b/sam ELA, pET-15b/ sam PVA
ou pET-15b/ sam AA suite à une induction par 0,1 mM d’IPTG à 16°C avec comme référence
une souche non transformée. Les précultures ont été réalisées dans du milieu LB + tétracycline
(12,5 µg/mL) + kanamycine (50 µg/mL) + ampicilline (100 µg/mL ; sauf dans le cas des
souches non transformée) pendant une nuit à 37°C, 200 rpm. Les souches ont été par la suite
inoculées à une densité optique (longueur d’onde de 600 nm) proche de 0,05 dans le milieu de
culture (milieu LB + ampicilline (excepté pour E. coli Origami B (DE3))) puis incubées à 37°C
et 200 rpm d’agitation. L’ajout 0.1 mM d’IPTG a été effectué à une DO comprise entre 0,6 et
0,9 avec un ajustement de la température d’incubation à 16°C. Des prélèvements de 1 mL de
milieu de culture et des mesures de DO à 600 nm ont été réalisés avant et après induction jusqu’à
l’arrêt de culture (18h – 20h après induction).
Le suivi de la croissance des différentes cultures, représenté sur la figure 4.1, montre clairement
que l’ajout d’IPTG n’a pas provoqué d’arrêt de la croissance (pas de toxicité vis-à-vis d’E. coli).
La croissance des souches E. coli Origami B(DE3) pET-15b/SamELA était plus faible que les
autres, un temps d’attente plus important a été nécessaire avant l’ajout d’IPTG.
168
pET-15b/samAA pET-15b/samPVA
4 pET-15b/samELA E. coli Origami B (DE3)
3,5
3
DO 600 nm
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 500 1000 1500
Temps (min)
Figure 4.1 : Suivi de la densité optique du milieu de culture, à 600nm, lors de l’expression
protéique chez les souches E. coli Origami B(DE3) transformées par les plasmides pET15b/
SamAA, pET-15b/ SamPVA ou pET-15b/ SamELA ; et la souche non transformée. Le moment
d’induction est indiqué par la flèche noire (pour pET-15b/ SamAA, pET-15b/ Sam PVA, et E.
coli Origami B (DE3)), et la flèche rouge (pour pET-15b/ SamELA).
Après récupération des cellules par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 10 min), lavage et re-
suspension (tampon Tris HCl 25mM, NaCl 50 mM, pH 8), une lyse des cellules a été réalisée
à l’aide de la presse de French (1 passage à 2 Kbar) afin de libérer les protéines intracellulaires.
Cela a été suivi d’une élimination des débris cellulaires par centrifugation du lysat (11000 rpm,
20 min, 4°C) et une concentration du surnageant contenant les protéines solubles par
ultrafiltration dans des systèmes Amicon Ultra-15 ; Millipore (4000g, 4°C, 15 min). Le profil
protéique de tous les échantillons, avant et après induction, a été analysé par électrophorèse sur
gel de polyacrylamide en présence de dodécyl-sulfate de sodium (SDS-PAGE).
Les électrophorèses des mélanges protéiques issus des cultures des souches d’E. coli Origami
B (DE3) transformées (figure 4.2) montrent qu’il y’a eu expression de protéines correspondant
aux poids moléculaires de Sam-ELA et de Sam-AA recombinantes mais pas de Sam-PVA. En
effet, Sam ELA est une enzyme monomérique qui possède un poids moléculaire de 61 kDa ce
qui correspond environ à la taille de la protéine identifiée sur le gel. Cette bande est absente
avant induction mais apparaît 3 h après induction et s’intensifie après 15 h induction (figure
4.2.B). Cela confirme l’expression de cette protéine. De même, le gel SDS-PAGE (figure 4.2.D)
montre aussi l’apparition d’une bande qui s’intensifie après 20 h d’induction. Cette dernière
correspond à un poids moléculaire aux alentours de 56 kDa similaire à celui de Sam AA ce qui
suggère l’expression de cette enzyme. Le gel sur lequel ont été déposés les mélanges protéiques
extraits de la souche transformée avec le plasmide pET-15b/ sam-PVA ne permet pas de
visualiser d’expression de protéines après induction. Sachant que Sam PVA est une protéine
169
hétérodimérique (sous unité α de 19 kDa, et sous unité β de 61 kDa), aucune protéine de cette
taille ne semble avoir été exprimée (figure 4.2.C).
Figure 4.2 : Électrophorèses SDS-PAGE des mélanges protéiques issues des cultures d’E. coli
Origami B (DE3) non transformée (A), transformée avec le plasmide pET-15b/ sam-ELA (B),
transformée avec le plasmide pET-15b/ sam-PVA (C), et transformée avec le plasmide pET-
15b/ sam-AA (D). MW : Marqueur de taille (Unstained Precision Plus Protein Standards ;
BioRad) ; I- : avant induction ; I+Xh : X heures après induction à 0,1mM IPTG. Les flèches
rouges indiquent la position des protéines exprimées.
Etant donné la faible intensité de la bande correspondant au poids moléculaire de Sam-AA
(figure 4.2.D), une étude a été réalisée sur l’influence de la concentration de l’inducteur sur
l’expression de Sam AA en utilisant plusieurs concentrations d’IPTG (0, 0,05, 0,1 et 0.25 mM).
Ces expériences ont été réalisées afin de tenter d’augmenter l’expression de l’enzyme et de
réduire la présence de corps d’inclusion. Les cultures, l’induction et l’extraction des protéines
ont été réalisées dans les mêmes conditions que précédemment. L’analyse par SDS-PAGE du
culot des cultures d’E. coli Origami B (DE3) / pET-15b/ Sam-AA a montré la présence de corps
d’inclusion formés par l’agrégation et l’accumulation des protéines à l’intérieur des souches
transformées. Ces dernières ont une masse moléculaire similaire à celle de Sam-AA (environ
56 kDa) et sont présentes uniquement quand il y a induction (figure 4.3). Dans le cas des
métalloprotéines comme Sam-AA, la présence de zinc ou d’un autre ion divalent est crucial
pour l’activité et la stabilité de la structure de l’enzyme. Story et al., 2001 lors de l’expression
170
hétérologue de l’aminoacylase de Pyrococcus furiosus chez E. coli, ont relié la perte d’activité
enzymatique à la formation de corps d’inclusion et une altération de la structure de l’enzyme
due à l’incapacité de cette souche à incorporer le bon métal dans la structure (Story et al., 2001).
Figure 4.3 : Électrophorèse SDS-PAGE des mélanges protéiques issues des cultures d’E. coli
Origami B (DE3) transformé avec le plasmide pET-15b/ sam-AA obtenus 24h après induction
avec différentes concentrations d’IPTG. MW : Marqueur de taille (Unstained Precision Plus
Protein Standards ; BioRad) ; I- : avant induction. La flèche rouge indique la position de Sam-
AA exprimée.
Les extraits protéiques solubles issus de l’expression des différentes protéines chez E. coli
Origami B(DE3) ainsi que ceux de la souche non transformée ont été analysés en termes
d’activité hydrolytique de l’- et de l’-acetyl-lysine afin d’évaluer l’activité spécifique et la
régiosélectivité de Sam ELA et Sam AA recombinantes par rapport au mélange d’enzymes issu
de la souche sauvage de S. ambofaciens.
4.4.1.2 Evaluation de l’activité des extraits protéiques issus des

souches d’E. coli Origami B(DE3) transformées
La réaction d’hydrolyse de l’α/ε- acétyl-L-lysine a été utilisée pour l’évaluation de l’activité
enzymatique. La détermination de l’activité de l’extrait protéique issu de la culture d’E. coli
Origami B (DE3) non transformé, a montré la présence d’une activité hydrolytique endogène
de l’acétyl-L-lysine (ACK) en particulier en présence de l’-ACK. En effet, la présence de
déacétylases réalisant la réaction d’acétylation chez E. coli qui intervient dans différents
évènements (modification post-traductionnelle des protéines) a été largement décrite dans la
littérature (Zhou et al., 2017 ; Hentchel, Escalante-Semerena, 2015).
Les résultats des analyses des hydrolyses réalisées en présence de l’extrait protéique issu de la
culture d’E. coli Origami B(DE3) transformée avec le plasmide pET-15b / Sam-ELA ont
171
montré une activité hydrolytique vis-à-vis de l’ε-ACK. En effet, l’activité en présence de l’ε-
ACK était beaucoup plus forte qu’en présence de l’-ACK ce qui confirme la présence de Sam-
ELA recombinante dans l’extrait protéique testé. Ce résultat valide également la présence et la
spécificité de substrat de l’ lysine acylase de S. ambofaciens décrite par Dettori et al., 2017.
Les auteurs avaient décrit la perte d’une partie importante de l’activité hydrolytique de ε-ACK
après délétion du gène identifié in-silico comme codant l’expression d’une  lysine acylase
similaire à celle identifiée chez S. mobaraensis par Koreishi et al., 2005b (Ferrari, 2014a).
L’expression hétérologue de l’  lysine acylase de S. mobaraensis (Sm-ELA) a déjà été reportée
par Koreishi et al., 2009 en utilisant Streptomyces lividans TK24 comme hôte avec le vecteur
d’expression pUC702. Cela avait permis la production hétérologue de Sm-ELA recombinante
avec une activité similaire à celle purifiée à partir de la souche sauvage (Koreishi et al., 2009a).
L’activité hydrolytique en présence de l’extrait protéique soluble issu de la culture d’E. coli
Origami B(DE3) transformée avec le plasmide pET-15b / Sam-AA a été déterminée par
l’hydrolyse de l’acétyl-L-lysine ( ou ). L’activité hydrolytique a été observée uniquement en
présence de l’-ACK où une rapide apparition de lysine a été mise en évidence, ce qui confirme
la présence de Sam-AA dans l’extrait protéique utilisé. Dettori et al., 2018 ont démontré la
présence d’une enzyme ayant une activité similaire à celle de Sm-AA de S. mobaraensis. La
délétion du gène codant cette enzyme a montré une perte de 85% de l’activité hydrolytique de
l’-ACK (Dettori et al., 2017). La présence d’une enzyme qui catalyse la réaction d’acylation
en position alpha a rarement été décrite dans la littérature, ce qui montre l’intérêt de l’utilisation
de cette aminoacylase de S. ambofaciens. L’expression hétérologue de Sm-AA recombinante a
déjà été réalisée chez S. lividans TK24 en utilisant le vecteur d’expression pSH19. L’enzyme
recombinante avait montré une activité hydrolytique vis-à-vis de plusieurs N-acétyl-L-acide
aminés supérieure à celle de l’enzyme issue de la souche sauvage (Koreishi et al., 2009b).
Malgré l’absence de bande sur le gel SDS-PAGE de l’extrait protéique issue de la culture d’E.
coli Origami B (DE3) – pET-15b / Sam-PVA, une détermination de l’activité a été réalisée.
L’évaluation de l’activité de l’extrait a été effectuée par un test de synthèse du lauroyl-L-lysine,
sachant que le test d’hydrolyse de l’acétyl-lysine n’est pas le plus adapté pour cette enzyme
(Koreishi et al., 2006a). En effet, Sm-PVA décrite par Koreishi et al., 2006, est capable de
synthétiser du N-α-lauroyl-L-lysine, ainsi que de la N-ε-lauroyl-L-lysine. Cependant, aucune
apparition de produit n’a été mesurée dans notre cas, ce qui confirme la non expression de cette
enzyme chez la souche transformée. L’absence d’expression de Sam-PVA issu du genre
Streptomyces, chez E. coli pourrait s’expliquer par la conformation hétérodimérique de cette
172
enzyme. Cette dernière nécessite une maturation de la structure peptidique primaire, constituée
d’un peptide signal d’excrétion et d’un peptide espaceur des sous unités α et β respectivement.
Torres-Bacete et al. (2015) avaient démontré que le résidu N-terminal de la sous unité β avait
un rôle essentiel permettant d’assurer le mécanisme réactionnel de ces enzymes. D’où
l’importance de la maturation de la structure peptidique primaire de Sam-PVA. Ces mêmes
auteurs ont suggéré qu’E. coli n’est pas capable d’assurer cette maturation. Sachant que Sam-
PVA est un hétérodimère, ce qui pourrait rendre complexe l’expression hétérologue de cette
enzyme. Zhang et al., 2007 ont rapporté l’expression infructueuse des Pénicilline V acylase
(PVA) issues de S. mobaraensis chez E. coli mais ils ont réussi à l’exprimer chez S. lividans
(Zhang et al., 2007).
Le tableau 4.1 compare les activités hydrolytiques de l’ /  - acetyl-L-lysine des extraits bruts
issus des cultures d’E. coli Origami B (DE3) transformés et non transformés. L’apparition de
lysine au cours des réactions a été quantifiée par CLHP équipé d’un détecteur fluorimétrique
suivant la méthode de dérivatisation des acides aminés en utilisant de l’orthophtalaldéhyde. Les
activités des différents extraits bruts issus des souches transformées d’E. coli Origami B (DE3)
ont été comparés à ceux de la souche non transformée étant donné que celle-ci présentait
également une faible activité hydrolytique des deux substrats. La fraction soluble de la culture
d’E. coli Origami B (DE3) incorporant le plasmide pET-15b/ Sam-ELA présente une activité
hydrolytique du N-ε- acétyl-L-lysine 30 fois supérieure à l’activité de la souche non
transformée. L’activité spécifique de l’extrait brut issu d’E. coli Origami B (DE3) / pET-15b /
sam-PVA n’a pas été quantifiée vu l’absence de produit visible sur CCM. Par ailleurs, la
fraction soluble d’E. coli Origami B (DE3) / pET-15b/ Sam-AA montre une activité spécifique
d’hydrolyse de N-α- acétyl-L-lysine 37 fois supérieure à l’activité de la souche non transformée.
L’activité spécifique de cet extrait est très similaire à celle de l’extrait brut issu de S.
ambofaciens ( 34 nmole Lys / min . mg).
Tableau 4-1 : Activités spécifiques des extraits bruts des cultures d’E. coli Origami B (DE3)
transformées et non transformée.
A.S (nmole Lys / min . mg) Hydrolyse de l’α- Hydrolyse de l’ε-
acétyl-L-lysine acétyl-L-lysine
E. coli Origami B (DE3) 0,92 0,13
E. coli Origami B (DE3) / sam-ELA 0,26 3,71
E. coli Origami B (DE3) / sam-AA 33,24 0
E. coli Origami B (DE3) / sam-PVA N.d N.d
N.d : Non déterminé
173
Les résultats de l’évaluation de l’activité, en particulier ceux de Sam-AA recombinant,

présentent un intérêt important dans une perspective d’étude structurelle de l’enzyme par
cristallographie. Cependant, cette dernière est jusqu’à présent en mélange avec d’autres
protéines et molécules issus de l’hôte utilisé. A cet effet, la purification de cette enzyme est
donc une étape impérative.
4.4.1.3 Purification de Sam-AA recombinante

La purification de Sam-AA recombinante a été réalisée par l’utilisation de la chromatographie
d’affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC). En effet, le vecteur d’expression utilisé
(pET-15b) permet l’ajout d’un motif poly-histidine en position N-terminale (partie du 6xHis).
Ce dernier permet de faciliter la purification des protéines solubles exprimées chez E. coli
transformé, par interaction de la queue poly-histidine avec les ions métalliques immobilisés sur
la phase stationnaire, Nickel (Ni2+) dans notre cas. Après injection de l’échantillon dans la
colonne, l’élution des molécules adsorbées s’est fait avec de l’imidazole à différentes
concentrations (80 mM, 160 mM et 250 mM) contenu dans du tampon à pH 8 (25 mM Tris
HCl, 50 mM NaCl). L’éluat a été ensuite ultrafiltré (membrane de 10 kDa) afin d’éliminer
l’imidazole et les protéines ont été concentrées par précipitation à l’acétone à 80%. Le précipité
de chaque élution a été séché, analysé par électrophorèse SDS-PAGE et son activité
hydrolytique a été mesurée. Sur le gel d’électrophorèse (figure 4.4), une bande de très faible
intensité est visible aux alentours de 55 kDa, suite à la première élution. Pour la deuxième et
troisième élution, aucune bande n’a été visible sur le gel. Ceci est probablement dû à une faible
rétention de l’enzyme recombinante par les ions métalliques. Le phénomène le plus répandu
dans le cas de l’expression hétérologue de protéine avec un motif poly-histidines est la non
disponibilité de ce dernier. En effet, il est possible qu’il soit inclus à l’intérieur de la structure
après repliement de la protéine ou, encore, qu’il soit absent suite à une hydrolyse par les
enzymes de l’hôte. Une saturation des sites d’interaction de la colonne par la forte concentration
d’autres molécules présentes dans l’extrait protéique, telles des peptides contenant des résidus
d’histidine ou d’autres protéines, peut aussi expliquer ce résultat. La mesure de l’activité
hydrolytique de l’-acétyl-lysine par les différents échantillons a confirmé les résultats de
l’électrophorèse puisqu’une activité hydrolytique a été enregistrée dans l’échantillon issu de la
première élution contrairement à ceux issus de la deuxième et de la troisième élution.
174
Figure 4.4 : Électrophorèse SDS-PAGE des protéines issues de l’élution à différentes

concentrations d’imidazole (élution 1 : 80 mM, élution 2 : 160 mM et élution 3 : 250 mM). MW
: Marqueur de taille (Unstained Precision Plus Protein Standards ; BioRad). La flèche rouge
correspond à la bande de la taille de Sam-AA.
En conclusion, ce travail avait pour but d’évaluer l’expression hétérologue des différentes
aminoacylases de S. ambofaciens chez E. coli Origami B(DE3) en utilisant le plasmide pET-
15b comme vecteur d’expression. Les résultats ont démontré l’expression de Sam-ELA et Sam-
AA avec le système choisi. Les enzymes recombinantes ont présenté des sélectivités cohérentes
avec celles attendues. Par contre, Sam-PVA n’a pas pu être exprimée. Néanmoins, une forte
proportion des enzymes est produite sous forme de corps d’inclusion. Cela présente un
inconvénient majeur. Afin de compléter cette étude, il semble très important de revoir le
protocole d’expression de ces enzymes afin de minimiser les risques d’apparition de corps
d’inclusion. L’optimisation des conditions de culture et/ou des performances des cellules hôtes
doit être envisagée afin d’adapter la machinerie cellulaire à la production des enzymes cibles
sous forme soluble (Singh, Panda, 2005 ; Sørensen, Mortensen, 2005 ; Arya et al., 2015). Une
approche possible serait de resolubiliser les corps d’inclusion et renaturer les enzymes produites
sous cette forme.
4.4.2 Comparaison des performances catalytiques entre des extraits bruts

d’une souche mutante n’exprimant que Sam-AA et de la souche
sauvage de S. ambofaciens
L’expression des aminoacylases de S. ambofaciens nécessitant une amélioration du système
d’expression afin de réduire la formation de corps d’inclusion et de faciliter la récupération des
enzymes, en particulier Sam-AA, une deuxième approche a été suivie afin d’étudier Sam-AA
séparément des autres aminoacylases du mélange. Le travail présenté dans le chapitre 4-2 a été
réalisé en utilisant l’extrait brut de la souche sauvage de S. ambofaciens semi-purifié contenant
quatre aminoacylases (Sam-AA, Sam-AA like, Sam-ELA et Sam-PVA). Parmi les quatre
175
acylases, Sam-AA a été décrite comme responsable de plus de 80 % de l’activité hydrolytique

de l’-acétyl-lysine, ce qui suggère qu’elle est aussi responsable de l’acylation des acides
aminés et peptides en position alpha (Ferrari, 2014a). Afin de comparer les performances
catalytiques de Sam-AA avec celles de l’extrait brut de la souche sauvage, une souche mutante
de S. ambofaciens chez laquelle les gènes codant pour Sam-ELA et Sam-PVA ont été délétés,
a été construite. Cette souche mutante a été cultivée dans les mêmes conditions que la souche
sauvage. Les mêmes protocoles de semi-purification de l’extrait brut ont été appliqués. La
spécificité de substrat et la régiosélectivité de l’extrait protéique envers les acides aminés et les
acides gras a ensuite été évalué.
L’activité spécifique de l’extrait protéique issu de la souche mutante et la souche sauvage a été
évaluée en réalisant la réaction d’acylation de la lysine avec l’acide laurique dans les mêmes
conditions (0,1 M des deux substrats dans du tampon tris HCl 25 mM, 50mM NaCl pH 8 à
45°C, agitation à 500 rpm contenant 1 g/L de protéines). Le suivi cinétique des réactions montre
une activité spécifique initiale légèrement moins importante de l’extrait protéique issu de la
souche mutante (2.2 mM/h/mg protéine) par rapport à l’extrait protéique issu de la souche
sauvage (2.7 mM/h/mg protéine) (figure 4.5). Cette différence d’activité pourrait être liée à
l’absence de Sam-PVA qui a été décrite comme capable de catalyser l’acylation des acides
aminés avec l’acide laurique (Koreishi et al., 2006a).
Figure 4.5 : suivi cinétique de la réaction de synthèse de l’-lauroyl-lysine en présence de

l’extrait protéique issu de la souche sauvage et mutante. Réaction réalisée dans du tampon tris
HCl 25 mM, 50mM NaCl pH 8 à 45°C, agitation à 500 rpm contenant 0.1 M des deux substrats
et 1 g/L de protéines
176
4.4.2.1 Evaluation et comparaison de la spécificité de substrat envers

les acides aminés
L’évaluation de la spécificité de substrat des extraits protéiques de la souche sauvage et mutante
envers les acides aminés a été réalisée en utilisant l’acide 10-undécénoique comme donneur
d’acyle. L’analyse par HPLC de l’acide gras résiduel au cours de la réaction a permis de montrer
que le profil de spécificité de substrat envers les 20 acides aminés était similaire entre les deux
souches avec uniquement quelques différences en termes de taux de conversion (figure 4.6). En
effet, dans les deux cas, l’analyse des produits de la réaction par LC-MS-MS a permis de
confirmer la N-acylation de l’amine en position alpha des acides aminés sauf en présence de la
proline, de l’acide aspartique et de l’acide glutamique, pour lesquels aucun produit n’a été
détecté. Pour l’histidine, la tyrosine et le tryptophane l’absence de produit peut aussi être
expliquée par leur faible solubilité dans les conditions expérimentales. Pour la proline,
l’absence d’acylation peut être liée à la présence d’amine secondaire uniquement. L’absence de
réaction pour les acides aminés polaires chargés négativement peut-être liée à la présence d’un
groupement carboxylique au niveau de l’extrémité de la chaine latérale de l’acide aspartique et
l’acide glutamique. Cette hypothèse a été confirmée par l’évaluation de l’activité enzymatique
en utilisant des molécules présentant ou pas un groupement carboxylique (acide 6-
aminohexanoique et 6-aminohexanol) (chapitre 4.2). Les deux extraits protéiques présentent
des taux de conversion très similaires sauf en présence de valine, leucine, d’isoleucine et de
thréonine avec des taux de conversion moins importants lors de l’utilisation de l’extrait
protéique de la souche mutante par rapport à la souche sauvage (figure 4.6). Ces résultats
peuvent être liés à l’absence de Sam-PVA dont le gène a été délété.
177
Figure 4.6 : pourcentage de conversion de l’acide 10-undécénoique en présence des 20 acides

aminés. Réaction réalisée pendant 24 h dans du tampon tris HCl 25 mM, 50 mM NaCl pH 8 à
45°C, agitation à 500 rpm contenant 0,1 M des deux substrats et 1 g/L de protéines (n=2)
4.4.2.2 Comparaison de la spécificité de substrat envers les acides

gras
L’évaluation de la spécificité envers les acides gras a été réalisée en utilisant la lysine comme
accepteur d’acyle afin de pouvoir vérifier si la régiosélectivité est identique quelle que soit la
longueur de la chaine de l’acide gras. Pour les deux souches étudiées les taux de conversion les
plus importants ont été obtenus en présence de l’acide 10-undécénoique et de l’acide laurique
alors qu’un faible taux de conversion a été obtenu en présence de l’acide oléique (figure 4.7).
Par ailleurs, une différence très importante de taux de conversion a été observée en présence de
l’acide octanoïque. En effet, avec l’extrait protéique brut de la souche sauvage, les deux
produits acylés correspondant à l’acylation de la fonction amine en position alpha et en position
epsilon de la lysine ont été obtenus. Dans le cas de la réaction en présence de l’extrait protéique
contenant uniquement Sam-AA, un seul produit correspondant à l’acylation de l’amine en
position alpha a été observé, on ne retrouve que des traces du composé acylé en position epsilon
(taux de conversion inférieur à 0,5%).
178
Souche mutante (SamAA) Souche sauvage
Taux de conversion de l'acide gras (%)

20%
15%
10%
5%
0%
Acide octanoïque Acide octanoïque Acide Acide laurique Acide oléique
(epsilon) (alpha) undecénoique
Acide gras
Figure 4.7 : pourcentage de conversion d’acides gras en présence de la lysine comme accepteur
d’acyle. Réaction réalisée pendant 24 h dans du tampon tris HCl 25 mM, 50 mM NaCl pH 8 à
45°C, agitation à 500 rpm contenant 0,1 M des deux substrats et 1 g/L de protéines
La régiosélectivité des aminoacylases provenant des deux souches (mutante et sauvage) lors de
l’acylation de la lysine avec l’acide octanoïque a été confirmée par analyse LC-MS-MS. Dans
le cas de la souche sauvage, deux produits possédant la même masse sont élués avec un
intervalle de temps d’environ 1,5 min. La fragmentation du produit élué à 7,36 min produit
l’ion fils 210 m/z correspondant à [la masse du produit - COOH - H2O + H]+ comme ion
majoritaire. Cette fragmentation est significative d’une acylation en position epsilon étant
donné que l’acide carboxylique est moins protégé que dans le cas d’une acylation en position
alpha. Le deuxième produit à 5,79 min génère l’ion fils 237 m/z correspondant à [la masse du
produit - 2H2O + H]+ comme ion majoritaire ce qui signifie que l’acylation de la lysine a été
réalisée en position alpha (figure 4.8.1.A). Le même profil a été obtenu lors de l’analyse LC-
MS-MS du produit de la réaction d’acylation de la lysine avec l’acide octanoïque catalysée en
présence de l’extrait protéique de la souche mutante (figure 4.8.1.B). Cela confirme la
régiosélectivité de Sam-AA vis-à-vis de la position alpha de la lysine et la contribution de Sam-
ELA dans l’apparition du produit acylé en position epsilon (Ferrari, 2014a ; Dettori et al.,
2018b). Afin de valider ce résultat, l’acide phénylpropionique a été utilisé comme donneur
d’acyle. En présence de l’extrait protéique provenant de la souche sauvage, deux produits acylés
en position alpha ou epsilon, facilement séparables par HPLC avec une colonne hydrophobe
(C18) ont été synthétisés. Avec l’extrait de la souche mutante, un seul produit acylé en position
alpha a été obtenu (figure 4.8.2). Ces résultats permettent de valider l’hypothèse d’une acylation
en position epsilon liée à la présence de Sam-ELA et à une faible sélectivité de Sam-AA vis-à-
179
vis des acides gras à courtes chaines. Ces résultats sont différents de ceux obtenus par Koreishi
et al. (2005b). Ces derniers ont décrit le potentiel catalytique de l’ lysine acylase de S.
mobaraensis en réalisant la réaction d’acylation en présence de plusieurs acides gras, et ont
montré une diminution de l’activité de cette enzyme en réduisant la longueur de la chaine de
l’acide gras. En effet, en présence d’acides gras tels que l’acide laurique un taux de conversion
de 100% a été mesuré alors que 58.7 % de conversion ont été obtenus en présence de l’acide
octanoïque (Koreishi et al., 2005b). Cela n’est pas le cas lorsque l’extrait protéique de la souche
sauvage de S. ambofaciens a été utilisé. En effet, l’apparition de produits acylés en epsilon a été
observée quand des acides gras à courtes chaine ont été utilisés. Aucun produit acylé en position
epsilon n’a été identifié en présence d’acide gras d’une longueur supérieur à huit carbones. Cela
pourrait signifier que la spécificité de substrat entre les epsilons lysine acylases de S.
mobaraensis et de S. ambofaciens sont différentes malgré leur importante homologie de
séquence (80 %).
1) A B
Figure 4.8 : suivi et spectre MS2 après fragmentation de l’acyl-lysine : A: souche sauvage de
S. ambofaciens ; B : souche mutante de S. ambofaciens, pour la synthèse de (1) l’octanoyl-
lysine ou (2) phénylpropionyl-lysine
180
2) A B
Figure 4.8 (suite) : suivi et spectre MS2 après fragmentation de l’acyl-lysine : A: souche
sauvage de S. ambofaciens ; B : souche mutante de S. ambofaciens, pour la synthèse de (1)
l’octanoyl-lysine ou (2) phénylpropionyl-lysine
4.5 Conclusion
Suite aux faibles performances obtenues lors de l’acylation enzymatique des acides aminés par
la lipase B de C. antarctica, l’utilisation des aminoacylases de S. ambofaciens pour cette
réaction a été évaluée. Ces enzymes ont été décrites dans une étude antérieure pour leur capacité
à catalyser la réaction de N-acylation de la lysine sur l’amine en position alpha mais aucune
donnée sur leur sélectivité envers les donneurs d’acyle et les accepteurs d’acyle n’avait été
décrite. A cet effet, l’évaluation des performances catalytique de ces enzymes pour la N-
acylation des 20 acides aminés protéinogénique a été réalisée en présence d’acide
undécénoïque. Les aminoacylases de S. ambofaciens ont permis l’acylation de la majorité des
accepteurs d’acyle avec de meilleures performances en présence des acides aminés chargés
positivement (arginine et lysine) ainsi que de leucine et de méthionine. Tous les acides aminés
ont été acylés sur l’amine de la chaine principale sans apparition de produit secondaire lié à
l’acylation des groupements de la chaine latérale. La sélectivité de ces enzymes envers
différents donneurs d’acyle a aussi été déterminée. Les résultats ont montré un accroissement
de l’activité avec l’augmentation de la longueur de la chaine grasse jusqu’à 12 carbones puis
181
une diminution de l’activité. Les analyses en LC-MS-MS ont montré un changement de

régiosélectivité de ces enzymes lorsque des acides gras de moins de 8 carbones sont utilisés.
Afin de vérifier si cela était lié à la présence de Sam-ELA qui catalyse la réaction de N-acylation
de la lysine en position epsilon, un extrait enzymatique issu d’une souche de S. ambofaciens
pour laquelle les gènes codant pour Sam-ELA et Sam-PVA ont été délétés a été utilisé dans les
mêmes conditions. Cela a permis de confirmer la contribution de Sam-ELA dans l’acylation de
la lysine en position epsilon en présence d’acides gras à courtes chaines. L’influence des ions
divalents dans l’activité enzymatique a aussi été déterminée, mettant en évidence l’effet
activateur du cobalt sur l’activité des aminoacylases de S. ambofaciens. Afin de pouvoir étudier
séparément les différentes aminoacylases, l’expression hétérologue de ces enzymes dans une
souche d’E. coli a été réalisée. Différentes souches d’E. coli ont été obtenues, capables de
produire les aminoacylases Sam-AA et Sam-ELA, dont la régiosélectivité respective a pu être
confirmée. Cependant, ces enzymes sont présentes sous forme soluble en faible concentration
en raison de la formation majoritaire de corps d’inclusion. L’utilisation de ces souches pour la
production de Sam-AA pure n’est pas envisageable. A cet effet, la production des différentes
aminoacylases par expression hétérologue dans d’autres souches et/ou en utilisant d’autres
vecteurs d’expression pourrait être envisagée dans de futures études. Ainsi, l’utilisation des
aminoacylases de S. ambofaciens issues de la souche sauvage ou mutante reste, à ce jour, la
meilleure alternative pour la N-acylation des acides aminés.
Afin d’intensifier la réaction de N-acylation des acides aminés et de développer un procédé vert
compétitif et économique, plusieurs stratégies peuvent être envisagées. Parmi les méthodes
d’intensification des réactions enzymatique les plus utilisées se trouve l’utilisation des réacteurs
à lit fixe mettant en œuvre des enzymes immobilisées. A cet effet, l’évaluation de
l’immobilisation des enzymes, en particulier des aminoacylases de S. ambofaciens, a constitué
l’une des tâches les plus importantes de cette thèse. La mise en place d’un procédé
d’immobilisation des enzymes et l’évaluation de leurs performances après immobilisation font
l’objet du chapitre 5.
182
CHAPITRE V: ÉVALUATION DES PERFORMANCES DES
AMINOACYLASES DE STREPTOMYCES AMBOFACIENS
IMMOBILISÉES
183
184
Chapitre V : Performances des acylases de S. ambofaciens immobilisées
5 Chapitre V : Evaluation des performances des aminoacylases de

Streptomyces ambofaciens immobilisées
5.1 Introduction
Lors du chapitre précédent, les performances des aminoacylases de S. ambofaciens ont montré
leurs très prometteuses capacités pour catalyser la réaction de N-acylation d’acides aminés,
comparativement aux lipases. Cependant, l’utilisation de ces enzymes est limitée par leur faible
stabilité au cours du temps, le suivi cinétique montrant un arrêt de la réaction après environ 24
h d’incubation. Cela peut être principalement relié à une dénaturation thermique irréversible de
l’enzyme et / ou à une inhibition par le substrat et / ou le produit de la réaction. Afin de remédier
à cela, l’immobilisation de ces aminoacylases peut permettre une amélioration de leur stabilité
thermique et de réaliser des réactions en continu par l’utilisation d’enzymes immobilisées en
réacteur à lit fixe permettant d’éviter l’accumulation de produit en contact avec l’enzyme et de
recycler le biocatalyseur. L’utilisation de matériaux à base de silice, tel que SBA15, a été
largement décrite dans la littérature pour l’immobilisation d’enzymes (Wang, Caruso, 2005 ;
Brühwiler, 2010 ; Hartmann, Kostrov, 2013b). Ces supports présentent de nombreux avantages,
en particulier liés à la présence de groupements hydroxyle facilitant le greffage de molécules
fonctionnelles pouvant améliorer l’affinité des enzymes vis-à-vis du support (cas de la
physisorption) ou la fixation covalente de l’enzyme sur le support (cas de la chimisorption).
Dettori et al., 2018 ont évalué les performances des aminoacylases de S. ambofaciens
immobilisées sur SBA15 par physisorption (sans modification en surface) et par chimisorption
(utilisation du glutaraldéhyde et du glycidyle ou glymo comme agent greffant). Ils avaient
montré que les aminoacylases perdaient la quasi-totalité de leur activité après immobilisation
par chimisorption contrairement à la physisorption où une activité résiduelle correcte était
maintenue. Cependant, lors du recyclage du biocatalyseur, une importante désorption de
l’enzyme avait été observée (Dettori et al., 2018). C’est pourquoi, lors de notre étude, la
physisorption des aminoacylases a été réalisée sur SBA 15 avec et sans modification en surface,
par greffage du (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) à différentes concentrations
permettant d’augmenter, selon le pourcentage, le caractère hydrophobe des supports. D’autre
part, la taille des pores des supports poreux peut aussi influencer considérablement le transfert
de matière externe du substrat et du milieu réactionnel vers l’enzyme. C’est pourquoi des
supports méso-macroporeux ont été également utilisés et traités de la même manière que les
supports mésoporeux (SBA15) (Kim et al., 2015). Les résultats de cette étude ont fait l’objet
d’une publication soumise au journal « Colloids and surfaces B : biointerfaces ».
185
APTES modified SBA-15 and meso-macroporous silica materials for

the immobilization of aminoacylases from Streptomyces ambofaciens
Mohamed Chafik Bourkaiba, Pierrick Gaudinb, Yann Guiavarc’ha, Stephane Delaunaya, Xavier
Framboisiera, Catherine Humeaua, Isabelle Chevalota, Jean-Luc Blinb*
a
: LRGP, UMR 7274 CNRS-Université de Lorraine, 2 avenue de la Forêt de Haye, TSA 40602,
F-54518, VANDŒUVRE CEDEX, France
b
: Université de Lorraine/CNRS, L2CM, UMR7565, 54500 Vandoeuvre-lès-Nancy, France
Abstract:
The use of enzyme for the production of biomolecules is increasingly coveted but their
industrial implementation is limited by the cost of this biocatalyst which is non-recyclable when
used in free form. Crude extracts from Streptomyces ambofaciens exhibiting aminoacylases
activities were recently described as very attractive for the synthesis of amino acids biobased
surfactants. It consists in a mixture of four acylases among which an aminoacylase presents the
amino acids N-acylation activity desired. However, these enzymes suffer from thermal
instability and are negatively influenced by the amino-acyl product of the reaction.
Consequently, the immobilization of these enzymes presents a promising way to overcome
these issues. The aim of the present study is to investigate the influence of the porosity of the
silica support and of its functionalization by 3-aminopropyl-tri-ethoxysilane (APTES) on the
immobilization and activities of these aminoacylases. To reach this goal, two porous silica
supports were compared: a mesoporous (SBA-15) and of meso-macroporous (MMS) silica
material. The behaviour of both supports after enzyme adsorption was compared without and
with functionalization with APTES. The results show that the enzyme immobilization on non-
functionalized support (without APTES) at pH=8 leads to a poor enzyme loading due to
electrostatic repulsion between the enzyme and the silica support. Moreover, these non-
functionalized materials suffer from a significant leaching from the first utilisation. The APTES
functionalization of the silica materials allow a better enzyme loading by favouring enzyme-
support interactions. For both materials, the results show an increase of the immobilization rate
by increasing the APTES functionalization rate from 0 to 10%, then a plateau is reached likely
due to surface saturation with APTES around 10% grafting rate. A higher immobilized enzymes
amount is obtained by using MMS instead of SBA-15, which is assigned to a better enzyme
diffusion in the meso-macroporous structure of the MMS along the immobilization procedure.
186
However, the measurement of the hydrolysis and synthesis catalytic performances of materials
shows a significant improvement of the conversion rate by increasing the APTES percentage
in the case of SBA-15 while the activity of the immobilized enzymes on the functionalized
MMS is not influenced by the APTES ratio. This behaviour can be explained by the better
enzyme accessibility on SBA-15-based materials were the enzyme is mainly located on the
external surface area of the materials. The APTES grafting slows down the enzyme leaching
phenomenon as compared to non-functionalized supports, although the phenomenon still occurs
after several recycling. The cross linking of the aminoacylases by using glutaraldehyde at
different percentages leads to a loss of the activity due to enzyme inactivation by
glutaraldehyde. Finally, the results of the evaluation of the synthesis behaviour of the
immobilized enzyme show the same trends as those observed with hydrolysis. The LC-MS-MS
analysis shows that the regioselectivity of the enzymes after immobilization is not modified.
Introduction:
Acylation reactions are largely used at industrial scale for the synthesis of food, pharmaceutics
and cosmetic ingredients from natural resources [1]. Among them, bio-based surfactants, more
especially amino acids surfactants (AAS), are ones of the most attractive due to their eco-
compatibility, good techno-functional properties and, for some of them, attractive bioactivities
which makes them molecules of choice for several industries. However, these molecules are
industrially produced by chemical synthesis, especially by the Schotten-Baumann chemical
reaction, requiring the use of functional group protection or activation what results in the
production of large quantity of effluents which need to be reprocessed in order to reduce the
environmental impact [2,3]. One of the most attractive alternatives to the chemical processes is
the use of enzymes to perform these reactions under mild conditions and without using and
generating hazardous molecules for the environment. For this reason, a wild range of enzymes
has been used in different industries (cosmetics, detergents, biofuels, pharmaceutics…) [4].
Several microbial enzymes were already described as able to perform the N-acylation reaction
of amino acids in water without any protection/unprotection steps and with different regio- and
chemo-selectivities allowing the control of the reaction. For these reasons, the enzymatic
synthesis appears to be of great interest for the development of green and sustainable processes
[5–8]. However, their protein nature makes them brittle outside their natural cellular
environment where it exerts such activity [9]. Indeed, the lack of long-term operational stability
and the difficulty to reuse the free enzyme, in addition of their high costs, reduce the economic
interest of such processes and hamper the development of industrial enzymatic production
187
methods [10,11]. Several strategies can be used to improve the stability of the enzyme. The first
method is the protein engineering by substitution of some amino acids residues in order to
improve the structural stability towards the operational conditions (pH, temperature, pressure
…). However, it does not facilitate the reuse of the enzyme. The immobilization of the enzyme
on an inert solid material might lead to an improvement in the operational life and easy
recycling of the enzyme [12]. The immobilization depends on the material characteristics, the
immobilisation techniques and conditions, so there is no standard immobilisation method
suitable for all types of enzymes [13].
The selection of the most suitable material is crucial when developing immobilization process
[14]. A large variety of materials exhibiting different physicochemical characteristics have been
developed for enzyme immobilization [15–17]. Among them, inorganic supports, especially the
porous silica gels are the most used material due to their eco-compatibility, availability and low
cost with an easy and controllable synthesis. The presence of silanol groups makes easy the
immobilization and the surface modification of the material by grafting functional groups
through silylation what allows the modulation of the surface physicochemical characteristics
[18]. Ordered mesoporous silica, especially Santa Barbara Amorphous 15 (SBA-15) support ,
are widely used for enzyme immobilisation due to their good stability to the operational
conditions, hydrophilic property, high surface area (300-1500 m2/g), regular and easily
controllable pore diameters (2-40 nm), which are compatible with the enzyme diameters, and
high pore volume (around 1 mL/g) [10,17,19]. The pore size of the support is one of the most
important parameters in enzyme immobilization. It is well known that closer the pore size of
the support to the diameter of the enzyme is, better is the immobilization performance due to a
better conformational stability and less structure modification possibilities of the adsorbed
enzyme in the pores while preventing the leaching phenomenon [20–22]. However, the
incorporation of macropores in such supports can improve the immobilization process by
decreasing mass transfer limitations by acting as transport channels of the enzyme to the
mesopores [23]. Indeed, these hierarchical porous materials combine the advantage of
macroporous structures leading to less diffusional limitations (pores bigger than 50 nm) while
maintaining high specific surface areas and the ones of the mesoporous materials which exhibit
more adapted pores size and high porous volume [24–26]. Those properties might significantly
increase enzyme loading [21,27].
The immobilisation method can also significantly influence both the activity and the stability
of the enzyme. The immobilization strategies can be classified according to the interaction
188
mode between the enzyme and the support. Chemical immobilization is based on the formation
of covalent bond (amide or ester bond) between an amino acid residue at the surface of the
enzyme, in particular with lysine side chain amino group, and an organic moiety grafted at the
surface of the material like glutaraldehyde (GA) and isocyanate. The covalent immobilization
can lead to a better stiffening of the enzyme at the surface of the support, preventing desorption
and allowing a better recycling of the enzyme but with high probability to reduce or loss the
activity of the enzyme due to multipoint attachments of the amino acids residues close to the
active side on the support. This can lead to a conformational change of the enzyme or diffusional
limitations of the substrates to the active site [28]. At the opposite, physical immobilisation
(physisorption, entrapment, and encapsulation) is based on the use of low interaction modes
(hydrogen, hydrophobic, electrostatic and Van der walls interactions) [29,30]. This can lead to
structural preservation of the native 3D conformation of the enzyme, depending on the surface
properties of the material, that allows maintaining the enzyme initial catalytic properties [31].
In addition, this immobilisation methodology is simple, rapid and cheap without using any
functionalized material nor toxic solvents. For this reason, this kind of immobilization
technique is of great interest for immobilized enzyme-based processes. However, due to week
attachment of the enzyme to the support, there is a high probability to have an enzymatic
desorption from the latter during the catalytic reaction due to reaction conditions or through
mechanical shear forces [32]. In order to overcome this scientific bottleneck, surface property
modification by grafting alkylsilanes on the hydroxyl groups of the support surface was
described as improving the immobilization performances [33]. The immobilization rate and the
stability of the enzyme are influenced by the pH, the temperature, the size of the pores and of
the enzyme and the surface properties of those later. In addition, these parameters affect the
orientation of the enzyme that can lead to a decrease of reactant mass transfer into the active
site when the enzyme is fixed on the active site entrance cavity [34]. Indeed, the ionic
interactions are closely related to the pH of the medium, which governs the surface charges of
both enzyme and support. As a result, the adsorption equilibrium of the protein is closely
dependent on the pH [35]. Wang and Caruso [21] evaluated the immobilization of different
enzymes on spherical mesoporous silica materials at pH 7. Given that the pI of the supports is
around 3, they demonstrated that enzymes with higher pI like lysozyme are widely immobilized
and more stable compared to the ones with pI lower than 7 like catalase. This was attributed to
favorable electrostatic interactions between the enzyme and the substrate at such pH [21]. The
presence of hydroxyl groups at the surface of the silica material can disadvantage the enzyme
adsorption on the support. Indeed, the usual pH condition of an enzyme like acylase (around 7)
189
is generally higher than its pI, leading to enzyme and support both being negatively charged.
This results in a repulsion phenomenon and a significant decrease of the enzyme loading even
if there is some Van der Walls and hydrophobic interactions [36]. The grafting of organosilane,
like 3-aminopropyl-tri-ethoxysilane (APTES) and 3-aminopropyl-dimethyl-ethoxysilane
(APDMES), on the support might change the electrostatic equilibrium and introduce other kind
of low interactions such as hydrogen and hydrophobic interactions which might improve the
immobilization rate [37]. Zhao et al. [38] immobilized penicillin acylase (PA) on SBA-15
functionalized with different organosilanes. They demonstrated that the surface
functionalization allowed higher adsorption of the enzyme due to an increase of the surface
hydrophobicity and a decrease of the electrostatic repulsions. They also showed that APTES
was the most suitable grafting agent for enzymatic activity compared to other organosilanes
[38]. Indeed, the material surface hydrophobicity clearly influences the immobilization process
and the activity of the immobilized enzyme. However, a highly hydrophobic surface can lead
to a significant decrease the enzyme activity by affecting the structural conformation of the
latter. Many authors investigated the influence of the support characteristics on the structural
configuration of the enzymes [35,36,39–41]. Sang et al. [35] evaluated the structural change of
lysozyme and myoglobulin immobilized on SBA-15 (hydrophilic surface) and propyl-
functionalized SBA-15 (hydrophobic surface) with controlled pore size. They demonstrated
that the enzymes presented the better activity when immobilized on SBA-15 with pore size
close to the enzyme diameter. By analyzing the trend of amide I and II bands ratio using ATR-
FTIR spectroscopy, they showed that there is no change of the secondary structure of the
enzyme when immobilized on hydrophilic surface compared to the free enzyme unlike the ones
immobilized on hydrophobic surface where a significant change was observed, suggesting a
disruption of the protein conformation [35]. [41] investigated, by molecular simulation, the
stability of the alcohol dehydrogenase (ADH) when immobilized on hydrophobic methacrylate
and hydrophilic SBA-15 supports. They demonstrated that the enzyme exhibits an enhanced
activity when immobilized on hydrophilic supports due to its structural stability and well
orientation unlike the use of highly hydrophobic materials where a loose of structural
conformation was observed. The enzyme activity remains stable when immobilized on weakly
hydrophobic surface which was the same case by using hydrophilic and hydrophobic SBA-15.
Belfort et al. [42] completed the precedent study by studying the activity of ADH immobilized
on weakly hydrophilic SBA-15 and highly hydrophilic support NH2-SBA-15. Their results
show a complete loss of the activity of the immobilized enzyme on NH2-SBA-15 due to higher
hydrogen-bonding interactions which increase the surface energy, leading to an instability of
190
the protein by inter-protein interactions. Furthermore, Shah et al. [43] investigated the influence
of the pH on the immobilization of Penicillin G acylase (PGA) on APTES functionalized SBA-
15. They demonstrated that the pH of immobilization below or above the isoelectric point of
the enzyme (pI of PGA around 8.1) leads to electrostatic repulsion due to the positive or
negative net charge of the enzyme resulting in the decrease of the enzyme loading. However, a
high increase of the amount and the stability of the immobilized enzyme was observed when
the pH is close to the pI (net charge of the protein around zero). The activity of the immobilized
enzyme is close (92%) to the one of the free enzymes, showing that the enzyme is properly
oriented [43]. Finally, Jesionowski et al. [37] immobilized the acylase I from Aspergillus
melleus on APTES and glutaraldehyde (GA) functionalized and non-functionalized Stöber
silica. They also showed the efficiency of the APTES functionalization of the silica support
where the enzyme retains 62 % of its activity compared to non-functionalized and GA-
functionalized support (42 and 23 % respectively). They suggested that the loss of the activity
is due to unfavorable interactions and the formation of covalent bonds when using GA while
APTES improved the immobilization and the activity by increasing hydrogen and hydrophobic
interactions. To sum up, the influence of the surface properties on the activity depends on the
enzyme nature but the use of APTES as organosilane appears to be the most suitable to maintain
acylase activity compared to other organosilanes.
The acylation of amino acids with fatty acids using immobilized enzyme has been already
described by different authors using lipases or proteases in non-aqueous media; however, the
use of immobilized acylases for this reaction was rarely described [32,44,45]. In a recent work,
the exceptional ability of the aminoacylases from Streptomyces ambofaciens to perform the
reaction of N-acylation of the amino acids on their alpha amino group was described in the
perspective of green synthesis of amino acids-based surfactants [46]. These enzymes consist in
a mixture of four acylases with different specificities: the epsilon lysine acylase (Sam ELA)
specific to the acylation and deacylation of lysine on the side chain amino group, penicillin V
acylase (Sam PVA) specific to the acylation of lauroylated amino acid and two aminoacylases
(Sam AA and Sam AAlike) specific to the acylation and deacylation of amino acids on the
alpha amino group and responsible of almost all the -acylation activity [7,46]. However, these
aminoacylases present low thermal stability in their free form, suggesting the possible benefit
of their immobilization. Dettori et al. [32] immobilized these enzymes by physical and chemical
methods using glutaraldehyde and glycidyle functionalization on SBA-15 and investigated their
activity and stability [32]. They demonstrated that the covalently immobilized enzymes lost
191
almost all their activity (around 5% relative activity was kept) unlike the physically
immobilized enzymes (around 23% relative activity was preserved). However, by recycling the
enzyme immobilized on SBA-15, a significant leaching of the adsorbed protein was observed
due to the weak interactions with the support.
Given that the immobilization and the reaction processes are strongly dependent on both the
porous structure (enzyme diffusion during the immobilization step) and the surface
hydrophilic/hydrophilic (enzyme-support interactions) of the support, the present work aims at
investigate the influence of the porosity of two silica supports and of their functionalization by
3-aminopropyl-tri-ethoxysilane (APTES) on the immobilization and activities of the
aminoacylases from S. ambofaciens. Two porous silica supports were compared: a mesoporous
(SBA-15) and a meso-macroporous (MMS) silica material. In order to tune their surface
hydrophobicity [47], the grafting rate of APTES on both silicas supports was varied from 0%
to 50% mol.%. The enzyme immobilization step and activity performances of the resulting
material were investigated for both mesoporous SBA-15 and meso-macroporous (MMS) silica,
with and without APTES functionalization.
Materials and methods
Pluronic P123 triblock copolymer, (EO)20(PO)70(EO)20 and (3-aminopropyl) triethoxysilane

(APTES), 98%, were purchased from Sigma-Aldrich. Tetra-methoxy-silane (TMOS), 98%,
was bought from Alfa Aesar. All chemicals were used as received without further purification.
Lysine (K) and lauric acid (C12) were purchased from Sigma-Aldrich, K with 99% of purity
were acquired from Bachem. Aminoacylases were produced from S. ambofaciens.
Aminoacylases of S. ambofaciens production
The aminoacylases from S. ambofaciens were produced and partially purified following the
procedure described by Bourkaib et al. (2020) and by using the same components [46].
Support preparation
SBA-15 preparation:
The synthesis of SBA-15 silica was carried out following the standard procedure [48]. The
synthesis was conducted by dissolving 2.66 g of Pluronic 123 (P123) in 100 mL of a chlorhydric
acid solution (1 M) at room temperature. After complete dissolution of P123, 4.17 g of
tetramethyl orthosilicate (TMOS) were added and the mixture was kept under stirring at room
192
temperature during 30 min. Afterwards, the solution was transferred in a Teflon-lined autoclave
heated at 40°C during 24 h. Then the temperature was raised up to 100°C for 24 h. The mixture
was then filtered and the material was submitted to extraction by ethanol during 48 h using a
Soxhlet, in order to remove the surfactant. The obtained mesostructured silica material was
finally dried at ambient atmosphere during one night to recover SBA-15 as a white powder.
Meso-macroprorous silica preparation:
Hierarchical meso-macroporous silica material was prepared by “Dual Templating”, combining

emulsions (for the macropores) and micellar solution (for the mesopores), following a
procedure reported by Blin et al. [49]. The emulsions were prepared by dissolving 760 mg of
R_8^F 〖(EO)〗_9 and 1760 mg of R_7^F 〖(EO)〗_7 fluorinated surfactants in 7.5 g of
aqueous HCl at pH = 0 at 40°C. After complete dissolution of the fluorinated surfactants, 2 g
of perfluorodecalin were added to the solution under vigorous stirring. The solution was kept
under stirring for 1 night. Afterwards, 980 mg of TMOS were added to the solution which was
kept under stirring at 40°C for 1 h. Then the mixture was transferred in a Teflon-lined autoclave
in an oven at 100°C for 24 h. Afterwards, the surfactant was removed by ethanol extraction for
48 h (soxhlet) and the resulting white powder was dried at ambient atmosphere for 24 h.
APTES functionalization of the materials:
Both materials were functionalized with amino-propyl-tri-ethoxy-silane (APTES) at different

molar percentages allowing to cover the silicas surface with amine function. During the
functionalization a covalent bonding between silanols of the silica surface and the tri-alkoxy-
silane moieties of APTES is formed [32]. In order to study the effect of APTES concentration
on the performance of the immobilization and the enzymatic activity, six different
functionalization loadings of organic functions (APTES) in the silica were performed : 0%, 1%,
5%, 10%, 25% and 50% (functionalization loading = (moles of organosilane/moles of
organosilane + moles of silica) x 100). The functionalization was conducted by adding 1 g of
the material in toluene (50 mL). The mixture was stirred and heated at 110°C, then the required
amount of APTES (tab. 1) was added and the suspension was kept under stirring (400 rpm)
over-night under reflux. After cooling, the mixture was filtered and washed two times with
toluene, followed by two times with ethanol and dried over-night under vacuum to recover the
functionalized materials as a powder. The resulting supports are labelled as SBA15n% for
functionalized SBA-15 and MMSn% for functionalized meso-macroporous support, where n
represent the silica/organic group molar ratio.
193
Tab. 1: quantity of APTES used for 1 g of material during the functionalization of both support
(SBA-15 and MMS)
Functionalization (%) 0 1 5 10 25 50
APTES quantity (mL) 0 0.078 0.390 0.780 1.950 3.900
Immobilization of the aminoacylases of S. ambofaciens on the different materials
The physical adsorption of the aminoacylases from S. ambofaciens was conducted by

suspending 200 mg of the support (without or with functionalization) in 36 mL of TRIS buffer
(TRIS 25 mM in water, NaCl 50 mM, pH=8) and 1 mL of the aminoacylases solution (20 mg/
mL) was then added. The mixture was stirred during 18 h at 4°C. The final mixture was filtrated,
washed two times with TRIS buffer and dried one night under air to afford functionalized or
non-functionalized SBA-15-acylase or MMS-acylase.
Cross liking enzyme aggregates (CLEAs) of the immobilized enzyme on the functionalized
SBA-15 with 50% APTES: the immobilized acylases on the SBA-15 functionalized with 50%
APTES was conducted using different molar percentages of Glutaraldehyde from Sigma
Aldrich with 25% purity. The addition of Glutaraldehyde results in a covalent bridge between
the amino acids residues of the enzymes which can improve the catalytic performance and the
stability of the enzyme [49]. In order to study the effect of glutaraldehyde concentration,
different molar percentages were used: 0%, 1%, 5% and 10% (glutaraldehyde rate = (moles of
glutaraldehyde x 100 / (moles of glutaraldehyde + moles of silica)). The functionalization was
conducted by mixing 0.5 g of the functionalized SBA-15 in 5 mL of Tris HCl 25 mM, NaCl 50
mM, pH 8 containing the appropriate quantity of glutaraldehyde (34, 175 and 370 µL of
glutaraldehyde solution for the 1, 5 and 10% molar ratio). The mixture was stirred at 4°C and
100 rpm by rotatory agitation overnight. The mixture was then filtrated and washed two times
with the Tris HCl buffer and dried one night under vacuum to recover the final material as a
brick red powder proofing the glutaraldehyde incorporation and CLEAs formation. As a
reference sample, the free enzyme was also treated in the same way by using 370 µL of
glutaraldehyde.
Characterization of the materials
Nitrogen adsorption–desorption isotherms, Small angle X-ray scattering (SAXS) experiments

and solid-state NMR spectra were all conducted following the same methodology and
machinery described by [32]
194
Macropores were detected using mercury porosimetry on a Micromeritics Autopore IV 9500.

The penetrometer (stem volume = 0.412 ml, penetrometer volume = 1ml) was filled with 0.1 g
of the sample. A low pressure (0.1 to 15 psia) followed by a high-pressure analysis (15 to 60
000 psia) were performed in order to detect pores down to 5 nm in diameter, the equilibration
time is 10 seconds.
Enzyme activity assays
Hydrolysis reaction
After the adsorption process, the activity of all immobilized enzyme was evaluated for their
hydrolytic activity of the Nα-acetyl-L-lysine as substrate. The enzymatic hydrolysis was carried
out in test tubes containing 1.8 mL Tris-HCl (25 mM) NaCl (50 mM) at pH 8, 0.2 mL of the
substrate (40 mM) and the quantity equivalent to 1 mg/mL of immobilized enzyme or the free
enzyme (around 0.5 mg/mL) for a 2 mL final volume. The reaction was performed during 24 h
at 37°C and 500 rpm stirring. Samples of 100 μL were withdrawn and diluted 10 times in water
for TLC and HPLC-MS analyses. The conversion rate was calculated from the measurement of
lysine concentration released during the hydrolysis and corresponding to the percentage of
lysine produced from acetyl-lysine hydrolysis by free or immobilized enzymes. For recycling
stability, activity of immobilized aminoacylase was determined after 3 cycles and the
corresponding relative hydrolytic activity of the immobilized enzymes was determined by
taking the first reaction as reference (set as 100%). The specific activity of the enzymes was
defined as the amount of lysine produced reported to the quantity (mg) of aminoacylases in the
reaction medium.
Acylation reaction
The N--lauroyl-lysine synthesis activity of the aminoacylases was carried out in test tubes
containing 0.1 M of lysine and 0.1 M of lauric acid in 2 mL of Tris-HCl (25 mM), NaCl (50
mM) at pH 8. A quantity equivalent to 1 mg/ml of the immobilized protein or 0.5 mg/mL of the
free enzyme was then added to start the reaction. The reaction was conducted during 48 h at
45°C and 250 rpm stirring. 100 μL samples were withdrawn and diluted 10 time with
methanol/water (80/20, v/v) solution for the evaluation of the synthetic activity by TLC and
HPLC.
Analysis of the reaction medium
Qualitative analysis by TLC
195
Before HPLC analysis, qualitative analysis of the production of lysine from the hydrolysis
reaction and the acylated product from synthesis reaction were evaluated by TLC on Kieselgel
G 60 Plates 20 cm×20 cm (Merck, Darmstadt, Germany). The mixture butanol (60 %)/acetic
acid (20 %)/water (20 %) was used as mobile phase. Knowing that lysine contains two amino
groups allowed the detection by spraying a commercial solution of ninhydrin reagent (Sigma-
Aldrich).
Quantitative analysis by HPLC
Quantitative analysis of the lysine produced during the hydrolysis reaction was performed by
high-pressure liquid chromatography (HPLC) coupled with a mass spectrometry (MS)
Shimadzu®. The separation of the lysine from the other constituents was carried out using
Hypercarb column (100 x 2,1 mm ; 5µm ; Phenomenex, USA). During the analysis the column
temperature was set to 10°C. The mobile phases was composed of ultrapure water containing
20 mM Nonafluoropentanoic acid (NFPA) for phase A and pure acetonitrile for phase B. the
phase B gradient used for the analysis was : 0 to 15 % during 10 min then 15 to 26% during 10
min then 26 to 50% during 10 min followed by an isocratic gradient at 50% during 10 min
before the decrease of the concentration to 0% phase B for the equilibration of the column. The
detection and the quantification of the lysine was done using mass analysis data lysine transition
from M+H/z=147.10 uma major ion daughter at M+H/z=84.10uma, coming from the
dissociation generated after the collision with argon, in MRM positive mode (Multiple Reaction
Monitoring). The apparatus is equipped with double ionisation or DUIS (Dual Interface
Ionization System) with the ElectroSpray Ionization (ESI) and Atmospheric Pressure Chemical
Ionization (APCI).
For synthesis production of lauroyl-lysine, the quantification of reaction conversion yield was
conducted using HPLC (LC10 AD-VP, Shimadzu, France) equipped with a UV detector at 214
nm and a light-scattering low temperature evaporative detector (Shimadzu, France). A C18
amide 125×2.1 mm (Altima®, Altech, France) maintained at 25°C was used as the suitable
separation column. The mobile phase (0.2 mL/min flow rate) consisted of solvent A:
methanol/water/TFA (60/40/0.1 v/v/v) and solvent B: methanol/TFA (100/0.07). A linear
elution gradient was applied to reach 95 % methanol/TFA after 6 min. This methanol
concentration was maintained for 13 min and then decreased in 1 min to reach the initial
methanol/water ratio until the end of the run (35 min). Calibrations were performed using
standard curve fatty acids and purified commercial α-lauroyl-lysine. The substrate conversion
196
yield was determined using the following equation: conversion yield (%) = (1 - ([fatty acid]mol/L
consumed / [fatty acid]mol/L initial) × 100.
Results and discussion
Immobilization of acylases onto the bare porous silica and activity of the supported
biocatalyts
To investigate the influence of the porosity on the amount of immobilized enzyme and on its
activity, the bare SBA-15 and MMS silicas was first used as support. For both supports, the
nitrogen sorption isotherms display type IV isotherms, characteristic of the presence of
mesopores in the materials according to the IUPAC classification (Fig 1A) [50]. The SBA-15
mesostructured silica adsorption/desorption isotherms exhibit a H1 hysteresis loop with two
parallel and vertical branches, which are assigned to well defined cylindrical mesopores with
homogeneous size. The physisorption isotherm of the MMS material is a combination of type
IV and type II isotherms, featuring the presence of both meso- and macro-pores. The BJH pore
size distribution represented in 1 B show a sharp peak in the case of SBA-15 while MMS shows
a broader mesopore size distribution, evidencing a better homogeneity of the pore size for the
SBA-15 material.
The values of the BET specific surface areas (SBET), the porous volumes (Vpor) and the pore
diameter (pore) are reported in table 2. Both materials exhibit nearly similar mesopores
diameter (7.8 nm for MMS and 8.7 nm for SBA-15). However, the presence of macropores in
the MMS silica results in higher porous volume (1.7 cm3/g) and specific surface area (802
m2/g) compared to SBA-15 (0.82 cm3/g and 650 m2/g, respectively). Such characteristics are
expected to allow the immobilization of higher amount of enzyme on the MMS support. The
mercury porosity analysis (Figure 2) features the presence of macropores who’s the pore size
distribution is centred on 4.7 µm. In accordance with mercury porosity characterization,
micrographs obtained by scanning electron microscopy (Figure 2) show the presence of sponge-
like silica particles with macropores who’s the size ranges from 1 to 3 µm.
The SAXS patterns of SBA-15 shows three reflection peaks at q1=11.0 nm-1, q2=6.3 nm-1 and
q3=5.0 nm-1 which verify the relation q1:q2:q3 = 1: √3: 2 and were assigned respectively to
the 100, 110 and 200 diffraction planes of the 2D hexagonal arrangement of the mesoporous
channels (Fig. 1. 1C). The first reflection peak (q1) was used to calculate Bragg distance which
is in accordance with the literature (10.9 nm) [31,32]. The Bragg distance was used to determine
the unit cell dimension (a0 = 2d100/√3). The mesopore wall thickness was estimated to 4.0 nm-
197
1 by subtracting the pore size diameter determined by N2 sorption isotherm to the unit cell a0
(tab 2). In the case of MMS (Fig. 1. 2C), only one broad peak is detected at around 9.0 nm-1,
suggesting the formation of a wormhole-like mesopore network [49]. Assuming that the Bragg
distance represents the sum of the mesopore diameter and of the mesopore wall thickness, the
later can be estimated to 1.2 nm, which is 3 times lower than the one of the SBA-15.
The enzyme immobilization was carried out in the same conditions for both supports. The
amount of the acylases immobilized on the support was around 3 % for the SBA-15 and more
than 4% for the MMS which shows an improvement of the adsorption for the MMS material.
The higher enzyme loading might result from both the presence of macropores which favour
the enzyme diffusion in the porous network and to the higher porous volume (Vpor) and specific
surface area (SBET) compared to the SBA-15 material. After immobilization the shape of the
N2 sorption isotherm was similar for both supports (Fig 1. 1A and 2A). A very important
decrease of the SBET, Vpor and the pore diameter (pore), more pronounced when using
MMS, was observed (fig 1 and tab 2). This result can be assigned to the pore filling with the
enzyme and/or the partial alteration of the silica structure during the immobilization process
performed in basic medium (pH=8). Indeed, silica is prone to hydrolysis under aqueous basic
conditions. The adsorption of the enzyme at the outer surface of the materials cannot be
excluded. SBA-15 is less prone to such textural modifications which is attributed to its higher
wall thickness an higher level of silica condensation, what limits the structure collapse [19].
Such phenomenon is confirmed by SAXS patterns which evidence no significant changes
before and after adsorption of the enzyme on the SBA-15 materials. On the contrary, the
diffraction peak observed at 9.0 nm-1 for the MMS material before immobilization nearly
disappears after enzyme immobilization, suggesting a partial collapse of the silica structure. In
both cases the immobilization rate was lower than in the literature [43,32]. Considering that the
acylases present a PI of around pH 7 [36,38], such a result can be explained by electrostatic
repulsions between the enzyme and the supports, which have an isoelectric point (PI) around
pH 2-3.
198
1. 2.
C C
A A
B B
Fig 1. Nitrogen sorption isotherms (A), mesopores pore size distribution (B) and SAXS patterns
(C) before and after immobilization of the non-functionalized SBA-15 (1) and MMS (2).
199
1. 2.
Fig 2. Pore size distribution obtained by mercury porosity analysis (1) and scanning electron
microscopy images of MMS (2)
In order to evaluate their recycling potential, the behaviour of the immobilized enzymes was
evaluated along successive experiments by using the hydrolytic reaction of the -acetyl-lysine
as a reference reaction. The activity was evaluated by carrying out the reaction in 2 mL flask
with magnetic stirring during 24 h. Then, the support was separated from the reaction medium
by centrifugation and washed to times before being used for the next reaction (with a fresh
substrate solution). The support was recycled two times (Figure 3). The first catalytic activity
of the immobilized enzymes (around 1.67 µM lysine / mg protein / h) was much lower than the
one of the free enzymes which was around 167 µM lysine / mg protein / h. As shown in figure
3, a significant decrease of the activity due to protein leaching along cycles was observed.
Several authors described the same behaviour of immobilized enzymes on SBA-15 [32,52].
This can be explained by the weak interactions (Van der Walls or, at lower level, by hydrogen
interactions) between the silica material and the protein. The higher desorption rate observed in
the case of meso-macroporous support can be assigned either to the easy diffusion of the
enzyme from inside the pore towards the reaction medium and/or to the collapse of the silica
structure due to its low wall thickness.
200
Enzymatic activity Specific enzymatic activity

100
Relative activity (%)

80
60
40
20
0
1st use 2nd use 3rd use 1st use 2nd use 3rd use
SBA15 MMS
Material and recycling step
Fig 3. Relative activity of the immobilized acylases after support recycling compared to the
initial activity set at 100%. in blue: relative conversion of the alpha acetyl-lysine, in red: relative
conversion of the alpha acetyl-lysine reported by the amount of the protein present in the
reaction medium
Tab 2. Physical characterisations of mesoporous (SBA-15) and meso-macroporous materials

before and after immobilization of the aminoacylases from S. ambofaciens
Immobilization SBET Vpor pore dBragg a0 Wall thickness d110 d200

support (m2/g) (cm3/g) (nm) (nm) (nm) (nm) (nm) (nm)
SBA-15 650 0.8 8.7 11.0 12.7 4.0 6.4 5.0
SBA-15-acylases 336 0.5 7.5 10.2 11.7 4.2 6.0 5.1
MMS 802 1.7 7.8 9.0 10.4 2.6 Np* Np*
MMS-acylases 268 0.4 5.7 Np* - - Np* Np*
Np*: no peak clearly detected
Immobilization of acylases onto APTES-functionalized mesoporous (SBA-15) and

meso-macroporous silica (MMS) supports
In order to investigate the possible improvement of the activity and stability of the immobilized
enzymes by the silica surface modification, both materials were functionnalized with 3-
aminopropyl-tri-ethoxysilane (APTES).
As reminded in the introduction, several authors investigated the use of organosilane-

functionalized silica materials for the immobilization of acylases [37,38,43]. They
demonstrated that APTES-functionalized materials seem to be the most suitable to improve the
activity and the stability of penicillin acylase and the acylase I from Aspergillus melleus. For
this reason, the APTES was used in this study with different loading, in order to evaluate the
201
influence of the surface modification. The grafting of APTES changes the surface properties of
the silica by increasing surface hydrophobicity due to the presence of propyl groups and by
reducing the quantity of free hydroxyl groups [43]. Moreover, the nature of the interactions
between the enzyme and the functionalized support strongly depend on their respective pI and
of the pH. Electrostatic interactions between the positively charged amino group of APTES (R-
NH3+) and the negatively charged carboxyl group of the glutamic and aspartic acid residue of
the surface of the immobilized proteins possibly occur but due to the lack of information about
the 3D structure of the enzyme, there is no way to confirm this hypothesis. It is also possible to
observe an improvement of the hydrogen interactions between non-protonated APTES amino
group (R-NH2) and the enzyme as described in the literature [37]. The functionalized materials
(SBA-15 and MMS) were physically characterized before and after immobilization of the
aminoacylases of S. ambofaciens and the activities of the immobilized enzymes were compared.
Silicon NMR (29Si NMR) was used to characterize the functionalization rate of the supports.
The 29Si NMR spectra of the functionalized SBA-15 and MMS (with 1% and 50% APTES) are
given in fig.4A. Before functionalization, the 29Si RMN spectrum features the presence of Q2
(Si(OSiOH)2), Q3 (Si(OSi)3OH ) and Q4 (Si(OSi)4 species assigned to the peaks at -95 ppm, -
105 ppm and -115 ppm. After grafting with 1% APTES, Q3 and Q4 species are still observed
and a weak peak appears at -71 ppm, assigned to T3 ((SiO)3SiC) species, evidencing the
covalent linking of the propylamine moieties to the silica support. At higher loading (50%
APTES) the T3 peak becomes more intense and a second peak at -64 ppm appears, assigned to
T2 ((SiO)2Si(OH)C) species, both peaks featuring the higher grafting rate of APTES on silica
material as compared to the 1% APTES material.
By integration of the Tn and Qn signals, using the formula ∫Tn/(∫Tn + ∫Qn), the functionalization
rate of the silica support by APTES was estimated. Results are reported in Table 3. Noteworthy,
29
the Si RMN spectra of the APTES-functionalized materials are similar before and after
enzyme immobilization, suggesting that the immobilization procedure does not impact (or in a
minor extent) the covalent bonds between APTES and silica.
Tab 3: APTES functionalization rate calculated from 29Si NMR characterizations
SBA-15_1% SBA-15_50% MMS_1% MMS_50%

Material
APTES APTES APTES APTES
Functionalization rate (%) 12 49 6 46
202
Carbon NMR (13C CPMAS NMR) spectra of the supports functionalized with 1% and 50%
APTES before acylase immobilization are presented in fig. 4 B and C. Three major peaks are
observed for SBA-15 at around 43, 23 and 10 ppm and at around 39, 26 and 6.5 ppm for MMS
with APTES (50%). These peaks correspond to the carbon atoms of the CH3-N, CH2 and CH3-
Si groups of APTES, respectively [32,37,53].
After enzymes immobilization, a new peak appears at around 174 ppm, for the SBA-15
functionalized with 50% APTES. This signal might be the result of the peptide linkage (NH-
CO). Another peak is present at around 60 ppm, especially when the enzymes were immobilized
on SBA-15, it might correspond to the carbon atoms close to a nitrogen atom of the -amino
group of the amino acids chain (NH-CH(R)-CO) [31]. Those peaks confirm the presence of the
enzyme at the surface of the materials however the low protein immobilized amount make the
detection by NMR difficult.
SAXS patterns reported on fig. 4 D and E show that the mesostructure of the materials is
preserved after the grafting step. Indeed, the reflexion spectra of the functionalized and non-
functionalized SBA-15-based materials are similar, with the presence of three reflection peaks
characteristics of the hexagonal configuration of the mesopores, as discussed above. Similarly,
MMS-based materials exhibit similar SAXS patterns before and after the functionalization.
After immobilization of acylases on the different supports, the same trend was observed as the
one described above, i.e.: no significant change in the ordered hexagonal mesopores of the
SBA-15 is noticed while a partial collapse of the mesoporous structure (decrease of the peak
intensity) of the MMS is observed.
After the functionalization, the general shape of the adsorption isotherms is not modified (fig
4. F and G). However, it is evident that higher the APTES content, lower the specific porous
volume of the materials which is assigned to pore filling by the grafted organic moieties.
Regarding the SBA-15-based materials, a significant decrease of the BET specific surface area,
porous volume and pore diameter after enzymes immobilisation is observed on the non-
functionalized SBA-15 support (figure 5). Such a result can be attributed to pore filling by the
enzymes. However, it is noteworthy that no significant change of the porous volume and pore
diameter is observed after enzymes immobilization on the APTES-functionalized SBA-15-
based materials. This might be due to the presence of grafted aminopropyl groups that prevent
the diffusion of the enzymes toward the inside of the mesoporous network. The slight decrease
of the BET specific surface area after enzymes immobilization on the APTES-functionalized
203
SBA-15-based materials can be assigned to the enzyme adsorption on the external surface area
of the support. Contrarily to SBA-15-based materials, a strong decrease of the pore diameter is
observed for the MMS-based materials after enzymes immobilization. Such a result can be
assigned to the macropores filling by the enzyme and/or the partial collapse of the silica
structure along the immobilization step, as discussed previously.
B C
D E
F G
204
29 13
Fig 4: Si CPMAS NMR spectra (A), C CPMAS NMR spectra (B for SBA-15 and C for
MMS) and SAXS patterns (D for SBA-15 and E for MMS) of the functionalized and non-
functionalized supports with and without enzyme and nitrogen sorption isotherms the
functionalized and non-functionalized supports (F for SBA-15 and G for MMS).
A B
Without acylases With acylases 1,8 Without acylases With acylases
800
Porous volume (cm3/g)
1,5
Specific surface (BET)
600 1,2
400 0,9
200 0,6
0,3
0 0
50%
10%
25%
50%
10%
25%
1%
5%
1%
5%
SBA15
MMS
10%
5%
10%
25%
50%
25%
50%
1%
1%
5%
SBA15
MMS
Mesoporous Meso/macroporous Mesoporous material Meso/macroporous

material (SBA15) material (SBA15) material
Immobilization material Immobilization material
C D
10 Without acylases With acylases Initial material
Pore diameter (nm)
8 Treated with Tris buffer

2 After enzymes immobilization
6
Porous volume (cm3/g)
4 1,5
2 1
0 0,5
10%
25%
50%
10%
25%
50%
1%
5%
1%
5%
SBA15
MMS
0
SBA15 5% 50% MMS 5% 50%
Mesoporous material Meso/macroporous Mesoporous material Meso/macroporous

(SBA-15) material (MMS)
(SBA15) material
Immobilization material Immobilization material
Fig 5. Specific surface area (A), porous volume (B) and pore diameter (C) evolution after
functionalization and immobilization steps on MMS and SBA-15 supports and evolution of the
porous volume of the 5% and 50% APTES functionalized MMS and SBA-15 supports after
treatment with the buffer used for the immobilization with and without enzyme (D).
205
After the adsorption of the aminoacylases from S. ambofaciens on the different kind of
functionalized materials, the quantity of immobilized proteins was determined by BCA analysis
of the filtrate, and the washing solution. As shown in figure 6, the quantity of the adsorbed
proteins depends on the nature of the support and on the functionalization rate. The enzyme
loading on MMS is more or less 1.5 time higher than on SBA-15. This result can be related to
the presence of the second pore network; i.e. the macropore one in the MMS material which
improves the accessibility of the enzyme into the porous network. The results show that the
functionalization rate considerably improves the immobilized acylases amount (more than 2
times) for both porous materials when increasing the APTES loading from 0 to 10%. For
APTES loading higher than 10% and up to 50% the enzyme loading reaches a plateau at around
0.65 mg prot/mg material for SBA-15-APTES support and around 0.95 mg prot./mg material
for MMS-APTES material. The increase of enzyme loading for APTES grafting from 0% to
10% can be explained by the modification of surface properties of the materials by grafting
APTES molecules which reduce the presence of hydroxyl group and increase the possible
hydrophobic, electrostatic and hydrogen interactions between the grafted organosilane and the
enzyme. The reduction of the presence of the free -OH at the surface might prevent the
electrostatic repulsion caused by the negative charge of the material and the enzyme surface at
the pH used during the immobilization process (pH 8 > pI of the material and the enzymes).
Moreover, the hydrophobic interactions between the propyl part of the APTES and the amino
acids residues of the enzyme surface might be promoted. The same trend was described by
Chong et al. [38]. The authors reported a faster and better enzyme immobilization of penicillin
acylase on SBA-15 functionalized with APTES, compared to the native SBA-15 [38]. For both
supports, the stabilization of the immobilization rate after 10% APTES functionalization can
be attributed to a saturation of the surface of the materials by the APTES and a possible
obstruction of the mesopores by organic moieties.
206
Fig 6. Amount of enzymes adsorbed on functionalized SBA-15 and MMS materials after 18 h
immobilization at 4°C under 100 rpm rotatory agitation.
The results concerning the acylases immobilization show a very important difference between
SBA-15 and MMS supports. In the case of the functionalized SBA-15, whatever the
functionalization rate, only very slight changes of the specific surface area and of the pore
volume are observed. This can be related to diffusional limitations of the enzyme into the
mesopores. Indeed, as shown in figure 5. C, no change in the pore diameter was observed after
immobilization on the functionalized unlike the non-functionalized SBA-15. The quantification
of the protein immobilized on the support (fig 6) shows an improvement of the adsorbed amount
13
of enzymes by increasing the APTES rate and the C CPMAS NMR spectra confirm clearly
the presence of the enzymes at the surface of the functionalized materials. Those observations
suggest that a major part of the enzyme is immobilized on the external surface area of the
functionalized SBA-15 assigned to diffusional limitations of the enzymes into pores of the
SBA-15, due to the presence of APTES.
The MMS-based materials show a completely different behaviour after the immobilization on
the functionalized material. An important decrease of the specific surface area and of the porous
volume is observed after immobilization on the different functionalized MMS. The final values
reached are similar to the ones of SBA-15 materials after immobilization. These results strongly
suggest that the immobilization of the acylases occurred inside the pores of the MMS, promoted
by the presence of larger pore diameter and the possible funnel organization between
macropores and mesopores allowing a better diffusion of enzyme molecules inside the
mesoporous structure. Indeed, according to the figure 5. C an important decrease of the pore
size and an increase of the wall thickness of the mesopores was registered, confirming the
207
immobilization of the acylases inside the pores. However, the possible immobilization of the
enzymes at the external surface cannot be excluded. In order to check if there were a collapse
of the MMS mesoporous structure causing a decrease of the material properties, the SBA-15
and MMS functionalized with 5% and 50% functionalized was treated with the buffer (buffer
Tris-HCl 25 mM, NaCl 50 mM, pH 8) in the same way as when the immobilization was
conducted. The adsorption/desorption isotherm showed a significant decrease (50%) of the
porous volume of the MMS compared to the SBA-15 where no change was registered after the
treatment with only the buffer (figure 5.D). In addition, the pore size of the material after the
treatment without enzyme showed also a significant decrease passing from 6.8 to 4.6 for MMS
functionalized with 5% APTES and from 5.2 to 4.9 for the one functionalized with 50% APTES
while no change of the mesoporosity of the SBA-15 were observed. This result confirms the
collapse of the mesostructured of the MMS material due to a fragile structure and a pore wall
thicknesses lower than the one of the SBA-15 allowing more resistance (pore wall thicknesses
of 2.5 nm for MMS and around 4 nm for SBA-15). The reduction of the pore size may cause a
diffusional limitation of the enzymes into the mesopores which mean that the they are
essentially immobilized in the macro-porosity of the MMS. On the other hand, if the enzymes
enter the mesopores which is likely the case because of the higher decrease of the pore size
when the enzyme solution is used, they can be entrapped in there which can stabilise the enzyme
inside the pore but can induce a diffusional limitation of the substrate to the enzyme during the
reaction. This can be confirmed by the activity evaluation.
Activity of the physically immobilized aminoacylases on APTES-functionalized

materials (SBA-15 and MMS)
In order to evaluate the catalytic performances of the immobilized enzymes on the different
functionalized materials, the N--acetyl-L-lysine hydrolysis reaction was performed in Tris
HCl buffer at pH 8 and with the same enzyme equivalent amount (1 mg proteins/mL). The
conversion rates of the immobilized enzymes are presented on figure 7.A. The results show that
the immobilized enzymes exhibit a catalytic activity, what can be explained by the orientation
of the enzyme at the surface of the support by exposing the active site to the reaction medium
resulting in an increase of the enzyme/substrate interactions and a better diffusion of the
reactants towards the active sites. However, as expected, in all cases the hydrolytic activity was
much lower than the free enzymes which show a complete hydrolysis of the substrate after 24
h in the same operational conditions. Several authors described an improvement of the catalytic
activity after immobilization of acylases on APTES functionalized materials. Chong et al. [38]
208
immobilized the penicillin acylase on functionalized and non-functionalized SBA-15. They

showed that the APTES was the most appropriate organosilane compared to other organosilanes
(4-(trimethoxysilyl)-butyronitrile vinyltriethoxysilane, (3-Mercaptopropyl) tri-methoxysilane,
…) for the immobilization of this enzyme with around two times improvement of the activity
compared to the one immobilized on non-functionalized SBA-15 [38]. Jesionoxski et al. [37]
performed the immobilization of the acylase I from Aspergillus melleus on amino and carbonyl
functionalized Stöber silica. They also demonstrated an important increase in the catalytic
activity by using APTES functionalized materials. This was related to a better orientation of the
enzyme avoiding the obstruction of the active site of the enzyme. Radhakrishna et al. (2013)
explained the phenomena implicated in the improvement of the catalytic activity of the enzymes
immobilized on moderately hydrophobic surface by a better stiffening of the enzyme at the
surface of the material without any conformational disruption [41].
Regarding our results (figure 7.A), the catalytic activity of the SBA-15-APTES-Enzyme
materials seems to be correlated to their enzyme loading, which itself depends on the APTES
functionalization rate of the support, as discussed above. An increase of the enzyme loading
and material activity is observed for APTES grafting rate increasing from 1% to 10%, then a
plateau is reached between 10% and 50%. The MMS-based materials exhibit a significantly
lower activity than the SBA-15-based ones, although the enzyme loading is around 1,5 times
higher on the MMS support as compared to the SBA-15 one. Such results feature that the
enzyme activity (turnover frequency) is much higher on the SBA-15 supports than one the
MMS ones. Moreover, the activity of the immobilized enzymes on the functionalized MMS is
weakly affected by the APTES rate unlike the functionalized SBA-15. These results can be
related to the partial collapse of the MMS porous network observed in the previous section,
restricting the accessibility of the substrate to the enzyme. On the contrary, in the case of
APTES functionalized SBA-15 the support characterisations strongly suggest that the main part
of the enzymes is adsorbed at the external surface of the material which makes them more
exposed to the substrate, thus reducing the diffusional limitations of the substrate to the active
site. The thicker walls of SBA-15 make it more resistant to collapsing phenomena compared to
MMS. Based on these results, the functionalized SBA-15 was selected for the rest of the study.
The ability to reuse the immobilized biocatalyst is an important factor to determine the
economic viability of a process. The immobilization of the acylases on non-functionalized
SBA-15 previously described, showed an important leaching of the enzymes after the first use.
The functionalization of the SBA-15 with APTES is supposed to improve the stabilization of
209
the enzymes on the material by introducing hydrophobic interactions and avoiding electrostatic
repulsions. The results of the measurement of the protein desorption after several uses of the
supported material is presented on figure 7.B. The immobilized enzymes on the functionalized
material present a better stability after the first reuse compared to the non-functionalized one.
However, after the second reuse, an important leaching of the protein was observed to reach the
same amount of enzymes as the one with non-functionalized material. The desorption of the
enzymes can be explained by the moderately hydrophobic surface which exhibit better affinity
for this enzyme than the highly hydrophilic one of pure SBA-15 but not enough to retain the
enzymes and to resist to the mechanical shear of the magnetic agitation mode used during the
reaction.
These immobilized enzymes were also evaluated for their synthetic activity by using lauroyl-
lysine synthetic reaction, using L-lysine and lauric acid as substrates with an equimolar ratio.
The relative activity compared to the activity of the free enzymes is presented on the figure 7.C.
The evolution of the synthetic activity depending on the APTES functionalization rate follows
the same trend as the one obtained for the hydrolytic activity: an increase of the APTES rate
results in an increase in the conversion rate. In order to check if there was no change in the
regioselectivity of the immobilized acylases, LC-MS-MS analysis of the reaction products was
conducted. In all cases, the results show the apparition of only a mono-acylated product
corresponding to the acylated lysine on the alpha amino group. The same MS2 profile was
obtained by using the free enzymes [46]. However, in all cases, a significant loss of the synthesis
activity (more than 90 %) was observed compared to the free acylases. This loss can be
explained by diffusional limitations of the substrate emulsion to the active site which was more
difficult than the use of a single molecule as substrate. The evaluation of the protein leaching
after the three days synthesis reaction shows that around 23 % was desorbed from the silica
materials.
In order to reinforce the stability of the enzymes at the surface of the immobilization support,
an additional chemical treatment of the immobilized enzymes on the SBA-1550% with
glutaraldehyde was conducted. This treatment allows the formation of cross-linking enzyme
aggregates (CLEAs) between the immobilized enzymes on the material. Different
glutaraldehyde ratios were used in order to determine its influence on the activity. After the
treatment, no loss of the already immobilized enzymes was detected by BCA analysis of the
filtration and washing solutions. According to the results reported on the figure 7.D the
formation of cross-linking between the enzymes led to a dramatic loss of the activity compared
210
to the non-treated material. The increase of the glutaraldehyde percentage was accompanied
with a decrease of the enzymatic activity. The SAXS analysis didn’t show any structural
modifications of the mesopores. The production of CLEAs using the free enzymes and 10%
glutaraldehyde showed a complete loss of the catalytic activity. This result can be explained by
the formation of covalent bridges between the protein amino acids residues causing a distortion
of the protein conformation and the active site. Due to the fragile structure of those
aminoacylases, the CLEAs formation was not suitable for the improvement of both the activity
and the stability of these enzymes.
A B
14
Conversion rate of alpha-acetyl-
100
Residual immobilized enzyme

12
80
lysine to lysine (%)
10
8
60
6 (%)
4 40
2
- 20
25%
10%
25%
50%
10%
50%
1%
0%
5%
0%
1%
5%
SBA15 MMS 0% 1% 5% 10% 25% 50%
APTES functionalization rate (%) SBA15

APTES functionalization rate (%)
C D
6
100
5
80
4
60
3
40
2
20
1
0
0
0% Glut 1% Glut 5% Glut 10% Glut
0% 1% 5% 10% 25% 50%
SBA15 SBA15 50% APTES
APTES functionalization rate (%) Glutaraldehyde rate %
Fig 7. A. Determination of the N--acetyl-L-lysine hydrolytic activity of both APTES

functionalized materials (24 h at 37 °C, 500 rpm), B. relative residual adsorbed proteins on the
APTES functionalized SBA15 after re-use for 3 cycles, C. relative synthetic activity compared
to the free enzymes (72 h at 45°C, 600 rpm), D. relative hydrolytic activity of the cross linked
enzyme aggregate post immobilization on the SBA15 functionalized with 50% APTES (24 h at
37 °C, 500 rpm)
211
Conclusion:
The aim of this study was to investigate the influence of the pores size and of the surface
functionalization of (macro)-mesoporous silica-based materials on the immobilization and the
activity of the aminoacylases from S. ambofaciens. The use of meso-macroporous materials
(MMS) allowed higher physisorption of the enzymes due to the presence of macropores but the
activity was better after immobilization on mesoporous silica material (SBA-15). The
functionalization of the materials with APTES allowed an increase of the catalytic
performances of the enzymes related to a better orientation of the active site influenced by the
increase of the surface hydrophobicity. However, the stability was low even after the surface
functionalization. In order to improve the stability and the activity of the acylases the evaluation
of other organosilanes with different chain lengths can be considered. Furthermore, it was
demonstrated that the aminoacylases from S. ambofaciens are cobalt dependent: work is in
progress to favour the co-condensation of cobalt in the material preparation that might also
improve the catalytic performances.
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https://doi.org/10.3390/ijms11020762.
216

L’objectif de cette étude était d’évaluer les performances des aminoacylases de S. ambofaciens
suite à leur immobilisation par physisorption sur des supports silicatés méso-poreux (SBA15)
et méso-macroporeux (MMS). L’influence de la modification des propriétés de surface de ces
supports sur le taux d’immobilisation, sur les performances catalytiques des enzymes
immobilisées et sur leur stabilité lors du recyclage a été étudiée afin de sélectionner le support
le plus adapté.
Initialement, les deux types de supports ont été utilisés pour l’immobilisation sans modification
de surface afin d’étudier leurs caractéristiques. La détermination des propriétés physiques des
matériaux a mis en évidence la présence de structures mésoporeuses hexagonales
caractéristiques des SBA15, contrairement aux MMS qui ont présenté une structure
mésoporeuse de forme non-définie. L’analyse en microscopie électronique à balayage et de
porosité au mercure a montré une répartition non homogène de la taille des pores des MMS
avec une dominance des macro-pores permettant d’avoir une surface spécifique et un volume
poreux plus importants que les SBA15. Ceci permet une bonne accessibilité des pores de MMS
aux enzymes, se traduisant par un taux d’immobilisation plus important (autour de 4%) qu’avec
les matériaux mésoporeux (SBA15) (environ 3%). L’évaluation des performances catalytiques
des enzymes immobilisées a montré la présence d’une activité hydrolytique de l’-acétyl-lysine
similaire pour les deux supports. En termes de stabilité lors des cycles de recyclage, les enzymes
immobilisées sur SBA15 ont présenté une meilleure stabilité que celles immobilisés sur les
MMS. Cette perte d’activité après recyclage est certainement liée à l’importante désorption des
enzymes liée aux faibles interactions de ces dernières avec le support qui font principalement
appel à des liaisons hydrogènes ou de Van der Waals. De plus, la présence de macro-pores dans
le cas des MMS a facilité le relargage de l’enzyme vers le milieu réactionnel causant une
désorption plus importante. Afin de tenter d’améliorer les interactions de l’enzyme avec les
supports, une modification des propriétés de surface des matériaux utilisés par greffage de
l’APTES a été réalisée.
Les deux types de supports ont été fonctionnalisés avec de l’APTES à différents pourcentages,
afin d’étudier l’effet de ce dernier sur le taux d’immobilisation et sur l’activité enzymatique.
Les résultats ont montré une augmentation du taux d’immobilisation des enzymes sur les deux
supports proportionnellement à l’augmentation du taux d’APTES de 0 à 10 % puis une
stabilisation de la quantité immobilisée. Cette augmentation a été reliée à l’introduction de
groupements propyle qui augmentent le caractère hydrophobe de surface permettant une plus
217
forte interaction avec les résidus hydrophobes de l’enzyme. La présence des groupements
amines de l’APTES permet aussi d’accentuer les interactions de type électrostatique (entre les
NH3+ de l’APTES et les résidus chargés négativement de la surface de l’enzyme) et hydrogène
entre l’enzyme et le support (figure 5.1). Lors de l’utilisation des supports silicatés non
fonctionnalisés, le support est en grande majorité chargé négativement ce qui favorise la
répulsion électrostatique par implication des résidus acides présent en surface de l’enzyme
(Kołodziejczak‐Radzimska et al., 2018). Une augmentation progressive de l’activité des
enzymes immobilisées sur les SBA15 avec l’augmentation du taux d’APTES a aussi été
observée. Cette augmentation de l’activité pourrait être liée à une meilleure orientation du site
actif de l’enzyme vers le milieu réactionnel permettant une meilleure accessibilité du substrat.
Par contre, les performances des enzymes immobilisées sur les MMS fonctionnalisés n’ont pas
montré la même tendance avec très peu d’accroissement de l’activité, même si le taux
d’immobilisation était supérieur comparativement aux MMS non fonctionnalisés par APTES.
En termes de stabilité, une désorption moins importante des enzymes immobilisées sur les
supports fonctionnalisés a été observée après la première utilisation. Toutefois, après deux
recyclages, les quantités d’enzyme adsorbée sur les différents SBA15 fonctionnalisés et non-
fonctionnalisés étaient similaires. Afin de tenter de remédier à ce problème, une condensation
des enzymes après leurs immobilisation par la formation de CLEAs (cross-linked enzyme
aggregates) a été réalisée. Cette dernière étape a été réalisée par l’utilisation de différents
pourcentages de glutaraldéhyde. Les résultats ont montré une diminution progressive de
l’activité des enzymes immobilisées avec l’augmentation du taux de glutaraldéhyde. Cette perte
d’activité est probablement due à une dénaturation de l’enzyme après formation de liaisons
covalentes entre le glutaraldéhyde et l’enzyme. En effet, la formation de CLEAs
d’aminoacylases libres de S. ambofaciens a aussi été réalisée de la même manière. Cela a
conduit à une perte totale de l’activité enzymatique.
Figure 5.1 : schéma des interactions hydrogènes possibles entre les fonctions amines de
l’APTES et l’enzyme (Kołodziejczak‐Radzimska et al., 2018)
218
Cette étude a permis d’évaluer l’influence de la taille des pores et de l’augmentation du

caractère hydrophobe de la surface des matériaux siliceux sur l’activité et la stabilité des
enzymes immobilisées. Les résultats montrent clairement l’influence positive de
l’augmentation du caractère hydrophobe du support sur les interactions enzyme / support.
L’évaluation de l’activité enzymatique a montré de meilleures performances des enzymes
immobilisées sur les SBA15 fonctionnalisés avec de l’APTES à 50%. Cependant, ces résultats
ne permettent pas d’envisager l’utilisation de ces catalyseurs pour la production de molécules
d’intérêt car l’activité de ces enzymes sous forme immobilisée reste faible par rapport à leur
forme libre. Toutefois, la démarche suivie peut être utilisée pour l’évaluation de l’utilisation de
supports d’autres natures et propriétés. Afin de compléter ces résultats, d’autres types de
supports ont été étudiés.
5.3 Résultats complémentaires

5.3.1 Performances des aminoacylases de S. ambofaciens immobilisées
sur différents supports silicatés
L’étude des performances des aminoacylases de S. ambofaciens immobilisées sur les supports
mésoporeux (SBA15) et méso-macroporeux (MMS) ayant montré une influence de la taille des
pores sur le taux d’immobilisation et sur l’activité enzymatique, d’autres types de supports de
porosités différentes ou sans porosité ont été utilisés. Certains auteurs ont rapporté l’importance
d’avoir une taille de pores au minimum deux fois plus importante que le diamètre des enzymes
afin d’assurer une bonne accessibilité du substrat à l’enzyme et de faciliter le transfert du produit
de la réaction (Cao, 2005c). A cet effet, les matériaux macroporeux siliceux appelés SiHIPE
(High Internal Phase Emulsion) peuvent présenter un intérêt pour l’immobilisation des
aminoacylases de S. ambofaciens. Les SiHIPE ont été synthétisés par les partenaires du projet
suivant la méthode décrite dans la littérature (Backov, 2012a). La caractérisation de la
distribution de la taille des pores de ces supports a montré une très faible méso-porosité,
déterminée par la méthode BJH, et une très forte macroporosité, déterminée par l’évaluation de
la porosité au mercure et observée par microscopie électronique (Figure 5.2 et 3). Ces supports
présentent une surface spécifique de 1033 m2/g, ce qui est plus important que celle des supports
mésoporeux (SBA15 ; 650 m2/g) et méso-macroporeux (MMS ; 802 m2/g). Cela signifie qu’une
très grande partie du squelette du matériau est représentée par des macrospores (estimé à 93%).
219
A B
Figure 5.2 : distribution de taille des mésopores par la méthode BJH (A) et des macropores
par l’analyse de porosité au mercure (B) des SiHIPE
A B
Figure 5.3 : observation en microscopie électronique à balayage (A) et à transmission (B) des
SiHIPE
Un autre type de support a aussi été élaboré pour l’immobilisation des aminoacylases. Il s’agit
d’un support hybride présentant à la fois des méso-pores semblables à ceux des SBA15 en
termes de taille et d’organisation et des macropores similaires à ceux des SiHIPE avec une
surface intermédiaire entre les deux (Roucher et al., 2018b). Les caractéristiques de ces
matériaux méso-macroporeux innovants appelés SBA-Si-HIPE et leurs méthodes de production
ont été décrites par Roucher et al. (2018).
Ces deux types de supports ont été utilisés pour l’immobilisation par adsorption des
aminoacylases de S. ambofaciens, dans les mêmes conditions que pour les supports SBA15 et
MMS décrites précédemment afin de pouvoir comparer les résultats. Les résultats des taux
d’immobilisation sont présentés sur la figure 5-4-A. La quantité d’enzyme immobilisée dépend
clairement de la taille des pores : l’augmentation du diamètre des pores s’accompagne d’un taux
d’immobilisation plus important, ce qui est logique. En effet, la présence d’une porosité plus
importante et d’une plus grande surface conduit à une amélioration de la diffusion de l’enzyme
à l’intérieur des pores qui va pouvoir tapisser une surface plus importante. La comparaison des
deux matériaux méso-macroporeux montre un taux d’immobilisation deux fois plus important
220
sur les SBA-si-HIPE que sur les MMS. Plusieurs paramètres peuvent être à l’origine de ces
résultats. Les mésopores des SBA-si-HIPE présentent une organisation et une taille homogène
de structure hexagonale, permettant une répartition similaire des enzymes au niveau des pores
contrairement aux MMS qui présentent une répartition de taille hétérogène des mésopores.
Cette homogénéité de taille de pores peut aussi réduire la désorption des enzymes au cours de
l’immobilisation, augmentant ainsi le taux d’immobilisation. La quantité d’enzyme
immobilisée sur les SBA-si-HIPE est presque similaire à celle obtenue avec les Si-HIPE.
L’activité hydrolytique de l’-acétyl-lysine des enzymes immobilisées a été ensuite mesurée et
comparée aux activités des enzymes immobilisées sur les SBA15 et MMS.
La détermination de l’activité d’hydrolyse de l’-acétyl-lysine par les enzymes immobilisées a
été réalisée en adaptant la quantité de support ajoutée afin de placer l’équivalent de 1 g/L de
protéines dans le milieu réactionnel, en tenant compte du taux d’immobilisation. Les résultats
de l’activité hydrolytique après 24h des enzymes immobilisées sur les différents matériaux, sont
représentés dans la figure 5-4-B : l’activité des enzymes immobilisées reste très faible par
rapport à celle de l’enzyme libre. L’activité hydrolytique des enzymes immobilisés sur les Si-
HIPE et les SBA-si-HIPE est similaire mais moins importante que l’activité observée avec les
supports SBA15 et MMS. Ce résultat peut être expliqué par des problèmes de diffusion du
substrat vers l’enzyme soit à cause d’une immobilisation au cœur des pores du matériau ou par
l’obstruction des pores par accumulation des enzymes à l’entrée. L’orientation des enzymes
immobilisées peut aussi être la raison de cette faible activité. Malgré ces résultats, les supports
ont pu être recyclés deux fois, et des réactions d’hydrolyse de l’-acétyl-lysine ont été mises
en œuvre afin d’évaluer la stabilité de ces enzymes immobilisées. Les résultats sont représentés
dans la figure 5-4-C. Pour les Si-HIPE, une perte d’activité très importante a été mise en
évidence d’un cycle d’hydrolyse à l’autre. Cette perte d’activité est principalement liée à la
désorption des protéines immobilisées ; la détermination de l’activité spécifique (activité
déterminée sur la base de la quantité de protéine restant adsorbée sur le support) montre une
relative stabilité de cette activité spécifique (environ 80%). L’introduction de mésopores sur ce
support (SBA-si-HIPE) a permis une amélioration de l’adsorption de l’enzyme au niveau des
pores, ce qui signifie que les pertes d’activité sont principalement liées à une dénaturation de
l’enzyme au cours des cycles d’hydrolyse. L’activité de synthèse de l’-lauroyl-lysine des
enzymes immobilisées sur ces deux supports a aussi été évaluée. Les résultats n’ont pas montré
d’apparition de produit après 48 h de réaction.
221
A B
0,082 0,086 2,5
Quantité de proteines immobililisée
Pourcentage de conversion (%)

(mg d'enzyme / mg de support)
0,08 2,5
2,0 1,8
0,06
1,5
0,039
0,04 0,030 1,0
0,02 0,5 0,3 0,3
0 0,0
Support utilisé Matériaux utilisés
C
Activité Activité spécifique
100
Pourcentage de conversion relative (%)
80
60
40
20
0
H1 H2 H3 H1 H2 H3 H1 H2 H3 H1 H2 H3
SBA15 MMS SBA-si-HIPE Si-HIPE
Support utilisé
Figure 5.4 : quantité d’enzyme immobilisée sur les différents types de support (A), taux de
conversion de l’ -acétyl-lysine en lysine (B) et suivi de l’évolution de l’activité suite à 2
recyclages des enzymes immobilisées (C). H : cycle d’hydrolyse de l’-acétyl-lysine en lysine
Vu les faibles activités obtenues, un autre type d’immobilisation a été réalisé. Il s’agit de
l’immobilisation par encapsulation des aminoacylases de S. ambofaciens dans une double
émulsion. Cette immobilisation a été réalisée par les partenaires du projet ANR suivant la
méthode décrite dans la littérature (Blin et al., 2014b). En résumé, elle est réalisée en
introduisant l’enzyme lors de la première étape de production de l’émulsion eau dans l’huile
qui sera par la suite utilisée pour la formation de la double émulsion, laquelle sera séchée à
l’étuve à la fin pour récupérer la poudre finale. Les enzymes étant piégées à l’intérieur du
support, le rendement d’immobilisation est de 100% avec un taux d’immobilisation de l’ordre
de 0.04 mg protéine / mg de matériau. Les supports ainsi produits ont été évalués en termes
222
d’activité hydrolytique de l’-acétyl-lysine et de stabilité au recyclage et leurs performances

ont été comparées à celles des MMS (figure 5-5-A). A la première utilisation des enzymes
immobilisées dans les doubles émulsions, l’activité enzymatique était 7 fois plus importante
que celle des enzymes immobilisées sur les MMS. Cela peut être expliqué par la présence
d’enzymes sous forme libre, piégées à l’intérieur du matériau, ce qui améliore l’accessibilité du
substrat au site actif et sans changement de la structure tridimensionnelle de l’enzyme. Par
contre, les enzymes immobilisées par adsorption nécessitent l’ancrage de l’enzyme à la surface
du support par des interactions faibles (liaison hydrogène, hydrophobes, Van der Waals), ce qui
peut modifier la conformation de l’enzyme, avec un risque d’obstruction du site actif lors d’une
mauvaise orientation de l’enzyme à la surface. L’évaluation de la stabilité de l’enzyme a été
réalisée en recyclant le support deux fois. Les résultats montrent une très faible stabilité de
l’enzyme au recyclage avec une perte de 80 % de l’activité dès le premier recyclage, suivie
d’une perte presque totale d’activité enzymatique (figure 5-5-B). Plusieurs hypothèses peuvent
expliquer ces résultats. Même si les aminoacylases sont piégées à l’intérieur du support, ce qui
réduira leur relargage, l’agitation par un barreau aimanté à une vitesse d’agitation de 600 rpm
génère un cisaillement assez important, pouvant endommager la structure de la double
émulsion, libérant ainsi les enzymes qui seront éliminées lors des étapes de lavage entre chaque
recyclage. Afin de vérifier cela, la quantité d’enzyme libérée après chaque réaction a été
mesurée en utilisant différentes méthodes de quantification des protéines (Bradford et BCA).
Cependant, les résultats n’ont pas pu être exploités liés certainement à la présence des molécules
qui composent la double émulsion (telles que le tensioactif) et qui semblent interférer avec ces
méthodes de dosage protéique, donnant des résultats aberrants. La deuxième hypothèse pouvant
expliquer cette perte d’activité peut être liée à une inactivation de l’enzyme au cours du temps.
Cette hypothèse est effectivement possible si l’on considère le fait que les enzymes
immobilisées par encapsulation sont assez libres, retrouvant ainsi la problématique de la faible
stabilité thermique et de l’inactivation au cours du temps de l’enzyme libre décrite dans le
chapitre 4 et qui sera détaillée dans le chapitre 6. Globalement, les enzymes immobilisées par
adsorption sur les supports MMS ont présenté une meilleure stabilité de l’activité spécifique.
Ces résultats sont très similaires à ceux décrits par Blin et al. (2014) lors de l’immobilisation
de la lipase de Mucor miehei dans une double émulsion similaire. Les résultats avaient montré
une très bonne activité de ces enzymes lors de la première utilisation puis une forte perte des
performances enzymatiques lors de la production de biodiesel dans de l’hexane. Les enzymes
immobilisées sur les SBA15 présentaient une meilleure stabilité.
223
A B
20 Activité Activité spécifique
100
Activité hydrolytique relative (%)

Pourcentage de conversion de l'-
18
acétyl-lysine en lysine (%)
16
80
14
12 60
10
8 40
6
4 20
2
0 0
MMS Double H1 H2 H3 H1 H2 H3
émulsion
MMS Double émulsion
Support utilisé
Support utilisé
Figure 5.5 : taux de conversion de l’-acétyl-lysine en lysine (A) et activité hydrolytique

relative suite à 2 recyclages des enzymes immobilisées, H : cycle d’hydrolyse de l’-acétyl-
lysine en lysine
Les enzymes immobilisées par encapsulation dans la double émulsion ont été évaluées lors de
la synthèse de l’-lauroyl-lysine par acylation de la lysine avec de l’acide laurique. Les résultats
des analyses HPLC et LC-MS n’ont pas montré d’apparition de produit contrairement aux
analyses obtenues avec les enzymes immobilisées sur les MMS pour lesquelles une conversion
similaire à celle observée en hydrolyse a été mesurée. L’absence d’activité de synthèse peut
être expliquée par des problèmes de transfert de substrat vers l’enzyme et/ou du produit vers le
milieu externe. En effet, les substrats introduits lors de la réaction sont sous forme d’émulsion
préparée préalablement par sonication. Bien que la taille des pores soit estimée autours de 8
nm, il est fort possible d’avoir des interactions entre l’émulsion, le substrat et le matériau
(double émulsion) et ainsi une réduction de transfert du substrat vers l’enzyme et le site actif
ainsi qu’un colmatage de l’entrée des pores. D’autres auteurs ont aussi observé une faible
activité enzymatique lors de la synthèse de l’-oleoyl-lysine catalysée par la lipase de Mucor
miehei dans de l’hexane reliée à une possible interaction entre l’acide gras et le support
hydrophobe empêchant l’accès du substrat à l’enzyme (Montet et al., 1990). Vu les pertes
importantes de l’activité hydrolytique lors du recyclage, malgré les fortes activités observées
initialement et l’absence d’activité de synthèse, la stratégie d’immobilisation par encapsulation
dans les doubles émulsions a été mise à l’écart. D’autres types d’immobilisation sur les supports
macroporeux (Si-HIPE) par chimisorption ont aussi été envisagés en utilisant des molécules
telles que l’isocyanate, glymo et glutaraldéhyde mais aucune activité résiduelle de l’enzyme
n’a pu être mise en évidence. Les résultats décrits dans cette partie sont résumés dans le tableau
5-1.
224
Tableau 5-1 : tableau de synthèse des résultats de l’immobilisation des aminoacylases de S. ambofaciens sur les différents supports
Taux d’immobilisation Performances catalytiques (%

Support Méthode (% = mg protéine / 100 mg d’hydrolyse de l’-acétyl- Remarques
de support) lysine)
* 3% (support non traité) * 0,54 % (support non traité)
Physisorption - augmentation de l’activité avec l’augmentation du %
* augmentation en * augmentation du taux de
SBA 15 directe ou après d’APTES : meilleure exposition et bonne orientation de
fonction du % d’APTES conversion avec l’augmentation
(mésoporeux) fonctionnalisation l’enzyme
(jusqu’à 6% avec 25 % du % d’APTES jusqu’à 11,5%
avec de l’APTES - recyclage : perte d’activité progressive liée à la désorption
APTES) avec 25 % APTES)
*4% (support non traité) * 1,43 % (support non traité)
Physisorption
* augmentation en * faible augmentation en - faible influence du taux d’APTES : obstruction probable des
MMS (méso- directe ou après
fonction du % d’APTES fonction du % d’APTES pores par l’enzyme
macroporeux) fonctionnalisation
(jusqu’à 9,5% avec 10 % (jusqu’à 2,5% avec 10 % - recyclage : perte d’activité progressive liée à la désorption
avec de l’APTES
APTES) APTES)
- faible activité : soit due à une obstruction des pores par
SBA 15 -si-
accumulation des enzymes à l’entrée des pores ou à une
HIPE (méso- Physisorption * 8,2 % * 0,3 %
mauvaise orientation des aminoacylases immobilisées
macroporeux)
- recyclage : désorption moins importante des enzymes
- faible activité : soit liée à des limitations diffusionnelles par
Si-HIPE accumulation des enzymes au cœur des pores ou à une
Physisorption *8,6 % * 0,3 %
(macroporeux) mauvaise orientation des aminoacylases immobilisées
- recyclage : désorption très importante des enzymes
- très bonne activité catalytique : présence d’enzymes piégées
mais libres au cœur de la double émulsion (maintien de la
Emulsion flexibilité de l’enzyme ?)
Encapsulation *4 % * 17 %
double - recyclage : perte très importante de l’activité due soit à un
relargage de l’enzyme ou à une inactivation de l’enzyme
présente sous forme libre
225
Au regard des faibles performances des aminoacylases de S. ambofaciens immobilisées sur les
supports poreux à base de silice, liées principalement à une perte d’activité de ces enzymes,
l’intérêt des supports silicatés innovants développés dans cette étude a été évalué avec une autre
enzyme de type CALB. En effet, cette enzyme est connue pour sa bonne résistance et sa stabilité
lors de l’immobilisation contrairement aux aminoacylases de S. ambofaciens.
5.3.2 Performances de la lipase B de C. antarctica immobilisée sur

différents supports silicatés
L’immobilisation de CALB a été entreprise sur les différents supports silicatés développés par
les partenaires du projet. Comme il a été montré dans le chapitre 3 que cette enzyme catalysait
peu les réactions de N-acylation d’acides aminés, une autre réaction d’acylation a été choisie.
Le choix s’est porté sur l’acylation d’une molécule d’intérêt cosmétique, déjà décrite dans la
littérature qui est l’acylation du géraniol. Il a également été choisi de réaliser ces réactions en
milieu sCO2 afin d’éviter d’employer un solvant organique.
Les réactions de O-acylation de composés apolaires sous scCO2 ont été largement étudiées et
décrites dans la littérature en particulier pour la production d’arômes et d’ingrédients pour la
cosmétique (Knez et al., 1998 ; Dos Santos, Rezende, et al., 2016b ; Bezbradica et al., 2017 ;
dos Santos et al., 2017 ; Dias et al., 2018b ; Nyari et al., 2018 ; Knez, 2018b). C’est donc la
synthèse de l’acétate de géraniol qui est un ester de monoterpène (géraniol) obtenu soit par
extraction via distillation de certaines huiles essentielles végétales (geranium, lemongrass,
palmarosa, rose, …) ou par condensation chimique du géraniol et de l’acide acétique qui a été
choisie comme modèle réactionnel. L’acétate de géraniol présente plusieurs activités telles
qu’anti-inflammatoire et antimicrobienne et est très utilisée dans les produits cosmétiques et
détergents auxquels elle donne une note olfactive florale et fruitée à la fois. La production
enzymatique d’acétate de géraniol a aussi été étudiée dans différents milieux non-aqueux dont
le CO2 supercritique en utilisant des lipases immobilisées en réacteur batch (Chulalaksananukul
et al., 1993) mais aussi en réacteur continu à lit fixe (Peres et al., 2003 ; Couto et al., 2011).
Afin de disposer d’une référence pour comparer les performances de CALB immobilisée sur
différents supports, une étude préliminaire a été réalisée avec CALB commerciale Lipozyme®
435 : cette étude a fait l’objet d’un article publié dans le journal « Process Biochemistry » et
intitulé « Enzymatic synthesis of geranyl acetate in packed bed reactor in supercritical carbon
dioxide under various pressure-temperature conditions and reactor configurations » présenté en
annexe 5 (Bourkaib et al., 2018, https://doi.org/10.1016/j.procbio.2018.05.008). Plusieurs
supports et méthodes d’immobilisation ont été par la suite évalués dans les conditions de
226
fonctionnement (55°C et 200 bars) permettant de maintenir une bonne activité et d’éviter une
dénaturation rapide de CALB.
Lors de cette étude, CALB a été immobilisée par chimisorption au regard du risque élevé de
désorption de l’enzyme immobilisée par physisorption décrit précédemment lors de
l’immobilisation des aminoacylases. Le support mésoporeux a été fonctionnalisé avec
différents organosilanes afin d’identifier le plus adapté à l’immobilisation covalente de CALB.
A cet effet, du glutaraldéhyde (Glu), du (3-Glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (Glymo) et de
l’isocyanate (Iso) ont été utilisés à une concentration de 5 mmol / g de support. Dans tous les
cas le taux d’immobilisation obtenu était de l’ordre de 0,05 g de CALB / g de support. Les
enzymes ainsi immobilisées ont été étudiées via la réaction de synthèse de l’acétate de géraniol
sous scCO2 à 55°C et 200 bars, suivi d’une dépressurisation rapide. Une deuxième réaction
successive dans les mêmes conditions a été réalisée afin de vérifier la stabilité de l’enzyme. Les
analyses en GC-MS des produits de la réaction ont montré une très faible activité des enzymes
immobilisées par rapport à l’enzyme commerciale (figure 5.6.A). Par ailleurs, il est à noter que
la préparation liquide commerciale de CALB utilisée pour l’immobilisation est composée d’une
grande quantité de sorbitol et de glycérol (50 %), utilisés comme conservateurs et stabilisants
(figure 5.6.B). Ces molécules peuvent soit s’introduire au niveau des pores ou s’adsorber à
l’entrée des mésopores, limitant ainsi l’accès aux substrats, ce qui se traduirait par un très faible
taux de conversion. Ces résultats peuvent donc être expliqués par des limitations diffusionnelles
des substrats vers l’enzyme par implication de ces stabilisants malgré l’importante diffusivité
du scCO2 qui est semblable à celle d’un gaz. Afin de remédier à ce problème, une étape de
standardisation a été mise en place afin d’éliminer ces molécules. Il s’agit d’une filtration
membranaire de la solution d’enzyme commerciale, diluée par dix, suivie de deux étapes de
dia-filtration, après reprise du rétentat dans de l’eau, par l’utilisation d’un système de filtration
tangentielle d’un seuil de coupure de 10kDa. Les enzymes en environnement aqueux
standardisées ont ensuite été immobilisées sur les mêmes types de supports. Selon les résultats
présentés dans la figure 5.6.A, les taux de conversion observés avec les greffons Glu et Glymo
étaient similaires avec ou sans standardisation. Les faibles activités observées dans ces
conditions pourraient être liées soit à une dénaturation de l’enzyme lors du greffage par liaisons
covalentes sur les organosilanes ou bien à un encombrement stérique de l’accès des pores par
l’enzyme, la haute surface spécifique disponible dans les mésopores n’étant alors pas valorisée
comme souhaitée. Il est possible que la ou les premières lipases immobilisées de manière
covalente à l’entrée des pores de moins de 8 nm après ajout des greffons organiques (Glu,
Glymo, Iso) empêchent les molécules de lipases suivantes de pénétrer à l’intérieur des pores
227
pour s’y fixer correctement. La limitation de transfert des substrats dans la porosité des SBA15
est, elle, peu probable, car ces substrats sont de petites tailles et le CO2 supercritique est presque
aussi diffusif qu’un gaz. Il est donc envisageable que la fonctionnalisation des SBA 15 se fasse
surtout en surface externe des particules de SBA 15, ne protégeant à nouveau pas les lipases
des violentes décompressions de 200 bars à l’atmosphère, sans réelle protection de la porosité
qui ne serait pas valorisée. En revanche, une augmentation du taux de conversion d’un facteur
5 a été observée en utilisant la solution de CALB après standardisation et immobilisée sur les
supports fonctionnalisés avec de l’isocyanate. Cela confirme la possible implication des
stabilisants présents dans la solution initiale d’enzyme dans les faibles activités observées avant
standardisation. L’activité enzymatique observée dans ce cas était environ 1,5 fois celle de
l’enzyme commerciale dans les mêmes conditions mais contrairement au support commercial,
une forte baisse de l’activité a été observée lors du deuxième cycle de synthèse sous CO2
supercritique. Cette perte d’activité est probablement liée à une désorption des enzymes du
support lors de la décompression intermédiaire entre les deux cycles, ce qui tendrait à montrer
que seule une partie des enzymes considérées comme immobilisées de manière covalente l’était
vraiment et qu’une grande partie des enzymes était en fait simplement « adsorbée » en surface
des SBA15 fonctionnalisées. Les produits de la réaction interagissant avec les différents tests
de détermination de la quantité d’enzyme, la quantification des enzymes désorbées n’a pas pu
être réalisée. Les faibles activités observées peuvent aussi être dues à la formation de liaisons
covalentes entre l’enzyme et le support qui induit un changement conformationnel de l’enzyme.
A B
12 Cycle 1 Cycle 2 Pourcentage
Activité spécifique (mg d’ACG / mg
10 Ingrédients (% w/w)
8 Eau 43,7
6
de protéine / 30min)
Sorbitol 25
4 Glycérol 25
2 Lipase 6
0 Sodium
SBA15 Iso
SBA15 Iso
SBA15 Glymo
SBA15 Glymo
SBA15 Glu
SBA15 Glu
CALB commerciale
benzoate 0,2
Potassium
sorbate 0,1
Enzyme sans standardisation Enzyle après standardisation Lipozyme

Support 435
Figure 5.6 : A. Activité de CALB immobilisée sur les différents SBA15 fonctionnalisés vs
CALB commerciale immobilisée par adsorption sur des supports de polyméthacrylate
divinylbenzène macroporeux (cycle : une réaction de synthèse de l’acétate de géraniol sous
scCO2 à 55°C et 200 bar suivi d’une dépressurisation rapide) B. composition de la solution de
lipase utilisée pour l’immobilisation sans standardisation.
228
Une autre stratégie d’immobilisation sur les supports siliceux mésoporeux qui a été largement
rapportée dans la littérature, est la fonctionnalisation de ces matériaux avec des groupements
en utilisant du triéthoxy(phényl)silane (Kato, Seelan, 2010 ; Bernal et al., 2017 ; Gama et al.,
2019). Cette fonctionnalisation permet de rendre la surface du support plus apolaire, favorisant
les interactions hydrophobes de l’enzyme avec le support et permettant une meilleure
stabilisation sans formation de liaisons covalentes. Boros et al. (2013) ont utilisé cette stratégie
pour l’immobilisation de CALB sur des supports mésoporeux en silice. Ils ont montré que
CALB immobilisée présentait de meilleures performances et une meilleure stabilité après
adsorption sur ces supports, comparativement à l’immobilisation par interactions covalentes
(Boros et al., 2013). Dans notre étude, les supports SBA15 ont été fonctionnalisés avec 5 mmol
de triéthoxy(phényl)silane / g d’SBA 15 avant de réaliser l’immobilisation par adsorption de
CALB. Les supports utilisés présentaient une surface spécifique de 539 m²/g et un volume
poreux de 0,7 cm3/g, avec un diamètre moyen de pores de 8,5 nm. Les enzymes ont été
immobilisées par adsorption et leur activité de synthèse de l’acétate de géraniol sous scCO2 à
55°C et 200 bars a été mesurée sur 2 cycles séparés d’une dépressurisation. Les résultats sont
présentés sur la figure 5.7.A. L’activité des enzymes immobilisées sur les supports SBA15
phényl était légèrement inférieure à celles des enzymes immobilisées sur SBA15
fonctionnalisés avec de l’isocyanate mais avec une meilleure stabilité que ces dernières. Cette
faible activité pourrait être liée à une mauvaise orientation de l’enzyme adsorbée. En effet, selon
la structure 3D de CALB (figure 5.7.B), la face de l’enzyme comprenant le site actif présente
une surface très hydrophobe et qui est la plus susceptible d’interagir avec la surface du support
contenant les groupements phényles. Ceci pourrait engendrer une limitation de l’accessibilité
du substrat vers le site actif réduisant ainsi le taux de conversion. Dans tous les cas, l’activité et
la stabilité se sont révélées moins importantes que celles observées en utilisant l’enzyme CALB
commerciale Lipozyme® 435 où la lipase est pourtant immobilisée de manière non covalente,
sur une surface elle aussi hydrophobe, ceci sans perte d’activité entre les cycles et donc sans
lessivage même lors des phases de décompression.
229
A
12 Cycle 1 Cycle 2
Activité spécifique (mg d’ACG

10
/ mg de protéine / 30min)
8
6
4
2
0
SBA15 Glu SBA15 Glymo SBA15 Iso SBA15 Phényl CALB
commerciale
Chimisorption Physisorption Lipozyme 435
Support
B
Figure 5.7 : A. Activité de CALB immobilisée sur les différents supports SBA15
fonctionnalisés vs CALB commerciale immobilisée sur des supports de méthacrylate
divinylbenzène macroporeux (cycle : une réaction de synthèse d’acétate de géraniol sous scCO2
à 55°C et 200 bars suivie d’une dépressurisation rapide), B. image de la structure 3D des deux
faces de CALB obtenue par l’utilisation du logiciel Discovery studio
Il est fort probable que le faible diamètre des pores des SBA15 contribue fortement à leur
obstruction partielle par les lipases immobilisées à leur entrée réduisant ainsi le contact site actif
de CALB / substrats, malgré la forte diffusivité et la faible viscosité du CO2 véhiculant les
substrats dans les pores. Les limitations diffusionnelles potentiellement externes ou internes
dans les mésopores pouvant être la cause principale des faibles performances catalytiques
obtenues avec CALB immobilisée en surfaces des SBA15, l’utilisation de supports
macroporeux tels que les Si-HIPE décrites précédemment peuvent présenter un avantage de par
leur importante surface spécifique (1033 m2/g) dont une fraction importante est liée à la
présence de macropores (diamètre de pore supérieur à 50 nm). Cela pourrait permettre une
meilleure accessibilité aux enzymes comme aux substrats et ainsi contre carrer les problèmes
rencontrés avec les supports mésoporeux SBA15.
Au regard des meilleures performances observées avec les supports SBA15 fonctionnalisés
avec de l’isocyanate par rapport aux autres types de fonctionnalisation, l’isocyanate a été utilisé
pour l’immobilisation de CALB par chimisorption sur des monolithes de si-HIPE. Ces
230
monolithes ont permis de retrouver une très bonne efficacité de la lipase de Thermomyces
lanuginosus après une immobilisation par chimisorption (Backov, 2012a).
Les monolithes ont été fonctionnalisés avec de l’isocyanate à différentes concentrations (2,5 et
5 mmol / g de support nommés ISO 2,5 et ISO 5) afin d’évaluer l’influence des conditions de
fonctionnalisation du support sur l’activité enzymatique. Sur ces supports, l’enzyme CALB a
été immobilisée et les résultats ont été comparés à ceux obtenus avec l’enzyme commerciale.
La quantité de lipases immobilisées sur les monolithes fonctionnalisés avec 5 mmol
d’isocyanate était plus importante que celle immobilisée sur les supports fonctionnalisés avec
2,5 mmol (0,075 et 0,055 mg de CALB / mg de support, respectivement). Cette augmentation
de la quantité d’enzyme immobilisée est due à la présence de plus de groupements fonctionnels
permettant l’établissement de davantage de liaisons covalentes avec le support. Ces deux
enzymes supportées ont été évaluées pour leur activité de synthèse de l’acétate de géraniol sous
scCO2 à 55°C et 200 bars suivie d’une dépressurisation rapide. Les supports ont été recyclés 3
fois successivement, en réalisant des réactions de synthèse dans les mêmes conditions. Les
résultats (figure 5.8) ont montré que l’enzyme CALB immobilisée sur les supports ISO 2,5
présente une activité spécifique beaucoup plus importante que sur les supports ISO 5. Ce
résultat pourrait-être expliqué par un effet inhibiteur de l’isocyanate, quand il est introduit en
excès, sur l’activité enzymatique. D’autre part, les performances catalytiques de l’enzyme
CALB immobilisée sur les monolithes fonctionnalisés (ISO 2,5) étaient supérieures à celles de
l’enzyme de référence. Du point de vue de la stabilité enzymatique, une faible perte d’activité
a été enregistrée surtout après le 1er et le 3ème cycle, ce qui peut être dû à une désorption d’une
certaine quantité d’enzymes immobilisées. Plusieurs paramètres peuvent expliquer
l’amélioration de l’activité enzymatique suite à l’immobilisation sur les supports macroporeux
fonctionnalisés avec de l’isocyanate. L’utilisation de supports macroporeux permet de réduire
considérablement les limitations diffusionnelles des substrats vers l’enzyme immobilisée et de
maintenir une bonne flexibilité de cette dernière. Il a été rapporté qu’afin d’avoir une bonne
activité enzymatique, il est considéré comme nécessaire que le diamètre des pores soit beaucoup
plus important que celui de l’enzyme (2 * le diamètre de l’enzyme + 2 * 20 nm soit dans notre
cas environ 50 nm c’est à dire le domaine des macropores) (Cao, 2005a). Il est par ailleurs
préférable que l’enzyme forme une seule couche sur le support afin de faciliter l’accès des
substrats à l’enzyme ainsi que sa stabilité (Cao, 2005a). Vu les faibles taux d’immobilisation
observés sur le support ISO 2,5 (0,055 mg de CALB / mg de support) et la faible quantité
d’isocyanate (2,5 mmol d’isocyanate / g de support) qui permet une plus large dispersion des
groupement fonctionnels, contrairement au supports ISO 5, l’apparition d’une monocouche
231
d’enzymes est très probable, permettant d’augmenter l’activité. Han et al, (2005) ont évalué les
performances de CALB immobilisée sur des mousses méso-cellulaires qui sont des supports à
base de silice avec des pores interconnectés de 25 nm et d’une surface spécifique d’environ 500
m2 / g. Ils ont démontré que les enzymes immobilisées présentaient de meilleures performances
que la CALB commerciale Novozyme 435 (Han et al., 2006b). Ces résultats sont très
prometteurs pour le développement de procédés en continu d’acylation de composés sous
scCO2. Ces résultats préliminaires mériteraient une étude plus approfondie pour mieux
caractériser ces enzymes supportées.
180 ISO 2,5 CALB ISO 5 CALB CALB ref
d'ACG / mg de prot/30 min)
150
Activité spécifique (mg
120
90
60
30
-
imprégnation Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3
Cycle de pressurisation/dépressurisation
Figure 5.8 : Activité de CALB immobilisée sur les monolithes fonctionnalisés avec de
l’isocyanate à différentes concentrations vs Lipozyme 435® (cycle : une réaction de synthèse
de l’acétate de géraniol sous scCO2 à 55°C et 200 bars pendant 30 min suivi d’une
dépressurisation rapide)
D’autres types de supports ont aussi été utilisés : c’est le cas des supports à base de carbone tels
que les graphènes et les nanotubes de carbone qui ont été déjà été décrits pour l’immobilisation
des enzymes, en particulier des lipases (Prlainović et al., 2011 ; Wee et al., 2019 ; Tan et al.,
2019a). Ce sont des structures nanométriques rigides formées d’un ou de plusieurs feuillets, ce
qui permet d’avoir une surface externe par unité de masse ou volume très importante (autour
de 1300 m2 / g). Cette caractéristique en plus de l’absence de pores, qui réduit le risque de
problème diffusionnels des substrats, font de ces matériaux des supports très attractifs, au moins
sur le plan fondamental, pour l’immobilisation d’enzymes (Feng, Ji, 2011). La surface de ces
supports est très hydrophobe mais on peut facilement réduire cette forte hydrophobie par
fonctionnalisation chimique (oxydation) afin de pouvoir rendre ces matériaux carbonés
dispersibles en phase aqueuse tamponnée et réduire le risque de dénaturation des enzymes
immobilisées par physisorption (Pavlidis et al., 2010b ; Radhakrishna et al., 2013). Dans notre
cas, les nanotubes de carbone multifeuillets (MWCNT : multiwalled carbon nanotubes) ont été
utilisés pour l’immobilisation de CALB par physisorption et par chimisorption après
232
modification de la surface du support en contrôlant l’équilibre hydrophobie/hydrophilie de

surface. L’activité et la stabilité des lipases immobilisées ont été mesurées et comparées via des
synthèses d’acétate de géraniol sous scCO2 en réacteur à lit fixe. Les résultats de cette étude ont
fait l’objet d’une publication dans le journal « Catalysis Today » sous le titre « Non-covalent
and covalent immobilization of Candida antarctica lipase B on chemically modified
multiwalled carbon nanotubes for a green acylation process in supercritical CO 2 » (annexe 6).
Cependant, les performances catalytiques ont dans tous les cas été moins importantes que celles
de CALB commerciale (Lipozyme 435®).
En résumé, les résultats des performances de CALB immobilisée sur les différents supports
sont synthétisés dans le tableau 5-2.
233
Tableau 5-2 : tableau récapitulatif des résultats de l’immobilisation de CALB sur les différents supports
Taux d’immobilisation Performances catalytiques
Support Méthode (% = mg protéine / 100 (M d’acétate de géraniol / M Remarques
mg de support) de CALB / min)
Lipozyme 435® N.D. 14% 45 Voir annexe 5
Voir annexe 6
- performances catalytiques plus faibles que celle de CALB
Nanotubes de Physisorption et
16 % (physisorption) 2,7 (physisorption) commerciale (Lipozyme 435®)
carbone (non chimisorption
21 % (chimisorption) 11,5 (chimisorption) - recyclage : désorption importante dans les deux cas
poreux) (EDC et NHS)
d’immobilisation reliée à l’exposition des enzymes
immobilisées au flux de CO2
- meilleure activité des enzymes immobilisées sur les SBA15
fonctionnalisés avec de l’isocyanate mais inférieure à celle de
Chimisorption
7,4 (SBA15 Glymo) Lipozyme435® liée à des probables limitations diffusionnelles
SBA15 (glutaraldéhyde,
5% 12,5 (SBA15 Glu) du substrat vers l’enzyme
(mésoporeux) glymo,
29,0 (SBA15 Iso) - recyclage : perte d’activité après la première utilisation liée à
isocyanate)
une désorption des enzymes mal fixées par liaison covalente ou
par une inactivation enzymatique
- faible activité liée à une probable orientation inadéquate de
SBA15-phényle l’enzyme sur le support hydrophobe
Physisorption 5% 19,6 (SBA15 Phényle)
(mésoporeux) - recyclage : meilleure stabilité de l’activité enzyme reliée à
une désorption moins importante
- activité enzymatique très supérieure à celle de l’enzyme
commerciale, en particulier après immobilisation sur les
Chimisorption
supports fonctionnalisés avec 2,5 mmoles / g d’isocyanate,
Si-HIPE (isocyanate à 5,5 % (ISO 2,5) 967,1 (ISO 2,5)
reliée à une très bonne accessibilité des substrats au site actif
(macroporeux) différentes 7,5 % (ISO 5) 85,3 (ISO 5)
de l’enzyme
concentrations)
- recyclage : très bonne stabilité de l’activité enzymatique
reliée à une faible désorption de l’enzyme
234
5.4 Conclusion
L’objectif de ce chapitre était la sélection du support et de la méthode la plus adaptée à
l’immobilisation des aminoacylases de S. ambofaciens permettant de maintenir leur activité et
une bonne stabilité. Plusieurs supports siliceux avec des diamètres de pore différents, dont des
supports mésoporeux (SBA15), mésomaroporeux (MMS et SBA-si-HIPE) et macroporeux (SI-
HIPE) ont été évalués. La comparaison des performances des enzymes immobilisées sur les
différents supports a montré une augmentation progressive de la quantité d’enzymes
immobilisées avec une augmentation de la taille des pores. Ce résultat est probablement dû à
un meilleur transfert de matière vers l’intérieur des pores permettant ainsi l’immobilisation de
l’ordre de 8,5 % d’enzyme par unité de surface en utilisant les Si-HIPE. La présence de structure
mésoporeuse organisée au niveau des supports méso-macroporeux (SBA-si-HIPE) a permis une
augmentation d’un facteur 2 de la quantité d’enzyme immobilisée s’expliquant par une
meilleure stabilisation des enzymes au niveau des méso-pores. Par ailleurs, l’évaluation de
l’activité hydrolytique ne suit pas cette logique (tableau 5.1). Les MMS suivi des SBA15 ont
présenté la meilleure activité et stabilité par rapport aux autres supports. Cette faible activité
observée avec les supports MMS pourrait être liée à une mauvaise orientation de l’enzyme à la
surface et / ou à des limitations diffusionnelles du substrat vers l’enzyme. Les supports
mésoporeux et méso-macroporeux ont été modifiés en réalisant une fonctionnalisation avec de
l’APTES à différents pourcentages, afin d’augmenter graduellement le caractère hydrophobe
de la surface et de davantage favoriser les interactions de type liaison hydrogène. Dans le cas
des deux supports, cette modification a permis une amélioration des interactions enzyme /
support qui s’est traduite par une augmentation graduelle de la quantité d’enzyme immobilisée
jusqu’à un taux d’APTES de 10%. Par ailleurs, les performances catalytiques des enzymes
immobilisées sur les deux types de supports ont été différentes. L’augmentation du taux de
fonctionnalisation a permis une amélioration de l’activité enzymatique lors d’une
immobilisation sur les supports SBA15 contrairement aux supports MMS. A l’issue de ces
résultats, il apparaît que les supports mésoporeux SBA15 fonctionnalisés avec de l’APTES sont
les plus adaptés pour l’immobilisation des aminoacylases de S. ambofaciens ; cependant,
l’activité enzymatique rest faible par rapport à celle des enzymes libres. C’est pourquoi d’autres
études plus approfondies sur l’utilisation de matériaux à base de silice ou carbone avec une
optimisation de la surface de ces supports par greffage d’autres groupements fonctionnels
devront être entreprises pour aboutir à un procédé en continu de synthèse d’acides aminés acylés
plus compétitif. L’étude in-silico par méso-modélisation des interactions enzyme / support
pourrait être également envisagée afin de faire un screening préalable et d’identifier les supports
235
les plus adaptés, tout en limitant le nombre d’expérimentations. En effet, la connaissance de la

structure de l’aminoacylase cible serait un apport important au développement d’une démarche
rationnelle de choix de support, en connaissant mieux les propriétés de surface des protéines,
notamment aux abords du site actif.
Etant donné les faibles performances des aminoacylases immobilisées, une évaluation des
performances de CALB immobilisée sur les mêmes types de support a été réalisée. Au regard
des très faibles performances des lipases pour la réaction de N-acylation des acides aminés sous
scCO2 à cause de la non compatibilité de ce solvant avec les composés hydrophiles et surtout
les amines, une réaction de O-acylation a été prise comme référence pour l’étude des
performances des lipases immobilisées. Initialement, les performances de CALB commerciale
immobilisée sur des supports de méthacrylate divinylbenzène macroporeux ont été évaluées
pour la réaction de synthèse d’acétate de géraniol sous scCO2. Cette étude a permis de
démontrer l’efficacité de CALB pour cette réaction et de montrer qu’une bonne maîtrise des
conditions de procédés pouvait permettre d’obtenir de très bons taux de conversion (982 %)
sans utilisation de solvant organique et sans effluent à retraiter et une excellente stabilité
catalytique de la lipase. Ce travail préalable, publié dans Process Biochemistry (annexe 5) a
servi de base de comparaison dans le cadre d’autres investigations portant sur l’immobilisation
de lipases sur différents types de supports. Les supports siliceux mésoporeux ordonnés (SBA15)
ont été utilisés pour l’immobilisation par chimisorption de CALB en utilisant différents
organosilanes. Parmi les organosilanes utilisés, les enzymes immobilisées sur les SBA15
fonctionnalisées avec de l’isocyanate ont présenté de meilleures performances mais avec une
faible stabilité et une activité sensiblement inférieure à celle de CALB commerciale. Cette
observation a été reliée à de possibles limitations diffusionnelles dans les pores ainsi qu’à
l’obstruction possible des pores par les premières molécules de lipase immobilisée, limitant
l’accessibilité des substrats au site actif. A cet effet, des supports macroporeux (diamètre de
pore supérieur à 50 nm) ont été utilisés pour l’immobilisation de la lipase permettant un meilleur
accès de ces dernières à la surface des macropores et un transfert de matière (substrats et
produits) très fortement amélioré au cœur de cette macroporosité. Les résultats de la synthèse
de l’acétate de géraniol par CALB immobilisée sur les monolithes macroporeux de Si-HIPE
fonctionnalisés avec 2,5 mmoles d’isocyanate / g de support ont ainsi montré des performances
catalytiques bien supérieures à celles de CALB immobilisée commerciale (tableau 5.2). L’étude
a aussi montré l’effet inhibiteur d’une fonctionnalisation avec une concentration trop
importante d’isocyanate. Au regard de ces résultats prometteurs, il sera intéressant
236
d’approfondir l’étude sur l’immobilisation des lipases sur les supports macroporeux afin de
développer un procédé de O-acylation de composés à intérêt industriel sous scCO2. Des
supports non poreux à base de carbone (nanotubes de carbone) ont aussi été élaborés
l’immobilisation par physisorption et par chimisorption a été réalisée (annexe 6). L’avantage
de ces supports est la présence d’une surface spécifique élevée (1500 m 2 / g de support) et une
immobilisation sur la surface externe permettant un meilleur contact enzyme / substrat. L’étude
de CALB immobilisée sur ces supports carbonés par physi- ou chimi-sorption a montré que les
performances étaient moins importantes que celles de CALB immobilisée sur les supports à
base de silice.
En conclusion, une immobilisation efficace des aminoacylases de S. ambofaciens aurait permis

le développement de procédés intensifiés de N-acylation des acides aminés par l’utilisation de
réacteurs à lit fixe ou de synthèse en continu. Malheureusement, dans le cadre de cette thèse,
les immobilisations des aminoacylases de S. ambofaciens se sont toutes révélées pas ou peu
convaincantes. C’est pourquoi, à ce jour, l’usage des aminoacylases de S. ambofaciens sous
forme libre reste le plus adapté à la synthèse de lipoaminoacides (LAA) ou lipopeptides (LPP)
d’intérêt en phase aqueuse. C’est pourquoi il a été choisi d’étudier la synthèse d’un acide aminé
acylé particulier, d’intérêt industriel catalysée par les aminoacylases de S. ambofaciens sous
forme libre. L’intensification de la réaction de synthèse de l’undécénoyl-phénylalanine qui est
un acide aminé acylé à intérêt cosmétique et pharmaceutique important puisqu’il est à la fois
un bio-tensioactif biosourcé facilement biodégradable et éco-compatible mais également un
actif cosmétique utilisé comme éclaircissant cutané par inhibition de la synthèse de mélanine
par les mélanocytes de la peau a donc été mise en œuvre et est présentée dans le chapitre suivant.
237
238
CHAPITRE V: MISE EN ŒUVRE D’UN PROCÉDÉ DE
PRODUCTION ET DE PURIFICATION DE L’UNDÉCÉNOYL-
PHÉNYLALANINE
239
240
Chapitre VI : mise en œuvre d’un procédé de production et de purification du C11’-Phe
6 Chapitre VI : mise en œuvre d’un procédé de production et de

purification de l’undécénoyl-phénylalanine
6.1 Introduction
Les travaux décrits dans les deux chapitres précédents avaient pour objectif principal de
sélectionner l’enzyme la plus adaptée à la N-acylation des acides aminés et la le mode d’usage,
libre ou immobilisé, de cette dernière. L’utilisation des aminoacylases de S. ambofaciens en
milieu aqueux (tampon tris-HCl) sous forme libre s’est avérée la plus pertinente. Par ailleurs,
peu d’informations sont disponibles sur l’influence des conditions de mise en œuvre du procédé
sur les performances catalytiques de ces aminoacylases. En effet, les aminoacylases décrites
dans la littérature présentent des conditions de mise en œuvre sensiblement différentes en raison
de leur différence structurale même si elles sont issues de la même espèce microbienne
(Koreishi et al., 2005b ; 2006b ; 2007b ; 2009). De plus, comme nous avons pu le mesurer, les
performances catalytiques des enzymes varient selon leur affinité vis-à-vis d’un substrat donné.
Ce dernier chapitre a donc pour objectif d’étudier les conditions de catalyse de la N-acylation
de la phénylalanine pour la production du N-10-undecenoyl-phenylalanine (C11’F) et de mettre
en place un procédé de purification de ce dernier en vue d’une évaluation de son activité
biologique. Cette étude a ainsi pour objectif principal de caractériser et d’intensifier la réaction
d’acylation d’acides aminés en particulier pour la production de bio-tensioactifs d’intérêt
industriel dont le C11’F. D’autre part, il s’agira également d’évaluer l’activité biologique du
lipoaminoacide produit par voie enzymatique et de comparer son activité biologique avec celle
de la même molécule produite par voie chimique (par la méthode de Schoten-Baumann). Les
résultats de cette étude ont fait l’objet d’une publication soumise au journal « Process
Biochemistry ».
6.2 Evaluation des performances catalytiques des aminoacylases de

Streptomyces ambofaciens pour l’acylation de la phénylalanine
Les surfactants non-ioniques tels que ceux issus de la N-acylation de la phénylalanine sont très
utilisés dans les produits cosmétiques et d’entretien en raison de leurs propriétés de tension de
surface et moussante. De plus, plusieurs études ont démontré l’efficacité de certains de ces bio-
tensioactifs, tel que le C11’F, comme agents éclaircissants de la peau. Il a été montré que ce
dernier inhibe la production de mélanine en agissant comme antagoniste à l’hormone
mélanotrope (MSH pour Melanocyte Stimulating Hormone) de récepteurs spécifiques à la
surface des mélanocytes (Bissett et al., 2009b). Cela augmente considérablement son intérêt
pour une utilisation dans des produits cosmétiques tels que les crèmes éclaircissantes et les
241
crèmes solaire. La production de cette molécule à l’échelle industrielle se fait exclusivement

par la voie chimique de Schotten-Baumann et aucune étude n’a, jusqu’à présent, décrit la
possible synthèse enzymatique de ce lipoaminoacide. Nous avons donc choisi le procédé de
production de cette molécule comme modèle pour une évaluation plus approfondie de
l’influence des conditions opératoires (concentration en substrats, en produit, température, pH,
ajout d’ions métalliques, volume de réacteur) sur les performances catalytiques des
aminoacylases de S. ambofaciens. La stabilité thermique et l’effet inhibiteur du produit de la
réaction sur l’activité enzymatique ont aussi été étudiés. Afin de pouvoir évaluer l’activité
biologique du C11’F produit par voie enzymatique, un procédé de purification du produit a été
mise en œuvre afin de pouvoir disposer d’environ 1 g de produit pur. En raison des propriétés
physicochimiques très proches entre le C11’F et l’acide gras utilisé (acide undécénoïque ;
C11’), l’obtention d’un produit pur a nécessité la mise en œuvre de différentes techniques de
purification. L’activité biologique du produit issu de cette purification a été évaluée par le
laboratoire Recherche et Développement de SEPPIC, partenaires du projet ANR ISEAPIM3.
242
Enzymatic synthesis of N-10-undecenoyl-phenylalanine catalysed by

aminoacylases from Streptomyces ambofaciens
Mohamed Chafik Bourkaib1, Stephane Delaunay1, Xavier Framboisier1, Catherine Humeau1,

Jérôme Guilbot2, Cecile Bize2, Estelle Illous2, Isabelle Chevalot1, Yann Guiavarc’h1*
Authors are affiliated to:
1
LRGP, UMR 7274 CNRS-Université de Lorraine, 2 avenue de la Forêt de Haye, TSA 40602,
F-54518 - VANDŒUVRE Cedex, France
2
R&D laboratory of Seppic, Air Liquide Healthcare Specialty Ingredients, 50 boulevard
National - CS 90020 - 92257 La Garenne Colombes Cedex, France.
*Author to whom correspondence should be addressed

: +33 (0)3 83 17 51 90
Fax : +33 (0)3 83 32 29 75
: [email protected]
Short title: “Enzymatic synthesis of N-10-undecenoyl-phenylalanine”
Abstract:
Due to its physico-chemical and biological activities, N-10-undecenoyl-phenylalanine (C11’F)
is one of the most interesting lipoaminoacids used in cosmetic and pharmaceutical industries.
Its production is currently based on the Schotten-Baumann chemical reaction, which shows
some environmental issues in terms of effluents. As a possible biocatalytic alternative, this
study presents the evaluation of the reactional and process conditions allowing the production
of C11’F using aminoacylases from Streptomyces ambofaciens culture. These aminoacylases
showed the best activity at 45°C and pH between 7 and 8 with a moderate thermal stability. The
influence of substrates concentrations on the kinetic parameters of C11’F synthesis showed a
more important impact of the phenylalanine concentration as compared to the 10-undecenoic
acid concentration. As a reactional product, C11’F appeared to have an inhibitory effect on the
enzymatic N-acylation. Cobalt addition allowed an eleven-fold increase of the reaction rate.
Batch reactors were used with free aminoacylases without impact on the final C11’F
concentration. For the first time, enzymatically produced C11’F was finally purified at the gram
scale as a 99% purity white powder. The evaluation of the biological activity on melanocytes
cultures showed the presence of skin lightening activity similar to the one obtained with the
chemically produced C11’F.
243
1. Introduction :
Amino acids surfactants (AAS) are eco-compatible surface-active agent with very interesting
techno-functional properties and, for some of them, with attractive bioactivities. There are
molecules of choice for food, pharmaceutical and cosmetic industries [1]. Non-ionic AAS, like
phenylalanine and leucine derivatives, are very attractive AAS as ingredients at industrial scale
because of their good detergency and foaming properties [2,3]. In addition to these properties,
phenylalanine-based surfactants were described as presenting cytotoxicity against several
human cancer cells thus widening their application scope [4]. Bisset et al., 2009 described the
ability of phenylalanine-fatty acid derivatives like N-10-undecenoyl-L-phenylalanine to reduce
melanin production in melanocytes. In their study, an emulsion prepared by the combination of
1 % N-10-undecenoyl-phenylalanine with 5 % niacinamide increased significantly the
efficiency in reducing the appearance of facial hyperpigmentation in vivo [5]. However, such
AAS are produced at industrial scale using the Schotten-Baumann chemical reaction where the
amino acid reacts with a fatty acid chloride under highly alkaline conditions by using NaOH in
water and sulfuric acid to stop the reaction [4]. In some cases, some organic solvents are used
to facilitate the reaction. In this last case a high purity powder with only some fatty acid traces
is obtained. Despite a high yield of synthesis, the corresponding down-stream processing of the
reaction medium leads to large volumes of saline effluents requiring an expensive reprocessing
step for the industrials [6]. Nowadays, the environmental issues caused by such process
encouraged the authorities to promote the industrial development of sustainable technologies
by switching from waste remediation and pollution control by end-of-pipe solution to waste
prevention thus reducing the reprocessing cost [7]. Enzymes represent an alternative for such
reactions to avoid by-products and salts generation. Enzymes were widely used for acylation
reaction especially for O-acylation but much less for N-acylation of amino acids. The ability of
some enzymes to perform the N-acylation of amino acids were studied by only few authors
using free fatty acids [8–15]. Lipases and proteases are hydrolases that can perform the
acylation reaction in non-aqueous media like organic solvents or in solvent-free conditions in
order to shift the thermodynamic equilibrium of the reaction. However, the low solubility of
amino acids in organic solvents limits the mass transfer of the substrates to the active site, which
decreases the performance of the reaction [8,16,17]. In this context, the use of acylases like
aminoacylases that are able to catalyse the N-acylation reaction in aqueous media with better
solubility of the substrates, especially of the acyl acceptor, has been yet considered [18,19].
Several enzymes were evaluated for amidation reaction but much less for the N-acylation of
244
amino acids. The most used enzymes performing this reaction were described by Koreishi et al.
who identified four acylases from Streptomycess mobaraensis [10,11,20,21]. Three of them
were aminoacylases characterized as monomeric metallo-enzymes with different
regioselectivities. Indeed, the aminoacylase of 100 kDa and the second one of 55 kDa (called
Sm-AA) had regioselectivity towards the alpha amino group of the amino acid while the third
one of 60 kDa (called Sm-ELA) was specific for the lysine epsilon amino group [10,12,20,21].
The fourth acylase was a penicillin V acylase (Sm-PVA), which is a dimeric enzyme able to
perform the N-acylation of several amino acids with lauric acid showing a better activity with
arginine, cysteine and lysine with a preference for the amino group in  position [11,22]. In
another study, the ability of a crude extract from Streptomycess ambofaciens ATCC23877 to
perform the N-acylation of lysine and peptides containing lysine on their alpha position was
described [13]. By genome comparison, a very close sequence identity between the genes
encoding Sm-AA, Sm-ELA and Sm-PVA from S. mobaraensis and the ones responsible for the
acylation activity from S. ambofaciens was shown, with 86, 80 and 69 % sequence identity
respectively. Another gene was also identified with 55% identity with Sam-AA (Sam-AA like)
but this had a very low α-acylation activity. In addition, the authors demonstrated that the
enzyme similar to Sm-AA, named SamAA, was responsible of 85 % of the N-α-acetyl-L-lysine
hydrolysis activity [13]. However, no information is available until now about the condition
influencing the activity of the acylases from S. ambofaciens ATCC23877. In a recent study,
Bourkaib et al. (2020) described the substrate specificity of the crude extract of Streptomyces
ambofaciens was investigated toward the 20 natural proteogenic amino acids and different fatty
acids for the enzymatic synthesis of many AAS in water. In the same study authors also
investigated the impact of some operational conditions on the production of alpha-lauroyl lysine
in batch reactor [23]. They also compared the performance of the crude extract from the wild
strain of S. ambofaciens and the one from a mutant strain which express only Sam-AA. The
results showed that the substrates specificity was similar between both strains confirming the
position that Sam-AA is responsible of the N-α-acylation activity of the crude extract from the
wild strain Streptomyces ambofaciens.
At the difference of what was performed in [23] where, for the first time, we mainly evaluated
the potential of Sam-AA to N-acylate the twenty proteogenic amino acids in one single
condition, the original aim of the present work was to focus on the enzymatic preparative
synthesis and purification of one AAS, the N-10-undecenoyl-phenylalanine (C11’F), using
Sam-AA from a crude extract from Streptomyces ambofaciens culture, and to compare the
245
biological activity of the enzymatically produced C11’F with the one of the chemically
produced C11’F. As above mentioned, the N-10-undecenoyl-phenylalanine (C11’F) is an AAS
of direct industrial interest, largely used in cosmetics and pharmaceutics as a skin lightening
agent. To date, no study is reported on the preparative enzymatic synthesis and purification of
this AAS in water, nor on the evaluation of its biological activity. This is also the first work of
its kind in the field of AAS enzymatic synthesis. . . In this study, the influence of the operational
conditions on the synthesis reaction of C11’F was investigated, including the use of various
metallic divalent cations such as Zn2+, Cu2+ or Co2+, and their concentrations. An up-scaling of
production using different reactor configurations as well as a convenient way to purify C11’F
as a white powder and at the gram scale was also presented. The inhibition of melanin
production of the purified product was evaluated using melanocyte cell line and compared to
the activity of the chemically produced C11’F.
2. Materials and methods :
2.1. Aminoacylases of S. ambofaciens production
The production of aminoacylases from S. ambofaciens was performed as described in detail in

[23]. Aminoacylases from S. ambofaciens were finally obtained as a protein crude extract
whose specific activity was evaluated using a lauroyl-lysine synthesis reaction. For this
reaction, lauric acid and L-lysine were used as substrates at equimolar concentration (100 mM)
in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50mM, at pH 8 and 45°C at 500 rpm magnetic stirring (2 mL
reaction volume) in a simple glass tube.
2.2. Enzymatic N-acylation of L-Phenylalanine assays
The evaluation of the operational conditions influencing the activity of the crude extract of
aminoacylases were conducted in test tubes of 2 mL final reaction medium containing 100 mM
of each substrate (except for substrate concentration influence) and 1 g/L enzymes
concentration (except for enzyme concentration influence) prepared in 25 mM Tris-HCl, 50
mM NaCl buffer, at 45°C (except for temperature influence), pH 8 (except for pH influence)
and 500 rpm magnetic agitation.
The influence of substrate concentration was investigated by using concentrations from 25

to 200 mM of L-phenylalanine and from 25 to 200 mM of 10-undecenoic acid setting the other
substrate’s concentration at 100 mM. The influence of the pH of the reaction was studied in the
pH range [6-9.5] using NaOH 7.5 M and HCl 1 M to control the pH. Temperature effect on the
246
reaction was evaluated in two steps. The first one was the evaluation of the optimal temperature
of the enzymes by performing the synthesis reaction in a temperature range of [30-55°C]. The
second step was to evaluate the stability of the enzymes by performing the standard reaction
after incubation at different temperature (37, 45 and 55°C) and during different incubation time
(16 and 25 h). The enzymes concentration influence was evaluated by using (0.25, 0.5, 1 and 2
g/L) protein concentration at the standard conditions. The inhibition by the product of the
reaction was investigated by adding different concentrations of a chemically produced
commercial N-10-undecenoyl-phenylalanine. The relative activity was then calculated using
the initials rates of the reactions with (Vi C11’F) and without (Vi0) the addition of the product (
𝑉𝑖 𝐶11’𝐹
𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑦 (%) = ).
𝑉𝑖 0
We investigated the effect of metal ions by using 0.1 mM of CuCl2 (from Fluka Chemika),
CoCl2, ZnSO4 (from Sigma), and Ethylene-Diamine-Tetra-acetic Acid (EDTA) in the standard
conditions. The influence of CoCl2 concentration was evaluated by using CoCl2 concentrations
in the range [0-0.5 mM]. In all case, the reaction was started after one-night agitation, in order
to check if there was a reaction without enzymes, by adding 1 g/L of the crude extract of
aminocaylases from S. ambofaciens.
At appropriate times, 50 or 100 µL aliquot of the reaction mixture was withdrawn and
diluted with 80% Methanol for HPLC-ELSD analysis. Finally, all reactions were stopped by
freezing directly the mixture at -18°C. Each reaction run was performed at least twice.
2.3. Reactor configuration
Different batch reactor with different reaction medium volumes and agitation systems were
also evaluated and compared to the classic batch reaction performed in a standard vessel filled
with 2 mL of the reaction medium. The first one was a 100 mL glass spinner flask with double
sidearms (Wheaton® 356875 Celstir®) used as reactor equipped with suspended magnetic
agitation filled with 20 mL of reaction medium final volume. The second one was a reactor of
500 mL equipped with automatic pH, temperature and agitation monitoring (OptiMax,
METTLER TOLEDO©). The agitation module consisted of a four blades propeller, upwards
(M8) of 45 mm diameter and 45° tilt. The reactor was filled with 300 mL of final reaction
medium. In both cases the reaction medium contained 100 mM of each substrate and 1 g/L
enzymes concentration in 25 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl buffer, at 45°C, pH 8 and 500 rpm
agitation. At appropriate times, 100 µL aliquot of the reaction mixture was withdrawn and
diluted with 80% Methanol for HPLC-ELSD analysis. Finally, all reactions were stopped by
247
freezing directly the mixture at -18°C. Each reaction was performed at least twice. The product
of the reaction performed in the OptiMax was purified following the procedure described
below.
2.4. Purification of the final product:
In order to get, for the first time, a pure enzymatically produced N-10-undecenoyl-pheylalanine,
a purification process was developed. The 300 mL final reaction medium containing 1.53 g of
the produced C11’F, residual 10-undecenoic acid (4.64 g) and L-phenylalanine (4.16 g) and the
enzymes was used for the development of the purification protocol. The first stage was an
ultrafiltration with a 10 kDa membrane (Amicon ultra-15; Merck) made of regenerated
cellulose in order to eliminate small molecules coming from the aminoacylases crude extract.
Two diafiltration steps and a 10-fold concentration step of the initial mixture were performed
by centrifugation during 30 min and 5000 rpm, using a fixed angle rotor (Centrifuge 5804 R,
Eppendorf). The second stage of the protocol consisted in removing the proteins by
precipitation with methanol. To do this the 30 mL concentrated solution was diluted 10 times
with a 80%/20% methanol/water solution. After 3 hours magnetic agitation the precipitated
proteins were removed by centrifugation (20 min at 8400 rpm and 15°C). The methanol present
in the supernatant part was evaporated using a rotating evaporator (Laborota 4002 control,
Heidolph, Germany). The third stage consisted in removing residual impurities and salts by size
exclusion chromatography (BioSepTM SEC-S2000 300 × 21.2 mm, 5 µm particle diameter,
Phenomesex, USA). The elution of the 5 mL injected volume was performed using an isocratic
system (45% acetonitrile) with a 5 mL/min flow rate, during 37 min. The mixture C11’/C11’F
was collected after a 23 min elution time. The recovered mixture was then concentrated by
evaporation for the next stage of purification by liquid chromatographic method. Different high
pressure reverse phase liquid chromatography methods were tested using a “classical” C18
column (Grace/Alltech, Darmstadt, Germany, 150 mm × 2.1 mm, 5 μm particle size) or less
classical C30 phases (LC Acclaim™ C30, 250 mm × 2.1 mm, 5 μm particle size, ThermoFisher
scientific, USA) and also a more specific phase containing phenyl functional groups on its
surface (Force Biphenyl 5 µm, 150 × 2.1 mm for analytic column and Ultra Biphenyl 5 µm,
250 × 21.2 mm for preparative column, Restek, USA). However, the very close
physicochemical properties of the product and the residual fatty acid, like hydrophobicity (logP
C11’ = 3.99, logP C11’F = 5.05), did not allow their proper separation. Also, although the
biphenyl analytical scale column showed its capability to separate the two molecules with about
2 min difference in retention times, the same phase used in a preparative scale column did not
248
allow any separation anymore even after several different trials. Actually, normal phase
chromatography using Kieselgel G 60 powder under atmospheric pressure appeared to be the
most suitable method leading to the pure product. The mixture 50% cyclohexane/50% ethyl
acetate was selected to elute the residual fatty acid, selectively. The product was then eluted by
adding around 1% (v/v) acetic acid to the previous eluting system. The elimination of the
residual fatty acid and the recovery of the product were followed using Kieselgel G 60 Plates
and iodine chamber. The collected fractions containing the product were concentrated using a
rotary evaporator and dissolved again in water for the lyophilisation step, leading to a white
powder. The product purity was assessed by HPLC-ELSD, LC-MS and proton NMR analyses.
2.5. Analytical methods
2.5.1. Quantitative analyses by HPLC
We monitored the reaction conversion by using the same analytical method as the one
previously described in [23], based on the use of an HPLC (LC 10 AD-VP, Shimadzu, France)
equipped with a UV detector at 214 nm followed by a light-scattering low temperature
evaporative detector (Shimadzu, France). Calibrations were performed using a chemically
synthetized N-10-unecenoyl-phenylalanine named SepiwhiteTM MSH kindly provided by
SEPPIC, France. The substrate conversion yield was determined using the following equation:
conversion (%) = (([C11’F] mol/L produced / [C11’] mol/L initial) × 100. We calculated the intial
rates of the reaction by using a third order polynomial model applied to the derivate of the first
experimental data points exhibited in the figures. The maximum velocity (Vmax) and the
Michaelis-Menten constant (Km) for each substrate were determined using a standard
1 1 1
Michaelis-Menten model based on the equation of the graphic representing = 𝑓 (𝑆) = 𝑆 ∗
𝑉
𝐾𝑚 1
+ 𝑉𝑚𝑎𝑥 where V is the initial rate and S is the substrate concentration.
𝑉𝑚𝑎𝑥
2.5.2. Mass spectrometry analysis
We performed the qualitative and semi-quantitative analysis of N-10-undecenoyl-

phenylalanine by using an HPLC-MS-MS system (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA,
USA) consisting in a binary pump connected to a photodiode array detector (PDA) and a Linear
Trap Quadrupole mass spectrometer (LTQ). An atmospheric pressure ionization interface
operating in positive electrospray mode (ESI+) was used. The chromatographic separation and
mass spectrometric conditions that were used as described in details in [23]. Raw data were
processed using Xcalibur software program (version 2.1, http://www.thermoscientific. com).
249
2.6. Biological activity evaluation
The evaluation of the melanin production by melanocytes was performed using B16 murine
melanoma cells (B16F1 cells) following the method described by Chung et al., 2019 with some
adaptations [24]. B16F1 cells were maintained in a CO2 incubator in Dulbecco's modified Eagle
medium (DMEM), without phenol red, supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin
(100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml). Cells were incubated in CO2 for 24 h after being
seeded in 96-well plate (6000 cells/well). Then cells were treated with SepiwhiteTM MSH
(SEPPIC) or enzymatic N-10-undecylenoyl-phenylalanine initially dissolved in ethanol or the
culture medium. Two different concentrations of each was tested (10 and 50 µg/mL) and kojic
acid at 50 µg/mL in the culture medium was used as a positive reference. 200 μL of the cell
culture medium was transferred to a 96-well plate after 72h incubation. The absorbance of the
samples and standard curve of synthetic melanin (0 to 500 μg/mL) was measured at 450 nm.
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑜𝑓 𝑚𝑒𝑙𝑎𝑛𝑖𝑛 𝑤𝑖𝑡ℎ 𝑡ℎ𝑒 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒𝑑 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑒
The inhibition activity (%) was expressed as ×
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑜𝑓 𝑚𝑒𝑙𝑎𝑛𝑖𝑛 𝑤𝑖𝑡ℎ𝑜𝑢𝑡 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒𝑑 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑒
100. In order to evaluate the cells viability, the latters were isolated and lysed in PBS buffer
prior concentration determination using a protein assay kit (BCA Protein Quantitation Kit). The
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑜𝑓 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑠 𝑤𝑖𝑡ℎ 𝑡ℎ𝑒 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒𝑑 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑒
cells viability was expressed as × 100. The
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑜𝑓 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑠 𝑤𝑖𝑡ℎ𝑜𝑢𝑡 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒𝑑 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑒
measured melanin contents were then normalised by the protein amount and expressed as μg/mg
of cell’s proteins. The evaluation was done at least 5 times and the statistical analysis was done
using Student test to compare the results with the control (XLSTAT software, Addinsoft Inc.,
Paris, France).
3. Results and Discussion
3.1. Influence of substrate concentration on enzymatic activity
In a recent study [23], the ability of the aminoacylases from S. ambofaciens to catalyse the
N-acylation of the amino acids on alpha amino group position was demonstrated. 10-
undecenoic acid is a mono-unsaturated fatty acid described as having antifungal, antiviral and
insect-repelling activity which makes it useful to treat superficial infections [25,26]. It was also
described as having neuroprotective and radical-scavenging activity [27]. The N-undecyl-10-
enoyl-L-phenylalanine (C11’F) generated by the condensation of the phenylalanine with the
10-undecenoic acid was described as having very interesting properties for cosmetic
applications. However, the enzymatic synthesis of C11’F has never been reported. In order to
study the operational conditions influencing the activity of the aminoacylases from S.
250
ambofaciens the synthesis of C11’F was used as reference reaction. In this study all experiments
were carried out using the same crude extract from S. ambofaciens containing 21 ± 0.7 g/L of
proteins [28]. The apparent specific activity of the proteins crude extract was evaluated using
lauroyl-lysine synthesis reaction performed with an equimolar concentration of the lauric acid
and lysine (100 mM). The reaction was performed using 1 g/L of protein crude extract. The
apparent specific activity of the acylases from S. ambofaciens was 33.4 ± 5 µM of α-lauroyl-
lysine / min / mg of proteins.
All N-acylation (amidation) reactions were carried out in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50 mM
pH 8, containing 1 g/L protein at 45°C  3°C. In order to evaluate the substrate concentration
influence on enzyme activity different reactions were performed. First of all, the best substrate
concentration, at equimolar conditions, was evaluated for the further parameters evaluation by
using different concentration (25 mM, 50 mM, 100 mM and 200 mM). The concentration
produced after 48 h (Fig.1) showed a maximum reaction by using 100 mM of both substrates
while very low activity was observed in the other conditions. The influence of the substrate
concentration on the performance of the aminoacylases from S. ambofaciens was then studied
by fixing the concentration of one of the substrates at 100 mM and by varying the concentration
of the other substrate from 25 mM to 200 mM. The influence of the concentration in 10-
undecenoic acid was very low compared to the influence of phenylalanine concentration
(Fig.2). The initial rate of the reaction was increased by the increase of the concentration of the
fatty acid from 25 mM to 125 mM followed by a stabilization of the reaction rate. The evolution
of the initial rate followed standard Michaelis-Menten model allowing the determination of Km
1
and Vmax for the undecenoic acid. According to the equation of the graphic representing 𝑉 =
1
𝑓 (𝑆) Vmax and Km of around 0.50  0.05 mM / h and 19.2 mM were found. Above a C11’
concentration of 175 mM a slight decrease of the activity was observed which can be due to a
substrate inhibition. The influence of the amino acid was more pronounced than the fatty acid
where a continuous increase of the initial rate was observed. Indeed, according to the equation
1 1
of the graphic representing 𝑉 = 𝑓 (𝑆) Vmax and Km of around 0.50  0.05 mM / h and 42 mM
were found. Koreishi et al., 2005 observed nearly the same relationship when performing the
reaction of Nα-Feruloyl-L-lysine synthesis using the aminoacylase from Streptomyces
mobaraensis. They showed, like in this study, that the activity was almost unaffected by the
concentration of the acyl donor. However, the effect of L-lysine concentration on the activity
was positively much more important [20].
251
14
C11'F concentration (mM)

12
10
0
25 mM 50 mM 100 mM 200 mM
Substrates concentration
Fig.1: Influence of substrates concentration at equimolar condition on the synthesis of N-10-

undecenoyl-phenylalanineafter after 72 h in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50mM containing 1
g/L acylases crude extract at 45°C, pH 8 and 450 rpm magnetic agitation (n=2 or 3).
A. B.
Fig.2: Influence of substrates concentration on the initial rate for the synthesis of N-10-
undecenoyl-phenylalanine in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50mM containing 1 g/L acylases
at 45°C, pH 8 and 450 rpm magnetic agitation, A. Effect of 10-undecenoic acid concentration
on the initial rate of N-10-undecenoyl-phenylalanine synthesis reaction. A reaction mixture
containing 0.025-0.2 M of 10-undecenoic acid and 100 mM L-phenylalanine. B. Effect of L-
phenylalanine concentration on the initial rate of N-10-undecenoyl-phenylalanine synthesis
reaction. A reaction mixture containing 100 mM 10-undecenoic acid and 0.025–0.2 M of L-
phenylalanine (n=2).
252
3.2. Influence of the pH on aminoacylases activity
The pH of the reaction medium is one of the most important operational parameters affecting
the performance of a reaction by changing even the ionisation state of the substrates and
enzymes and, subsequently, the enzymes activity. The results showed that the activity remained
nearly stable at pH range from 6.5 to 9 while no reaction was obtained at pH 6 and very low
activity was measured at pH 9.5 (Fig.3 A). However, by following and comparing the kinetic
of the reaction at pH 8-9 (Fig.3 B), the enzymes seems to be much less stable at pH 8.5 and 9
than at pH 8, which is very important in the perspective of an extrapolation. For this reason, the
pH of all the reaction performed using the aminoacylases from S. ambofaciens at 45°C were set
at a range of 7-8. Several studies evaluated the influence of the pH on the enzymatic activity
and showed nearly the same pH range for optimum activity, which is widely used for industrial
application. Koreishi et al. (2005, 2009), showed that the optimum pH of the aminoacylase
(SmAA) from Streptomyces mobaraensis was between 7 and 8 while the second aminoacylase
of 100 kDa had an optimum pH of 6.5 [20,21]. Wada et al., showed that the acylase I from Pig
Kidney had an optimal pH for the reaction of around 7 and 7.5 [29].
A B
0,6
0,5
Initial velocity (mM / h)
0,4
0,3
0,2
0,1
0
6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5
pH
Fig.3: Influence of the pH on the enzymatic activity for the synthesis of N-10-undecenoyl-
phenylalanine in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50 mM containing 100 mM of both substrates,
1 g/L acylases crude extract at 45°C, pH [6 - 9.5] and 450 rpm magnetic agitation, A. effect of
the pH on the initial rate. B. Kinetic evolution of the synthesized N-10-undecenoyl-
phenylalaninesynthesis reaction at pH 8, 8.5 and 9 (n=2).
3.3. Influence of the temperature
The influence of the temperature of the reaction on the enzymatic activity is shown in fig 4.A.
the best activity was obtained at 45°C while very low activity was observed at 55°C. The loss
253
of the activity at 55°C can be related to a low stability of the enzymes due to a fast protein
denaturation. In order to evaluate the thermal stability of the enzymes, the aminoacylases were
incubated at different temperature (37, 45 and 55°C) during 16 and 25 h before starting the
reaction at 45°C. As shown in fig.4.B, the enzymes lost around 80 % of the activity after 16 h
incubation at 37°C and around 90 % after 25 h and the higher is the incubation temperature, the
higher is the loss of activity. The results at 55°C confirmed that the low activity observed when
performing the reaction at this temperature was due to protein denaturation. Similar results were
obtained by Koreishi, who studied the stability of the aminoacylase (SmAA) from Streptomyces
mobaraensis by performing the hydrolysis of N-acetyl-L-methionine at 37 °C in Tris-HCl
buffer at pH 7.5. They also showed that the enzymes lost almost all the activity after only one-
hour incubation at 55°C [21].
A. B.
Fig.4: Effect of the temperature on the enzymatic activity A. Influence of the reaction
temperature on the enzymatic activity for the synthesis of N-10-undecenoyl-phenylalanine in
25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50 mM containing 100 mM of both substrates, 1 g/L acylases at
T°C [30-55°C], pH 8 and 500 rpm magnetic agitation B. Thermal stability of the enzymes after
16 and 25 h incubation time at 37, 45 and 55°C compared to fresh enzymes reaction conducted
in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50 mM containing 100 mM of both substrates, 1 g/L acylases
at 45°C, pH 8 and 500 rpm magnetic agitation (n=2).
3.4. Influence of protein concentration
Reactions using different protein concentration in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50 mM

containing 100 mM of both substrates at 45°C, pH 8 and 450 rpm magnetic agitation were
conducted. By following the kinetics of the production of C11’F at the different protein
254
concentrations, the increase of the quantity produced after 3 days was proportional to the protein
concentration when a concentration between 0.25 and 1 g/L was used. However, the increase
of the produced concentration was much less important from 1 to 2 g/L while the initial rate
was proportional to the quantity of protein used (Fig.5 A and B). In all cases, a decrease of the
activity after a certain time was observed. This can be attributed to a relatively low thermal
stability of the enzymes or to an inhibition by the product of the reaction knowing that the
C11’F is soluble in the operational condition. In order to face the problem of thermal
denaturation and to increase the amount of C11’F produced, a reaction was performed using 1
g/L of protein with an additional 1 g/L introduced to the reaction medium after 24 h. The kinetic
of the reaction was compared to the ones with 1 and 2 g/L (Fig.5 C). The addition of enzymes
during the reaction caused an increase of the production to reach the same concentration as with
2 g/L protein concentration. This means that the protein denaturation is not the only factor
controlling the reaction. The second reason could then be the enzymes inhibition by the C11’F
itself or that the thermodynamic equilibrium of the reaction was reached. The product inhibition
of the reaction was evaluated by performing the reaction in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50
mM containing 100 mM of both substrates and [0-10 mM] of C11’F at 45°C, pH 8 and 450 rpm
magnetic agitation. The results (Fig.5 D) showed a clear product inhibition where a progressive
decay of the initial activity of the enzymes was observed by increasing the concentration of the
product.
255
A. B.
1,0
0,8
Initial rate (mM / h)

0,6
0,4
0,2
0,0
0,25 0,5 1 1,5 2
Protein concentration (g / L)
C. D.
100
80
60
40
20
0
0 1 2,5 3,5 5 10
C11'F added concentartion (mM)
Fig.5: Influence of the protein concentration and the product concentration on the enzymatic
activity for the synthesis of N-10-undecenoyl-phenylalanine in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl
50 mM containing 100 mM of both substrates, 1 g/L acylases (except for the protein
concentration influence) at 45°C, pH 8 and 450 rpm magnetic agitation, A. C11’F production
kinetic at different enzymes concentration [0.25-2 g/L] B. Initial rate of the production at
different protein concentration C. C11’F production kinetic with enzymes addition during the
reaction compared to the reaction performed using 1 and 2 g/L initial enzymes concentration
D. Influence of the C11’F added concentration on the initial rate of the reaction (n=2 for Fig.
5A, 5B, 5C, 5D).
3.5. Influence of metal activator on the reaction
As described by Dettori et al., 2018, the sequence coding the aminoacylase from S.
ambofaciens, named SamAA, is very close to the one coding the aminoacylase from S.
256
mobaraensis (Sm-AA) described by Koreishi et al. in 2009 with 86 % sequence identity. This
enzyme was described as belonging to a metal-dependant family which can be influenced by
the addition of metal ions playing a key role in the catalytic process. To date and according to
the Brenda database, only 3 aminoacylases structures have been elucidated: PDB 1Q7L from
Homo sapiens (heterodimer of 65.11 kDa) described by Lindner et al. in 2003 [30], PDB 1YSJ
from Bacillus subtilis (homodimer of 89.92 kDa) described by Minasov et al. in 2005 [31], PDB
and PDB 4EWT from Staphylococcus aureus (homotetramer of 174.18 kDa) described by
Girish et al. in 2013 [32]. All of them were found to be Zn2+-dependent metalloenzymes. In the
case of the human aminoacylase-1 from the M20 family (heterodimer), Lindner et al. identified
two types of domains: a Zn2+ binding domain and second domain that facilitate dimerization
of Zinc binding domains. They suggested that this was that dimerization that allows catalysis
to occur, since aminoacylase's active site lies between its two Zinc binding domains. Regarding
the catalytic hydrolytic mechanism, and through probing of the acyl-binding pocket of the same
aminoacylase, Lindner et al. [33] proposed that the Zinc ions inside of aminoacylase are each
coordinated to glutamate, histidine, aspartate, and water. The Zinc ion polarizes the water,
facilitating its deprotonation by a nearby basic residue. The negatively charged hydroxide ion
is nucleophilic and attacks the electrophilic carbonyl carbon of the substrate's acyl group. But
the exact mechanism after this step is unknown. One possibility is that the carbonyl then
reforms, breaks the amide bond, and forms the two products. At some point in the mechanism,
another water molecule enters and coordinates with Zinc, returning the enzyme to its original
state. The nucleophilic attack by water is considered as the rate-limiting step of aminoacylase's
catalytic mechanism. In our case, SamAA is not multimeric but monomeric and was also shown
to be Zn2+ dependent in hydrolysis (or synthesis) reactions in water. Without crystallographic
structure so far, no mechanism can be proposed for this specific aminoacylase. Since, in this
study, the production of Sam AA was performed without metal addition (no Zinc in the culture
medium) we evaluated the effect of metal ions on the activity of this enzyme by using Co2+,
Zn2+ and Cu2+ cations, which were described as the most influencing ones [10,11,20,21].
Ethylene-diamine-tetra-acetic acid (EDTA) was used as chelating agent to check the metal-
dependency of the enzyme. As shown in Fig.6, for the same concentration of the three metal
ions (0.1 mM), Cobalt ion led to a three time increase of the initial rate unlike Zn2+ and Cu2+
ions allowing only a slight increase. No reaction was registered when EDTA was added, which
confirmed that the aminoacylases involved in the N-acylation are metalloenzymes. However,
by comparing the reaction course, the thermodynamic equilibrium was reached with CoCl2 after
48h while the thermodynamic equilibrium of the control reaction and the reaction with Zn2+ as
257
metal ion was not yet reached after 72 h. For the reaction with Cu 2+ the thermodynamic
equilibrium was also reached after 48 h but with around 25% less activity than with Co 2+ as
metal ion. The influence of Cobalt concentration was therefore also investigated. The increase
of the Cobalt concentration allowed an important increase of the initial rate of the reaction to
reach around eleven-fold increase of the initial rate by using 0.5 mM of CoCl2 (Tab.1). When
concentration from 0.3 to 0.5 mM of CoCl2 was used, the thermodynamic equilibrium was
reached after only 24 h reaction time but the final product concentration was affected. Indeed,
the increase of the CoCl2 concentration led to an increase in the conversion rate until 0.3 mM
CoCl2 with more than 20 mM C11’F concentration. A 16 mM C11’F concentration was reached
when using a 0.5 mM CoCl2 concentration. Koreishi et al. 2005 studied the influence of metal
ions on the hydrolytic activity of S. mobaraensis aminoacylase. Their results were similar to
the ones observed in this study where three-fold increase of the activity by adding 0.1 mM
CoCl2 and only a slight increase by adding Zn2+ ion was observed. However, they showed a
decrease of 80 % of the activity by adding Cu2+ ion (Koreishi et al., 2005a), which was not the
case with the acylases from S. ambofaciens.
Fig.6: influence of different metal ions at 0.1 mM concentration on the enzymatic activity for
the synthesis of N-10-undecenoyl-phenylalaninein 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50 mM
containing 100 mM of both substrates, 1 g/L acylases at 45°C, pH 8 and 500 rpm magnetic
agitation.
258
Tab.1 effect of metal ion and the concentration of CoCl2 on the initial rate of the reaction
synthesis of N-10-undecenoyl-phenylalaninein and the C11’F produced concentration after 48h
in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50 mM containing 100 mM of both substrates, 1 g/L acylases
at 45°C, pH 8 and 500 rpm magnetic agitation.
No metal
Metal ion ZnSO4 CuCl2 CoCl2 CoCl2
ions
Concentration (mM) 0.1 0.1 0.1 0.05 0.2 0.3 0.4 0.5
0.73  0.61  1.01  0.69  1.64  2.48  3.22  4.34 
Initial rate (mM / h) 0.4  0.08
0.17 0.05 0.26 0.18 0.1 0.7 0.6 0.4
C11’F concentration 11.5  15.7  17.7  22  20  17.2 
11.8  1.5 12.1  3 17  1.2
(mM) 2.2 1.5 2.5 0.35 2.9 2.7
3.6. Influence of reactor configuration
In a perspective of process intensification and to evaluate the best way to produce the C11’F
at gram scale, different reactor configurations were evaluated. CoCl2 was not added in this part
in order to avoid residual Co2+ in the final product. Intensified designed reactors were used by
different authors for enzymatic intensification allowing an enhancement of the product yield
per space and time units [34,35]. In this kind of reactors free or immobilized enzymes can be
used. The immobilization of the aminoacylases from S. ambofaciens was prevouslyinvestigated
on carriers such as mesoporous silica materials (SBA-15) using adsorption or covalent binding.
However, the aminoacylases lost almost all of their activity whatever the immobilization
technic used, thus showing that further studies are required in this field [36].
Different batch reactor configurations with different volume and agitation module were
evaluated in order to reach a gram scale of pure enzymatic C11’F. As shown in fig.7 A, there
is no influence of the reactor configuration on the final product concentration when performing
the reaction in the same conditions. Indeed, the same final concentration was obtained when
passing from 3 mL batch reactor with magnetic stirrer to the 300 mL batch reactor (Optimax)
equipped with Rushton mechanical stirrer. The reaction using Optimax reactor was carried out
seven days allowing to reach around 1.58 g of produced C11’F with around 4.6 g residual fatty
acid (Fig.7 B). The final reaction mixture was used for the purification procedure in order to
obtain the pure product.
259
A. B.
Fig.7: scaling-up of the C11’F synthesis reaction in 25 mM Tris-HCl buffer, NaCl 50 mM

containing 100 mM of both substrates, 1 g/L acylases at 45°C, pH 8 and 500 rpm magnetic
agitation A. influence of batch reactor configuration B. kinetic of the C11’F production and the
C11’ consumption for the reaction performed in OptiMax reactor (n=2).
3.7. Purification of the reaction product
As detailed in the Materials and Methods section, the C11’F was purified using filtration and
chromatographic methods. The first step consisting in an ultrafiltration on a 10 kDa allowed the
selective passage of the product of interest and the residual fatty acid (331 Da and 184 Da
respectively) while eliminating few impurities. As shown in fig.8 A, the three first steps of
diafiltration allowed the elimination of 64 % of the fatty acid with only 15 % loss of the product
from a sample of the initial reaction medium composed of 300 mg of C11’ and 127 mg of
C11’F. However, when more diafiltration steps were performed a higher loss of the C11’F was
observed (fig.8.A). This partial separation of the C11’ and the C11’F can be due to the
amphiphilic property of the acylated amino-acid which can interact with the proteins standing
in the retentate forming a polarization layer, while the apolar characteristic and the high quantity
of the residual C11’ increased its elimination in the permeate. However, after the elimination
of around 64 % of the fatty acid, the membrane pores became more accessible for the C11’F,
leading to a loss of the product. A compromise that allowed the partial elimination of the
residual C11’ while limiting the loss of the C11’F was found by applying two diafiltration steps
and a concentration step. This led to the recovery of a solution containing around 1.1 g of the
product and equivalent quantity of the fatty acid in addition to the aminoacylases used. The
proteins were eliminated by precipitation with methanol, and the product was separated from
the residual fatty acid by size exclusion chromatography. After lyophilisation 0.8 g of a 99 %
260
pure white powder of enzymatically produced N-10-undecenoyl-phenylalanine was obtained,

as determined by mass spectroscopy and proton NMR analysis (Fig.8 B).
A.
B.
Fig.8: Details on C11’F purification process A. quantity of fatty acid and product removed at
different diafiltration steps using a 10 kDa cut-off membrane and an initial solution of 25 mL
of the final reaction mixture (300 mg of C11’ and 127 mg of C11’F) B. proton NMR of the
final purified product.
261
3.8. Evaluation of the biological activity of the purified product
N-10-undecenoyl-phenylalanine was described in the literature as having a lightening effect on

the skin. This activity is due to an inhibition of the production of melanin by melanocytes as
antagonist to alpha-melanocyte stimulating hormone (MSH) receptor [5]. The enzymatic and
the chemical N-10-undecenoyl-phenylalanine solutions were prepared in ethanol and culture
medium at different concentrations (10 and 50 µg/mL) for the bioactivity evaluation. As
represented in Tab.2, inhibitory activity at 50 µg/mL was higher with enzymatic C11’F than
with the chemical one when it was solubilized in ethanol, while it was less active when it was
solubilized in the medium. This can be explained by the solubility of the enzymatic C11’F (data
not shown), which was slightly lower than the chemical one in the medium. The lower solubility
of the enzymatic product in the medium might be due to the presence of silica particles traces
from the last chromatographic step or acetic acid used to recover the product from the column.
The acetic acid can influence the ionization of the product resulting in a precipitation of a part
of the product in unbuffered medium. By comparing cells viability in those conditions, the
enzymatic product prepared in medium showed less toxicity than the chemical one unlike the
enzymatic product prepared in ethanol, which showed higher toxicity as compared to the
chemical one. Knowing that ethanol and the medium do not show any effect on the cell growth,
this effect is related to the presence of the product. This can also be explained by the slight
solubility difference of the enzymatic and chemical C11’F. In ethanol, enzymatic C11’F
showed higher cell toxicity than the chemical one but much better lightening activity due to its
good solubility. In the medium, the enzymatically produced C11’F showed lower cell toxicity
than the chemical one, which might be related to the lower solubility reducing the accessibility
of the product to the cells and to the MSH receptor resulting in less toxicity and activity. At 10
µg/mL, according to statistical analysis, non-significant difference was observed between
enzymatic and chemical C11’F prepared in ethanol and culture medium for the depigmentation
activity, due to low concentration. However, cell toxicity was slightly more pronounced with
enzymatic C11’F for no explained reason. Further study is needed in order to explain the reason
of the observed differences.
262
Tab.2 melanin production inhibition and cells viability evaluation.

Depigmentation* (%) Cells viability** (%)
Dilution Concentration p-value T p-value T
solution (µg/mL) Chemical Enzymatic test Chemical Enzymatic test
C11’F C11’F C11’F C11’F
50 9 26 0.0002 (***) 84 75 0.0001 (***)

Ethanol
10 6 9 0.2101 (NS) 98 95 0.0100 (*)
Culture 50 67 48 0.0463 (*) 76 82 0.0018 (**)
medium 10 17 13 0.2514 (NS) 100 97 0.0205 (*)
LS: limit of significance; 0.05<p<0.1; *0.01<p<0.05; **0.001<p<0.01 and ***p<0.001, n = 6.

*
: 97% inhibition of melanin production by melanocytes using Kojic acid as positive control
without any cell toxicity
**
: 100% cell viability correspond to the result with the control culture of melanocyte (without
any added molecules)
Conclusion
The aim of this study was to evaluate the operational conditions influencing the performances
of the aminoacylases from S. ambofaciens for the N-acylation of the L-phenylalanine with 10-
undecenoic acid as acyl donor. The results showed a positive effect of the phenylalanine
concentration on the aminoacylases activity, unlike what was observed with the 10-undecenoic
acid. Investigations on operational conditions showed a good N-acylation activity at 45°C, pH
[7-8] but low temperature stability. The inhibitory effect of the product on the conversion rate
was also demonstrated showing the interest of immobilization aiming to use these
aminoacylases in continuous flow reactors. The influence of the metal ions was also studied
confirming that the aminoacylases used are metallo-dependant and showing a very interesting
acceleration of the reaction by adding CoCl2. Different reactor configurations were evaluated
but the batch reactor was the most suitable for the synthesis of N-10-undecenoyl-phenylalanine
without any effect of the agitation mode. A purification procedure was developed leading to 0.8
g of N-10-undecenoyl-phenylalanine with more than 99% purity, under the form of a white
powder. The biological activity of the product was tested on melanocyte cell cultures and
showed a clear inhibition of the melanin production. When significant, the difference in the
lightening activity and/or the cell toxicity observed between the C11’F of chemical origin or
that issued from the enzymatic process was likely to be due to different impurities remaining in
the two products. These results represent a step forward towards the development of a green
263
bioprocess using S. ambofaciens aminoacylases in aqueous media, which could constitute a

promising alternative to existing chemical processes for the production and the purification of
lipoaminoacids (i.e. AAS) as biosurfactants.
CRediT author statement
Mohamed Chafik Bourkaib: Conceptualization, Investigation, Writing-Original Draft
Stephane Delaunay: Conceptualization, Methodology Xavier Framboisier: Resources,
Investigation Catherine Humeau: Investigation, Methodology, Writing - Review & Editing.
Jerôme Guilbot: Funding Acquisition, Validation Cecile Bize: Ressources, Investigation,
Formal analysis, Writing - Review & Editing Estelle Illoud: Project administration, Writing -
Review & Editing Isabelle Chevalot: Project Administration, Supervision, Writing - Review
& Editing, Validation Yann Guiavarc’h: Funding Acquisition, Project Administration,
Supervision, Formal Analysis, Writing - Review & Editing, Validation.
Acknowledgement
This work was mainly supported by the French National Research Agency (ANR) through the
“ISEAPIM3” project (ANR-15-CE07-0023-01), and partly by the “Impact biomolecules”
project of the « Lorraine Université d’Excellence (LUE) » (PIA-ANR). We also thank Emilien
GIROT from LRGP for giving us access to the Optimax reactor and for his valuable advices.
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267

L’objectif de cette étude concernait l’investigation des conditions réactionnelles influençant les
performances catalytiques des aminoacylases de S. ambofaciens en milieu aqueux et la
purification du produit de la réaction afin d’évaluer son activité biologique. La réaction de
synthèse du N-10-undecenoyl-phenylalanine par l’acylation enzymatique de la phénylalanine
avec de l’acide 10-undécénoïque a été utilisée comme modèle en raison des propriétés
biologiques de ce bio-tensioactif et de son intérêt industriel. L’influence des conditions
opératoires sur les performances catalytiques des aminoacylases de S. ambofaciens a été étudiée
en milieu aqueux (tampon Tris-HCl), en mode discontinu, dans un réacteur agité. L’évaluation
de l’influence des substrats sur la réaction de synthèse a montré un effet positif de
l’augmentation de la concentration en phénylalanine contrairement à la concentration en acide
gras qui n’a que peu d’impact sur le taux de conversion. Une concentration équimolaire (0,1 M
/ 0,1 M) des deux substrats a été utilisée pour la suite de l’étude. Les aminoacylases de S.
ambofaciens ont présenté une activité catalytique maximale à une température de 45°C. Par
contre, ces enzymes ont montré une faible stabilité thermique suite à une incubation à 37, 45
ou 50°C. Les vitesses initiales de réaction les plus élevées ont été obtenues pour des pH de 8,5
- 9. Cependant, un pH de 8 du milieu réactionnel a été retenu comme le meilleur compromis
étant donnée la faible stabilité au cours du temps des enzymes observée lors des réactions
réalisées à des pH supérieurs à 8. Par ailleurs, un effet inhibiteur du produit de la réaction, le
N-10-undecenoyl-phenylalanine (C11’F), a été démontré par l’ajout de concentrations
croissantes en produit au début de la réaction. Enfin, les résultats en présence d’ions métalliques
ont été similaires à ceux obtenus lors des réactions de synthèse de l’-lauroyl-lysine (chapitre
4). Cela a permis de démontrer notamment un effet activateur du cobalt sur la réaction de
synthèse se traduisant par une augmentation importante de la vitesse initiale et du taux de
conversion. Par ailleurs, l’amélioration de l’activité enzymatique par ajout du cobalt dépend
fortement de la concentration de ce dernier. En effet, les meilleures performances ont été
obtenues avec une concentration de 0,3 mM de CoCl2, mais au-delà de cette concentration, un
effet inhibiteur de ce métal a été observé. Le changement de système réactionnel (volume et
configuration du réacteur) n’a eu aucun effet sur les performances des enzymes. Les mélanges
réactionnels issus de la réaction de synthèse du C11’F réalisée dans un réacteur de 1 L (300 mL
de mélange final) ont été utilisés pour l’extraction et la purification du C11’F, suivant la
démarche présentée en figure 6.1. Le produit final a présenté une pureté de plus de 99%, évaluée
par LC-MS-MS et par RMN. L’activité inhibitrice de ce produit sur la synthèse de mélanine
268
par les mélanocytes a été déterminée et les tests biologiques réalisés sur des cultures de cellules
mélanocytes ont confirmé la présence d’activités éclaircissantes de la peau comparable à celles
obtenues avec du C11’F produit par voie chimique. Ces résultats décrivent pour la première
fois la production de C11’F par voie enzymatique mais le rendement de conversion maximale
obtenu par voie enzymatique (22%) reste bien plus faible comparativement à celui obtenu par
voie chimique (plus de 80%). Une extrapolation à plus grande échelle n’est pas envisageable
dans l’état actuel et nécessite une étude plus approfondie et plus large par l’utilisation, par
exemple, de réacteur intensifié tels que les réacteurs micro-fluidiques et/ou par le
développement d’une méthode d’immobilisation efficace permettant d’améliorer l’activité et la
stabilité de ces aminoacylases.
Figure 6.1 : procédures de purification évaluées et sélectionnées pour la purification du C11’F
6.4 Conclusion
Suite aux résultats obtenus décrits dans les chapitres précédents, l’utilisation des aminoacylases
de S. ambofaciens, sous forme libre, en milieux aqueux, a été retenue comme le système
réactionnel le plus adapté pour l’acylation enzymatique d’acides aminés. Etant donné que les
conditions opératoires influençant la réaction de N-acylation des acides aminés par l’utilisation
de ces aminoacylases n’avait pas été étudiée auparavant, ce chapitre a permis d’évaluer les
paramètres permettant une amélioration de la synthèse enzymatique du C11’F qui présente un
intérêt industriel important de par ses propriétés tensioactives et son activité éclaircissante de
la peau. Il a ainsi pu être défini que les aminoacylases présentent une activité maximale à une
température de 45°C, un pH 8 et en présence de à 0,3 mM de CoCl2 mais avec un taux de
conversion qui reste faible par rapport à la voie chimique (20% vs plus de 80%), avec une faible
stabilité thermique et une inhibition de l’activité par le produit de la réaction. Cependant,
269
l’extrapolation du procédé enzymatique mise en œuvre est, à ce jour, économiquement

incompatible, en particulier en tenant en compte du coût de production de l’enzyme. Le produit
issu de la réaction a été purifié permettant l’obtention de C11’F quasi pure sous forme de poudre
blanche, présentant une activité inhibitrice de la production de mélanine par les mélanocytes.
C’est la première fois qu’un procédé enzymatique permettant la synthèse d’un bio-tensioactif
présentant une telle activité biologique est décrit.
270
CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES
271
272
Conclusion et perspectives
Conclusion générale et perspectives

Le but principal de cette thèse était de développer un procédé de N-acylation enzymatique
d’acides aminés pour la production de lipoaminoacides (LAA), très utilisés en industrie, afin
de proposer une alternative au procédé chimique, moins respectueux de l’environnement,
actuellement utilisé en industrie. Ce travail s’inscrivait dans le cadre du projet ANR
ISEAPIM3 (Intensified & Sustainable Enzymatic Acylation Processes on Innovative
Macroporous/Mesoporous Materials 2015-2019) qui visait également le développement de
supports innovants pour l’immobilisation d’enzymes. Afin d’atteindre cet objectif, il a été
nécessaire de mettre en place une démarche expérimentale afin de sélectionner le meilleur
couple enzyme / solvant réactionnel permettant l’acylation d’acides aminés en utilisant des
solvants dits « verts » et d’étudier les mécanismes catalytiques et la sélectivité de ces
catalyseurs à l’échelle réactionnelle et moléculaire (chapitre 3 et 4), ainsi qu’à l’échelle du
procédé par l’immobilisation des enzymes (chapitre 5). Le procédé le plus adapté à la
production d’acide aminé acylé a été alors intensifié pour la production d’un surfactant à base
d’acide aminé, à fort intérêt industriel, dont l’activité biologique a été comparée au produit issu
de la voie chimique industrielle (chapitre 6).
La première étape a consisté à évaluer et comparer les performances de la lipase B de C.

antarctica dans différents solvants non aqueux et des aminoacylases de S. ambofaciens en
milieu aqueux pour la réaction de N-acylation d’acides aminés avec des acides gras. Étant
donné que la structure 3D de CALB est connue, il a été possible d’évaluer les interactions
moléculaires mises en œuvre lors de ces réactions d’acylation.
L’évaluation des performances de CALB pour la réaction d’acylation des acides aminés, en
particulier de la phénylalanine avec l’acide undécénoïque, a été réalisée en utilisant plusieurs
solvants non-aqueux dont le solvant organique M2B2, le CO2 supercritique et les solvants
eutectiques profonds (choline chloride / urée et glycérol). Les résultats ont montré de faibles
performances de cette enzyme sauf dans le cas de la lysine où une acylation en position epsilon
a été vérifiée. Cette faible réactivité pourrait être liée à plusieurs facteurs tels que le caractère
hydrophile des acides aminés, incompatible avec l’utilisation des milieux apolaires et
conduisant à la précipitation de ces derniers, ou encore, la viscosité du solvant, notamment dans
le cas des solvants eutectiques, qui peut engendrer des limitations de transfert du substrat vers
le site actif. Une autre raison de cette faible activité pourrait être la réactivité potentielle du
solvant avec les substrats ou l’enzyme pouvant induire la formation de liaisons carbamates
273
inhibant l’activité enzymatique dans le cas du scCO2 ou encore l’apparition de produits

secondaires par interaction de l’acide aminé avec les constituants du solvant réactionnel (urée)
réduisant sa disponibilité pour la réaction. L’absence d’affinité de l’enzyme pour certains des
substrats étudiés peut aussi être la raison de l’absence de conversion ; c’est pourquoi, une étude
à l’échelle moléculaire a été réalisée. L’étude in silico a débuté par une étape de dynamique
moléculaire afin d’optimiser la structure de l’acyle-enzyme (C11’-CALB) puis une étape de
simulation de docking rigide entre cette structure et les différents acides aminés a été réalisée
puis analysée suivant des critères de distance entre les résidus catalytiques et le groupement
nucléophile (groupement amine). Les résultats ont démontré une faible probabilité d’apparition
d’acides aminés N--acylés sauf pour l’alanine et pour l’acide aspartique ce qui n’était pas en
accord avec les résultats expérimentaux. Dans le cas de la lysine, la simulation a montré une
possible acylation sur la chaîne latérale, ce qui, dans ce cas, était cohérent avec les résultats
obtenus. Pour les autres acides aminés certaines poses présentaient un bon positionnement dans
la cavité catalytique, mais ces dernières étaient peu favorables sur le plan énergétique. Cette
faible réactivité semble s’expliquer par des interactions de type liaison hydrogène et/ou des
interactions hydrophobes avec des résidus localisés à l’entrée du site actif (Ala141, Leu140,
Ala141, Leu144, et Val154), stabilisant ainsi le substrat à l’entrée de la cavité, ou avec des
résidus proches de la triade catalytique (Gln157 et Asp134) qui stabilisent l’acide aminé dans
des positions non favorables à une N-acylation. Par ailleurs, ces résultats fournissent des
premiers éléments de compréhension de la sélectivité de CALB vis-à-vis des acides aminés
mais ne nous permettent pas de conclure avec certitude sur l’inadéquation de CALB à catalyser
la réaction d’acylation de ce genre de composés, ce qui pourrait expliquer l’absence de
références bibliographiques traitant de l’acylation d’acides aminés autres que la lysine. Afin
d’étayer ces premiers résultats, une étude complémentaire in silico plus approfondie devra être
réalisée, par exemple par le calcul d’énergie d’interactions électrostatiques. D’autres acides gras
peuvent aussi être utilisés comme donneurs d’acyles à la place de l’acide undécénoïque ce qui
pourra changer le comportement des acides aminés au niveau de la cavité catalytique.
Dans un deuxième système réactionnel, l’utilisation des aminoacylases de S. ambofaciens a été

évaluée en milieu aqueux tamponné. Ces enzymes ont été décrites dans une étude précédente
comme capables de catalyser la réaction d’acylation de certains peptides et de la lysine au
niveau de leur fonction amine de la chaine principale (Dettori et al., 2017). Par ailleurs, la
spécificité de substrat de ces enzymes vis-à-vis des autres acides aminés et d’autres donneurs
d’acyle n’avait jamais été établie. Ainsi, l’étude de la spécificité de substrat vis-à-vis des 20
274
acides aminés protéinogéniques a été réalisée en présence d’acide undécénoïque. Les

aminoacylases ont présenté une spécificité assez large avec une acylation orientée
exclusivement sur l’amine de la chaine principale, en position alpha, sans produit secondaire
visible par LC-MS-MS. Les meilleures performances ont été obtenues en présence de
l’arginine, la lysine, la leucine et la méthionine. La sélectivité de ces enzymes envers différents
donneurs d’acyles a également été établie en utilisant des acides gras de différentes longueurs
de chaine. Les résultats ont montré que l’augmentation de la longueur de la chaine grasse,
jusqu’à 12 carbones, permettait une amélioration du taux de conversion. Au-delà, une
diminution de l’activité est observée. Par ailleurs, un changement de la régiosélectivité des
enzymes a été observé lorsque des acides gras d’une longueur inférieure à 8 carbones sont
utilisés. En effet, en présence d’acide caprylique ou d’acides gras à plus courte chaîne, de la
lysine acylée en position epsilon est synthétisée. Cela peut être mis en lien avec la présence de
Sam-ELA qui catalyse la réaction de N-acylation de la lysine en position epsilon. En effet,
l’utilisation d’un extrait enzymatique issu d’une souche de S. ambofaciens pour laquelle les
gènes codant pour Sam-ELA et Sam-PVA ont été délétés a montré l’absence de lysine acylée
en position epsilon en présence de courtes chaines grasses. Une étude cinétique de la réaction
d’acylation de la lysine avec de l’acide laurique a aussi été réalisée afin d’évaluer l’influence
de la concentration de substrat et de la présence des ions divalents sur l’activité enzymatique.
Une influence positive du donneur d’acyle et négative de l’accepteur d’acyle a ainsi pu être
démontrée sur la réaction de N-acylation. La comparaison de l’utilisation de différents métaux
a permis de mettre en évidence l’effet activateur du cobalt sur l’activité des aminoacylases de
S. ambofaciens. Ces résultats sont très prometteurs et nécessitent d’être élargis par une étude
cinétique plus approfondie afin de mieux comprendre le mécanisme réactionnel mis en œuvre.
L’étude de la spécificité de substrat et la caractérisation des différentes aminoacylases prises
séparément devront être aussi réalisées soit après purification ou suite à une production
hétérologue.
Des tentatives d’expression hétérologues des différentes aminoacylases dans une souche d’E.
coli Origami B ont été menées. Différentes souches d’E. coli productrices des aminoacylases
Sam-AA et Sam-ELA ont pu être construites et la régiosélectivité des enzymes produites a pu
être confirmée en réalisant la réaction d’hydrolyse de l’- et de l’-acétyl-lysine. Cependant,
ces enzymes étaient synthétisées principalement sous la forme de corps d’inclusion. Cela a
exclu l’utilisation de ces souches, durant la thèse, pour la production hétérologue de Sam-AA
et des autres aminocylases pures. Il sera donc nécessaire de trouver un système d’expression
275
plus adapté à la production de ces enzymes. La renaturation des corps d’inclusion est aussi une
solution qui peut être envisagée. La production de ces acylases pures ouvrira les portes à de
nombreuses études expérimentales et par modélisation moléculaire après leur cristallisation, ce
qui est un objectif majeur afin d’envisager une utilisation de ces biocatalyseurs de manière
intensifiée et à plus grande échelle.
A l’issue de ces résultats, l’utilisation des aminoacylases de S. ambofaciens est apparue comme
la meilleure alternative pour la N-acylation des acides aminés. Cependant, les enzymes libres
présentent une stabilité très faible et leur séparation du milieu réactionnel après utilisation reste
très compliquée. Pour ces raisons, une immobilisation de ces dernières présente un intérêt du
point de vue de la mise en œuvre des réactions. Les travaux associés à cette immobilisation ont
été présentés dans le chapitre 5.
Les aminoacylases de S. ambofaciens ont été immobilisées sur des supports de différentes
natures et présentant différentes propriétés mécaniques et physicochimiques. Des supports
siliceux mésoporeux (SBA15), méso-macroporeux (MMS et SBA-si-HIPE) et macroporeux
(SI-HIPE) à base de silice développés en partenariat avec le CRPP et le L2CM ont été élaborés
et les aminoacylases ont été immobilisées par différentes méthodes. L’évaluation de l’activité
et de la stabilité des acylases immobilisées a été mise en œuvre en milieux aqueux en réalisant
la réaction d’hydrolyse de l’-acétyl-lysine et/ou la réaction de synthèse de l’-lauroyl-lysine.
L’augmentation de la taille des pores des supports a permis une augmentation progressive de la
quantité d’enzymes immobilisée grâce à une réduction des limitations de transfert de matière
vers l’intérieur des pores. L’organisation des mésopores a aussi influencé le taux
d’immobilisation dans le cas des supports méso-macroporeux. Ainsi, une augmentation d’un
facteur 2 de la quantité d’enzyme immobilisée a ainsi été obtenue dans les mésopores de
structure hexagonale (SBA15) par rapport aux mésopores vermiformes (MMS). En termes
d’activité catalytique, les aminoacylases immobilisées sur les MMS et les SBA15 ont montré
de meilleures performances et stabilités par rapport aux autres supports. Cela était probablement
lié à une meilleure orientation de l’enzyme à la surface de ces supports. Les deux supports
sélectionnés (méso-poreux et méso-macroporeux) ont été, par la suite, fonctionnalisés avec de
l’APTES à différents pourcentages, afin d’augmenter graduellement l’hydrophobie de surface
et de favoriser les interactions électrostatiques. Cela a permis une augmentation de la quantité
d’enzyme immobilisée jusqu’à un taux d’APTES de 10%. L’évaluation des performances
catalytiques des enzymes immobilisées a montré une différence entre les deux types de
276
supports. Dans le cas des SBA15, l’augmentation du taux de fonctionnalisation a permis une
amélioration de l’activité enzymatique ce qui n’était pas le cas des enzymes immobilisées sur
les supports MMS fonctionnalisés. Ceci est principalement dû à la fragilité de la paroi des MMS
ou à un effondrement de la structure mésoporeuse qui aurait bouché l’entrée des pores causant
des limitations de transfert du substrat vers l’enzyme malgré sa présence en quantité plus
importante. L’encapsulation des aminoacylases dans une double émulsion a aussi été réalisée
mais l’enzyme immobilisée a présenté une très faible stabilité malgré l’excellente activité
hydrolytique observée. De plus, l’enzyme encapsulée n’était pas en mesure de catalyser la
réaction de synthèse du lauroyl-lysine, là aussi, en raison de limitations de transfert du substrat
vers l’enzyme. En conclusion, les supports mésoporeux SBA15 fonctionnalisés avec de
l’APTES ont présenté, par leur porosité et leur stabilité structurale, les meilleurs résultats mais
l’activité enzymatique reste très faible comparée à celle des enzymes libres. Il reste donc
nécessaire de réaliser d’autres études plus approfondies en utilisant d’autres types de matériaux
(inorganiques ou polymériques) avec une optimisation des propriétés de surface par greffage
d’autres groupements fonctionnels afin de pouvoir réaliser les réactions de synthèse en réacteur
à lit fixe. Une étude in-silico de méso-modélisation des interactions enzyme / support pourrait
s’avérer très utile afin de comprendre les interactions mises en jeux et d’orienter le choix du
support et du groupement organique. Dans l’attente de la mise au point d’une procédure
d’immobilisation efficace permettant le maintien de bonnes activités et stabilités de ces
enzymes, l’utilisation des aminoacylases libres pour réaliser les réactions de N-acylation des
acides aminés reste la meilleure alternative.
Afin d’évaluer l’intérêt des supports développés par les équipes partenaires, l’étude de l’activité
et de la stabilité de CALB a été réalisée, en scCO2, en prenant la synthèse de l’acétate de
géraniol (réaction de O-acylation) comme réaction modèle étant donnée l’absence de N-
acylation lors des réactions étudiées précédemment au cours de notre travail dans ce solvant,
même en présence de cosolvant. Plusieurs supports et méthodes d’immobilisation ont été
utilisés et l’activité et la stabilité des enzymes immobilisées ont été déterminées, en continu,
dans un réacteur à lit fixe, sous scCO2, à 55°C et 200 bars. Des supports à base de carbone
(nanotubes de carbone) et de silice (SBA15 et si-HIPE) ont également été utilisés pour
l’immobilisation par physisorption et/ou par chimisorption en utilisant différents agents de
greffage. Les performances des biocatalyseurs produits ont été comparées à celles de CALB
commerciale immobilisée sur des supports polymériques de polyméthacrylate divinylbenzène
macroporeux (publication dans Process Biochemistry présentée en annexe 5). Les principaux
277
résultats ont permis de mettre en évidence que la lipase immobilisée sur les supports non poreux
à base de carbone (nanotubes de carbone) présentait une meilleure activité et une meilleure
stabilité lorsqu’elle était immobilisée par chimisorption. Cependant, une faible stabilité au
recyclage a été observée, comparativement à la CALB immobilisée commerciale, probablement
en raison des contraintes de cisaillement lors de l’étape de dépressurisation qui impactent
directement les enzymes immobilisées sur la surface externe du support. L’utilisation de
supports poreux pourrait réduire cet effet par l’immobilisation de l’enzyme à l’intérieur des
pores. A cet effet, CALB a été immobilisée sur SBA15 en utilisant différents greffons.
L’utilisation de l’isocyanate pour l’immobilisation permettait de maintenir de meilleures
performances catalytiques comparativement au glutaraldéhyde et au glymo. Par ailleurs, la
stabilité de l’enzyme était faible et l’activité résiduelle était très inférieure à celle de CALB
commerciale. Ceci est probablement lié à des limitations diffusionnelles des substrats vers le
cœur des mésopores contenant l’enzyme ou à une mauvaise orientation de l’enzyme
immobilisée. Pour résoudre ce problème, l’augmentation de la taille des pores pourrait être
envisagée. L’utilisation des supports macroporeux si-HIPE a également été évaluée en réalisant
l’immobilisation de CALB avec différentes concentrations d’isocyanates (2,5 et 5 mmoles
d’isocyanate / g de support ISO2,5 et ISO5 respectivement) afin de comparer l’effet de la
concentration du greffon. Les résultats ont montré que l’enzyme immobilisée présentait des
performances meilleures que celles de CALB commerciale, en particulier lors de
l’immobilisation en présence de ISO2,5. Par contre, un effet inhibiteur a été mis en évidence
lors d’une fonctionnalisation avec une concentration trop importante d’isocyanate. Ces résultats
préliminaires en O-acylation sous scCO2 sont très prometteurs et nécessitent un
approfondissement des investigations sur l’immobilisation des lipases sur ce support
macroporeux afin d’évaluer l’impact d’autres greffons sur le taux d’immobilisation et de
conversion.
À l’issue des travaux présentés ci-dessus, il est apparu que la mise en œuvre des aminoacylases
de S. ambofaciens sous forme libre demeurait pour le moment l’approche la plus approprié pour
la synthèse de lipoaminoacides d’intérêt industriel en phase aqueuse. La dernière étape de cette
thèse a consisté à évaluer la possible intensification de la réaction de synthèse de N-10-
undecenoyl-phenylalanine (C11’F) et de mettre en place un procédé de purification de ce
produit afin de comparer son activité inhibitrice de la synthèse de mélanine par les mélanocytes
avec celle du produit synthétisé par voie chimique (tâche 4 du projet ANR).
278
L’influence des conditions de mise en œuvre du procédé sur les performances catalytiques des
aminoacylases de S. ambofaciens a été déterminée en mode batch dans un réacteur agité. Il a
été montré qu’une augmentation de la concentration en phénylalanine conduisait à un meilleur
taux de conversion alors que l’augmentation de la concentration en acide undécénoïque (entre
25 et 200 mM) était très peu influente. L’effet de la température sur la réaction a montré une
meilleure activité catalytique à une température de 45°C mais il faut souligner la faible stabilité
thermique de ces enzymes. Par ailleurs, il a été déterminé que les aminoacylases étaient actives
à des pH entre 6,5 et 9 avec une bonne activité et une meilleure stabilité au cours du temps à
pH 8. Il a également pu être démontré que le produit de la réaction présentait un effet inhibiteur
de l’activité enzymatique. L’ajout d’activateur métallique, en l’occurrence le cobalt, a permis
une accélération très importante de la vitesse initiale de la réaction et du taux de conversion.
Cependant, à partir de 0,3 mM, un effet inhibiteur du cobalt a été mis en évidence. Lors de la
montée en échelle et du changement de système réactionnel (volume et configuration du
réacteur), très peu de variations de la cinétique de réaction ont été mises en évidence. Enfin, à
l’issue de la purification du C11’F synthétisé, par ultrafiltration sur des membranes de 10 KDa
et par différents types de chromatographie, un produit présentant une pureté de plus de 99% a
pu être obtenu. Les tests réalisés sur les cultures de cellules mélanocytes ont mis en évidence la
présence d’une activité inhibitrice de la synthèse de mélanine par le produit obtenu. C’est la
première fois que la production de C11’F par voie enzymatique est décrite. Cependant, à ce
jour, le faible taux de conversion par rapport à la voie chimique (20% vs plus de 80%), la faible
stabilité thermique et l’inhibition de l’activité enzymatique par le produit de la réaction
présentent un frein à l’extrapolation de ce procédé à l’échelle pilote puis industrielle. De plus,
le coût élevé de la production de l’enzyme rend le procédé enzymatique économiquement
incompatible. Il est donc nécessaire d’approfondir et d’élargir cette étude préliminaire mais très
prometteuse par l’utilisation de réacteurs intensifiés plus adaptés et bien contrôlés et par la mise
en place d’une méthode d’immobilisation efficace permettant d’améliorer l’activité et la
stabilité de ces aminoacylases. L’expression hétérologue de ces aminoacylases, et en particulier
de SamAA, devrait également permettre de rendre le procédé de synthèse enzymatique plus
compétitif. Une voie d’amélioration complémentaire serait de modifier génétiquement cette
dernière enzyme afin de disposer d’un catalyseur enzymatique optimisé pour la synthèse
d’acides aminés acylés dans des conditions plus respectueuses de l’environnement. Le procédé
mettant en œuvre cette enzyme pourrait alors constituer une alternative de choix aux procédés
chimiques actuellement utilisés industriellement.
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332
ANNEXES
333
334
Annexe 1 : Liste non exhaustive des acides aminés acylés et leurs activités
biologiques
Identification /
Acide aminé acylé Activité biologique Référence
utilisation
N-acétyl-L- Excrété chez les patients malades de
Urine (Goldstein, 1963)
phénylalanine phénylcétonurie
Cerveau (Audit-Ore,
N-acétyl-L-asparagine N.D
humain Wade, 1972)
Isovaleryl-glycine /
asparagine / histidine / Excrété chez les patients malades (Loots et al.,
Urine
lysine / tryptophan d’acidémie isovalérique 2005)
Acétyl-tryptophan
Activateur allostérique obligatoire de la
(Caldovic et al.,
N-acétyl-glutamate carbamyl phosphate synthétase I qui Mitochondrie
2006)
participe à l’uréogenèse
Arachidonoyl-glycine
/ alanine / acide Cerveau et (Huang et al.,
Analgésique
gamma amino autres tissus 2001)
butyrique (GABA)
(Milman et al.,
Propriétés vasodilatatrices et
2006 ; X. Zhang
N-arachidonoyl-L- vasoprotectrices Cerveau et
et al., 2010 ;
sérine Améliore l’angiogenèse autres tissus
Cohen-Yeshurun
Propriété pro-neurogènes et neuroprotectrice
et al., 2013)
Solubilisation et élimination de l’acide
biliaire dans les voies biliaires
Acides biliaires + (Trottier et al.,
Facilitation de l’absorption intestinale des Foie
glycine / taurine 2006)
lipides et vitamines (caractère hydrophobe
et propriétés de surface adaptée)
Réduction de la température corporelle et de (Chaturvedi et
N-oléoyl-glycine ND
la locomotion (molécule signale) al., 2006)
Augmentation de la sécrétion d’insuline (Chatzakos et al.,
Pancréas et
N-acyl-taurine Réduction de la prolifération des cellules 2012 ; Aichler et
autres
cancéreuses de la prostate al., 2017)
Activité anti-inflammatoire
(Takenouchi et
Arachidonoyl-glycine Activité pré-apoptotique pour les ND
al., 2012)
macrophages
N-10-undécénoyl-L- Réduction de la production de mélanine par (Bissett et al.,
Peau
phénylalanine les mélanocytes 2009a)
N-acyl-lysine / (Pinazo et al.,
Activité antimicrobienne ND
arginine 2016)
Activité antimicrobienne (Sreenu et al.,
N-acyl-isoleucine ND
Activité antioxydante 2014)
Peau (CosmeticOBS,
Capryloyl-glycine Activité antimicrobienne (traitement de 2015)
l’acné)
335
Diminue l’irritation du cuir chevelu (cas de
la dermatite séborrhéique)
Limite la production de sébum
Activité antimicrobienne (élimine la flore
indésirable responsable des mauvaises
Undecylenoyl glycine Peau
odeurs
Limite production de sébum.
Activité antirides et protection de la peau en
Di-palmitoyl stimulant la contraction des fibres de
Peau
hydroxyproline collagène
Activité antioxydant
Activité amincissante en limitant l’entrée
Lauroyl proline ND
des acides gras libres dans les adipocytes
Activités antirides en agissant contre les
Sodium cocoyl
marqueurs cellulaires du vieillissement en Peau
alaninate
particulier les protéines de signalisation
Activité anti-inflammatoire et antistress par Peau et
Palmitoyl glycine
régulation des molécules de signalisation cerveau
Palmitoyl isoleucine Activité antirides Peau
ND : non déterminé
336
Annexe 2 : conditions supercritiques de certaines molécules et solvants (Gérard,
2016 ; Attard, Hunt, 2018a)
Molécule Pression (bar) Température (°C)
Dioxyde de carbone 73,8 31,1
Eau 374,2 220.5
Méthane 46 -82,8
Ethane 48,7 32,2
Propane 42,5 96,7
Ethylène 50,76 9,5
Propylène 46,1 91
Méthanol 80,9 239,5
Ethanol 61,4 240,8
Acétone 47 235
Protoxyde d’azote 33,4 73,5
Ammoniaque 113,2 132,4
337
Annexe 3 : modèles de prédiction de la solubilité des molécules dans le CO 2
supercritique
Modèle Equation Nomenclature Références
k : paramètre associatif qui décrit le
nombre de molécules du gaz associé à une
molécule de soluté moins le ln du ratio de
la masse molaire du substrat (M2) et du
Chrastil pour A1 CO2 (M1)
ln y = k × lnρ + (Chrastil,
les solides et 𝑇 A1 et A2 : constantes pour chaque
1982)
les liquides +𝐴2 molécule qui correspondent aux
coefficients de régression obtenus par les
auteurs pour différentes molécules
ρ (g / L) : densité du scCO2
T (K) : température
𝑃
(y × 𝑃2𝑟𝑒𝑓 ) : facteur de renforcement où P
Bartle et al. est la pression et P2ref est une pression de
Pour les référence (0,1 MPa)
𝑃
solides et les ln (y × )= a : paramètre relié à la solvatation du (Bartle et
𝑃2𝑟𝑒𝑓
liquides à soluté al., 1991)
a × (ρ − ρref) + b′
faible b’ : paramètre lié à la pression de vapeur
volatilité du soluté
ρref (g / L) : densité du scCO2 (700 g / L)
Mendez-
(Méndez-
stantiago et T × ln(y × P) = E0, E1 et E2 : constantes indépendantes
Santiago,
Teja pour les E0 × ρ + E1 × T + E2 de la température obtenue par régression
Teja, 1999)
solides
338
Annexe 4 : classification des acylases selon leur spécificité
Nomenclature Identification Réaction Référence
EC 3.5.1.11 Pénicilline acylase Pénicilline + H2O  acide (Singh, Goyal, 2014)
carboxylique + 6-aminopenicillanate
EC 3.5.1.14 N-acyl-L-acide N-acyl-L-acide aminé + H2O  L- (Henseling, Rohm, 1988 ;
aminé aliphatique acide aminé + acide carboxylique Yang et al., 1994 ; Weiss et al.,
amidohydrolase 1995 ; Koreishi et al., 2005a ;
(aminoacylase I) Dettori et al., 2017 ; Takakura,
Asano, 2019)
EC 3.5.1.15 N-acyl-L-aspartate N-acyl-L-aspartate + H2O  acide (Kots et al., 2019)
amidohydrolase carboxylique +
(aspartoacylase ou L-aspartate
aminoacylase II)
EC 3.5.1.16 Acetylornithine N-acetylmethionine (Vogel, Bonner, 1956)
deacetylase + H2O  acetate + L-methionine
EC 3.5.1.17 N--acyl-L-lysine N--acyl-L-lysine + H2O  acide (Paik et al., 1957 ; Koreishi et
amidohydrolase carboxylique +L-lysine al., 2005b ; 2009a)
EC 3.5.1.21 N-acetyl-β-alanine N-acetyl-β-alanine + H2O  acetate (Fujimoto et al., 1968)
amidohydrolase + β-alanine
EC 3.5.1.55 N-acyl-L-glutamate N-acyl-L-glutamate + H2O  acide (Fukuda et al., 1982)
amidohydrolase carboxylique + L-glutamate
EC 3.5.1.68 N-formyl-L- N-formyl-L-glutamate + H2O  (Hu et al., 1987 ; Miyake et al.,
glutamate formate + L-glutamate 1983 ; Baker et al., 1997)
amidohydrolase
EC 3.5.1.71 N-feruloylglycine N-feruloylglycine + H2O  ferulate (Martens et al., 1988b ; 1988a)
amidohydrolase + glycine
EC 3.5.1.81 N-acyl-D-amino-acid N-acyl-D-amino acid + H2O  acide (Yang et al., 1991 ;
deacylase carboxylique + Hambardzumyan et al., 2016)
D-amino acid
EC 3.5.1.82 N-acyl-D-glutamate N-acyl-D-glutamate + H2O  acide (Sakai et al., 1991)
amidohydrolase carboxylique + D-glutamate
EC 3.5.1.83 N-acyl-D-aspartate N-acyl-D-aspartate + H2O  acide (Moriguchi et al., 1993)
amidohydrolase carboxylique + D-aspartate
EC 3.5.1.93 Cephalosporine (7R)-7-(4-carboxybutanamido) (Ishii et al., 1995 ; Monti et al.,
acylase cephalosporanate + H2O  (7R)-7- 2000 ; Kim et al., 2003 ; Tan et
aminocephalosporanate + glutarate al., 2019b)
EC 3.5.1.96 N-succinyl-L- N-succinyl-L-glutamate + H2O  (Wauven, Stalon, 1985 ;
glutamate succinate + L-glutamate Schneider et al., 1998 ; Lu,
amidohydrolase 2006)
EC 3.5.1.97 acyl-homoserine- N-acyl-L-homoserine lactone + H2O (Sio et al., 2006 ; Wahjudi et
lactone acylase  L-homoserine lactone + acide al., 2011 ;
carboxylique Chankhamhaengdecha et al.,
2013)
EC 3.5.1.114 N-acyl-aromatic-L- N-acyl- L- acide aminé aromatique + (Newman et al., 2007 ; Pushkin
amino acid H2O  acide aminé aromatique + et al., 2004 ; Tsirulnikov et al.,
amidohydrolase acide carboxylique 2009 ; Hsieh et al., 2010 ;
(aminoacylase III) Tsirulnikov et al., 2012)
339
Annexe 5 :
340
341
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Annexe 6 :
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358
359
Procédé enzymatique intensifié et durable de N-acylation d'acides aminés en milieux
écocompatibles : caractérisation, cinétiques et immobilisation de nouveaux biocatalyseurs
Mots clés : Acylation, Lipase, Acylase, immobilisation, modélisation, intensification
Résumé de la thèse :
Les acides aminés acylés constituent un important groupe de tensioactifs biosourcés présentant des propriétés
techno-fonctionnelles et bioactives très attractifs pour des applications en industries alimentaires, cosmétiques,
pharmaceutiques… La production de ces molécules à l’échelle industrielle se fait par voie chimique suivant la
réaction de Schotten-Baumann, qui en dépit de son efficacité, a un effet négatif sur l’environnement et ne présente
aucune spécificité de réaction. L’utilisation de biocatalyseurs enzymatiques est l’alternative la plus prometteuse à
cette voie chimique. L’objectif de cette thèse était d’évaluer le potentiel catalytique de différentes enzymes pour
la réaction de N-acylation des acides aminés en solvants verts. Dans un premier temps, le couple enzyme / substrat
le plus adapté à la réaction a été identifié. Les aminoacylases de Streptomyces ambofaciens en milieu aqueux ont
montré une bonne spécificité de substrat vis-à-vis de nombreux acides aminés contrairement à la lipase B de
Candida antarctica en milieu non-aqueux. Une relation entre la régiosélectivité des aminoacylases et la longueur
de la chaine du donneur d’acyle a été mise en évidence. Cela été lié à la présence de l’-lysine acylase dans le
mélange enzymatique. L’ajout d’ions cobalt a permis une accélération importante de la vitesse initiale de la
réaction de N-acylation et une augmentation du taux de conversion. Dans une deuxième phase, les enzymes ont
été immobilisées sur différents supports afin de faciliter leur recyclage. Les enzymes immobilisées sur les supports
mésoporeux (SBA15) fonctionnalisés avec de l’APTES ont été sélectionnés comme les meilleurs supports pour
l’immobilisation des aminoacylases de S. ambofaciens permettant de maintenir une certaine activité de l’enzyme
après immobilisation. Les performances de CALB après immobilisation ont été évalués sous scCO2 pour la
réaction de synthèse de l’acétate de géraniol. L’immobilisation de CALB par chimisorption sur des supports
siliceux macroporeux avec de l’isocyanate comme greffon a permis une augmentation importante de l’activité par
rapport aux autres supports et à l’enzyme CALB commerciale immobilisée sur une résine acrylique. Enfin,
l’impact des conditions réactionnelles sur la production de l’undécénoyl-phénylalanine (un surfactant d’intérêt en
cosmétique) par les aminoacylases de S. ambofaciens a été évaluée. Le produit de la réaction a été purifié à >99%
et l’activité de dépigmentation de la peau a été vérifié.
Intensified and sustainable enzymatic process for amino acids N-acylation in eco-
compatible media : characterization, kinetics and immobilization of new biocatalysts
Keywords : Acylase, Lipase, Acylation, immobilization, modeling, intensification
Abstract :
Acylated amino acids are one of the most attractive biobased surfactants for food, cosmetic and pharmaceutic
industry regarding their techno-functional and bioactive properties. Those molecules are produced at industrial
scale by using Schotten-Baumann chemical method which is a very productive way but non-specific and have a
negative impact on the environment. Enzymatic catalysis is one of the most promising alternatives. The aim of
this work was to find the best enzymatic way for the N-acylation of amino acids in green solvent. The first step
was to select the couple enzyme / reactional medium enabling the implementation of this reaction. Aminoacylases
from Streptomyces ambofaciens in aqueous medium showed the best N-acylation specificity towards the amino
acids and the acyl donors with some correlating between the structure of the substrates and the catalytic
performances compared to CALB which doesn’t show any N--acylation activity. The addition of cobalt to the
reaction medium allowed an acceleration of the reaction rate and an increase of the activity. In a second time, the
activity of the different enzymes was evaluated after the immobilization on various supports. The aminoacylases
immobilized on SBA-15 functionalized with APTES showed the best performances compared to the use of the
others supports but a decrease of the activity compared to the free enzymes was observed. In the case of CALB,
the covalent immobilization using isocyanate as grafting agent on the macroporous silica material allowed a
significant improvement of the catalytic performance under scCO2 even better than the commercial immobilized
CALB. Lastly, the operational condition affecting the aminoacylases activity for the synthesis of undecenoyl-
phenylalanine, a product with cosmetic interest, was evaluated. The product of the reaction was purified to >99%
and the skin depigmentation activity was checked.

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N-acylation d’acides aminés en milieux écocompatibles :

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Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4

J’adresse mes sincères remerciements à Mr Pedro Lozano et Mr Eric Dubreucq de m’avoir

Je souhaite également remercier l’Agence Nationale de la Recherche (ANR) d’avoir financé le

1 Chapitre I : Étude bibliographique ...............................................................................7

1.1 Acylation d’acides aminés ....................................................................................7

1.1.1 Les acides aminés acylés ................................................................................7

1.1.2 Activités biologiques des surfactants à base d’acides aminés..........................9

1.1.3 Caractéristiques structurales des AAS et paramètres influençant leur efficacité

1.1.4 Toxicité et biodégradabilité des AAS ........................................................... 12

1.1.5 Synthèse in vivo de surfactants à base d’acides aminés ................................. 14

1.1.6 Synthèse in vitro de surfactants à base d’acides aminés ................................ 15

1.1.6.1 Acylation des acides aminés par voie chimique ........................................ 15

1.1.6.2 Acylation des acides aminés par voie enzymatique ................................... 17

1.1.6.3 Acylation des acides aminés par voie chimio-enzymatique ....................... 18

1.2 Réaction d’acylation enzymatique en milieu non aqueux..................................... 19

1.2.1 Enzymes catalysant la réaction d’acylation en milieu non aqueux ................ 19

1.2.2 Structure et mécanisme catalytique des lipases .............................................21

1.2.3 Paramètres influençant les réactions en milieu non-aqueux .......................... 23

1.2.3.1 Influence de la teneur en eau .................................................................... 23

1.2.3.2 Influence de l’état d’ionisation ................................................................. 25

1.2.3.3 Impact de la température ..........................................................................26

1.2.3.4 Influence du substrat et du choix du solvant réactionnel ........................... 26

1.2.4 Acylation enzymatique sous CO2 supercritique ............................................ 29

1.2.4.1 Les fluides supercritiques et le CO2 .......................................................... 29

1.2.4.2 Paramètres influençant les réactions sous CO2 supercritique ..................... 31

1.2.4.2.1 Solubilité et solubilisation des composés ............................................ 31

1.2.4.2.2 Influence de l’eau sur l’activité enzymatique......................................33

1.2.5 Acylation enzymatique dans les liquides ioniques ........................................ 38

1.2.6 Acylation enzymatique en solvants eutectiques profonds ............................. 40

1.3 Réaction d’acylation enzymatique en milieu aqueux ...........................................45

1.3.1 Enzymes catalysant la réaction d’acylation en milieu aqueux ....................... 45

1.3.2.1 Influence du pH........................................................................................ 49

1.3.2.2 Influence de la température ......................................................................50

1.3.2.3 Influence des coactivateurs métalliques et inhibition de l’activité

1.3.3 Acylation enzymatique d’acides aminés par les aminoacylases en milieu

1.3.3.1 Les pénicillines acylases (EC 3.5.1.11) ..................................................... 52

1.3.3.2 L’epsilon lysine acylase (EC 3.5.1.17)...................................................... 53

1.3.3.3 Les aminoacylases I (EC 3.5.1.14)............................................................ 54

1.4 Immobilisation d’enzymes .................................................................................. 57

1.4.1 Matériaux utilisés pour l’immobilisation d’enzymes .................................... 58

1.4.1.1 Matériaux à base de polymères naturels.................................................... 58

1.4.1.2 Matériaux à base de polymères synthétiques.............................................59

1.4.1.3 Matériaux à base de silice ......................................................................... 60

1.4.1.4 Matériaux à base de carbone..................................................................... 60

1.4.1.5 Les supports magnétiques ......................................................................... 62

1.4.2 Caractéristiques du support ..........................................................................62

1.4.3 Techniques d’immobilisation ....................................................................... 65

1.4.3.1 Immobilisation par adsorption .................................................................. 65

1.4.3.2 Immobilisation par chimisorption ............................................................. 68

1.4.3.4 Immobilisation par réticulation ................................................................. 72

1.5 Approches utilisées pour l’intensification de procédés enzymatiques .................. 72